Summary
微创横向主动脉缩窄（MTAC）节省常规横向主动脉缩窄（TAC）的要领，同时消除了气管插管使用呼吸机。它被证明是对左心室过载，特别是在翻译研究高通量研究一个非常理想的方法。
Abstract
微创横向主动脉缩窄（MTAC）为横向主动脉的小鼠比标准开胸横向主动脉缩窄（TAC）缩颈更理想的方法。虽然横向主动脉缩窄为左心室高压的感应一个高功能的方法，它是一个更加困难和冗长过程由于其使用人工通气的气管插管。 TAC是常常也少生存，作为较新的方法，MTAC，既不要求肋骨和肋间肌也没有气管插管与通气设置切割。在MTAC，相对于一个开胸访问到胸腔，通过设在前壁颈部正中切口到达主动脉弓。甲状腺拉回以显示胸骨切迹。胸骨随后降低到第二肋水平，并通过分离的结缔组织和胸腺到达主动脉弓简单。从还有，缝合线能够围绕拱形缠绕并与间隔并列，然后胸骨切口和皮肤可以关闭。 MTAC是更快和更小侵入性的方式来诱导左心室高血压，并使用于高通量研究的可能性。缩颈的成功可以采用高频经胸超声心动图，尤其是彩色多普勒和脉冲波多普勒，确定主动脉弓的流速进行验证和左，右颈动脉，血管的尺寸，并左心室功能和形态。一个成功的收缩也会触发显著病理变化，如间质及血管周围纤维化心肌细胞肥大。这里，MTAC的程序中描述，显示了如何在颈动脉所得流量的变化可以用超声心动图，大体形态，并在心脏组织病理学变化进行检查。
Introduction
这篇文章的总体目标是演示如何横向小鼠主动脉缩窄（TAC）可以被修改以产生一个更简单，更方便的手术。 TAC最早在1991年1引入并启用分子生物学家研究导致肥大在左心室和心脏衰竭，特别是在小动物与操纵基因组2，3，4，5，6中的细胞和分子通路。尽管它在产生所需的压力超负荷功效，该技术最终由难以执行的程序和由它的低存活率的限制。一位外科医生在进行TAC必须能够执行气管插管，开胸，为了防止肺萎陷1使用人工通气。
内容“>通常，一个简单的和更小侵入性方法是期望的。因此，微创横向主动脉缩窄（MTAC）被制定3，虽然结果（具体地说，左心室肥大）是一样的，该过程涉及显著较少装置和向动物损伤较小。MTAC证明是具有更大的生存率，90％以上，理想的方法，并且具有唯一的15至25分钟。成功的手术后死亡的罕见情况下的操作时间可以归因于太主动脉弓-tight收缩，造成了巨大的左心室超负荷和致命减少血液供应的关键器官如肾脏。在这个步骤完成后，超声心动图可以用来评估带和心脏形态和功能的成功。的高频超声波系统可被用于测量直径，并在左，右流的变化颈动脉，以显现主动脉弓缩窄为峰值流速的测量，并确定左心室壁的厚度和功能参数7,8。安乐死后，器官也可以收集对用苏木精和曙红染色和天狼猩红胶原染色的组织病理学研究，后者为纤维化的观测是特别有用的。
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Protocol
该协议遵循了委员会对教学与研究（CULATR）使用活的动物在香港大学的指导方针。
1.操作场地准备
- 消毒用75％异丙醇的手术部位。调节加热垫温度至37℃，以避免在心脏和变化受试动物的呼吸率。
- 使用在重力位移消毒灭菌的外科器械在121℃进行30分钟，或通过其它适当的方法。
- 取2 - 4 30号针头和针保持器曲线它们，如在图1看到的那样，以使对结扎和组织分离并用作牵开器的工具。安装在一个棉花施用器用于在外科手术中使用的现弯曲针。
- 钝的27号针和曲线它与针保持器90º。通过摩擦硬表面，使在连接步骤0.4毫米间隔平滑小费。
- 麻醉2月龄，雄性，22-25克的C57BL / 6N小鼠相对于体重的适当氯胺酮和赛拉嗪的混合物：100毫克/公斤+10毫克/公斤的ip确认带负尾捏反射的麻醉。
- 用脱毛霜2至3分钟应用程序中删除的前颈部和胸部的头发。取出用温水和棉签的精华。
- 应用眼用软膏或凝胶的动物的眼睛来防止晒出角膜。
- 放置在一个加热垫的动物仰卧位，并进行术中监测，是一定要保持适当的文件在每15分钟间隔。
- 使用外科纸带固定四肢到加热垫，以保持在正确的位置的动物的手术过程中。
- 用酒精和聚维酮碘溶液三次交替消毒皮肤。
- 使用无菌博士猿带有裸操作字段，以防止污染。使用新的无菌手套对每个鼠标和必要的。
3.连接程序
- 在颈部和胸部用手术刀的中线位置打开小鼠的皮肤上。
- 轻轻用钝的剪刀分离结缔组织拉向头甲状腺。
- 在向两侧与弯曲针的中线分开的气管肌肉层。
- 使用钝剪，胸骨的第二肋（大约5毫米）。打开用拉钩或弯钳切。
- 彼此并通过分离与弯曲针结缔组织下部胸壁分开胸腺裂片;横向主动脉弓和两个颈动脉将在这一点上清晰可见。
- 放置弓下弯针和由脓另一侧的血管壁和结缔组织之间穿孔兴弯曲探出头来。
- 使用弯针，拉主动脉弓下6-0单丝缝合。
- 放置在循环中的隔离件和具有双结固定到位缝线。轻轻取下垫片。
- 确认结位置成功收缩并切断缝线的末端。
- 关闭使用6/0丝线缝合胸壁用一个简单的间断缝合模式。关闭了6/0单丝缝合皮肤在连续缝合模式。
4.术后护理
- 应用聚维酮碘溶液到缝合部位，然后将动物在回收和手术后监测预热笼。
- 注射丁丙诺啡（0.05 - 0.1毫克/千克SC每12小时）后，动物已经苏醒，以减轻疼痛，并提供适当的软食鼠标。
- 返回该动物完全恢复之后的12小时光照/黑暗周期的房间。
5。超声心动图：结扎成功和测量确认
- 一周后，麻醉先前带状小鼠用3 - 5％异氟醚，感应，和1 - 1.5％，以进行维护，以1升/分钟氧气流速。
- 删除使用脱毛霜的胸毛。彻底去除，用温水和棉签的精华。
- 固定鼠标在仰卧位置向动物处理平台，保持在37℃。应用电极凝胶的爪子和磁带他们用电极垫。
- 应用超声波凝胶鼠标胸前。带有40兆赫MS550D探针和高频超声波系统，在左，右颈动脉进行彩色多普勒和脉冲波多普勒扫描，以及在主动脉弓。
- 使用B模式，找到左心室。使用M模式中，收缩和舒张的壁厚可以被测量。利用电影存储和帧存储根据需要保存的数据和图像。
- ü唱B型，定位分支点之前的左颈动脉。利用脉冲波和彩色多普勒评估流程。与类似观点的右颈总动脉重复。保存电影存储和帧存储模式的图像供以后分析。
- 倾斜动物处理平台到最左边，使鼠标在左侧卧位。把探头上的鼠标，30°在胸骨旁位置从平行于头的位置偏移，和操纵的X和Y找到主动脉弓。
- 找到收缩。使用彩色多普勒模式以使收缩更明显的部位，如将要流过点之间的狭窄通道血液其中两个颈动脉从主动脉弓分支出来。
- 利用脉冲波和彩色多普勒测量峰值流速。利用电影存储和帧存储根据需要保存的数据和图像。
- 让动物在俯卧位加热垫恢复。返回动物到原始笼中，12小时光照/黑暗周期的房间后它已经完全从麻醉中恢复。
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Representative Results
MTAC使得能够显著高血压在左心室及时的诱导。
如在图1看到的，主要工具的程序编制简单和最小的，仅需要2 - 4 30号针头以用聚氨酯管子被弯曲并保持在适当位置。手术过程本身也不太复杂，因为相比TAC，并且可以容易地进行。一旦甲状腺已收回，胸骨被切断，胸腺被移动以清除视图。主动脉弓是用于结扎过程（ 图2）容易地可定位。
MTAC可靠地产生在结扎小鼠左心室压力过载。 图3示出本清楚，作为缩横向主动脉可在图3C中可以清楚地观察到，为WELL通过在3D收缩部位的增加峰值流速。这可相比于假手术小鼠中， 图3A和3B，它表现出与正常峰值流速没有收缩看到。如在图 4C看出结扎的结果，流速在右颈动脉被显著增加，并且压力可以建立升主动脉和心脏产生左心室肥大。然而，由于上游收缩的结果，流速显著在左颈动脉减少，如在图4D。另一方面，近乎相同的颈动脉血流中的假手术小鼠观察到的，如在图4A（右颈动脉）和图4B（左颈动脉）。
所得肥大有关的参数S和存活曲线显示在图5中 ，在其中MTAC结扎小鼠的心脏可观察到显著放大和变形可以容易地观察到。这只是进一步看出在细胞水平上，如在图6A和6B所示 ，相比于假手术小鼠其显示的MTAC操作鼠标的心脏扩大证明。相比，非结扎小鼠什么可进一步观察到的是在MTAC小鼠中增加心肌细胞尺寸和纤维化（ 图6D，6F，和6H）（ 图6C，6E，和6G）。
因为MTAC可以通过高频超声波系统进行验证，未能成功地收缩主动脉弓会因缺乏在二维超声心动图的横向主动脉的可见收缩的被揭示，如在图3B中 3D。这可以用脉冲波和彩色多普勒模式进一步验证，一个成功的收缩应表现出在左颈动脉（ 图4C和4D）在右颈动脉中的较高的流动速度和减少流速。
图1：通过弯曲1英寸，30号针尖端形成所需针钩的过程。 A）原来的1英寸，30号针头。 B）抓住与针保持器的针尖和沿着其长度大约一半弯曲。弯曲针进入一个循环，根据需要使用的针保持器和手，以形成在图中的上右图循环。 C）的覆盖用聚氨酯管针，以保持弯曲段就位。 D）的使用持针器，弯曲环的端部成所需的形状。在这种情况下，有两个45针尖 - 60°弯已经示出用于说明的目的。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：结扎横向主动脉弓过程。 A）主动脉弓清晰可见。 B）使用上述钩针，分离从附近的结缔组织主动脉弓。 C）使用钩针，引导缝合主动脉弓下，并与使用的隔板，领带所需直径的收缩。 D）已完成结扎。 PL轻松点击此处查看该图的放大版本。
图3：颜色和结扎非连接的小鼠的主动脉弓脉冲波多谱勒超声成像。 A）非结扎小鼠的主动脉弓的彩色多普勒成像。两个颈动脉是清楚可见的，以及缺乏它们之间的收缩。 B）主动脉峰值流速非结扎鼠标速度。 C）一个结扎鼠标主动脉弓的彩色多普勒成像。在主动脉弓两个颈动脉之间的收缩是可见的（黄色箭头）。 D）在缩颈部位峰值流速。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4：结扎，非结扎小鼠左，右颈动脉脉冲波的多普勒成像。 A）非连接鼠标的左侧颈动脉的脉冲波的多普勒成像。 B）一种非结扎小鼠的右颈动脉的脉冲波多普勒。值得注意的是，在血液流动的速度几乎相同的左颈动脉的。 C），在其主动脉弓的收缩鼠标的右颈总动脉的脉冲多普勒。血液速度显著增加，由于条目到左侧颈动脉的下游收缩。 D），在其主动脉弓的收缩鼠标的左侧颈动脉的脉冲多普勒。血流速度因收缩显著减少上游的入口的左颈动脉。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5：心肌肥厚及相关参数与存活曲线从3周结扎和非连接的小鼠。 a）从3个月大的小鼠心脏没有横向主动脉缩窄。心脏是健康和正常的形状，没有任何立即显现病症。 B）3个月大的老鼠的经历MTAC 3周的心脏。注意心脏的畸形清晰自然，由于左室壁扩大。在主动脉弓结扎也是可见的。 C）3个月之久的非结扎小鼠心脏的横截面。 D）的3心脏的横截面个月大的鼠标一点，接受横向主动脉缩窄3周。左心室的扩大是清晰可见。一般来说，心脏也因扩大造成的MTAC左心室压力负荷过重。 E）的心脏对体重比率在带状3周的小鼠的显著增加。 F）的心脏到左胫骨长度比小鼠显著增加带状3周（*，P <0.05; **，P <0.01; ***，P <0.001）。 G）的生存曲线3周的实验（MTAC = 12，SHAM = 12）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图6：小鼠心脏的组织学幻灯片。 A）一SH的横截面上午操作的小鼠心脏。 B）一种心脏MTAC结扎3周，具有加厚左心室壁和部分纤维化的横截面。总体心脏尺寸增加为好。 C）从假手术组小鼠心肌纤维纵向部分。 D）从MTAC结扎小鼠心肌纤维纵向部分。将细胞显著扩大，通过增大直径为证，而核一直保持相同的尺寸。 E）从假手术小鼠肌肉纤维的横截面。 F）从MTAC结扎小鼠心肌纤维的横切面。将细胞增大，由于压力过载作为MTAC的结果。 G）从天狼猩红染色胶原假手术鼠标冠状动脉。 高）从MTAC结扎鼠标冠状动脉。胶原组织的显著量ARO观察扩张的血管，表示血管周围纤维化UND由于在冠状动脉的压力超负荷。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
洛克人和同事发明了第一个方法主动脉缩窄为学习压力超负荷的心脏的方法。这使研究开始揭露高血压和心脏衰竭1的细胞和分子的后果。一种改进的方法，微创横向主动脉缩窄（MTAC），提供了左心室压力负荷和心脏衰竭的诱导的顺从，依赖于时间的方法，没有以往的横向主动脉缩窄9的缺点。该过程本身可以比TAC被显著更容易且具有增加的存活率进行。该方法的主要优点是，它使所述主动脉缩窄实验的性能，但与显著较少的设备，手术技能，以及相同或更好的结果操作时间。
交过程中的开胸方法确实能够摹reater访问和心脏和血管的整体的一个更好的视野。潜在的好处是，它可以容易地与其它的程序，如肺动脉收缩为右心室压力过载或冠状动脉结扎在作为主动脉弓绑扎完成同时缺血性病症的性能进行的。相反，微创方法是不适合于比升序或横主动脉弓缩窄其它任何东西。
值得注意的是，这种方法已被改编和以各种方式进行修改。在某些情况下，使用钛夹子代替缝合以收缩主动脉已被认为更合适的，因为它是一种实验条件，很容易再现的：因为它们可以在涉及标准TAC和MTAC程序频带不能滑落缝合6。在于，当与高频超声系统测试的情况下，小鼠的大量尚未在实验过程中被成功连接，还需要进一步的实践。也许上述的钛夹的应用可以提高手术6的成功率。
当进行实验，这是至关重要的主动脉周围缝合不太紧。它可能会损伤主动脉或使身体的其他部分，包括重要器官，如肾脏致命减少血流。护理也必须考虑使用的弯曲钩到主动脉从周围结缔组织和容器分开时是平缓的，因为它可以破坏肺静脉和其他船只，并可导致致命的血液损失。胸腔具有负和外部环境具有正压力。在此过程中，虽然胸壁从胸骨切开主动脉弓呈条带状，胸腔和负压环境完好无损。如果有accidenta升损害和内部负压改变，肺部就会倒塌，动物会死亡瞬间，因为就没有正压通气。一般，程序可以安全地在30分钟内进行，即使有性能下降，如果不存在致命的伤害。术后护理也很关键，因为压力可以降低，如果动物是脱水，或动物可以饿死由于疼痛和难以在到达食物。容易获得的软食，止痛，补液是恢复的关键，以及为成功的结果。
后续使用超声系统，特别是彩色多普勒模式中，使横主动脉弓的可视化，成功收缩，和MTAC的效果。超声波系统使流速的测量在颈动脉，在动脉壁的厚度，和左心室的形态。值得注意的是，流速在正常或假手术的小鼠的比应为约1 10。在缩颈部位峰值流速可以用来计算使用改性伯努利方程（4×2V 以下 2）的可靠参数作为颈比率的压力梯度。值得一提的是，超声心动图中，该体温和心脏速率必须保持尽可能接近正常生理范围，应该动物之间相似，以产生可比较的数据点10。
缩的不同级别可以从运营商的不同经验水平得到，并可以显著影响获得的形态学。为了获得一致的结果，检查成功缩颈与压力梯度水平和仅使用一定的限度，如40-80毫米汞柱之间的压力梯度内小鼠，是重要的。只要有可能，高频ECHocardiography应当用于确认和动物的选择标准，以实现在研究中的结果一致。然而，超声心动图是没有必要的MTAC方法本身。
如果高频超声心动图是不可用，则成功的收缩能与心脏重量和相对比例，并与在实验结束时的组织病理学研究来验证。成功的收缩会提高瘦肉率心脏重量，相对比体重和左胫骨骨的长度。同样，心肌细胞肥大和两者间质和血管周围纤维化，也可成功地结扎小鼠中观察到。此3周的实验仅用于以诱导心脏肥大，但不引起故障。 8周或更高版本 - 心脏扩张和心脏衰竭，通常6后开始出现问题。
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Acknowledgments
我们要感谢在香港理工大学生命科学（ULS）大学的研究设施，以提供VEVO 2100超声系统。特别感谢温家宝纯一博士从生物医学工程，香港理工大学，跨学科司提供训练和便利。这项工作是由香港政府拨款计划GRF 17127215，764812和HKU6 / CRF / 11G比利KC周的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 inch 30 Gauge Needles | BD, Franklin Lakes, NJ 07417, USA. | 305128 | Curved as in the procedure and Figure 1 |
| 27 Gauge Needle | BD, Franklin Lakes, NJ 07417, USA. | 301629 | Make blunt and smooth for spacer |
| 6/0 Dafilon | B. Braun, 34212 Melsungen, Hessen, Germany. | C0933066 | |
| 6/0 Silkam | B. Braun, 34212 Melsungen, Hessen, Germany. | C0762067 | |
| Sterile gloves | A.R. Medicom, Inc (Asia), Hong Kong. | ||
| Cotton Applicator | Mannings, Quarry Bay, Hong Kong. | Local Shopping Center | |
| Depilatory Cream | Veet (Hong Kong), Kwun Tong, Kowloon, Hong Kong | Local Shopping Center | |
| Lexer-Baby Scissor | FST, British Columbia V7H 0A6, Canada. | 14078-10 | |
| Curved Iris Forcep | FST, British Columbia V7H 0A6, Canada. | 11065-07 | |
| Micro Olsen-Hegar Needle Holder | WPI, Sarasota, FL 34240, USA. | 501989 | |
| Stereo Micrioscope | WPI, Sarasota, FL 34240, USA. | PZMIII-BS | |
| GenTeal Eye Gel | Novartis, East Hanover, NJ 07936, USA. | Local Pharmacy | |
| Heating Pad | Kent Scientific Corporation, Torrington, CT 06790, USA. | DCT-20 | |
| Surgical tape | Laboratory Animal Unit | ||
| Ketamine and Xylazine | Laboratory Animal Unit | ||
| Betadine | Laboratory Animal Unit | ||
| Buprenorphine | Laboratory Animal Unit |
References
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