Introduction
Hjertet er den første funktionelle organ til at udvikle i embryonet 1, 2. I forbindelse med kredsløbssystemet, det leverer ilt, næringsstoffer, og en mekanisme affaldsbortskaffelse under udviklingen. Tre uger efter befrugtningen, det menneskelige hjerte slår for første gang og den korrekte regulering vedligeholdes af cardiomyocytter (CMS). Den uoprettelige tab af disse specialiserede celler er derfor det grundlæggende spørgsmål bag progressiv hjerteinsufficiens. Mens nogle organismer såsom zebrafisk og Xenopus har potentiale for hjerte- regenerering, det voksne mammale hjerte er mere begrænset 3, 5, 6. I betragtning af den kritiske funktion af hjertet, er således ikke overraskende, at hjertesygdom er den hyppigste årsag til dødsfald i verden, og at 600.000 dødsfald i USA alene 7. DetDerfor indgår, cellebaserede behandlingsformer til effektivt reparere eller erstatte den skadede myokardiet er af stor klinisk interesse.
Den skelsættende undersøgelse af Yamanaka og kolleger 8 viste, at tvungen ekspression af fire transkriptionsfaktorer er tilstrækkelig til at omdanne fuldstændigt differentierede fibroblastceller pluripotente stamceller. Imidlertid har den tumorigen kapacitet for alle pluripotente stamceller strategier været et kritisk problem i deres anvendelse til terapeutiske formål. Dette motiverede det videnskabelige område for at søge efter alternative metoder til at transdifferentiate celler samtidig undgå en pluripotent stadie. For nylig har flere grupper vist muligheden for denne strategi ved at vise direkte omdannelse af musefibroblaster til inducerede cardiomyocyte-lignende celler (iCLMs) med ektopisk udtryk for transskription faktorer Gata4, Mef2c, Tbx5, og senere, Hand2 (GMT og GHMT henholdsvis) 9, 10. Furthermore, kan den samme strategi udføres in vivo og in human-afledte væv 9, 11, 12. Nylige undersøgelser har peget yderligere faktorer eller signalveje, som kan moduleres til yderligere at forbedre hjertefunktionen omprogrammering effektivitet 13, 14, 15. Tilsammen disse undersøgelser viser potentialet i dirigeret transdifferentiering for regenerative behandlinger. Men den lave effektivitet CM omprogrammering, de ukendte molekylære mekanismer, inkonsekvent reproducerbarhed på grund af metodologiske forskelle 16, og den heterogene karakter af iCLMs forblive adresseløse.
For at direkte evaluere iCLM heterogenitet, vi designet en diskret og robust single-celleassay til identifikation af sarkomeret udvikling og kardial afstamning specification-to nødvendige karakteristika funktionelle cardiomyocytter. Der er mindst tre hovedtyper af CM i hjertet som defineret ved deres placering og unikke elektriske egenskaber: atrial (AM), ventrikulær (VM) og pacemaker (PM) 17, 18, 19, 20. I en organiseret kombination, de tillader en korrekt pumpning af blod. Under hjerte skade, måske en eller alle undertyper blive berørt, og typen af celleterapi vil skulle løses fra sag til sag. I øjeblikket er de fleste strategier fokuserer på den samlede generation af cardiomyocytter, mens lidt arbejde der gøres for at studere de molekylære mekanismer, der regulerer undertype specifikation.
Den følgende undersøgelse beskriver, hvordan man korrekt kvantificere velorganiserede sarkomerer og identificere et bredt sæt af cardiomyocyte undertyper. Ved hjælp af en pacemaker (PM) -specifik reporter mus, er vi i stand til at anvende en immunocytochemical tilgang til at skelne inducerede atrial-lignende myocytter (IAM), inducerede ventrikulære-lignende myocytter (IVM) og inducerede PM-lignende myocytter (IPMS) 21. Baseret på vores observationer, kun celler, der udviser sarkomer organisation er i stand til spontant bankende. Denne unikke omprogrammering platform giver mulighed for at vurdere, hvilken rolle af visse parametre i sarkomeret organisation, undertype specifikation, og effektiviteten af CM omprogrammering på encellede opløsning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle procedurer, der involverer dyr praksis blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg på UT Southwestern Medical Center.
1. Isolering af Hcn4-GFP E12.5 mus embryonale fibroblast (MEF)
- Opsæt timede parringer mellem homozygote Hcn4-GFP hanner og CD-1 hunner.
- Sacrifice gravid kvinde på E12.5 ved kuldioxid eutanasi og efterfølgende cervikal dislokation.
- Fjern uterine horn med dissekere pincet som tidligere beskrevet 22, 23, og placere dem i en petriskål på is med 1x phosphatpufret saltvand (PBS) uden Ca2 + eller Mg2 +.
- Udføre alle efterfølgende trin i vævskultur hætte under anvendelse af steril teknik.
- Fjern embryoner fra livmoderen og fosterhinden med saks og dissekere pincet. Hold moderkagen vedlægges til bedre håndtering. pregnant CD-1 hunner typisk føder mellem 10 og 14 unger.
- Ved hjælp af dissekere pincet, tage de isolerede embryoner og hurtigt skyl dem to gange i 70% (v / v) EtOH.
BEMÆRK: De vasker skal være hurtigt for at minimere celledød. - Fjern hoved, lemmer, hale, og indre organer, herunder hjertet fra de isolerede embryoer.
- Anbring resterende væv i 10 cm skål med 1 ml 1x PBS og fint hakkekød anvendelse af en steril barberblad til ca. 1 mm3 i størrelse.
- Overfør hakket væv i en 50 ml konisk rør med PBS.
- Spin ved 300 xg i 3 min. aspirere omhyggeligt overskydende PBS.
- Tilsæt 1 ml sterilt 0,25% trypsin-EDTA pr embryo. Cellerne inkuberes i et 37 ° C vandbad i 15 min. Bland forsigtigt røret hver 4 min. Over-fordøjelse af væv i betydelig grad vil sænke udbyttet.
- blanding Vortex celle ved maksimal hastighed (3200 rpm) i 4 s.
- Tilsæt 2 ml af fibroblast medier pr foster og blandes. Filter through en 100 um cellefilter anvendelse af en pipette til at støtte cellerne gennem sien. Se Tabel 1 for formuleringen af alle efterfølgende medier.
- Spin ved 300 xg i 4 min. aspirere omhyggeligt supernatant.
- Tilsæt 10 ml frisk fibroblast medier pr 3 embryoner og udriv 6-10 gange.
- Plate cellerne i en 15-cm vævskulturskål for hver 3 embryoner forberedt. Kultur natten over i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator.
- Efter inkubation natten over, erstatte medierne med friske 30 ml medier per plade. Placer celler tilbage i inkubatoren natten over.
BEMÆRK: Kontroller for Hcn4-GFP + forurening celle under en fluorescerende mikroskop. Kulturen skal være GFP - og kun bliver GFP + ved omprogrammering. - Den næste dag, høst celler med 3 ml frisk forvarmet 0,25% trypsin-EDTA. Tæl og fryse cellerne. Typisk fryse cellerne ved 3 x 10 6 celler pr ml. Den forventede Yield skal være 3 x 10 6 celler pr embryo.
2. Retrovirus Produktion og Omprogrammering
Advarsel: Følgende protokol kræver produktion og håndtering af infektiøse retrovirus. Udfør følgende trin i en biosikkerhedsniveau 2 skab under BSL-2 retningslinjer og steril teknik. Brug 10% blegemiddel til at disponere over alle materialer udsat for retrovirus.
- Retrovirus produktion og MEF forberedelse
BEMÆRK: Følgende protokol er for retroviral produktion i 6-brønds plader og MEF infektion i 24-brønds plader. For andre formater, se tabel 2. MEF belagt på dag -1, så timingen skal koordineres hensigtsmæssigt for hvert forsøg (Se afsnit 2.3 og figur 2).- Vedligehold Plat-E (PE) celler som pr fabrikantens anbefalinger. Kort beskrevet kultur PE-celler i DMEM suppleret med 10% FBS, 1 ug / ml puromycin, 10 ug / ml blasticidin, penicillin og streptomycin. Passage celler 1: 4 hver to dage, når kulturen når 70-90% sammenflydning.
- Dag -2: Dagen før transfektion, frø Plat-E-celler ved 1 x 10 6 celler / brønd på en 6-brønds plade i transfektion medier. Celler bør være 70-80% konfluente på tidspunktet for transfektion.
- Transfektion ved anvendelse af en kommerciel transfektion middel.
BEMÆRK: De kommercielle reagenser skal have stuetemperatur (RT) før transfektion. For DNA-transfektion, tilføje hver retroviralt plasmid-DNA individuelt (G, H, M og T) for at danne en GHMT cocktail 9.- Dag -1: I en 15 ml konisk polystyrenrør, bland 60 pi af reducerede serum medier med 6 pi transfektionsreagens pr reaktion for en 6-brønds pladeformat. Inkuber blandingen i 5 minutter ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Da transfektion reagens, der anvendes her binder til plast, enDd direkte til den reducerede serum medier for at undgå enhver nedgang i transfektionseffektiviteten. - Tilføj alt 2 ug GHMT cocktail pr reaktion og forsigtigt trykke for at blande det. Undlad at slynge. Inkubér reaktionen i 15 minutter ved stuetemperatur.
- Tilsæt blandingen fra trin 2.2.3 til PE celler i en dråbevis måde.
- Inkuber de transficerede Plat-E-celler natten over i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator. Registrere tidspunktet for transfektion.
- Dag -1: I en 15 ml konisk polystyrenrør, bland 60 pi af reducerede serum medier med 6 pi transfektionsreagens pr reaktion for en 6-brønds pladeformat. Inkuber blandingen i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Podning af Hcn4-GFP muse embryonale fibroblaster.
- 1 time før udpladning MEF'er, fremstille en 24-brønds plade til immuncytokemi.
- Tilføj et 12 mm fibronectin dækglas per brønd.
- Coat brønde med 300 pi bovint collagen-opløsning (f.eks SureCoat) og inkuber i en 37 ° C inkubator i 1 time.
- Aspirer belægning opløsning umiddelbart før MEF plating.
- Optø et frosset hætteglas med Hcn4-GFP MEF'er og vask x1 med forvarmet fibroblast medier ved 500 xg i 5 min.
- Bestemme cellelevedygtighed under anvendelse trypanblå udelukkelse eller lignende farvestoffer. Beregne antallet af levedygtige celler pr ml kultur ved anvendelse af følgende formel:
% levedygtige celler = [1,00 - (antal blå celler / antal totale celler)] x 100- Beregne det samlede antal levedygtige celler ved anvendelse af følgende formel:
Levedygtige celler =% levedygtige celler x fortyndingsfaktor x 10.000 x totalvolumen cellesuspension
- Beregne det samlede antal levedygtige celler ved anvendelse af følgende formel:
- Seed 3 x 10 4 celler per brønd ned på en 24-brønds plade med tidligere fremstillet bovin collagen-opløsning-fibronectin dækglas.
- 1 time før udpladning MEF'er, fremstille en 24-brønds plade til immuncytokemi.
- Transduktion og omprogrammering af MEF
BEMÆRK: I henhold til producentens notater, ordentligt vedligeholdt Plat-E celler producerer en gennemsnitlig titer på 1 x 10 7 infektion enheder / ml. Selv titeren ikke direkte måles for hvert forsøg, er et GFP kontrol altid inkluderet som et surrogat for infektionseffektivitet.Høj GFP udtryk og intensitet (GFP +> 95%) typisk korrelerer med succes GHMT-medieret generation af iCLMs.- Dag 0: 24 h efter transfektion foretage PE retroviral medium gennem et 0,45 um-porestørrelse uden overfladeaktivt celluloseacetatfilter og overføres til en 15 ml konisk rør. Tilføj polybren til en slutkoncentration på 8 ug / ml. genopbygge omhyggeligt celler med 2 ml frisk transfektion medium.
BEMÆRK: Celler nemt løsnes fra pladen, hvis mediet ændres for hurtigt. - Aspirer mediet af de dyrkede MEF'er og tilsæt frisk indsamlet retroviral medium; Det bør give 1,7 ml medium per brønd af en 6-brønds plade. Tilføj ~ 800 pi pr brønd af en 24-brønds plade. Retur MEF plade til inkubatoren og inkuberes natten over.
- Dag 1: Gentag trin 2.4.1 og 2.4.2. Kassér celler efter den 2. virus kollektion. Retur inficerede MEF'er til inkubatoren, og lad dem hvile natten over.
- Dag 2: 48 timer efter induktion, aspireres cellen konditionerede medier og vask x1 med 1x PBS. Der tilsættes 500 pi forvarmet iCLM medier pr brønd af en 24 brønds plade.
- Udskift iCLM medier hver 2 - 3 dage. Proces plade 14 dage efter viral induktion for immuncytokemi (ICC) analyse af hjerte omprogrammering.
- Dag 0: 24 h efter transfektion foretage PE retroviral medium gennem et 0,45 um-porestørrelse uden overfladeaktivt celluloseacetatfilter og overføres til en 15 ml konisk rør. Tilføj polybren til en slutkoncentration på 8 ug / ml. genopbygge omhyggeligt celler med 2 ml frisk transfektion medium.
3. immunfarvning af omprogrammeret MEF
- 14-dage efter induktion, omhyggeligt aspireres medierne.
- Skyl hver brønd med 300 pi iskold 1x PBS. Aspirere overskydende opløsning.
- Fix celler med 250 pi af 4% paraformaldehyd (PFA) opløsning pr brønd af en 24 brønds plade. Inkuber 15 minutter ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Fast celler kan opbevares i PBS ved 4 ° C i 1 - 2 uger før farvning. - Permeabilisere celler ved vask brønde x3 med 300 pi 0,1% PBS-Triton® X 100 (PBST). Inkuber 5 min ved stuetemperatur mellem vaskene. Aspirere overskydende opløsning efter den sidste vask.
- Bloker for 10min ved stuetemperatur med 1 x Universal blokbuffer ved 300 pl / brønd.
- Forbered (ICC) farvning buffer: Tilsæt 1: 1 i 1x PBS og 1x Universal blokeringsbuffer. Fortynd primære antistoffer i ICC-farvning puffer og inkuberes antistoffer natten over ved 4 ° C. Se det materiale sektion for anbefalede fortyndinger.
- Farv et par slides med mus α-actinin, kylling αGFP og kanin Nppa for IPM og Iam identifikation.
- Farv et par slides med musen α-actinin, kylling αGFP, og kanin Myl2 for IPM og IVM identifikation.
- Den følgende dag vaskes brønde x3 med 300 pi 0,1% PBST. Inkuber 5 min ved stuetemperatur mellem vaskene. Aspirere overskydende opløsning efter den sidste vask.
- Forbered de sekundære antistof fortyndinger i ICC farvning buffer. Se det materiale sektion for anbefalede fortyndinger. Inkuber sekundære antistoffer 1 time ved stuetemperatur, beskyttet mod lys.
- Farv alle dias med følgende sekundære antibodies: muse Alexa-555, kylling Alexa-488, og kanin Alexa-647.
- Vask brønde x3 med 300 pi 0,1% PBST. Inkuber 5 min ved stuetemperatur mellem vaskene. Beskyttes mod lys.
- Tilføj 2.4 pi monteringsmedie indeholdende 1,5 ug / ml 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) til en objektglas. Fjern forsigtigt dækglasset fra brønden af 24-brønds plade, fjerne overskydende opløsning, og overførsel til objektglasset med monteringsmedie. Tryk forsigtigt dækglasset for at fjerne overskydende volumen og luft.
- Seal lysbilleder med foretrukne neglelak eller plast fugemasse. Store monterede dias ved 4 ° C beskyttet mod lys.
4. Identifikation af Hjerte undertyper Brug konfokalmikroskopi
BEMÆRK: billedbehandling, en konfokal mikroskop udstyret med mindst 2 fluorescerende detektorer i stand til spektral detektion ved 405, 488, 555 og 639 nm bølgelængder er nødvendig for at identificere IPMS, Iams, og IVMS. image celler ved hjælp af en Plan-Apochromat 20X / 0,75 objektiv eller bedre. Brug af producentens billedanalyse software, scanning zoom-billeder kan opnå 40X-olie fordybelse kvalitet billeder.
- Billede bibliotek: tage 8-bit billeder med DAPI, Alexa-488, Alexa-555, og Alexa-647 kanaler (ch.). Pixel dvæle på 6 s, 1024 rammestørrelse, line trin på 2, og gennemsnitsberegning af 2 er tilstrækkelig til billeder i høj opløsning.
- For hvert dias, starte fra den ene kant og begynde at scanne op og ned i den røde fluorescerende kanal (kap.) For α-actinin + sarkomer + celler (Se Figur 3 og Figur 5A for eksempler). Sarkomer Rillerne er nemmere at identificere visuelt i 555 nm bølgelængde.
- Når en α-actinin + sarkomer + celle er blevet identificeret, skifte til den grønne lm. og holde note, hvis den er positiv (IPM). Skift til computeren for at vurdere langt-rød 647 ch. (IAM eller IVM).
BEMÆRK: Celler, der erα-actinin + / sarkomeret + / Hnc4-GFP + / Nppa - / Myl2 - er udpeget som IPMS. GFP-ekspression vil ses på hele cellen (figur 4A). - Stain lysbilleder med α-actinin (mus-Alexa555), Hcn4-GFP (kylling-Alexa488), Nppa (kanin-Alexa647), og DAPI. Celler, der er α-actinin + / sarkomeret + / Hnc4-GFP - / Nppa + er IAM. Nppa farvning vises perinukleær og punktformig (figur 4B).
- Stain lysbilleder med α-actinin (mus-Alexa555), Hcn4-GFP (kylling-Alexa488), Myl2 (kanin-Alexa647). Celler positive for α-actinin + / sarkomeret + / Hnc4-GFP - / Myl2 + er IVMS. Myl2 farvning vil udvise en stribet formular sammen glødetråden sarkomeret. På grund af variationer i kvaliteten af farvningen og Z-planet, kan riller ikke altid er let synlige (figur 4C).
- Når en α-actinin + sarkomer + celle er blevet identificeret, skifte til den grønne lm. og holde note, hvis den er positiv (IPM). Skift til computeren for at vurdere langt-rød 647 ch. (IAM eller IVM).
BEMÆRK: For at vurdere det faktiske antal potentielt omprogrammerede MEF'er, er 2 brønde på en plade med 24 brønde podet parallelt med de eksperimentelle brønde og høstes én dag efter udpladning. Det samlede antal celler udpladet bestemmes derefter ved at tage gennemsnittet af de to brønde. Dette bliver den faktiske samlede udpladede celler (altVitamin).
- sarkomer +
- Efterse hver celle på et dækglas for korrekt α-actinin + / sarkomeret + (højre paneler figur 3) og record (figur 5B-i).
- Tabulere det samlede antal α-actinin + / sarkomer + på hver dækglas og dividere med den faktiske totale celler udpladet (altVitamin) (figur 5B-iii). For eksempel, hvis altVitamin = 12.500 celler og 100-celler blev a-actinin + / sarkomer + derefter, 0,8% af de pletterede MEF'er blev omprogrammeret. Et gennemsnitreprograming eksperiment vil give 1% a-actinin + / sarkomer + -celler (figur 5C).
- undertype +
BEMÆRK: de følgende trin, se figur 5B / C i en repræsentativ iCLM kvantificering workflow. Kort beskrevet for hver sarkomer + celle, tabulate hvis det er unikt for enten subtype (figur 5B-i). Beregn% Subtype (figur 5B-iii) ved at dividere antallet af undertype + -celler over den gennemsnitlige sarkomeret + celler x 100 (figur 5B-i). For at beregne den absolutte% subtype effektivitet (figur 5B-iv), opdele subtype + celletallet fra figur 5B-i med det samlede antal celler podet x 100 (figur 5B-ii).- For hver af α-actinin + / sarkomeret + celler, vurdere, om de er GFP +, Nppa + eller Myl2
- Tabulate samlede antal α-actinin + / sarkomer + / Hnc4-GFP + / Nppa - / Myl2 -, actinin + / sarkomer + / Hnc4-GFP - / Nppa +, og α-actinin + / sarkomer + / Hnc4-GFP - / Myl2 + celler (figur 5B-I).
- For at beregne den procentdel af hver undertype, dividere antallet af subtype + celler med det samlede antal α-actinin + / sarkomeret + celler i det godt og gange med 100. GHMT genererer IPMS, Iams, og IVMS på nogenlunde lige store nøgletal (figur 5B-iii).
- For at beregne det absolutte antal subtype + celler, dividere det totale antal subtype + celler til den eksperimentelle betingelse af altVitamin og gange med 100 (figur 5B-ii). I gennemsnit IPMS repræsenterer 0,3% af den samlede inficerede cellepopulation, Iams 0,3%, ogIVMS 0,25% (figur 5B-iv).
- For hver af α-actinin + / sarkomeret + celler, vurdere, om de er GFP +, Nppa + eller Myl2
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
At drage fordel af PM-specifikke reporter mus udviklede vi en multiplex immunfarvning strategi til at identificere forskellige endogene myocytter som afbildet i figur 1. Efter omprogrammering trin vist i figur 2, kan detekteres induktion af subtypespecifik CMS så tidligt som dag 4 21, om end i et lav hastigheds. På dag 14, kan forsøget stoppes og vurderes for sarkomer organisation (figur 3) og subtype-specifikation (figur 4). Figur 5 opsummerer arbejdsgangen af dias forberedelse til ICC (figur 5 Panel A), og kvantificering af iCLM subtype-specifikke celler (figur 5 Panel B / C).
Figur 1: Subtype mangfoldighed af endogeneCardiomyocytter. (AB) Immuncytokemi (ICC) farvning af neonatale atriale cardiomyocytter fra Hcn4-GFP reporter mus for α-actinin (sarkomeret markør, rød), Hcn4-GFP (PM markør, grøn), og Nppa (atrial markør, orange). (C) Immuncytokemi farvning af neonatale ventrikulære cardiomyocytter fra Hcn4-GFP reporter mus for α-actinin (sarkomeret markør, rød), Hcn4-GFP (PM markør, grøn), og Myl2 (ventrikulær markør, orange). DAPI (blå): nuklear farvning. Scale bars: 20 uM. Klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 1: dyrkningsmedium. sammendrag for udarbejdelsen af de forskellige medier, der anvendes under GHMT-induceret omprogrammering Table. Tabel 2: Såning, Transfektion og Induktion formater.(A) sammendrag for plettering og transfektion af celler Tabel. (B) Seedning tæthed og omtrentlige infektion enheder (eller viral supernatant) er nødvendig for at fremkalde MEF i cardiomyocyte-lignende celler. 
Figur 2: Omprogrammering Tidslinje Skematisk. Skematisk fremstilling af GHMT-inducerede Hcn4-GFP MEF. De tre store etaper er afbildet. 
Figur 3: Grad af sarkomeret Organization. ICC farvning af Hcn4-GFP MEF'er 14 dage efter GHMT transduktion for α-actinin (sarkomer markering, rød) viser en bred vifte af sarkomer organisation. Graden af organisation stiger fra venstre til højre paneler. Repræsentative billeder af hvert niveau (n = 3). Scale bar: 20 pm. Klik her for at se en større version af dette tal. 
Figur 4: subtypespecifik omprogrammeret Cardiomyo cytes. (AC) ICC farvning af GHMT-transducerede Hcn4-GFP MEF til α-actinin (sarkomeret markør, rød), Hcn4-GFP (PM markør, grøn), Nppa (atrial markør, orange), eller Myl2 (ventrikulær markør, orange) . DAPI (blå): nuklear farvning. Scale bars: 20 uM. Klik her for at se en større version af dette tal. 
Figur 5: Image Acquisition og Analysis Workflow. Skematisk repræsentation af billedanalyse. Panel A viser prioritetsrækkefølgen for at tildele sarkomeret + og undertype-specificitet til en celle. Panel B (i-iv) og C viser de forventede resultater fra en gennemsnitlig GHMT-iCLM eksperiment. Hovedpunkter og formler er vist med grønt.about / filer / ftp_upload / 55.456 / 55456fig5large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal. iCLM medier Komponent Volumen (ml) Endelig koncentration DMEM 270 medium 199 90 FBS 50 10% Insulin-Transferrin-Selenium G 2.5 0,50% MEM vitamin opløsning 10 2% MEM aminosyrer 20 4% Ikke-essentielle aminosyrer 10 2% Antibiotika-Antimykotika 10 2% B-27 supplement 10 2% Varmeinaktiveret hesteserum 25 5% Na-pyruvat 2.5 1,5 mM Plat-E medier (PE) Komponent Volumen (ml) Endelig koncentration DMEM 450 FBS 50 10% Penicillin / streptomycin 5 1% puromycin 0.05 1 ug / ml blasticidin 0.5 10 ug / ml Fibroblast medium (FB) Komponent0; Volumen (ml) Endelig koncentration DMEM 450 FBS 50 10% Penicillin / streptomycin 5 1% Glutamax 5 1% Transfektion medium (TXF) - filtreret (0,45 um) Komponent Volumen (ml) Endelig koncentration DMEM 450 FBS 50 10% Immuncytokemi (ICC) farvning puffer Komponent Volumen (ml) Endelig koncentration 1x PBS 5 1x Universal blokeringspuffer 5 A) Cell såning og transfektion Plade / parabol Areal (cm2) Udsåningstæthed (celler) Vækstmedium (ml) Totalt DNA beløb til transfektion (ug) Transfektionsreagens (pi) Reduceret Serum Medier (pl) 15 cm plade 152 1.00E + 06 20 25 75 600 10 cm plade 55 5.50E + 06 10 9 27 300 6 cm plade 21 2.20E + 06 4 3,5 10.5 105 6 brønd / x1 9 1.00E + 06 2 2 6 60 12 brønd / x1 4 4.00E + 05 1 0.5 1.5 15 24 brønd / x1 2 2.00E + 05 0.5 0,3 0.9 9 48 brønd / x1 1 1.70E + 05 0.25 0,15 0.45 4,5 B) Fibroblast podning og induktion Plade / parabol Fibroblast udsåningstæthed (millioner) Omtrentlige infektion enheder til iCLM 6 cm plade 0,22-0,33 5.00E + 7 (~ 5 ml) 6 brønd / x1 0,1-0,15 3.00E + 7 (~ 3 ml) 12 brønd / x1 0,04-0,06 1.30E + 7 (~ 1 ml) 24 brønd / x1 0,02-0,03 6.50E + 6 (~ 0,8 ml) 48 godt 0,001 til 0,015 3.00E + 6 (~ 0,4 ml)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den foreliggende undersøgelse giver en direkte-omprogrammering strategi for konvertering af MEF'er til et bredt sæt af hjerte-undertyper via retrovirus-medieret udtryk for hjertets transskription faktorer Gata4, Mef2c, Tbx5, og Hand2 (GHMT). Ved hjælp af en multiplex immunfarvning fremgangsmåde i kombination med en PM-specifik reporter mus, er vi i stand til at identificere IAM, IVMS, og IPMS på enkelt celle opløsning. En sådan analyse giver mulighed for en eksperimentel in vitro system, der kan isolere bidragene fra de enkelte transkriptionsfaktorer mod undertype mangfoldighed og sarkomer udvikling. Samtidig kunne det bringe indsigt til nye transkriptionsfaktorer eller små molekyler, der Bias iCLMs mod en bestemt slægt. Ikke desto mindre er der flere kritiske trin til en vellykket gennemførelse af denne analyse. Nedenfor har vi fat effekten af viral titer, fibroblast kvalitet, og billedbehandling analyse i et generelt iCLM eksperiment.
I vores undersøgelse, vi empLoy ecotrope-retrovirus at omprogrammere E12.5 MEF. Vi har bemærket den retrovirale titer er direkte relateret til kvaliteten af cellerne. High passage nummer (> 35) og ringe dyrkningsteknikker alvorligt påvirke kvaliteten af de retrovirale partikler; Derfor er der flere overvejelser at huske på. Plat-E-celler producerer ikke VSV-G pseudotype virus, og kan således ikke modstå ultracentrifugering eller frysning-cykler 24, 25. For at bevare levetiden af cellerne, er det bydende nødvendigt at opretholde bestanden med antibiotisk selektion. De bør imidlertid holdes i antibiotikum-frit medium under virusproduktion. Det er vores erfaring, at transfektion reagens, der anvendes her giver de højeste transfektionseffektiviteten i celler. Hvis andre transfektionsfremgangsmåder skal anvendes, sammenligne de virustitere produceret er væsentligt 26. Selv om der er anbefalinger af producenten til at høsteden virale supernatant 48 timer efter transfektion, observerede vi, at to 24-h høst runder giver højere omprogrammering effektivitet samtidig undgå toksiske virkninger normalt er forbundet med højere titer virale preps. Desuden, selv om flere undersøgelser har vist muligheden for kommercielle virale supernatant koncentratorer 27, vi har ikke ansat disse i vores almindelige protokol for at opretholde et højere gennemløb.
Ud over høj titer virale cocktails, fibroblast kvalitet er af afgørende betydning for en vellykket omprogrammering assay 28. Hvis timet korrekt, bør frisk isolerede MEF'er udnyttes på grund af deres højere effektivitet sammenlignet med frosne lagre. Dette kunne være relateret til arten af retrovira, som de har brug en højt proliferativ vært for at integrere 29. Derudover MEF udsåningstæthed spiller en kritisk rolle. Vi har inkluderet en tabel med seeding tætheder ansati vores eksperimenter (tabel 2). Desuden passage af MEF vil også signifikant fald omprogrammering effektivitet.
Immuncytokemi (ICC) er vores standard teknik til analyse af sarkomeret organisation og undertype specifikation. Med hjælp fra en PM-GFP reporter mus, var vi i stand til at danne et antistof panel til påvisning af tre store hjerte-undertyper (AM, VM, og PM). Men på grund af begrænsninger af antistof arter tilgængelighed og begrænsning af 4-kanaler på en standard konfokal mikroskop set-up, der er brug for, to dækglas pr undertype at kvantificere forekomsten af alle tre undertyper. Et dækglas vil farve for α-actinin / GFP (Hcn4) / Myl2, og en for α-actinin / GFP (Hcn4) / Nppa. Baseret på vores tidligere observation, at sarcomerisk struktur er et fælles kendetegn for alle CMS og en potentiel forudsætning for undertype specifikation 21, det første skridt i vores analyse er at bestemme sarkomeret +celler. Men på grund af sin subjektive natur, fastsættelsen af sarkomeret organisation er måske den vanskeligste del af denne analyse; dette kan begrænses ved at midle flere observatørens kvantificering eller ved udvikling af beregningsmæssige celle segmentering software til at automatisere processen 30. Brug endogene celler som et referencepunkt, opdagede vi en tærskel for velorganiseret sarkomeret + og udnyttet, at for at score iCLMs (Figur 3). På baggrund af disse parametre, vil en gennemsnitlig eksperiment give anledning til 20 - 30% a-actinin + -celler, men kun 1% er a-actinin + / sarkomer +. Af de 1% sarkomeret + celler, ~ 30% vil være Nppa +, Myl2 +, eller Hcn4-GFP +.
I betragtning af at cardiomyocytter er strukturelt komplekse, populationsbaseret genekspression (f.eks QRT-PCR) eller flowcytometri analyser kan ikke fange den indviklede morfologiske lmanges, der opstår under iCLM omprogrammering. I modsætning hertil patch fastspænding og calcium forbigående billedbehandling er meget strenge encellede funktionelle assays, men specialiserede kompetencer og udstyr er forpligtet til at foretage disse eksperimenter. Således den beskrevne metode er enestående, fordi det giver en enkel tilgang til at studere vigtige strukturelle og funktionelle parametre iCLM omprogrammering uden væsentligt at kompromittere gennemløb.
På trods af de mange nylige fremskridt i direkte omprogrammering, stadig meget arbejde, der skal gøres for bedre at forstå de molekylære mekanismer, der regulerer cardiac omprogrammering, og mere specifikt, undertype specifikation. Disse mekanismer bliver især vigtigt at oversætte direkte omprogrammering for kliniske anvendelser. Som sådan i denne undersøgelse beskriver vi en platform i stand til direkte at modulere diskrete parametre for at vurdere bidrag til sarkomeret udvikling, undertype specifikation, og iCLM modenhed. Moreover, kan dette system blive yderligere udviklet til at arbejde i en high-throughput format giver mulighed for komplekse screening af små molekyler eller ekstracellulære matricer til det næste skridt i regenerativ kardiologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma | D5796 | Component of iCLM media, Plat-E media, fibroblast, and Transfection media |
| Medium 199 | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | Component of iCLM media |
| Fetal bovine serrum (FBS) | Sigma | F2442 | Component of iCLM media, Plat-E media, fibroblast, and Transfection media |
| Insulin-Transferrin-Selenium G | Thermo Fisher Scientific | 41400-045 | Component of iCLM media |
| MEM vitamin solution | Thermo Fisher Scientific | 11120-052 | Component of iCLM media |
| MEM amino acids | Thermo Fisher Scientific | 1601149 | Component of iCLM media |
| Non-Essential amino acids | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | Component of iCLM media |
| Antibiotic-Antimycotics | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Component of iCLM media |
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | Component of iCLM media |
| Heat-Inactivated Horse Serum | Thermo Fisher Scientific | 26050-088 | Component of iCLM media |
| NaPyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360-70 | Component of iCLM media |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 1514022 | Component of Plat-E media and fibroblast media |
| Puromycin | Thermo Fisher Scientific | A11139-03 | Component of Plat-E media |
| Blasticidin | Gemini Bio-Products | 400-128P | Component of Plat-E media |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | Component of Fibroblast media |
| Confocal laser scanning LSM700 | Zeiss | For confocal analysis | |
| FuGENE 6 transfection Reagent | Promega | E2692 | Transfection reagent |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985-070 | Transfection reagent |
| Polybrene | Millipore | TR-1003-G | Induction reagent. Use at a final concentration of 8 μM/mL |
| Platinium-E (PE) Retroviral Packagin Cell Line, Ecotropic | CellBiolabs | RV-101 | Retroviral pacaking cell line |
| Trypsin 0.25% EDTA | Thermo Fisher Scientific | For MEFs and Plat-E dissociation | |
| Mouse anti α-Actinin (Clone EA-53) | Sigma | A7811 | Antibody for confocal analysis. Use at 1:200 |
| Chicken anti-GFP IgY | Thermo Fisher Scientific | A10262 | Antibody for confocal analysis. Use at 1:200 |
| Rabbit Pab anti-NPPA | Abgent | AP8534A | Antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Rabbit Pab anti Myl2 IgG | ProteinTech | 10906-1-AP | Antibody for confocal analysis. Use at 1:200 |
| Vectashield solution with DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Vector Labs | H-1500 | Dye for confocal analysis |
| Superfrost Plus Microscope slides | Thermo Fisher Scientific | 12-550-15 | 25 x 75 x 1.0 mm |
| BioCoat Fibronectin 12 mm coverslips | NeuVitro Corp | GG-12-1.5 | Coverslips for confocal analysis |
| 100 μm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| 0.45 μm Syringes filters SFCA 25MM | Thermo Fisher Scientific | 09-740-106 | For virus filtration |
| 6 mL Syringes | Covidien | 8881516937 | For virus filtration |
| Goat anti-Chicken IgY (H&L) A488 | Abcam | AB150169 | Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Donkey anti-rabbit A647 IgG(H+L) | Thermo Fisher Scientific | A31573 | Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Goat anti-mouse IgG(H+L) A555 | Thermo Fisher Scientific | A21422 | Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Triton X-100 | Sigma | 93443-100ml | For cell permeabilization |
| Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS) | Sigma | D8537 | |
| Power Block 10x Universal Blocking reagent | Thermo Fisher Scientific | NC9495720 | Dilute to 1x in H2O |
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution (PFA) | Electro Microscopy Sciences | 15710 | Use at 4% diluted in dH2O |
| 6 cm plates | Olympus | 25-260 | |
| 6-well plates | Genesee Scientific | 25-105 | |
| 24-well plates | Genesee Scientific | 25-107 | |
| 10 cm Tissue culture dishes | Corning | 4239 | |
| 15 cm Tissue culture dishes | Thermo Fisher Scientific | 5442 | |
| 15 mL Conical tubes | Corning | 4308 | |
| 50 mL Conical tubes | Corning | 4249 | |
| 0.4% Trypan blue solution | Sigma | T8154 | For viability |
| Ethyl Alcohol 200 proof | Thermo Fisher Scientific | 7005 | |
| Bleach | Thermo Fisher Scientific | 6009 |
References
- Sissman, N. J. Developmental landmarks in cardiac morphogenesis: comparative chronology. Am J Cardiol. 25 (2), 141-148 (1970).
- Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nat Rev Genet. 6 (11), 826-835 (2005).
- Ali, S. R., et al. Existing cardiomyocytes generate cardiomyocytes at a low rate after birth in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (24), 8850-8855 (2014).
- Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
- Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493 (7432), 433-436 (2013).
- Lin, Z., Pu, W. T. Strategies for cardiac regeneration and repair. Sci Transl Med. 6 (239), 239rv231 (2014).
- Writing Group, M., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), e38-e360 (2016).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
- Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485 (7400), 593-598 (2012).
- Fu, J. D., et al. Direct reprogramming of human fibroblasts toward a cardiomyocyte-like state. Stem Cell Reports. 1 (3), 235-247 (2013).
- Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Akt1/protein kinase B enhances transcriptional reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (38), 11864-11869 (2015).
- Zhou, Y., et al. Bmi1 Is a Key Epigenetic Barrier to Direct Cardiac Reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 382-395 (2016).
- Zhao, Y., et al. High-efficiency reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes requires suppression of pro-fibrotic signalling. Nat Commun. 6, 8243 (2015).
- Miki, K., Yoshida, Y., Yamanaka, S. Making steady progress on direct cardiac reprogramming toward clinical application. Circ Res. 113 (1), 13-15 (2013).
- Atkinson, A., et al. Anatomical and molecular mapping of the left and right ventricular His-Purkinje conduction networks. J Mol Cell Cardiol. 51 (5), 689-701 (2011).
- Bootman, M. D., Smyrnias, I., Thul, R., Coombes, S., Roderick, H. L.
- Miquerol, L., Beyer, S., Kelly, R. G. Establishment of the mouse ventricular conduction system. Cardiovasc Res. 91 (2), 232-242 (2011).
- Später, D., Hansson, E. M., Zangi, L., Chien, K. R. How to make a cardiomyocyte. Development. 141 (23), 4418-4431 (2014).
- Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).
- Conner, D. A. Current Protocols in Molecular Biology. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), (2012).
- Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (17), 8033-8037 (1993).
- Ichim, C. V., Wells, R. A. Generation of high-titer viral preparations by concentration using successive rounds of ultracentrifugation. J Transl Med. 9, 137 (2011).
- Qian, L., Berry, E. C., Fu, J. D., Ieda, M., Srivastava, D. Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro. Nat Protoc. 8 (6), 1204-1215 (2013).
- Yang, R., et al. Direct conversion of mouse and human fibroblasts to functional melanocytes by defined factors. Nat Commun. 5, 5807 (2014).
- Muraoka, N., Ieda, M. Direct reprogramming of fibroblasts into myocytes to reverse fibrosis. Annu Rev Physiol. 76, 21-37 (2014).
- Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. Retroviruses. Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. , (1997).
- Bass, G. T., et al. Automated image analysis identifies signaling pathways regulating distinct signatures of cardiac myocyte hypertrophy. J Mol Cell Cardiol. 52 (5), 923-930 (2012).
