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Article de méthode

Évaluation des cardiomyocytes types suivants Reprogrammation Transcription Factor médiée par des fibroblastes embryonnaires de souris

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DOI :

10.3791/55456

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22 mars 2017

 , 
1Department of Internal Medicine- Cardiology, UT Southwestern Medical Center

Dans cet article

Résumé

Ce manuscrit décrit un protocole étape par étape pour la génération et la quantification de divers sous-types cardiaques reprogrammés à l’aide d’une administration médiée par un rétrovirus de Gata4, Hand2, Mef2c et Tbx5.

Résumé

La reprogrammation directe d’un type de cellule en un autre est récemment apparue comme un paradigme puissant pour la médecine régénérative, la modélisation des maladies et la spécification de lignée. En particulier, la conversion des fibroblastes en myocytes induits de type cardiomyocytes (iCLM) par Gata4, Hand2, Mef2c et Tbx5 (GHMT) représente une voie importante pour générer des myocytes cardiaques de novo in vitro et in vivo. Des preuves récentes suggèrent que la GHMT génère une plus grande diversité de sous-types cardiaques qu’on ne le pensait auparavant, soulignant ainsi la nécessité d’une approche systématique pour mener des études supplémentaires. Cependant, avant que la reprogrammation directe puisse être utilisée comme stratégie thérapeutique, les fondements mécanistes de la conversion de lignée doivent être compris en détail pour générer des sous-types cardiaques spécifiques. Nous présentons ici un protocole détaillé pour générer des iCLM par reprogrammation de fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) médiée par GHMT.

Nous décrivons des méthodes pour l’isolement des MEF, la production de rétroviraux et l’infection par les MEF afin d’accomplir une reprogrammation efficace. Pour déterminer l’identité du sous-type des cellules reprogrammées, nous détaillons une approche étape par étape pour effectuer l’immunocytochimie sur des iCLM à l’aide d’un ensemble défini d’anticorps compatibles. Des méthodes de microscopie confocale, d’identification et de quantification des iCLM et des sous-types individuels auriculaires (iAM), ventriculaires (iVM) et stimulateurs cardiaques (iPM) sont également présentées. Enfin, nous discutons des résultats représentatifs d’expériences de reprogrammation directe prototypiques et soulignons les aspects techniques importants de notre protocole pour assurer une conversion efficace de la lignée. Dans l’ensemble, notre protocole optimisé devrait fournir une approche par étapes aux chercheurs pour mener des expériences de reprogrammation cardiaque significatives qui nécessitent l’identification de sous-types individuels de MC.

Introduction

Le cœur est le premier organe fonctionnel à se développer dans l'embryon 1, 2. En conjonction avec le système circulatoire, il fournit de l'oxygène, des nutriments, et un mécanisme d'élimination des déchets au cours du développement. Trois semaines après la fécondation, le cœur humain bat pour la première fois et sa réglementation appropriée est maintenue par cardiomyocytes (SGC). La perte irréversible de ces cellules spécialisées est donc la question fondamentale qui sous-tend l'insuffisance cardiaque progressive. Tandis que certains organismes , tels que le poisson zèbre et Xenopus ont un potentiel de régénération cardiaque, le cœur de mammifère adulte est plus limitée 3, 5, 6. Ainsi, compte tenu de la fonction critique du cœur, il est pas étonnant que la maladie cardiaque est la principale cause de décès dans le monde, ce qui représente 600.000 décès aux Etats-Unis seulement 7. lerefore, les thérapies à base de cellules pour réparer ou remplacer efficacement le myocarde blessés sont d'un grand intérêt clinique.

L'étude séminal Yamanaka et ses collègues 8 montré que l' expression forcée de quatre facteurs de transcription est suffisante pour transformer des cellules de fibroblastes complètement différenciées des cellules souches pluripotentes. Cependant, la capacité tumorigène de toutes les stratégies de cellules souches pluripotentes a été une préoccupation critique dans leur utilisation à des fins thérapeutiques. Ceci a motivé le domaine scientifique à la recherche de méthodes alternatives pour transdifférencier cellules tout en évitant une étape pluripotentes. Récemment, plusieurs groupes ont montré la faisabilité de cette stratégie en affichant la conversion directe de fibroblastes de souris aux cellules analogues à des cardiomyocytes induites (iCLMs) avec l'expression ectopique de facteurs de transcription Gata4, MEF2C, Tbx5, et plus tard, Hand2 (GMT et GHMT , respectivement) , 9, 10. Furthermore, la même stratégie peut être réalisée in vivo et dans des tissus d' origine humaine 9, 11, 12. Des études récentes ont mis en évidence des facteurs supplémentaires ou les voies de signalisation qui peuvent être modulées pour améliorer encore l' efficacité de reprogrammation cardiaque 13, 14, 15. Pris ensemble, ces études démontrent le potentiel de transdifférenciation dirigé pour les thérapies régénératrices. Cependant, la faible efficacité de CM reprogrammation, les mécanismes moléculaires inconnus, reproductibilité incompatibles en raison des différences méthodologiques 16, et de la nature hétérogène de iCLMs restent sans réponse.

Afin d'évaluer directement ICLM hétérogénéité, nous avons conçu un essai à cellule unique discrète et robuste pour l'identification du développement des sarcomères et cardiaque lignée specification-deux caractéristiques nécessaires de cardiomyocytes fonctionnels. Il y a au moins trois grands types de CM dans le coeur tel que défini par leur emplacement et les propriétés électriques uniques: auriculaire (AM), ventriculaire (VM) et pacemaker (PM) 17, 18, 19, 20. Dans une combinaison orchestrée, ils permettent le bon pompage du sang. Pendant les blessures du cœur, un ou tous les sous-types peuvent être affectés, et le type de thérapie cellulaire devraient être abordées au cas par cas. À l'heure actuelle, la plupart des stratégies axées sur la production globale de cardiomyocytes, alors que peu de travaux sont en cours pour étudier les mécanismes moléculaires qui régule la spécification de sous-type.

L'étude suivante détaille comment quantifier correctement sarcomères bien organisés et identifier un ensemble diversifié de sous-types de cardiomyocytes. L'utilisation d'un pacemaker (PM) souris rapporteur spécifique de, nous sommes en mesure d'appliquer un iapproche mmunocytochemical de distinguer les myocytes atriaux induites comme (IAM), les myocytes ventriculaires induites comme (IVM), et myocytes PM-like induits (IPMS) 21. Sur la base de nos observations, seules les cellules qui présentent l'organisation sarcomère sont capables de battre spontanée. Cette plate-forme de reprogrammation unique permet d'évaluer le rôle de certains paramètres dans l'organisation du sarcomère, la spécification du sous-type, et l'efficacité de CM reprogrammation à seule cellule de résolution.

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Protocole

Toutes les procédures expérimentales impliquant des pratiques animales ont été approuvées par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle à l'UT Southwestern Medical Center.

1. Isolement de HCN4-GFP E12.5 souris embryonnaires fibroblaste (MEF)

  1. Mettre en place des accouplements chronométrés entre homozygotes mâles HCN4-GFP et CD-1 femelles.
  2. Sacrifiez femme enceinte à E12.5 par le dioxyde de carbone et l'euthanasie dislocation cervicale postérieure.
    1. Retirer cornes utérines avec des pinces à dissection comme décrit précédemment 22, 23, et les placer dans une boîte de Pétri sur de la glace avec une solution saline 1x tampon phosphate (PBS) sans Ca 2+ ou Mg 2+.
  3. Effectuez toutes les étapes ultérieures de la hotte de culture tissulaire en utilisant une technique stérile.
    1. Retirer les embryons de l'utérus et sac amniotique à l'aide de ciseaux et de pinces à disséquer. Gardez le placenta attaché pour une meilleure manipulation. pregnant CD-1 femelles donnent généralement naissance à entre 10 et 14 chiots.
    2. Utilisation de pinces à disséquer, prendre les embryons isolés et rapidement les rincer deux fois dans 70% (v / v) EtOH.
      NOTE: Les lavages doivent être rapides pour réduire au minimum la mort cellulaire.
    3. Retirez la tête, les membres, la queue et les organes internes, y compris le cœur des embryons isolés.
    4. Placer le tissu restant dans une boîte de 10 cm avec 1 ml de 1 x PBS et finement hachée à l' aide d' une lame de rasoir stérile à environ 1 mm3 en taille.
    5. Transfert tissu haché dans un tube de 50 ml conique avec du PBS.
    6. Spin à 300 xg pendant 3 min. Aspirer soigneusement l'excès de PBS.
    7. Ajouter 1 ml de 0,25% de trypsine-EDTA stérile par embryon. Incuber les cellules dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 15 min. Mélanger délicatement le tube toutes les 4 min. Over-digestion du tissu va réduire considérablement le rendement.
    8. mélange de cellules de Vortex à vitesse maximale (3.200 rpm) pendant 4 s.
    9. Ajouter 2 mL de milieu de fibroblaste par embryon et mélanger. Filtre trâce un tamis cellulaire de 100 um à l'aide d'une pipette pour aider les cellules à travers le tamis. Reportez - vous au tableau 1 pour la formulation de tous les supports suivants.
    10. Spin à 300 xg pendant 4 min. Aspirer soigneusement surnageant.
    11. Ajouter 10 ml de milieu de fibroblastes frais par 3 embryons et triturer 6-10 fois.
    12. Plaque les cellules de 1 à 15 cm boîte de culture de tissus pour tous les 3 embryons préparés. Nuit de la culture dans un 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur.
    13. Après une nuit d'incubation, remplacer les médias avec des produits frais 30 ml de milieu par plaque. Placez les cellules de nouveau dans l'incubateur pendant une nuit.
      NOTE: Vérifier HCN4-GFP + contamination des cellules sous un microscope à fluorescence. La culture doit être GFP - et ne deviennent GFP + sur la reprogrammation.
    14. Le lendemain, les cellules de récolte avec 3 mL de frais préchauffé 0,25% de trypsine-EDTA. Comptez et congeler les cellules. En règle générale, le gel des cellules à 3 x 10 6 cellules par ml. La yie attendueld devrait être de 3 x 10 6 cellules par embryon.

2. Rétrovirus Production et Reprogrammation

Attention: Le protocole suivant nécessite la production et la manipulation des rétrovirus infectieux. Effectuez les étapes suivantes dans une armoire de biosécurité de niveau 2 en vertu de BSL-2 des lignes directrices et une technique stérile. Utilisez l'eau de Javel à 10% de disposer de tous les matériaux exposés à des retrovirus.

  1. La production de retrovirus et de préparation MEFs
    NOTE: Le protocole suivant est pour la production rétrovirale dans des plaques 6 puits et de l'infection MEF dans des plaques à 24 puits. Pour les autres formats, se reporter au tableau 2. MEFs sont étalées à jour -1, de sorte que le calendrier devra être coordonné de manière appropriée pour chaque expérience ( Se reporter à la section 2.3 et à la figure 2).
    1. Maintenir les cellules selon les recommandations du fabricant Plat-E (PE). En bref, la culture de cellules PE dans du DMEM supplémenté avec 10% de FBS, 1 pg / ml puromycin, 10 pg / ml de blasticidine, de la pénicilline et de la streptomycine. cellules Passage 1: 4 tous les deux jours lorsque la culture atteint 70-90% de confluence.
    2. Jour -2: Le jour avant la transfection, les cellules ensemencer Plat-E à 1 x 10 6 cellules / puits sur une plaque de 6 puits dans les milieux de transfection. Les cellules doivent être de 70 à 80% de confluence au moment de la transfection.
  2. Transfection en utilisant un agent de transfection commercial.
    NOTE: Les réactifs commerciaux doivent être à température ambiante (TA) avant la transfection. Pour la transfection d'ADN, ajouter chaque ADN plasmidique retroviral individuellement (G, H, M et T) pour former un cocktail de GHMT 9.
    1. Jour -1: Dans un tube en polystyrène de 15 ml conique, mélanger 60 ul de milieu de sérum réduit avec 6 ul de réactif de transfection par réaction d'un format de plaque à 6 puits. Laisser incuber le mélange pendant 5 min à température ambiante.
      NOTE: Étant donné que le réactif de transfection utilisé ici se lie aux plastiques, undd directement au milieu de sérum réduit afin d'éviter toute diminution de l'efficacité de la transfection.
    2. Ajouter un total de 2 pg de GHMT cocktail par réaction et appuyez doucement pour mélanger. Ne pas vortex. Laisser incuber la réaction pendant 15 min à température ambiante.
    3. Ajouter le mélange de l'étape 2.2.3 pour les cellules PE d'une manière sage de chute.
    4. Incuber les cellules transfectées Plat-E pendant une nuit dans un 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur. Noter le temps de transfection.
  3. Ensemencement des fibroblastes embryonnaires HCN4-GFP souris.
    1. 1 h avant l'étalement MEF, préparer une plaque de 24 puits pour immunocytochimie.
      1. Ajouter un fibronectine lamelle de 12 mm par puits.
      2. Revêtir les puits avec 300 ul d' une solution de collagène bovin (par exemple, surecoat) et incuber dans un incubateur à 37 ° C pendant 1 h.
      3. Solution de revêtement Aspirer juste avant le placage MEF.
    2. Décongeler une fiole congelée de HCN4-GFP MEFs et laver x1 avec fibrobl préchaufféemédias ast à 500 xg pendant 5 min.
    3. Déterminer la viabilité des cellules en utilisant l'exclusion du bleu trypan ou des colorants similaires. Calculer le nombre de cellules viables par millilitre de culture à l'aide de la formule suivante:
      de cellules viables% = [1,00 - (Nombre de cellules bleues / Nombre de cellules totales)] x 100
      1. Calculer le nombre total de cellules viables en utilisant la formule suivante:
        des cellules viables de cellules viables =% x facteur de dilution x 10 000 x volume total de la suspension cellulaire
    4. Seed 3 x 10 4 cellules par puits sur une plaque de 24 puits avec préalablement préparé collagène bovin solution fibronectine lamelle.
  4. Transduction et la reprogrammation de MEFs
    NOTE: Selon les notes du fabricant, bien entretenu cellules Plat-E produisent un titre moyen de 1 x 10 7 unités d'infection / mL. Bien que le titre ne soit pas directement mesurée pour chaque expérience, un témoin GFP est toujours inclus en tant que substitut pour l'efficacité de l'infection.Une expression élevée de la GFP et de l' intensité (GFP +> 95%) corrélé avec succès de la production d'GHMT à médiation iCLMs.
    1. Jour 0: 24 h post-transfection, filtrer le milieu rétroviral de PE par un pm à pores de taille cellulose filtre d'acétate 0,45 sans tensioactif et transférer dans un tube de 15 ml conique. Ajouter du polybrène à une concentration finale de 8 pg / ml. reconstituer soigneusement les cellules avec 2 ml de milieu de transfection frais.
      NOTE: Les cellules se détachent facilement de la plaque si le support est changé trop rapidement.
    2. Aspirer le milieu des MEFs cultivées et ajoutez le moyen rétroviral fraîchement prélevé; il devrait donner 1,7 mL de milieu par puits d'une plaque à 6 puits. Ajouter ~ 800 ul par puits d'une plaque de 24 puits. Retour plaque MEF à l'incubateur et incuber pendant la nuit.
    3. Jour 1: Répétez les étapes 2.4.1 et 2.4.2. Jeter les cellules après la collection de virus 2 ème. Retour MEFs infectés à l'incubateur et laisser reposer toute la nuit.
    4. Jour 2: 48 h après l'induction, aspirez la cellule conditionné médias et lavage x1 avec PBS 1x. Ajouter 500 ul préchauffé médias ICLM par puits d'une plaque de 24 puits.
    5. Remplacer les médias ICLM tous les 2 - 3 jours. Plaque de 14 jours après l'induction virale pour immunocytochimie (ICC) analyse de reprogrammation cardiaque.

3. Immunomarquage de MEFs reprogrammée

  1. 14 jours après l'induction, aspirer soigneusement les médias.
  2. Rincer chaque puits avec 300 pi de glace-froid 1x PBS. Aspirer l'excès de solution.
  3. Fixer les cellules avec 250 pi de paraformaldehyde (PFA) solution à 4% par puits d'une plaque de 24 puits. Incuber 15 min à température ambiante.
    NOTE: les cellules fixes peuvent être stockés dans du PBS à 4 ° C pendant 1 - 2 semaines avant la coloration.
  4. cellules perméabiliser par puits de lavage x3 avec 300 ul de 0,1% PBS-Triton 100 (PBST). Incuber 5 min à température ambiante entre les lavages. Aspirer l'excès de solution après le dernier lavage.
  5. Bloc 10min à température ambiante avec 1x tampon Bloc universel à 300 pl / puits.
  6. Préparer (CPI) tampon de coloration: Ajouter 1: 1 de PBS 1x et 1x Universal tampon de blocage. Diluer anticorps primaires dans un tampon de coloration de la CPI et incuber des anticorps nuit à 4 ° C. Reportez-vous à la section matériel pour les dilutions recommandées.
    1. Colorer une paire de diapositives avec α-actinine souris, αGFP de poulet et de lapin NPPA pour iPM et identification iAM.
    2. Colorer une paire de diapositives avec la souris α-actinine, αGFP de poulet et de lapin Myl2 pour LID et GIV identification.
  7. Le lendemain, lavez les puits x3 avec 300 ul de 0,1% PBST. Incuber 5 min à température ambiante entre les lavages. Aspirer l'excès de solution après le dernier lavage.
  8. Préparer les dilutions d'anticorps secondaires dans un tampon ICC de coloration. Reportez-vous à la section matériel pour les dilutions recommandées. Incuber Anticorps secondaires 1 h à température ambiante, à l'abri de la lumière.
    1. Colorer toutes les diapositives avec le antibodie secondaire suivants: la souris Alexa-555, poulet Alexa-488, et le lapin Alexa-647.
  9. Laver les puits x3 avec 300 ul de 0,1% PBST. Incuber 5 min à température ambiante entre les lavages. Protéger de la lumière.
  10. Ajouter 2,4 ul de milieu de montage contenant 1,5 pg / ml de 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) sur une lame de microscope en verre. Retirez délicatement la lamelle du puits de la plaque de 24 puits, enlever l'excès de solution, et transfert à la lame de verre avec les médias de montage. Appuyez doucement sur la lamelle pour enlever un excès de volume et de l'air.
  11. diapositives Seal avec vernis à ongles préféré ou d'étanchéité en plastique. Magasin diapositives montées à 4 ° C à l'abri de la lumière.

4. Identification des cardiaques sous-types utilisant la microscopie confocale

NOTE: Pour l'imagerie, un microscope confocal équipé d'au moins 2 détecteurs fluorescents capables de détection spectrale à 405, 488, 555, et 639 longueurs d'onde nm est nécessaire afin d'identifier IPMS, Iams et MVI. Imagcellules e en utilisant un objectif Plan-Apochromat 20X / 0,75 ou mieux. En utilisant le logiciel d'analyse d'image du fabricant, la numérisation des images de zoom peut atteindre 40X-huile des images de qualité d'immersion.

  1. Bibliothèque d'images: prendre des images de 8 bits avec DAPI, Alexa-488, Alexa-555 et Alexa-647 canaux (ch.). Pixel temps de séjour de 6 s, 1024 taille de l'image, l'étape de ligne à 2, et une moyenne de 2 est suffisante pour des images haute résolution.
  2. Pour chaque diapositive, démarrer à partir d' un bord et commencer à numériser haut et en bas dans le canal rouge fluorescent (ch.) Pour α-actinine + Sarcomère cellules + (Reportez - vous à la figure 3 et la figure 5A pour des exemples). striures Sarcomère sont plus faciles à identifier visuellement la longueur d'onde de 555 nm.
    1. Une fois qu'une α-actinine + cellule Sarcomère + a été identifié, passer à la ch vert. et de garder la note si elle est positive (LAI). Basculer vers l'ordinateur pour évaluer le bien-rouge 647 ch. (IAM ou iVM).
      NOTE: Les cellules qui sontα-actinine + / Sarcomère + / Hnc4-GFP + / NPPA - / Myl2 - sont désignés comme IPMS. L' expression de GFP sera vu dans toute la cellule (figure 4A).
    2. diapositives Stain avec α-actinine (souris-Alexa555), HCN4-GFP (poulet-Alexa488), NPPA (lapin-Alexa647) et DAPI. Les cellules qui sont α-actinine + / Sarcomère + / Hnc4-GFP - / NPPA + sont iAM. NPPA coloration apparaît périnucléaire et punctiformes (figure 4B).
    3. diapositives Stain avec α-actinine (souris-Alexa555), HCN4-GFP (poulet-Alexa488), Myl2 (lapin-Alexa647). Les cellules positives pour α-actinine + / Sarcomère + / Hnc4-GFP - / Myl2 + sont MVI. Myl2 coloration présentera une forme striée le long du filament de sarcomère. En raison des variations dans la qualité de la coloration et le plan Z, striations ne peuvent pas toujours être facilement visibles (figure 4C).

5. Quantification

NOTE: Afin d'évaluer le nombre réel de MEFs potentiellement reprogrammées, 2 puits d'une plaque de 24 puits sont ensemencées en parallèle aux puits expérimentaux et sont récoltés un jour après placage. Le nombre total de cellules ensemencées est alors déterminée en calculant la moyenne des deux puits. Cela devient les cellules totales réelles plaquées (Un total).

  1. Sarcomère +
    1. Inspecter visuellement chaque cellule sur une lamelle pour le bon α-actinine + / Sarcomère + (panneaux de droite Figure 3) et enregistrer (figure 5B-i).
    2. Tabulez le nombre total d'α-actinine + / Sarcomère + sur chaque lamelle et diviser par les cellules totales réelles plaquées ( Un total) (figure 5B-iii). Par exemple, si = 12.500 cellules Un total et 100 cellules ont été a-Actinin + / Sarcomère + puis, 0,8% des MEFs plaqués ont été reprogrammée. Une moyenneexpérience reprogrammant donnera 1% a-actinine + / Sarcomère + cellules (Figure 5C).
  2. Sous +
    NOTE: Pour les étapes suivantes, reportez - vous à la figure 5B / C pour une ICLM quantification représentant workflow. En bref, pour chaque sarcomère + cellule, tabuler si elle est unique pour les deux sous - type (figure 5B-i). Calculer% Subtype (figure 5B-iii) en divisant le nombre de sous - type + cellules sur sarcomère moyenne + cellules x 100 (figure 5B-i). Pour calculer l'efficacité absolue% du sous - type (figure 5B-iv), diviser le nombre de sous - type + cellule à partir de la figure 5B-i par le nombre total de cellules ensemencées x 100 (figure 5B-ii).
    1. Pour chacun des α-actinine cellules + / Sarcomère +, d' évaluer si elles sont GFP +, NPPA + ou Myl2 +.
    2. Tabulez nombre total d'α-actinine + / Sarcomère + / Hnc4-GFP + / NPPA - / Myl2 -, actinin + / Sarcomère + / Hnc4-GFP - / NPPA + et α-actinine + / Sarcomère + / Hnc4-GFP - / + Myl2 cellules (figure 5B-I).
    3. Pour calculer le pourcentage de chaque sous - type, il faut diviser le nombre de sous - type + cellules par le nombre total d'α-actinine + / Sarcomère + cellules dans ce puits et multiplier par 100. GHMT génère IPMS, Iams et iVMS ratios à peu près égales (Figure 5B-iii).
    4. Pour calculer le nombre absolu de sous - type + cellules, diviser le nombre total de sous - type + cellules pour la condition expérimentale par Un total et multiplier par 100 (figure 5B-ii). Sur IPMS moyenne représentent 0,3% de la population totale de cellules infectées, Iams 0,3%, etiVMS 0,25% (figure 5B-iv).

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Résultats

Profitant de la souris reporter PM-spécifique, nous avons développé une stratégie d'immunocoloration multiplex pour identifier divers myocytes endogènes comme le montre la figure 1. Après les étapes de reprogrammation de la figure 2, l' induction de CMs spécifiques du sous-type peut être détectée dès le jour 4 21, mais à un faible taux. Au jour 14, l'expérience peut être arrêté et évalué pour l' organisation sarcom...

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Discussion

La présente étude fournit une stratégie directe reprogrammation pour la conversion de MEFs dans un ensemble diversifié de sous-types cardiaques via l'expression de retrovirus de la transcription cardiaque Facteurs Gata4, MEF2C, Tbx5 et Hand2 (GHMT). En utilisant une approche d'immunocoloration multiplex en combinaison avec une souris reporter PM-spécifique, nous sommes en mesure d'identifier iAM, IVM, et IPMS à la résolution d'une seule cellule. Un tel essai permet une expérimentation dans le sy...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

A.F.-P. a été soutenu par la bourse de recherche supérieure de la National Science Foundation dans le cadre de la subvention n° 2015165336. N.V.M a été soutenu par des subventions du NIH (HL094699), du Burroughs Wellcome Fund (1009838) et de la March of Dimes (#5-FY14-203). Nous reconnaissons Young-Jae Nam, Christina Lubczyk et Minoti Bhakta pour leurs importantes contributions au développement de protocoles et à l’analyse des données. Nous remercions également John Shelton pour sa précieuse contribution technique et les membres du laboratoire Munshi pour la discussion scientifique.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
DMEMSigmaD5796Composant des milieux iCLM, Plat-E, fibroblaste et milieu de transfection
Milieu 199Thermo Fisher Scientific11150059Composant du milieu iCLM
Sérum de veau fœtal (FBS)SigmaF2442Composant du milieu iCLM, du milieu Plat-E, du fibroblaste et du milieu de transfection
Insuline-Transferrine-Sélénium GThermo Fisher Scientific41400-045Composant du milieu iCLM
Solution vitaminique MEMThermo Fisher Scientific11120-052Composant du milieu iCLM
Acides aminés MEMThermo Fisher Scientific1601149Composant du milieu iCLM
Acides aminés non essentiels ThermoFisher Scientific11140-050Composant du milieu iCLM
Antibiotiques-antimycosiquesThermo Fisher Scientific15240062Composant du média iCLM
Supplément B-27Thermo Fisher Scientific17504044Composant du média iCLM Sérum de
cheval inactivé par la chaleurThermo Fisher Scientific26050-088Composant du média iCLM
NaPyruvateThermo Fisher Scientific11360-70Composant du média iCLM
Pénicilline/StreptomycineThermo Fisher Scientific1514022Composant du milieu Plat-E et du milieu fibroblastique
Puromycine  ;Thermo Fisher ScientificA11139-03Composant de Plat-E media
Blasticidine  ;   ;Gemini Bio-Products400-128PComposant du média Plat-E
GlutamaxThermo Fisher Scientific35050-061Composant du média Fibroblaste
Balayage laser confocal LSM700Zeiss Pour l’analyseconfocale
FuGENE 6 Réactif de transfectionPromegaE2692Réactif de transfection  ;
Opti-MEM Sérum Réduit MediumThermo Fisher Scientific31985-070Réactif de transfection  ;
PolybreneMilliporeTR-1003-GRéactif d’induction. Utilisation à une concentration finale de 8 &mu ; M/mL
Lignée cellulaire rétrovirale packagin platinium-E (PE), cellule écotropiqueBiolabsRV-101Lignée cellulaire rétrovirale pacaking
Trypsine 0,25 % EDTAThermo Fisher ScientificPour les MEF et la dissociation Plat-E
Souris anti &alpha ;-actinine (clone EA-53)Anticorps SigmaA7811pour l’analyse confocale. Utiliser à 1:200
Poulet anti-GFP IgYThermo Fisher ScientificA10262Anticorps pour l’analyse confocale. Utilisation à 1:200
Rabbit Pab anti-NPPA  ;Anticorps AP8534A Abgentpour l’analyse confocale. Utilisation à 1:400
Rabbit Pab anti Myl2 IgG  ;ProteinTech10906-1-APAnticorps pour l’analyse confocale. Utilisation à 1:200
Solution Vectashield avec DAPI (4',6-Diamidino-2-Phénylindole, dichlorhydrate)Vector LabsH-1500Colorant pour l’analyse confocale
Lames de microscope Superfrost Plus ThermoFisher Scientific12-550-1525 x 75 x 1,0 mm
BioCoat Fibronectine 12 mm Couvre-objectifsNeuVitro CorpGG-12-1.5pour l’analyse confocale
100 &mu ; crépine à cellules mThermo Fisher Scientific08-771-19
0.45 &mu ; m Seringues filtres SFCA 25MMThermo Fisher Scientific09-740-106Pour filtration virale
6 mL SeringuesCovidien8881516937Pour filtration virale
Chèvre anti-Poulet IgY (H& L) A488AbcamAB150169Anticorps secondaire pour l’analyse confocale. Utilisation à 1:400
Âne anti-lapin A647 IgG(H+L)  ;Thermo Fisher ScientificA31573Anticorps secondaire pour l’analyse confocale. Utilisation à 1:400
Chèvre anti-souris IgG(H+L) A555Thermo Fisher ScientificA21422Anticorps secondaire pour l’analyse confocale. Utilisation à 1:400
Triton X-100Sigma93443-100mlPour la perméabilisation cellulaire  ;
PBS de Dulbecco sans CaCl2 et MgCl2 (D-PBS)SigmaD8537
Power Block 10x Réactif de blocage universelThermo Fisher ScientificNC9495720Diluer à 1x dans H2O
16 % Solution aqueuse de paraformaldéhyde (PFA)Microscopy Sciences  ;15710Utilisation à 4 % diluée dans le dH2O
Plaques de 6 cmOlympus25-260
Plaques à 6 puitsGenesee Scientific25-105
Plaques à 24 puitsGenesee Scientific25-107
10 cm Boîtes de culture tissulaireCorning4239
15 cm ; Boîtes de culture tissulaireThermo Fisher Scientific5442
15 mL Tubes coniquesCorning4308
50 mL Tubes coniquesCorning4249
0,4 % Trypan blue solutionSigmaT8154Pour la viabilité
Alcool éthylique 200 proofThermo Fisher Scientific7005
Eau de JavelThermo Fisher Scientifique6009
Electro

Références

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Évaluation des cardiomyocytes types suivants Reprogrammation Transcription Factor médiée par des fibroblastes embryonnaires de souris
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