Introduction
Le cœur est le premier organe fonctionnel à se développer dans l'embryon 1, 2. En conjonction avec le système circulatoire, il fournit de l'oxygène, des nutriments, et un mécanisme d'élimination des déchets au cours du développement. Trois semaines après la fécondation, le cœur humain bat pour la première fois et sa réglementation appropriée est maintenue par cardiomyocytes (SGC). La perte irréversible de ces cellules spécialisées est donc la question fondamentale qui sous-tend l'insuffisance cardiaque progressive. Tandis que certains organismes , tels que le poisson zèbre et Xenopus ont un potentiel de régénération cardiaque, le cœur de mammifère adulte est plus limitée 3, 5, 6. Ainsi, compte tenu de la fonction critique du cœur, il est pas étonnant que la maladie cardiaque est la principale cause de décès dans le monde, ce qui représente 600.000 décès aux Etats-Unis seulement 7. lerefore, les thérapies à base de cellules pour réparer ou remplacer efficacement le myocarde blessés sont d'un grand intérêt clinique.
L'étude séminal Yamanaka et ses collègues 8 montré que l' expression forcée de quatre facteurs de transcription est suffisante pour transformer des cellules de fibroblastes complètement différenciées des cellules souches pluripotentes. Cependant, la capacité tumorigène de toutes les stratégies de cellules souches pluripotentes a été une préoccupation critique dans leur utilisation à des fins thérapeutiques. Ceci a motivé le domaine scientifique à la recherche de méthodes alternatives pour transdifférencier cellules tout en évitant une étape pluripotentes. Récemment, plusieurs groupes ont montré la faisabilité de cette stratégie en affichant la conversion directe de fibroblastes de souris aux cellules analogues à des cardiomyocytes induites (iCLMs) avec l'expression ectopique de facteurs de transcription Gata4, MEF2C, Tbx5, et plus tard, Hand2 (GMT et GHMT , respectivement) , 9, 10. Furthermore, la même stratégie peut être réalisée in vivo et dans des tissus d' origine humaine 9, 11, 12. Des études récentes ont mis en évidence des facteurs supplémentaires ou les voies de signalisation qui peuvent être modulées pour améliorer encore l' efficacité de reprogrammation cardiaque 13, 14, 15. Pris ensemble, ces études démontrent le potentiel de transdifférenciation dirigé pour les thérapies régénératrices. Cependant, la faible efficacité de CM reprogrammation, les mécanismes moléculaires inconnus, reproductibilité incompatibles en raison des différences méthodologiques 16, et de la nature hétérogène de iCLMs restent sans réponse.
Afin d'évaluer directement ICLM hétérogénéité, nous avons conçu un essai à cellule unique discrète et robuste pour l'identification du développement des sarcomères et cardiaque lignée specification-deux caractéristiques nécessaires de cardiomyocytes fonctionnels. Il y a au moins trois grands types de CM dans le coeur tel que défini par leur emplacement et les propriétés électriques uniques: auriculaire (AM), ventriculaire (VM) et pacemaker (PM) 17, 18, 19, 20. Dans une combinaison orchestrée, ils permettent le bon pompage du sang. Pendant les blessures du cœur, un ou tous les sous-types peuvent être affectés, et le type de thérapie cellulaire devraient être abordées au cas par cas. À l'heure actuelle, la plupart des stratégies axées sur la production globale de cardiomyocytes, alors que peu de travaux sont en cours pour étudier les mécanismes moléculaires qui régule la spécification de sous-type.
L'étude suivante détaille comment quantifier correctement sarcomères bien organisés et identifier un ensemble diversifié de sous-types de cardiomyocytes. L'utilisation d'un pacemaker (PM) souris rapporteur spécifique de, nous sommes en mesure d'appliquer un iapproche mmunocytochemical de distinguer les myocytes atriaux induites comme (IAM), les myocytes ventriculaires induites comme (IVM), et myocytes PM-like induits (IPMS) 21. Sur la base de nos observations, seules les cellules qui présentent l'organisation sarcomère sont capables de battre spontanée. Cette plate-forme de reprogrammation unique permet d'évaluer le rôle de certains paramètres dans l'organisation du sarcomère, la spécification du sous-type, et l'efficacité de CM reprogrammation à seule cellule de résolution.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Toutes les procédures expérimentales impliquant des pratiques animales ont été approuvées par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle à l'UT Southwestern Medical Center.
1. Isolement de HCN4-GFP E12.5 souris embryonnaires fibroblaste (MEF)
- Mettre en place des accouplements chronométrés entre homozygotes mâles HCN4-GFP et CD-1 femelles.
- Sacrifiez femme enceinte à E12.5 par le dioxyde de carbone et l'euthanasie dislocation cervicale postérieure.
- Retirer cornes utérines avec des pinces à dissection comme décrit précédemment 22, 23, et les placer dans une boîte de Pétri sur de la glace avec une solution saline 1x tampon phosphate (PBS) sans Ca 2+ ou Mg 2+.
- Effectuez toutes les étapes ultérieures de la hotte de culture tissulaire en utilisant une technique stérile.
- Retirer les embryons de l'utérus et sac amniotique à l'aide de ciseaux et de pinces à disséquer. Gardez le placenta attaché pour une meilleure manipulation. pregnant CD-1 femelles donnent généralement naissance à entre 10 et 14 chiots.
- Utilisation de pinces à disséquer, prendre les embryons isolés et rapidement les rincer deux fois dans 70% (v / v) EtOH.
NOTE: Les lavages doivent être rapides pour réduire au minimum la mort cellulaire. - Retirez la tête, les membres, la queue et les organes internes, y compris le cœur des embryons isolés.
- Placer le tissu restant dans une boîte de 10 cm avec 1 ml de 1 x PBS et finement hachée à l' aide d' une lame de rasoir stérile à environ 1 mm3 en taille.
- Transfert tissu haché dans un tube de 50 ml conique avec du PBS.
- Spin à 300 xg pendant 3 min. Aspirer soigneusement l'excès de PBS.
- Ajouter 1 ml de 0,25% de trypsine-EDTA stérile par embryon. Incuber les cellules dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 15 min. Mélanger délicatement le tube toutes les 4 min. Over-digestion du tissu va réduire considérablement le rendement.
- mélange de cellules de Vortex à vitesse maximale (3.200 rpm) pendant 4 s.
- Ajouter 2 mL de milieu de fibroblaste par embryon et mélanger. Filtre trâce un tamis cellulaire de 100 um à l'aide d'une pipette pour aider les cellules à travers le tamis. Reportez - vous au tableau 1 pour la formulation de tous les supports suivants.
- Spin à 300 xg pendant 4 min. Aspirer soigneusement surnageant.
- Ajouter 10 ml de milieu de fibroblastes frais par 3 embryons et triturer 6-10 fois.
- Plaque les cellules de 1 à 15 cm boîte de culture de tissus pour tous les 3 embryons préparés. Nuit de la culture dans un 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur.
- Après une nuit d'incubation, remplacer les médias avec des produits frais 30 ml de milieu par plaque. Placez les cellules de nouveau dans l'incubateur pendant une nuit.
NOTE: Vérifier HCN4-GFP + contamination des cellules sous un microscope à fluorescence. La culture doit être GFP - et ne deviennent GFP + sur la reprogrammation. - Le lendemain, les cellules de récolte avec 3 mL de frais préchauffé 0,25% de trypsine-EDTA. Comptez et congeler les cellules. En règle générale, le gel des cellules à 3 x 10 6 cellules par ml. La yie attendueld devrait être de 3 x 10 6 cellules par embryon.
2. Rétrovirus Production et Reprogrammation
Attention: Le protocole suivant nécessite la production et la manipulation des rétrovirus infectieux. Effectuez les étapes suivantes dans une armoire de biosécurité de niveau 2 en vertu de BSL-2 des lignes directrices et une technique stérile. Utilisez l'eau de Javel à 10% de disposer de tous les matériaux exposés à des retrovirus.
- La production de retrovirus et de préparation MEFs
NOTE: Le protocole suivant est pour la production rétrovirale dans des plaques 6 puits et de l'infection MEF dans des plaques à 24 puits. Pour les autres formats, se reporter au tableau 2. MEFs sont étalées à jour -1, de sorte que le calendrier devra être coordonné de manière appropriée pour chaque expérience ( Se reporter à la section 2.3 et à la figure 2).- Maintenir les cellules selon les recommandations du fabricant Plat-E (PE). En bref, la culture de cellules PE dans du DMEM supplémenté avec 10% de FBS, 1 pg / ml puromycin, 10 pg / ml de blasticidine, de la pénicilline et de la streptomycine. cellules Passage 1: 4 tous les deux jours lorsque la culture atteint 70-90% de confluence.
- Jour -2: Le jour avant la transfection, les cellules ensemencer Plat-E à 1 x 10 6 cellules / puits sur une plaque de 6 puits dans les milieux de transfection. Les cellules doivent être de 70 à 80% de confluence au moment de la transfection.
- Transfection en utilisant un agent de transfection commercial.
NOTE: Les réactifs commerciaux doivent être à température ambiante (TA) avant la transfection. Pour la transfection d'ADN, ajouter chaque ADN plasmidique retroviral individuellement (G, H, M et T) pour former un cocktail de GHMT 9.- Jour -1: Dans un tube en polystyrène de 15 ml conique, mélanger 60 ul de milieu de sérum réduit avec 6 ul de réactif de transfection par réaction d'un format de plaque à 6 puits. Laisser incuber le mélange pendant 5 min à température ambiante.
NOTE: Étant donné que le réactif de transfection utilisé ici se lie aux plastiques, undd directement au milieu de sérum réduit afin d'éviter toute diminution de l'efficacité de la transfection. - Ajouter un total de 2 pg de GHMT cocktail par réaction et appuyez doucement pour mélanger. Ne pas vortex. Laisser incuber la réaction pendant 15 min à température ambiante.
- Ajouter le mélange de l'étape 2.2.3 pour les cellules PE d'une manière sage de chute.
- Incuber les cellules transfectées Plat-E pendant une nuit dans un 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur. Noter le temps de transfection.
- Jour -1: Dans un tube en polystyrène de 15 ml conique, mélanger 60 ul de milieu de sérum réduit avec 6 ul de réactif de transfection par réaction d'un format de plaque à 6 puits. Laisser incuber le mélange pendant 5 min à température ambiante.
- Ensemencement des fibroblastes embryonnaires HCN4-GFP souris.
- 1 h avant l'étalement MEF, préparer une plaque de 24 puits pour immunocytochimie.
- Ajouter un fibronectine lamelle de 12 mm par puits.
- Revêtir les puits avec 300 ul d' une solution de collagène bovin (par exemple, surecoat) et incuber dans un incubateur à 37 ° C pendant 1 h.
- Solution de revêtement Aspirer juste avant le placage MEF.
- Décongeler une fiole congelée de HCN4-GFP MEFs et laver x1 avec fibrobl préchaufféemédias ast à 500 xg pendant 5 min.
- Déterminer la viabilité des cellules en utilisant l'exclusion du bleu trypan ou des colorants similaires. Calculer le nombre de cellules viables par millilitre de culture à l'aide de la formule suivante:
de cellules viables% = [1,00 - (Nombre de cellules bleues / Nombre de cellules totales)] x 100- Calculer le nombre total de cellules viables en utilisant la formule suivante:
des cellules viables de cellules viables =% x facteur de dilution x 10 000 x volume total de la suspension cellulaire
- Calculer le nombre total de cellules viables en utilisant la formule suivante:
- Seed 3 x 10 4 cellules par puits sur une plaque de 24 puits avec préalablement préparé collagène bovin solution fibronectine lamelle.
- 1 h avant l'étalement MEF, préparer une plaque de 24 puits pour immunocytochimie.
- Transduction et la reprogrammation de MEFs
NOTE: Selon les notes du fabricant, bien entretenu cellules Plat-E produisent un titre moyen de 1 x 10 7 unités d'infection / mL. Bien que le titre ne soit pas directement mesurée pour chaque expérience, un témoin GFP est toujours inclus en tant que substitut pour l'efficacité de l'infection.Une expression élevée de la GFP et de l' intensité (GFP +> 95%) corrélé avec succès de la production d'GHMT à médiation iCLMs.- Jour 0: 24 h post-transfection, filtrer le milieu rétroviral de PE par un pm à pores de taille cellulose filtre d'acétate 0,45 sans tensioactif et transférer dans un tube de 15 ml conique. Ajouter du polybrène à une concentration finale de 8 pg / ml. reconstituer soigneusement les cellules avec 2 ml de milieu de transfection frais.
NOTE: Les cellules se détachent facilement de la plaque si le support est changé trop rapidement. - Aspirer le milieu des MEFs cultivées et ajoutez le moyen rétroviral fraîchement prélevé; il devrait donner 1,7 mL de milieu par puits d'une plaque à 6 puits. Ajouter ~ 800 ul par puits d'une plaque de 24 puits. Retour plaque MEF à l'incubateur et incuber pendant la nuit.
- Jour 1: Répétez les étapes 2.4.1 et 2.4.2. Jeter les cellules après la collection de virus 2 ème. Retour MEFs infectés à l'incubateur et laisser reposer toute la nuit.
- Jour 2: 48 h après l'induction, aspirez la cellule conditionné médias et lavage x1 avec PBS 1x. Ajouter 500 ul préchauffé médias ICLM par puits d'une plaque de 24 puits.
- Remplacer les médias ICLM tous les 2 - 3 jours. Plaque de 14 jours après l'induction virale pour immunocytochimie (ICC) analyse de reprogrammation cardiaque.
- Jour 0: 24 h post-transfection, filtrer le milieu rétroviral de PE par un pm à pores de taille cellulose filtre d'acétate 0,45 sans tensioactif et transférer dans un tube de 15 ml conique. Ajouter du polybrène à une concentration finale de 8 pg / ml. reconstituer soigneusement les cellules avec 2 ml de milieu de transfection frais.
3. Immunomarquage de MEFs reprogrammée
- 14 jours après l'induction, aspirer soigneusement les médias.
- Rincer chaque puits avec 300 pi de glace-froid 1x PBS. Aspirer l'excès de solution.
- Fixer les cellules avec 250 pi de paraformaldehyde (PFA) solution à 4% par puits d'une plaque de 24 puits. Incuber 15 min à température ambiante.
NOTE: les cellules fixes peuvent être stockés dans du PBS à 4 ° C pendant 1 - 2 semaines avant la coloration. - cellules perméabiliser par puits de lavage x3 avec 300 ul de 0,1% PBS-Triton 100 (PBST). Incuber 5 min à température ambiante entre les lavages. Aspirer l'excès de solution après le dernier lavage.
- Bloc 10min à température ambiante avec 1x tampon Bloc universel à 300 pl / puits.
- Préparer (CPI) tampon de coloration: Ajouter 1: 1 de PBS 1x et 1x Universal tampon de blocage. Diluer anticorps primaires dans un tampon de coloration de la CPI et incuber des anticorps nuit à 4 ° C. Reportez-vous à la section matériel pour les dilutions recommandées.
- Colorer une paire de diapositives avec α-actinine souris, αGFP de poulet et de lapin NPPA pour iPM et identification iAM.
- Colorer une paire de diapositives avec la souris α-actinine, αGFP de poulet et de lapin Myl2 pour LID et GIV identification.
- Le lendemain, lavez les puits x3 avec 300 ul de 0,1% PBST. Incuber 5 min à température ambiante entre les lavages. Aspirer l'excès de solution après le dernier lavage.
- Préparer les dilutions d'anticorps secondaires dans un tampon ICC de coloration. Reportez-vous à la section matériel pour les dilutions recommandées. Incuber Anticorps secondaires 1 h à température ambiante, à l'abri de la lumière.
- Colorer toutes les diapositives avec le antibodie secondaire suivants: la souris Alexa-555, poulet Alexa-488, et le lapin Alexa-647.
- Laver les puits x3 avec 300 ul de 0,1% PBST. Incuber 5 min à température ambiante entre les lavages. Protéger de la lumière.
- Ajouter 2,4 ul de milieu de montage contenant 1,5 pg / ml de 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) sur une lame de microscope en verre. Retirez délicatement la lamelle du puits de la plaque de 24 puits, enlever l'excès de solution, et transfert à la lame de verre avec les médias de montage. Appuyez doucement sur la lamelle pour enlever un excès de volume et de l'air.
- diapositives Seal avec vernis à ongles préféré ou d'étanchéité en plastique. Magasin diapositives montées à 4 ° C à l'abri de la lumière.
4. Identification des cardiaques sous-types utilisant la microscopie confocale
NOTE: Pour l'imagerie, un microscope confocal équipé d'au moins 2 détecteurs fluorescents capables de détection spectrale à 405, 488, 555, et 639 longueurs d'onde nm est nécessaire afin d'identifier IPMS, Iams et MVI. Imagcellules e en utilisant un objectif Plan-Apochromat 20X / 0,75 ou mieux. En utilisant le logiciel d'analyse d'image du fabricant, la numérisation des images de zoom peut atteindre 40X-huile des images de qualité d'immersion.
- Bibliothèque d'images: prendre des images de 8 bits avec DAPI, Alexa-488, Alexa-555 et Alexa-647 canaux (ch.). Pixel temps de séjour de 6 s, 1024 taille de l'image, l'étape de ligne à 2, et une moyenne de 2 est suffisante pour des images haute résolution.
- Pour chaque diapositive, démarrer à partir d' un bord et commencer à numériser haut et en bas dans le canal rouge fluorescent (ch.) Pour α-actinine + Sarcomère cellules + (Reportez - vous à la figure 3 et la figure 5A pour des exemples). striures Sarcomère sont plus faciles à identifier visuellement la longueur d'onde de 555 nm.
- Une fois qu'une α-actinine + cellule Sarcomère + a été identifié, passer à la ch vert. et de garder la note si elle est positive (LAI). Basculer vers l'ordinateur pour évaluer le bien-rouge 647 ch. (IAM ou iVM).
NOTE: Les cellules qui sontα-actinine + / Sarcomère + / Hnc4-GFP + / NPPA - / Myl2 - sont désignés comme IPMS. L' expression de GFP sera vu dans toute la cellule (figure 4A). - diapositives Stain avec α-actinine (souris-Alexa555), HCN4-GFP (poulet-Alexa488), NPPA (lapin-Alexa647) et DAPI. Les cellules qui sont α-actinine + / Sarcomère + / Hnc4-GFP - / NPPA + sont iAM. NPPA coloration apparaît périnucléaire et punctiformes (figure 4B).
- diapositives Stain avec α-actinine (souris-Alexa555), HCN4-GFP (poulet-Alexa488), Myl2 (lapin-Alexa647). Les cellules positives pour α-actinine + / Sarcomère + / Hnc4-GFP - / Myl2 + sont MVI. Myl2 coloration présentera une forme striée le long du filament de sarcomère. En raison des variations dans la qualité de la coloration et le plan Z, striations ne peuvent pas toujours être facilement visibles (figure 4C).
- Une fois qu'une α-actinine + cellule Sarcomère + a été identifié, passer à la ch vert. et de garder la note si elle est positive (LAI). Basculer vers l'ordinateur pour évaluer le bien-rouge 647 ch. (IAM ou iVM).
NOTE: Afin d'évaluer le nombre réel de MEFs potentiellement reprogrammées, 2 puits d'une plaque de 24 puits sont ensemencées en parallèle aux puits expérimentaux et sont récoltés un jour après placage. Le nombre total de cellules ensemencées est alors déterminée en calculant la moyenne des deux puits. Cela devient les cellules totales réelles plaquées (Un total).
- Sarcomère +
- Inspecter visuellement chaque cellule sur une lamelle pour le bon α-actinine + / Sarcomère + (panneaux de droite Figure 3) et enregistrer (figure 5B-i).
- Tabulez le nombre total d'α-actinine + / Sarcomère + sur chaque lamelle et diviser par les cellules totales réelles plaquées ( Un total) (figure 5B-iii). Par exemple, si = 12.500 cellules Un total et 100 cellules ont été a-Actinin + / Sarcomère + puis, 0,8% des MEFs plaqués ont été reprogrammée. Une moyenneexpérience reprogrammant donnera 1% a-actinine + / Sarcomère + cellules (Figure 5C).
- Sous +
NOTE: Pour les étapes suivantes, reportez - vous à la figure 5B / C pour une ICLM quantification représentant workflow. En bref, pour chaque sarcomère + cellule, tabuler si elle est unique pour les deux sous - type (figure 5B-i). Calculer% Subtype (figure 5B-iii) en divisant le nombre de sous - type + cellules sur sarcomère moyenne + cellules x 100 (figure 5B-i). Pour calculer l'efficacité absolue% du sous - type (figure 5B-iv), diviser le nombre de sous - type + cellule à partir de la figure 5B-i par le nombre total de cellules ensemencées x 100 (figure 5B-ii).- Pour chacun des α-actinine cellules + / Sarcomère +, d' évaluer si elles sont GFP +, NPPA + ou Myl2
- Tabulez nombre total d'α-actinine + / Sarcomère + / Hnc4-GFP + / NPPA - / Myl2 -, actinin + / Sarcomère + / Hnc4-GFP - / NPPA + et α-actinine + / Sarcomère + / Hnc4-GFP - / + Myl2 cellules (figure 5B-I).
- Pour calculer le pourcentage de chaque sous - type, il faut diviser le nombre de sous - type + cellules par le nombre total d'α-actinine + / Sarcomère + cellules dans ce puits et multiplier par 100. GHMT génère IPMS, Iams et iVMS ratios à peu près égales (Figure 5B-iii).
- Pour calculer le nombre absolu de sous - type + cellules, diviser le nombre total de sous - type + cellules pour la condition expérimentale par Un total et multiplier par 100 (figure 5B-ii). Sur IPMS moyenne représentent 0,3% de la population totale de cellules infectées, Iams 0,3%, etiVMS 0,25% (figure 5B-iv).
- Pour chacun des α-actinine cellules + / Sarcomère +, d' évaluer si elles sont GFP +, NPPA + ou Myl2
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Profitant de la souris reporter PM-spécifique, nous avons développé une stratégie d'immunocoloration multiplex pour identifier divers myocytes endogènes comme le montre la figure 1. Après les étapes de reprogrammation de la figure 2, l' induction de CMs spécifiques du sous-type peut être détectée dès le jour 4 21, mais à un faible taux. Au jour 14, l'expérience peut être arrêté et évalué pour l' organisation sarcomère (Figure 3) et le sous - spécification (Figure 4). La figure 5 résume le flux de travail de préparation des lames pour la CPI (Figure 5 Panel A), et la quantification des ICLM cellules spécifiques du sous-type (Figure 5 Panneau B / C).
Figure 1: Sous la diversité des EndogèneCardiomyocytes. (AB) immunocytochimie (ICC) coloration des cardiomyocytes auriculaires néonatales de HCN4-GFP souris rapporteurs pour α-actinine (sarcomère marqueur, rouge), HCN4-GFP (PM marqueur, vert), et NPPA (marqueur auriculaire, orange). (C) Immunocytochimie coloration des néonatales cardiomyocytes ventriculaires de HCN4-GFP souris rapporteurs pour α-actinine (sarcomère marqueur, rouge), HCN4-GFP (PM marqueur, vert), et Myl2 (marqueur ventriculaire, orange). DAPI (bleu): coloration nucléaire. Barres d'échelle: 20 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Tableau 1: Milieu de culture. Résumé de la table pour la préparation des différents médiums utilisés lors de la reprogrammation GHMT-induite. Tableau 2: Ensemencement, Transfection et Formats induction.(A) Résumé de la table pour le placage et la transfection de cellules. (B) la densité de semis et d' infection approximative des unités (ou surnageant viral) nécessaires pour induire MEFs dans des cellules analogues à des cardiomyocytes. 
Figure 2: Reprogrammation Chronologie schématique. Représentation schématique des GHMT-induites MEFs HCN4-GFP. Les trois grandes étapes sont représentées. 
Figure 3: degré d'organisation Sarcomère. CPI coloration de HCN4-GFP MEFs 14 jours après GHMT transduction pour α-actinine (marqueur de sarcomère, rouge) montre un large éventail d'organisation sarcomère. Le degré d'organisation augmente de gauche à droite des panneaux. images représentatives de chaque niveau (n = 3). Barre d'échelle: 20 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. 
Figure 4: Sous-spécifique Cardiomyo reprogrammé cytes. (AC) ICC coloration des GHMT-transduction HCN4-GFP MEFs pour α-actinine (marqueur de sarcomère, rouge), HCN4-GFP (PM marqueur, vert), NPPA (marqueur auriculaire, orange), ou Myl2 (marqueur ventriculaire, orange) . DAPI (bleu): coloration nucléaire. Barres d'échelle: 20 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. 
Figure 5: Acquisition et analyse de workflow Image. Représentation schématique pour l'analyse d'image. Le panneau A représente l'ordre de priorité d'attribution sarcomère + et du sous-type de spécificité à une cellule. Groupe B (i-iv) et C montrent les résultats attendus d'une expérience moyenne GHMT-ICLM. Les points clés et les formules sont indiquées en vert.om / files / ftp_upload / 55456 / 55456fig5large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. médias ICLM Composant Volume (ml) La concentration finale DMEM 270 Medium 199 90 FBS 50 dix% Insulin-transferrine-Sélénium G 2.5 0,50% solution de vitamines MEM dix 2% MEM acides aminés 20 4% acides aminés non essentiels dix 2% Antibiotic-Antimycosiques dix 2% B-27 supplément dix 2% De sérum de cheval inactivé à la chaleur 25 5% Pyruvate de Na 2.5 1,5 mM Plat-E médias (PE) Composant Volume (ml) La concentration finale DMEM 450 FBS 50 dix% Pénicilline / Streptomycine 5 1% Puromycin 0,05 1 pg / ml Blasticidin 0,5 10 pg / ml Milieu de fibroblaste (FB) Composant0; Volume (ml) La concentration finale DMEM 450 FBS 50 dix% Pénicilline / Streptomycine 5 1% Glutamax 5 1% Milieu de transfection (TxF) - Filtré (0,45 pm) Composant Volume (ml) La concentration finale DMEM 450 FBS 50 dix% Immunocytochimie (CPI) tampon de coloration Composant Volume (ml) La concentration finale PBS 1x 5 un tampon de blocage 1x Universal 5 A) l' ensemencement cellulaire et transfection Assiette Surface (cm 2) La densité de semis (cellules) Le milieu de croissance (ml) Montant total de l' ADN à transfecter (pg) Le réactif de transfection (pi) Réduction des taux sériques des médias (pi) 15 cm plaque 152 1.00E + 06 20 25 75 600 10 cm plaque 55 5.50E + 06 dix 9 27 300 6 cm plaque 21 2.20E + 06 4 3.5 10.5 105 6 puits / x1 9 1.00E + 06 2 2 6 60 12 puits / x1 4 4.00E + 05 1 0,5 1.5 15 24 puits / x1 2 2.00E + 05 0,5 0,3 0,9 9 48 puits / x1 1 1.70E + 05 0,25 0,15 0,45 4.5 B) Fibroblast ensemencement et induction Assiette Densité d'ensemencement des fibroblastes ( en millions) Unités d'infection approximatives pour ICLM 6 cm plaque 0,22 à 0,33 5,00E + 7 (~ 5 ml) 6 puits / x1 0,1-0,15 3.00E + 7 (~ 3 ml) 12 puits / x1 0,04-0,06 1.30E + 7 (~ 1 ml) 24 puits / x1 0,02-0,03 6.50E + 6 (~ 0,8 ml) 48 bien 0,001 à 0,015 3.00E + 6 (~ 0,4 ml)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La présente étude fournit une stratégie directe reprogrammation pour la conversion de MEFs dans un ensemble diversifié de sous-types cardiaques via l'expression de retrovirus de la transcription cardiaque Facteurs Gata4, MEF2C, Tbx5 et Hand2 (GHMT). En utilisant une approche d'immunocoloration multiplex en combinaison avec une souris reporter PM-spécifique, nous sommes en mesure d'identifier iAM, IVM, et IPMS à la résolution d'une seule cellule. Un tel essai permet une expérimentation dans le système in vitro capable d'isoler les contributions des facteurs de transcription individuels vers la diversité de sous - type et le développement de sarcomère. En parallèle, cela pourrait apporter un aperçu de nouveaux facteurs de transcription ou de petites molécules qui biaisent iCLMs vers une lignée particulière. Néanmoins, il y a plusieurs étapes cruciales pour la réussite de ce test. Ci-dessous, nous examinons l'impact du titre viral, la qualité des fibroblastes, et l'analyse de l'imagerie dans une expérience de ICLM générale.
Dans notre étude, nous employ écotropes-retrovirus de reprogrammer MEFs de E12.5. Nous avons remarqué que le titre retroviral est directement liée à la qualité des cellules. nombre élevé de passage (> 35) et des techniques de culture pauvres affectent gravement la qualité des particules rétrovirales; par conséquent, il y a plusieurs considérations à garder à l'esprit. Cellules Plat-E ne produisent pas de VSV-G virus pseudotypé, et sont donc incapables de résister à ultracentrifugation ou cycles de congélation 24, 25. Afin de préserver la longévité des cellules, il est impératif de maintenir le stock avec la sélection antibiotique. Cependant, ils doivent être maintenus dans des milieux sans antibiotiques pendant la production virale. Dans notre expérience, le réactif de transfection utilisé ici fournit les rendements les plus élevés de transfection dans les cellules. Si d' autres méthodes de transfection sont utilisés, en comparant les titres viraux obtenus 26 est essentiel. Bien qu'il y ait des recommandations par le fabricant à la récoltele surnageant viral 48 h après la transfection, on a observé que deux tours de 24 h récolte donnent de meilleurs rendements de reprogrammation tout en évitant les effets toxiques habituellement associés à une plus-titer préparations virales. En outre, bien que plusieurs études ont montré la faisabilité de concentrateurs surnageant viral commerciaux 27, on n'a pas utilisé ces derniers dans notre protocole régulière afin de maintenir un débit plus élevé.
En plus de titre élevé cocktails virales, la qualité de fibroblaste est d' une importance cruciale pour un dosage de reprogrammation réussie 28. Si bon moment, MEFs fraîchement isolés doivent être utilisés en raison de leurs rendements plus élevés par rapport aux stocks congelés. Cela pourrait être lié à la nature des retrovirus, car elles ont besoin d' un hôte hautement prolifératifs afin d'intégrer 29. En outre, la densité d'ensemencement MEF joue un rôle crucial. Nous avons inclus une table avec les densités de semis employésdans nos expériences (tableau 2). En outre, les repiquage MEF diminuera également de manière significative l'efficacité de reprogrammation.
Immunocytochimie (ICC) est notre technique standard pour l'analyse de l'organisation du sarcomère et la spécification de sous-type. Avec l'aide d'un journaliste souris PM-GFP, nous avons pu former un panel d'anticorps pour la détection de trois sous-types cardiaques majeurs (AM, VM, et PM). Cependant, en raison de contraintes d'anticorps disponibilité des espèces et la limitation de 4 canaux sur un microscope confocal set-up standard, deux lamelles par sous-type sont nécessaires pour quantifier la prévalence de tous les trois sous-types. Une lamelle tache pour α-Actinin / GFP (HCN4) / Myl2, et un pour les α-Actinin / GFP (HCN4) / NPPA. Sur la base de notre précédente observation que la structure sarcomère est une caractéristique commune de tous les GC et une condition préalable potentiel pour la spécification de sous - type 21, la première étape de notre analyse consiste à déterminer sarcomère +cellules. Pourtant, en raison de sa nature subjective, établissant le niveau d'organisation de sarcomère est peut-être la partie la plus difficile de ce test; cela peut être limitée par la moyenne des quantifications de multiples observateurs ou en développant des logiciels de segmentation de la cellule de calcul pour automatiser le processus 30. En utilisant des cellules endogènes comme un point de référence, nous avons découvert un seuil pour bien organisé sarcomère + et utilisé que pour marquer iCLMs (figure 3). Compte tenu de ces paramètres, une expérience moyenne donnera lieu à 20 - 30% Actinin cellules a + mais seulement 1% sont a-Actinin + / Sarcomère +. Des cellules de sarcomères + 1%, ~ 30% sera NPPA + Myl2 + ou HCN4-GFP +.
Étant donné que les cardiomyocytes sont structurellement complexes, l' expression génique basée sur la population (par exemple qRT-PCR) ou de cytométrie de flux analyses ne peuvent pas capturer le ch morphologique complexeanges qui se produisent pendant ICLM reprogrammation. En revanche, patch clamp et imagerie calcique transitoire sont des tests fonctionnels unicellulaires très strictes, mais les compétences et les équipements spécialisés sont nécessaires pour mener ces expériences. Ainsi, la méthodologie décrite est unique en ce qu'elle offre une approche simple pour étudier les paramètres structurels et fonctionnels clés de ICLM reprogrammation sans compromettre considérablement le débit.
Malgré les nombreux progrès récents dans la reprogrammation directe, beaucoup de travail reste à faire pour mieux comprendre les mécanismes moléculaires qui régule la reprogrammation cardiaque, et plus précisément, la spécification du sous-type. Ces mécanismes seront particulièrement importants pour traduire la reprogrammation directe pour les applications cliniques. En tant que tel, dans cette étude, nous décrivons une plate-forme capable de moduler directement les paramètres discrets pour évaluer la contribution au développement de sarcomère, spécification de sous-type et ICLM maturité. Moreover, ce système peut être développé pour travailler dans un format à haut débit permettant le dépistage complexe de petites molécules ou des matrices extracellulaires pour la prochaine étape en cardiologie régénérative.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma | D5796 | Component of iCLM media, Plat-E media, fibroblast, and Transfection media |
| Medium 199 | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | Component of iCLM media |
| Fetal bovine serrum (FBS) | Sigma | F2442 | Component of iCLM media, Plat-E media, fibroblast, and Transfection media |
| Insulin-Transferrin-Selenium G | Thermo Fisher Scientific | 41400-045 | Component of iCLM media |
| MEM vitamin solution | Thermo Fisher Scientific | 11120-052 | Component of iCLM media |
| MEM amino acids | Thermo Fisher Scientific | 1601149 | Component of iCLM media |
| Non-Essential amino acids | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | Component of iCLM media |
| Antibiotic-Antimycotics | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Component of iCLM media |
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | Component of iCLM media |
| Heat-Inactivated Horse Serum | Thermo Fisher Scientific | 26050-088 | Component of iCLM media |
| NaPyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360-70 | Component of iCLM media |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 1514022 | Component of Plat-E media and fibroblast media |
| Puromycin | Thermo Fisher Scientific | A11139-03 | Component of Plat-E media |
| Blasticidin | Gemini Bio-Products | 400-128P | Component of Plat-E media |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | Component of Fibroblast media |
| Confocal laser scanning LSM700 | Zeiss | For confocal analysis | |
| FuGENE 6 transfection Reagent | Promega | E2692 | Transfection reagent |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985-070 | Transfection reagent |
| Polybrene | Millipore | TR-1003-G | Induction reagent. Use at a final concentration of 8 μM/mL |
| Platinium-E (PE) Retroviral Packagin Cell Line, Ecotropic | CellBiolabs | RV-101 | Retroviral pacaking cell line |
| Trypsin 0.25% EDTA | Thermo Fisher Scientific | For MEFs and Plat-E dissociation | |
| Mouse anti α-Actinin (Clone EA-53) | Sigma | A7811 | Antibody for confocal analysis. Use at 1:200 |
| Chicken anti-GFP IgY | Thermo Fisher Scientific | A10262 | Antibody for confocal analysis. Use at 1:200 |
| Rabbit Pab anti-NPPA | Abgent | AP8534A | Antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Rabbit Pab anti Myl2 IgG | ProteinTech | 10906-1-AP | Antibody for confocal analysis. Use at 1:200 |
| Vectashield solution with DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Vector Labs | H-1500 | Dye for confocal analysis |
| Superfrost Plus Microscope slides | Thermo Fisher Scientific | 12-550-15 | 25 x 75 x 1.0 mm |
| BioCoat Fibronectin 12 mm coverslips | NeuVitro Corp | GG-12-1.5 | Coverslips for confocal analysis |
| 100 μm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| 0.45 μm Syringes filters SFCA 25MM | Thermo Fisher Scientific | 09-740-106 | For virus filtration |
| 6 mL Syringes | Covidien | 8881516937 | For virus filtration |
| Goat anti-Chicken IgY (H&L) A488 | Abcam | AB150169 | Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Donkey anti-rabbit A647 IgG(H+L) | Thermo Fisher Scientific | A31573 | Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Goat anti-mouse IgG(H+L) A555 | Thermo Fisher Scientific | A21422 | Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Triton X-100 | Sigma | 93443-100ml | For cell permeabilization |
| Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS) | Sigma | D8537 | |
| Power Block 10x Universal Blocking reagent | Thermo Fisher Scientific | NC9495720 | Dilute to 1x in H2O |
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution (PFA) | Electro Microscopy Sciences | 15710 | Use at 4% diluted in dH2O |
| 6 cm plates | Olympus | 25-260 | |
| 6-well plates | Genesee Scientific | 25-105 | |
| 24-well plates | Genesee Scientific | 25-107 | |
| 10 cm Tissue culture dishes | Corning | 4239 | |
| 15 cm Tissue culture dishes | Thermo Fisher Scientific | 5442 | |
| 15 mL Conical tubes | Corning | 4308 | |
| 50 mL Conical tubes | Corning | 4249 | |
| 0.4% Trypan blue solution | Sigma | T8154 | For viability |
| Ethyl Alcohol 200 proof | Thermo Fisher Scientific | 7005 | |
| Bleach | Thermo Fisher Scientific | 6009 |
References
- Sissman, N. J. Developmental landmarks in cardiac morphogenesis: comparative chronology. Am J Cardiol. 25 (2), 141-148 (1970).
- Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nat Rev Genet. 6 (11), 826-835 (2005).
- Ali, S. R., et al. Existing cardiomyocytes generate cardiomyocytes at a low rate after birth in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (24), 8850-8855 (2014).
- Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
- Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493 (7432), 433-436 (2013).
- Lin, Z., Pu, W. T. Strategies for cardiac regeneration and repair. Sci Transl Med. 6 (239), 239rv231 (2014).
- Writing Group, M., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), e38-e360 (2016).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
- Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485 (7400), 593-598 (2012).
- Fu, J. D., et al. Direct reprogramming of human fibroblasts toward a cardiomyocyte-like state. Stem Cell Reports. 1 (3), 235-247 (2013).
- Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Akt1/protein kinase B enhances transcriptional reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (38), 11864-11869 (2015).
- Zhou, Y., et al. Bmi1 Is a Key Epigenetic Barrier to Direct Cardiac Reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 382-395 (2016).
- Zhao, Y., et al. High-efficiency reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes requires suppression of pro-fibrotic signalling. Nat Commun. 6, 8243 (2015).
- Miki, K., Yoshida, Y., Yamanaka, S. Making steady progress on direct cardiac reprogramming toward clinical application. Circ Res. 113 (1), 13-15 (2013).
- Atkinson, A., et al. Anatomical and molecular mapping of the left and right ventricular His-Purkinje conduction networks. J Mol Cell Cardiol. 51 (5), 689-701 (2011).
- Bootman, M. D., Smyrnias, I., Thul, R., Coombes, S., Roderick, H. L.
- Miquerol, L., Beyer, S., Kelly, R. G. Establishment of the mouse ventricular conduction system. Cardiovasc Res. 91 (2), 232-242 (2011).
- Später, D., Hansson, E. M., Zangi, L., Chien, K. R. How to make a cardiomyocyte. Development. 141 (23), 4418-4431 (2014).
- Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).
- Conner, D. A. Current Protocols in Molecular Biology. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), (2012).
- Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (17), 8033-8037 (1993).
- Ichim, C. V., Wells, R. A. Generation of high-titer viral preparations by concentration using successive rounds of ultracentrifugation. J Transl Med. 9, 137 (2011).
- Qian, L., Berry, E. C., Fu, J. D., Ieda, M., Srivastava, D. Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro. Nat Protoc. 8 (6), 1204-1215 (2013).
- Yang, R., et al. Direct conversion of mouse and human fibroblasts to functional melanocytes by defined factors. Nat Commun. 5, 5807 (2014).
- Muraoka, N., Ieda, M. Direct reprogramming of fibroblasts into myocytes to reverse fibrosis. Annu Rev Physiol. 76, 21-37 (2014).
- Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. Retroviruses. Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. , (1997).
- Bass, G. T., et al. Automated image analysis identifies signaling pathways regulating distinct signatures of cardiac myocyte hypertrophy. J Mol Cell Cardiol. 52 (5), 923-930 (2012).
