Introduction
Il cuore è il primo organo funzionale a sviluppare nell'embrione 1, 2. In combinazione con il sistema circolatorio, fornisce l'ossigeno, nutrienti, e un meccanismo di smaltimento durante lo sviluppo. Tre settimane dopo la fecondazione, il cuore umano batte per la prima volta e la sua regolamentazione adeguata è mantenuta da cardiomiociti (CMS). La perdita irreversibile di queste cellule specializzate è quindi la questione fondamentale sottostante insufficienza cardiaca progressiva. Mentre alcuni organismi come zebrafish e Xenopus hanno il potenziale per la rigenerazione cardiaca, cuore adulto dei mammiferi è più limitata 3, 5, 6. Così, data la funzione critica del cuore, non è sorprendente che la malattia di cuore è la principale causa di morte nel mondo, che rappresentano 600.000 morti nel solo 7 negli Stati Uniti. Ilto, è terapie a base di cellule per riparare o sostituire il miocardio danneggiato in modo efficiente sono di grande interesse clinico.
Lo studio fondamentale di Yamanaka e colleghi hanno mostrato che 8 espressione forzata di quattro fattori di trascrizione è sufficiente per convertire i fibroblasti completamente differenziate di cellule staminali pluripotenti. Tuttavia, la capacità tumorigenico di tutte le strategie di cellule staminali pluripotenti è stata una preoccupazione fondamentale per il loro uso per scopi terapeutici. Questo ha motivato il campo scientifico per la ricerca di metodi alternativi per transdifferenziare cellule, evitando uno stadio di pluripotenza. Recentemente, diversi gruppi hanno dimostrato la fattibilità di questa strategia per la visualizzazione di conversione diretta dei fibroblasti di topo a cellule cardiomiociti come indotte (iCLMs) con l'espressione ectopica di fattori di trascrizione Gata4, MEF2C, Tbx5, e più tardi, Hand2 (GMT e GHMT rispettivamente) 9, 10. Furthermore, la stessa strategia può essere eseguita in vivo e in tessuti umani di derivazione 9, 11, 12. Recenti studi hanno evidenziato fattori complementari o vie di segnalazione che possono essere modulati per migliorare ulteriormente l'efficienza riprogrammazione cardiaco 13, 14, 15. Presi insieme, questi studi dimostrano il potenziale di transdifferenziazione diretta per terapie rigenerative. Tuttavia, la scarsa efficienza della riprogrammazione CM, i meccanismi molecolari sconosciuti, riproducibilità incoerente a causa delle differenze metodologiche 16, e la natura eterogenea del iCLMs rimangono senza indirizzo.
Al fine di valutare direttamente iCLM eterogeneità, abbiamo progettato un saggio unicellulare discreto e robusto per l'individuazione di sviluppo sarcomere e cardiaco specificatio lignaggion-due necessarie caratteristiche di cardiomiociti funzionali. Ci sono almeno tre tipi principali di CM nel cuore come definite dalla loro posizione e uniche proprietà elettriche: atriale (AM), ventricolare (VM) e pacemaker (PM) 17, 18, 19, 20. In una combinazione orchestrato, permettono il corretto pompaggio di sangue. Durante la ferita del cuore, uno o tutti i sottotipi potrebbero essere interessati, e il tipo di terapia cellulare dovrebbero essere affrontate caso per caso. Attualmente, la maggior parte delle strategie si concentrano sulla generazione complessiva di cardiomiociti, mentre poco lavoro è stato fatto per studiare i meccanismi molecolari che regola specifica sottotipo.
Il seguente studio dettagli come quantificare correttamente sarcomeri ben organizzati e identificare un insieme diversificato di sottotipi di cardiomiociti. Utilizzando un pacemaker (PM) topo giornalista SPECIFICI, siamo in grado di applicare un iapproccio mmunocytochemical distinguere miociti atriali indotte-like (IAM), miociti ventricolari come indotta (IVM), e indotti miociti PM-like (IPMS) 21. Sulla base delle nostre osservazioni, solo le cellule che presentano l'organizzazione sarcomere sono in grado di battere spontanea. Questa piattaforma unica riprogrammazione permette di valutare il ruolo di alcuni parametri nell'organizzazione sarcomere, specifica sottotipo, e l'efficienza della riprogrammazione CM ad una risoluzione di singola cellula.
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Protocol
Tutte le procedure sperimentali che coinvolgono le pratiche degli animali sono stati approvati dal Comitato Istituzionale Animal cura e l'uso a UT Southwestern Medical Center.
1. Isolamento di HCN4-GFP E12.5 embrionali di topo fibroblasti (MEF)
- Impostare accoppiamenti cronometrati tra omozigoti maschi HCN4-GFP e CD-1 femmine.
- Sacrifica femmina incinta a E12.5 dal biossido di carbonio l'eutanasia e la successiva dislocazione cervicale.
- Rimuovere corna uterine con dissettore come descritto in precedenza 22, 23, e metterli in una capsula di Petri sul ghiaccio con soluzione salina 1x tampone fosfato (PBS) senza Ca 2+ e Mg 2+.
- Eseguire tutti i passaggi successivi nella cappa di coltura utilizzando la tecnica sterile.
- Rimuovere gli embrioni dall'utero e amniotico sac con le forbici e pinze dissezione. Mantenere la placenta allegata per una migliore maneggevolezza. pregnant CD-1 le femmine in genere partoriscono tra 10 e 14 cuccioli.
- Utilizzando dissezione pinze, prendere gli embrioni isolate e rapidamente sciacquare due volte in 70% (v / v) EtOH.
NOTA: I lavaggi devono essere veloci per ridurre al minimo la morte delle cellule. - Togliere la testa, gli arti, la coda, e gli organi interni, compreso il cuore dagli embrioni isolate.
- Posizionare il tessuto rimanente in un 10 cm Piatto con 1 ml di PBS 1x e tritare finemente usando una lama di rasoio sterile a circa 1 mm 3 dimensioni.
- Trasferire il tessuto tritato in una provetta da 50 ml con PBS.
- Spin a 300 xg per 3 min. Con attenzione aspirare l'eccesso di PBS.
- Aggiungere 1 ml di sterile 0,25% tripsina-EDTA per ogni embrione. Incubare le cellule in un bagno d'acqua a 37 ° C per 15 min. Mescolare delicatamente il tubo ogni 4 min. Over-digestione del tessuto abbasserà notevolmente la resa.
- miscela di cellule Vortex a velocità massima (3.200 rpm) per 4 s.
- Aggiungere 2 ml di media fibroblasti per embrioni e mescolare. Filtro tttraverso un colino cella di 100 micron con una pipetta per aiutare le cellule attraverso il filtro. Fare riferimento alla Tabella 1 per la formulazione di tutti i mezzi successive.
- Spin a 300 xg per 4 minuti. Con attenzione aspirare il surnatante.
- Aggiungere 10 ml di mezzi di fibroblasti fresca per 3 embrioni e triturare 6-10 volte.
- Piastra le cellule in 1 15 cm piatto di coltura di tessuti per ogni 3 embrioni preparati. Cultura overnight a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore.
- Dopo l'incubazione durante la notte, sostituire il supporto con freschi 30 ml di supporti per piastra. Mettere le cellule di nuovo nel incubatore durante la notte.
NOTA: Verificare la presenza di contaminazione delle cellule HCN4-GFP + sotto un microscopio a fluorescenza. La cultura dovrebbe essere GFP - e diventare solo GFP + sulla riprogrammazione. - Il giorno dopo, le cellule raccolto con 3 ml di fresca pre-riscaldato 0,25% tripsina-EDTA. Contare e congelare le cellule. Tipicamente, congelare cellule a 3 x 10 6 cellule per ml. Il Yie previstold dovrebbe essere di 3 x 10 6 cellule per dell'embrione.
2. Retrovirus Produzione e riprogrammazione
Attenzione: il seguente protocollo richiede la produzione e la gestione dei retrovirus infettive. Effettuare le seguenti operazioni in un armadio biosicurezza di livello 2 sotto BSL-2 linee guida e tecnica sterile. Utilizzare il 10% di candeggina per smaltire tutti i materiali esposti a retrovirus.
- La produzione Retrovirus e preparazione MEF
NOTA: Il seguente protocollo è per la produzione di retrovirale in 6 pozzetti e infezioni MEF in piastre da 24 pozzetti. Per gli altri formati, fare riferimento alla Tabella 2. MEF sono placcati in occasione della Giornata -1, così dovrà essere coordinata in modo appropriato per ogni esperimento (fare riferimento alla sezione 2.3 e Figura 2) la tempistica.- Mantenere le cellule secondo le raccomandazioni del produttore Plat-E (PE). In breve, le cellule cultura PE in DMEM supplementato con 10% FBS, 1 mg / ml puromycin, 10 mg / ml blasticidin, la penicillina, e streptomicina. cellule Passage 1: 4 ogni due giorni in cui la cultura raggiunge il 70-90% di confluenza.
- Giorno -2: Il giorno prima trasfezione, le cellule seme Plat-E a cellule 1 x 10 6 / bene su un 6-pozzetti nei media trasfezione. Le cellule devono essere 70-80% confluenti al momento della transfezione.
- Trasfezione utilizzando un agente trasfezione commerciale.
NOTA: I reagenti commerciali devono essere a temperatura ambiente (RT) prima di trasfezione. Per la trasfezione del DNA, aggiungere ogni DNA plasmide retrovirale singolarmente (G, H, M e T) per formare un cocktail GHMT 9.- Giorno -1: In una provetta di polistirene da 15 ml conica, mescolare 60 ml di mezzi siero ridotti con 6 ml di trasfezione reagente per la reazione per un formato 6-pozzetti. Incubare la miscela per 5 minuti a temperatura ambiente.
NOTA: Dal momento che il reagente di trasfezione usato qui si lega alla plastica, undd direttamente ai media siero ridotta per evitare qualsiasi diminuzione di efficienza di trasfezione. - Aggiungere un totale di 2 mg di GHMT cocktail a reazione e delicatamente toccare per mescolare. Non farlo vortice. Incubare la reazione per 15 minuti a RT.
- Aggiungere il composto dal punto 2.2.3 alle cellule PE in maniera saggia goccia.
- Incubare le cellule trasfettate Plat-E durante la notte in un 37 ° C, 5% CO 2 incubatore. Registrare il tempo di trasfezione.
- Giorno -1: In una provetta di polistirene da 15 ml conica, mescolare 60 ml di mezzi siero ridotti con 6 ml di trasfezione reagente per la reazione per un formato 6-pozzetti. Incubare la miscela per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Semina di HCN4-GFP fibroblasti embrionali di topo.
- 1 h prima della placcatura MEF, preparare un 24-pozzetti per immunocitochimica.
- Aggiungere un fibronectina coprioggetto 12 millimetri per pozzetto.
- Pozzi cappotto con 300 ml di soluzione di collagene bovino (ad esempio, SureCoat) e incubare in un incubatore a 37 ° per 1 ora.
- soluzione di rivestimento Aspirare immediatamente prima placcatura MEF.
- Scongelare una fiala congelata di HCN4-GFP MEF e lavare x1 con fibrobl pre-riscaldatosupporti AST a 500 xg per 5 min.
- Determinare la vitalità delle cellule utilizzando trypan esclusione blu o coloranti simili. Calcolare il numero di cellule vitali per ml di coltura utilizzando la seguente formula:
% cellule vitali = [1.00 - (Numero di celle blu / numero di cellule totali)] x 100- Calcolare il numero totale di cellule vitali utilizzando la seguente formula:
Le cellule vitali =% cellule vitali x fattore di diluizione x 10.000 x volume totale della sospensione cellulare
- Calcolare il numero totale di cellule vitali utilizzando la seguente formula:
- Seed 3 x 10 4 cellule per pozzetto su una piastra da 24 pozzetti con collagene bovino coprioggetto soluzione fibronectina precedentemente preparato.
- 1 h prima della placcatura MEF, preparare un 24-pozzetti per immunocitochimica.
- La trasduzione e riprogrammazione di MEF
NOTA: Secondo le note del produttore, corretta manutenzione cellule Plat-E producono un titolo medio di 1 x 10 7 unità di infezione / mL. Anche se il titolo non viene misurato direttamente per ogni esperimento, un controllo GFP è sempre inclusa come un surrogato per l'efficienza infezione.Espressione alta GFP e l'intensità (GFP +> 95%) correla generalmente con successo generazione GHMT-mediata di iCLMs.- Giorno 0: 24 ore dopo la trasfezione, filtrare il medium retrovirale PE attraverso una dimensione del filtro di acetato 0,45 micron-pori senza tensioattivi di cellulosa e trasferimento in un tubo da 15 ml. Aggiungere polibrene ad una concentrazione finale di 8 mg / mL. ricostituire con attenzione le cellule con 2 ml di terreno fresco trasfezione.
NOTA: Le cellule facilmente staccano dalla piastra se il supporto è cambiato troppo rapidamente. - Aspirare il mezzo di coltura delle MEF e aggiungere il supporto retrovirale appena raccolti; esso dovrebbe produrre 1,7 ml di mezzi per pozzetto di un 6-pozzetti. Aggiungere ~ 800 ml per pozzetto di una piastra da 24 pozzetti. Rientro piatto MEF per l'incubatore e incubare una notte.
- Giorno 1: ripetere le fasi 2.4.1 e 2.4.2. Eliminare le celle dopo la collezione di virus 2 °. Rientro MEF infetti per l'incubatore e lasciarli riposare durante la notte.
- 2 ° giorno: 48 ore dopo l'induzione, aspirare il cellulare condizionata media e lavare x1 con PBS 1x. Aggiungere i media iCLM 500 ml di pre-riscaldato per pozzetto di una piastra ben 24.
- Sostituire i media iCLM ogni 2 - 3 giorni. Placca di 14 giorni dopo l'induzione virale per immunocitochimica (ICC) analisi della riprogrammazione cardiaco.
- Giorno 0: 24 ore dopo la trasfezione, filtrare il medium retrovirale PE attraverso una dimensione del filtro di acetato 0,45 micron-pori senza tensioattivi di cellulosa e trasferimento in un tubo da 15 ml. Aggiungere polibrene ad una concentrazione finale di 8 mg / mL. ricostituire con attenzione le cellule con 2 ml di terreno fresco trasfezione.
3. Immunocolorazione di MEF riprogrammato
- 14 giorni post-induzione, aspirare accuratamente la media.
- Lavare ogni pozzetto con 300 ml di 1x PBS ghiacciato. Aspirare la soluzione in eccesso.
- Fissare le cellule con 250 ml di paraformaldeide soluzione al 4% (PFA) per pozzetto di una piastra ben 24. Incubare 15 minuti a temperatura ambiente.
NOTA: fisso cellule possono essere conservate in PBS a 4 ° C per 1 - 2 settimane prima colorazione. - cellule permeabilize da Wells lavaggio x3 con 300 microlitri di 0.1% PBS-TritonX 100 (PBST). Incubare 5 minuti a temperatura ambiente tra i lavaggi. Aspirare la soluzione in eccesso dopo l'ultimo lavaggio.
- Blocco per 10minuti a temperatura ambiente con 1x universale blocchetto a 300 ml / pozzetto.
- Preparare buffer di colorazione (ICC): Aggiungere 1: 1 di PBS 1x e 1x universale tampone di bloccaggio. Diluire gli anticorpi primari nel buffer di colorazione ICC e incubare anticorpi notte a 4 ° C. Fare riferimento alla sezione materiale per diluizioni raccomandate.
- Macchia un paio di diapositive con il mouse α-actinina, αGFP pollo e coniglio NPPA per iPM e l'identificazione iAM.
- Macchia un paio di diapositive con il mouse α-actinina, αGFP pollo e di coniglio per MYL2 iPM e IVM identificazione.
- Il giorno seguente, lavare i pozzetti x3 con 300 microlitri di 0.1% PBST. Incubare 5 minuti a temperatura ambiente tra i lavaggi. Aspirare la soluzione in eccesso dopo l'ultimo lavaggio.
- Preparare le diluizioni degli anticorpi secondari nel buffer ICC colorazione. Fare riferimento alla sezione materiale per diluizioni raccomandate. Incubare anticorpi secondari 1 ora a temperatura ambiente, al riparo dalla luce.
- Macchia tutte le diapositive con il seguente antibodie secondarias: il mouse Alexa-555, pollo Alexa-488, e coniglio Alexa-647.
- Lavare pozzi x3 con 300 microlitri di 0.1% PBST. Incubare 5 minuti a temperatura ambiente tra i lavaggi. Proteggere dalla luce.
- Aggiungere 2,4 ml di mezzo di montaggio contenenti 1,5 mg / mL di 4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) su un vetrino per microscopio. Rimuovere con attenzione il vetrino dal pozzo della piastra 24 pozzetti, rimuovere la soluzione in eccesso, e trasferire al vetrino con mezzi di montaggio. Premere delicatamente il vetrino per rimuovere l'eccesso di volume e l'aria.
- diapositive Seal con smalto preferito o sigillante di plastica. Conservare diapositive montate a 4 ° C al riparo dalla luce.
4. Identificazione di cardiache sottotipi Utilizzando Microscopia confocale
NOTA: Per l'imaging, un microscopio confocale dotato di almeno 2 rivelatori fluorescenti capaci di rilevazione spettrale a 405, 488, 555 e 639 nm lunghezza d'onda necessaria per identificare IPM, Iams, e IVMS. imagcellule e utilizzando un piano-Apochromat 20X / 0.75 obiettivo o migliore. Utilizzando il software di analisi di immagine del produttore, la digitalizzazione delle immagini dello zoom può ottenere immagini di qualità ad immersione 40X-petrolio.
- libreria Immagine: prendere immagini a 8 bit con DAPI, Alexa-488, Alexa-555, e Alexa-647 canali (cap.). Pixel tempo di sosta di 6 s, 1024 dimensione del frame, passo la linea a 2, e la media dei 2 è sufficiente per immagini ad alta risoluzione.
- Per ogni diapositiva, iniziare da un bordo e iniziare la scansione su e giù nel canale rosso fluorescente (ch.) Per le cellule sarcomere + α-actinina + (Fare riferimento alla Figura 3 e Figura 5A per gli esempi). striature sarcomere sono più facili da identificare visivamente nella lunghezza d'onda 555 nm.
- Una volta che un α-actinina + cellule sarcomere + è stato identificato, passare alla ch verde. e di tenere nota se è positivo (IPM). Passare al computer per valutare il far-rosso 647 ch. (IAM o IVM).
Nota: le celle che sonoα-actinina + / sarcomero + / Hnc4-GFP + / NPPA - / MYL2 - sono designati come IPMS. Espressione GFP sarà visto in tutta la cella (Figura 4A). - diapositive macchia con α-actinina (mouse Alexa555), HCN4-GFP (pollo-Alexa488), NPPA (coniglio-Alexa647) e DAPI. Le cellule che sono α-actinina + / sarcomero + / Hnc4-GFP - / NPPA + sono iAM. NPPA colorazione apparirà perinucleare e puntiformi (Figura 4B).
- diapositive macchia con α-actinina (mouse Alexa555), HCN4-GFP (pollo-Alexa488), MYL2 (coniglio-Alexa647). Cellule positive per la α-actinina + / sarcomero + / Hnc4-GFP - / + MYL2 sono IVMS. MYL2 colorazione esporrà una forma striato lungo il filamento sarcomero. A causa di variazioni nella qualità della colorazione e Z-plane, striature non sono sempre facilmente visibili (Figura 4C).
- Una volta che un α-actinina + cellule sarcomere + è stato identificato, passare alla ch verde. e di tenere nota se è positivo (IPM). Passare al computer per valutare il far-rosso 647 ch. (IAM o IVM).
NOTA: Per valutare il numero effettivo di MEF potenzialmente riprogrammati, 2 pozzetti di una piastra da 24 pozzetti vengono seminate in parallelo ai pozzetti sperimentali sono raccolte un giorno dopo la placcatura. Il numero totale di cellule piastrate è quindi determinata dalla media dei due pozzetti. Questo diventa le cellule totali effettivi cromato (atotal).
- sarcomere +
- Visivamente ogni cella su un vetrino per la corretta α-actinina + / sarcomero + (pannelli di destra Figura 3) e registrare (Figura 5B-i).
- Tabulare il numero totale di α-actinina + / + sarcomere su ogni vetrino e dividere per le cellule totali effettivi cromato (atotal) (Figura 5B-III). Ad esempio, se atotal = 12.500 cellule, e 100 cellule sono state alfa-actinina + / + sarcomere poi, 0,8% dei MEF placcati stati riprogrammato. Una mediareprograming esperimento produrrà cellule 1% alfa-actinina + / sarcomero + (Figura 5C).
- sottotipo +
NOTA: Per le seguenti operazioni, fare riferimento alla Figura 5B / C per un flusso di lavoro rappresentante iCLM quantificazione. In breve, per ogni sarcomero + cellulare, tabulare se è unica sia per il sottotipo (Figura 5B-i). Calcolare% sottotipo (Figura 5B-iii) dividendo il numero di cellule sottotipo + sul sarcomere media + cellule x 100 (Figura 5B-i). Per calcolare l'assoluta efficienza% sottotipo (Figura 5B-IV), dividere il numero sottotipo + cellulare da figura 5B-i per il numero totale di cellule seminate x 100 (Figura 5B-ii).- Per le celle ciascuno di α-actinina + / + sarcomere, valutare se sono GFP +, NPPA +, o MYL2
- Tabulare numero totale di α-actinina + / sarcomero + / Hnc4-GFP + / NPPA - / MYL2 -, actinina + / sarcomero + / Hnc4-GFP - / NPPA +, e α-actinina + / sarcomero + / Hnc4-GFP - + cellule / MYL2 (Figura 5B-i).
- Per calcolare la percentuale di ciascun sottotipo, dividere il numero di cellule Sottotip + per il numero totale di α-actinina + / + cellule sarcomere in che pure e moltiplicare per 100. GHMT genera IPMS, Iams, e IVMS più o meno uguali rapporti (Figura 5B-III).
- Per calcolare il numero assoluto di sottotipo + cellule, dividere il numero totale di sottotipo + cellule per la condizione sperimentale atotal e moltiplicare per 100 (Figura 5B-ii). Su IPMS media rappresentano lo 0,3% della popolazione cellulare infettata totale, Iams 0,3%, eIVMS 0,25% (Figura 5B-iv).
- Per le celle ciascuno di α-actinina + / + sarcomere, valutare se sono GFP +, NPPA +, o MYL2
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Representative Results
Approfittando della PM-specifica del mouse giornalista, abbiamo sviluppato una strategia immunocolorazione multiplex per identificare i diversi miociti endogeni come illustrato nella figura 1. Seguendo la procedura di riprogrammazione mostrati nella Figura 2, l'induzione di CM specifici del sottotipo può essere rilevato fin dal giorno 4 21, anche se ad un basso tasso. Entro il giorno 14, l'esperimento può essere fermato e valutati per l'organizzazione sarcomere (Figura 3) e sottotipo-specifica (Figura 4). Figura 5 riassume il flusso di lavoro di preparazione del vetrino per ICC (Figura 5 Pannello A), e la quantificazione dei iCLM cellule specifici del sottotipo (Figura 5 Pannello B / C).
Figura 1: Sottotipo diversità delle endogenaCardiomiociti. (AB) Immunocytochemistry (ICC) colorazione dei cardiomiociti atriali neonatali da topi reporter HCN4-GFP per α-actinina (marker sarcomero, rosso), HCN4-GFP (indicatore PM, verde), e NPPA (atriale marcatore, arancione). (C) Immunocytochemistry colorazione dei cardiomiociti ventricolari neonatali da topi reporter HCN4-GFP per α-actinina (marker sarcomero, rosso), HCN4-GFP (indicatore PM, verde), e MYL2 (ventricolare marcatore, arancione). DAPI (blu): colorazione nucleare. Barre di scala: 20 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: terreno di coltura. Riassunto Tabella per la preparazione dei diversi mezzi utilizzati durante la riprogrammazione GHMT-indotta. Tabella 2: Semina, Transfection e formati induzione.(A) sintesi Tabella per la placcatura e trasfezione di cellule. Unità (B) e densità di semina di infezione approssimativa (o surnatante virale) necessari per indurre nelle cellule MEF cardiomiociti-like. 
Figura 2: Riprogrammazione Timeline schematica. Rappresentazione schematica di GHMT indotte HCN4-GFP MEF. Le tre fasi principali sono raffigurati. 
Figura 3: Grado di sarcomere Organization. ICC colorazione di HCN4-GFP MEF 14 giorni dopo GHMT trasduzione di α-actinina (marcatore sarcomero, rosso) mostra una vasta gamma di organizzazione sarcomero. Il grado di aumenti organizzazione da sinistra a pannelli a destra. immagini rappresentative di ogni livello (n = 3). barra della scala: 20 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. 
Figura 4: sottotipo-specifici Riprogrammato Cardiomyo citi. (AC) ICC colorazione GHMT-trasdotte HCN4-GFP MEF per la α-actinina (marcatore sarcomero, rosso), HCN4-GFP (indicatore PM, verde), NPPA (marcatore atriale, arancione), o MYL2 (marcatore ventricolare, arancione) . DAPI (blu): colorazione nucleare. Barre di scala: 20 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. 
Figura 5: Acquisizione di immagini e analisi del flusso di lavoro. Rappresentazione schematica per l'analisi delle immagini. Pannello A raffigura l'ordine di priorità di assegnazione sarcomere + e sottotipo specificità a una cella. Pannello B (I-IV) e C mostrano i risultati attesi da un esperimento media GHMT-iCLM. I punti chiave e le formule sono mostrati in verde.om / files / ftp_upload / 55456 / 55456fig5large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. mezzi iCLM Componente Volume (ml) concentrazione finale DMEM 270 Medium 199 90 FBS 50 10% Insulina-transferrina-selenio G 2.5 0,50% soluzione vitamina MEM 10 2% MEM Aminoacidi 20 4% aminoacidi non essenziali 10 2% Antibiotici antimicotici 10 2% B-27 supplemento 10 2% Il calore inattivato Horse Serum 25 5% Na-piruvato 2.5 1.5 mM Plat-E i media (PE) Componente Volume (ml) concentrazione finale DMEM 450 FBS 50 10% Penicillina / streptomicina 5 1% puromicina 0.05 1 mg / mL Blasticidin 0.5 10 mg / ml Media dei fibroblasti (FB) Componente0; Volume (ml) concentrazione finale DMEM 450 FBS 50 10% Penicillina / streptomicina 5 1% Glutamax 5 1% Media Transfection (TxF) - filtrato (0,45 micron) Componente Volume (ml) concentrazione finale DMEM 450 FBS 50 10% Immunocitochimica (ICC) buffer di colorazione Componente Volume (ml) concentrazione finale 1x PBS 5 1x universale tampone bloccante 5 A) semina delle cellule e trasfezione Piatto / piatto Superficie (cm 2) Densità di semina (celle) Terreno di crescita (ml) Importo totale del DNA per trasfezione (mg) Transfection Reagent (ml) Ridotto siero media (ml) piatto 15 cm 152 1.00E + 06 20 25 75 600 piatto 10 cm 55 5.50E + 06 10 9 27 300 piatto 6 centimetri 21 2.20E + 06 4 3.5 10.5 105 6 e / x1 9 1.00E + 06 2 2 6 60 12 bene / x1 4 4.00E + 05 1 0.5 1.5 15 24 bene / x1 2 2.00E + 05 0.5 0.3 0.9 9 48 bene / x1 1 1.70E + 05 0.25 0.15 0.45 4.5 B) fibroblasti semina e induzione Piatto / piatto Fibroblasti densità di semina (milioni) Unità di infezione approssimativi per iCLM piatto 6 centimetri 0,22-0,33 5.00E + 7 (~ 5 mL) 6 e / x1 0,1-0,15 3.00E + 7 (~ 3 mL) 12 bene / x1 ,04-,06 1.30E + 7 (~ 1 ml) 24 bene / x1 0,02-0,03 6.50E + 6 (~ 0,8 ml) 48 bene ,001-,015 3.00E + 6 (~ 0,4 ml)
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Discussion
Il presente studio fornisce una strategia a riprogrammazione diretta per la conversione di MEF in un insieme diversificato di sottotipi cardiaci tramite espressione retrovirus-mediata della trascrizione cardiaco fattori Gata4, MEF2C, Tbx5, e Hand2 (GHMT). Utilizzando un approccio immunocolorazione multiplex in combinazione con un PM-specifica del mouse giornalista, siamo in grado di identificare iAM, IVMS, e IPMS ad una risoluzione di singola cellula. Tale test permette una sperimentazione in vitro sistema in grado di isolare il contributo dei singoli fattori di trascrizione nei confronti della diversità sottotipo e sviluppo sarcomere. In parallelo, questo potrebbe portare intuizione di nuovi fattori di trascrizione o piccole molecole che BIAS iCLMs verso una particolare stirpe. Tuttavia, ci sono diversi passaggi critici per il buon esito di questo test. Qui di seguito, ci rivolgiamo l'impatto del titolo virale, la qualità dei fibroblasti, e l'analisi di immagini in un esperimento generale iCLM.
Nel nostro studio, abbiamo empin lega ecotropic-retrovirus per riprogrammare MEF E12.5. Abbiamo notato che il titolo retrovirale è direttamente correlato alla qualità delle cellule. numero elevato passaggio (> 35) e tecniche di coltura poveri influenzano fortemente la qualità delle particelle retrovirali; Pertanto, ci sono diverse considerazioni da tenere a mente. Cellule Plat-E non producono virus pseudotyped VSV-G, e sono quindi in grado di resistere a ultracentrifugazione o cicli di congelamento 24, 25. Per preservare la longevità delle cellule, è imperativo mantenere lo stock con selezione antibiotica. Tuttavia, essi devono essere mantenuti in media liberi di antibiotici durante la produzione virale. Nella nostra esperienza, il reagente di trasfezione usato qui fornisce la più alta efficienza di trasfezione nelle cellule. Se altri metodi di transfezione devono essere utilizzati, confrontando i titoli virali prodotte è essenziale 26. Anche se ci sono raccomandazioni da parte del produttore per il raccoltoil virale surnatante 48 ore dopo la trasfezione, abbiamo osservato che due turni di 24 ore di raccolta resa efficienze superiori di riprogrammazione, evitando gli effetti tossici di solito associati a più alta titolazione preparazioni virali. Inoltre, se diversi studi hanno dimostrato la fattibilità di concentratori surnatante virale commerciali 27, non abbiamo impiegato questi nel nostro protocollo regolari al fine di mantenere una produttività più elevata.
Oltre a ad alto titolo virale cocktail, qualità fibroblasti è di importanza cruciale per un saggio riprogrammazione successo 28. Se cronometrato correttamente, MEF appena isolate dovrebbero essere utilizzati a causa della loro maggiore efficienza rispetto alle scorte congelate. Questo potrebbe essere correlato alla natura dei retrovirus, come hanno bisogno un host altamente proliferativo per integrare 29. Inoltre, MEF densità di semina gioca un ruolo fondamentale. Abbiamo incluso una tabella con le densità di semina impiegatinei nostri esperimenti (Tabella 2). Inoltre, passaging i MEF anche diminuire significativamente l'efficienza riprogrammazione.
Immunocitochimica (ICC) è la nostra tecnica standard per l'analisi dell'organizzazione sarcomere e le specifiche sottotipo. Con l'aiuto di un topo giornalista PM-GFP, siamo stati in grado di formare un pannello di anticorpi per l'individuazione di tre principali sottotipi cardiaci (AM, VM, e PM). Tuttavia, a causa di vincoli di anticorpi disponibilità di specie e la limitazione di 4 canali su un microscopio confocale set-up standard, sono necessari due coprioggetto per sottotipo di quantificare la prevalenza di tutti e tre i sottotipi. Un vetrino si macchia di α-actinina / GFP (HCN4) / MYL2, e uno per la α-actinina / GFP (HCN4) / NPPA. Sulla base delle nostre osservazioni precedenti che la struttura sarcomerica è una caratteristica comune di tutti i CMS e un potenziale prerequisito per la specifica sottotipo 21, il primo passo nella nostra analisi è determinante sarcomere +cellule. Tuttavia, a causa della sua natura soggettiva, stabilire il livello di organizzazione sarcomere è forse la parte più difficile di questo dosaggio; questo può essere limitata dalla media quantificazioni dell'osservatore multipli o sviluppando computazionale software segmentazione cella per automatizzare il processo 30. Utilizzando cellule endogene come un punto di riferimento, abbiamo scoperto una soglia per ben organizzato sarcomere + e utilizzati che a segnare iCLMs (Figura 3). Alla luce di questi parametri, un esperimento media darà luogo a 20 - 30% delle cellule alfa-actinina +, ma solo l'1% è alfa-actinina + / + sarcomere. Delle cellule sarcomero + 1%, ~ 30% sarà NPPA +, MYL2 +, o HCN4-GFP +.
Dato che i cardiomiociti sono strutturalmente complessi, espressione genica basato sulla popolazione (ad esempio qRT-PCR) o citometria a flusso analisi non possono catturare l'intricato ch morfologicaanges che si verificano durante iCLM riprogrammazione. Al contrario, patch di bloccaggio e calcio di imaging transiente sono molto severi test funzionali monocellulari, ma le competenze e le attrezzature specialistiche sono tenuti a condurre questi esperimenti. Così, la metodologia descritta è unico in quanto fornisce un approccio semplice per studiare parametri strutturali e funzionali chiave di iCLM riprogrammazione senza compromettere significativamente il throughput.
Nonostante le molte recenti progressi nella riprogrammazione diretta, molto lavoro resta ancora da fare per capire meglio i meccanismi molecolari che regolano la riprogrammazione cardiaca, e più in particolare, specifica sottotipo. Questi meccanismi saranno particolarmente importante tradurre riprogrammazione diretta per le applicazioni cliniche. In quanto tale, in questo studio descriviamo una piattaforma in grado di modulare direttamente i parametri discreti per valutare il contributo allo sviluppo sarcomere, specifica sottotipo e iCLM maturità. Moreover, questo sistema può essere ulteriormente sviluppato per lavorare in un formato ad alta produttività consentendo lo screening complesso di piccole molecole o matrici extracellulari per il passaggio successivo in cardiologia rigenerativa.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma | D5796 | Component of iCLM media, Plat-E media, fibroblast, and Transfection media |
| Medium 199 | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | Component of iCLM media |
| Fetal bovine serrum (FBS) | Sigma | F2442 | Component of iCLM media, Plat-E media, fibroblast, and Transfection media |
| Insulin-Transferrin-Selenium G | Thermo Fisher Scientific | 41400-045 | Component of iCLM media |
| MEM vitamin solution | Thermo Fisher Scientific | 11120-052 | Component of iCLM media |
| MEM amino acids | Thermo Fisher Scientific | 1601149 | Component of iCLM media |
| Non-Essential amino acids | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | Component of iCLM media |
| Antibiotic-Antimycotics | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Component of iCLM media |
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | Component of iCLM media |
| Heat-Inactivated Horse Serum | Thermo Fisher Scientific | 26050-088 | Component of iCLM media |
| NaPyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360-70 | Component of iCLM media |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 1514022 | Component of Plat-E media and fibroblast media |
| Puromycin | Thermo Fisher Scientific | A11139-03 | Component of Plat-E media |
| Blasticidin | Gemini Bio-Products | 400-128P | Component of Plat-E media |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | Component of Fibroblast media |
| Confocal laser scanning LSM700 | Zeiss | For confocal analysis | |
| FuGENE 6 transfection Reagent | Promega | E2692 | Transfection reagent |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985-070 | Transfection reagent |
| Polybrene | Millipore | TR-1003-G | Induction reagent. Use at a final concentration of 8 μM/mL |
| Platinium-E (PE) Retroviral Packagin Cell Line, Ecotropic | CellBiolabs | RV-101 | Retroviral pacaking cell line |
| Trypsin 0.25% EDTA | Thermo Fisher Scientific | For MEFs and Plat-E dissociation | |
| Mouse anti α-Actinin (Clone EA-53) | Sigma | A7811 | Antibody for confocal analysis. Use at 1:200 |
| Chicken anti-GFP IgY | Thermo Fisher Scientific | A10262 | Antibody for confocal analysis. Use at 1:200 |
| Rabbit Pab anti-NPPA | Abgent | AP8534A | Antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Rabbit Pab anti Myl2 IgG | ProteinTech | 10906-1-AP | Antibody for confocal analysis. Use at 1:200 |
| Vectashield solution with DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Vector Labs | H-1500 | Dye for confocal analysis |
| Superfrost Plus Microscope slides | Thermo Fisher Scientific | 12-550-15 | 25 x 75 x 1.0 mm |
| BioCoat Fibronectin 12 mm coverslips | NeuVitro Corp | GG-12-1.5 | Coverslips for confocal analysis |
| 100 μm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| 0.45 μm Syringes filters SFCA 25MM | Thermo Fisher Scientific | 09-740-106 | For virus filtration |
| 6 mL Syringes | Covidien | 8881516937 | For virus filtration |
| Goat anti-Chicken IgY (H&L) A488 | Abcam | AB150169 | Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Donkey anti-rabbit A647 IgG(H+L) | Thermo Fisher Scientific | A31573 | Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Goat anti-mouse IgG(H+L) A555 | Thermo Fisher Scientific | A21422 | Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Triton X-100 | Sigma | 93443-100ml | For cell permeabilization |
| Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS) | Sigma | D8537 | |
| Power Block 10x Universal Blocking reagent | Thermo Fisher Scientific | NC9495720 | Dilute to 1x in H2O |
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution (PFA) | Electro Microscopy Sciences | 15710 | Use at 4% diluted in dH2O |
| 6 cm plates | Olympus | 25-260 | |
| 6-well plates | Genesee Scientific | 25-105 | |
| 24-well plates | Genesee Scientific | 25-107 | |
| 10 cm Tissue culture dishes | Corning | 4239 | |
| 15 cm Tissue culture dishes | Thermo Fisher Scientific | 5442 | |
| 15 mL Conical tubes | Corning | 4308 | |
| 50 mL Conical tubes | Corning | 4249 | |
| 0.4% Trypan blue solution | Sigma | T8154 | For viability |
| Ethyl Alcohol 200 proof | Thermo Fisher Scientific | 7005 | |
| Bleach | Thermo Fisher Scientific | 6009 |
References
- Sissman, N. J. Developmental landmarks in cardiac morphogenesis: comparative chronology. Am J Cardiol. 25 (2), 141-148 (1970).
- Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nat Rev Genet. 6 (11), 826-835 (2005).
- Ali, S. R., et al. Existing cardiomyocytes generate cardiomyocytes at a low rate after birth in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (24), 8850-8855 (2014).
- Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
- Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493 (7432), 433-436 (2013).
- Lin, Z., Pu, W. T. Strategies for cardiac regeneration and repair. Sci Transl Med. 6 (239), 239rv231 (2014).
- Writing Group, M., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), e38-e360 (2016).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
- Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485 (7400), 593-598 (2012).
- Fu, J. D., et al. Direct reprogramming of human fibroblasts toward a cardiomyocyte-like state. Stem Cell Reports. 1 (3), 235-247 (2013).
- Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Akt1/protein kinase B enhances transcriptional reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (38), 11864-11869 (2015).
- Zhou, Y., et al. Bmi1 Is a Key Epigenetic Barrier to Direct Cardiac Reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 382-395 (2016).
- Zhao, Y., et al. High-efficiency reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes requires suppression of pro-fibrotic signalling. Nat Commun. 6, 8243 (2015).
- Miki, K., Yoshida, Y., Yamanaka, S. Making steady progress on direct cardiac reprogramming toward clinical application. Circ Res. 113 (1), 13-15 (2013).
- Atkinson, A., et al. Anatomical and molecular mapping of the left and right ventricular His-Purkinje conduction networks. J Mol Cell Cardiol. 51 (5), 689-701 (2011).
- Bootman, M. D., Smyrnias, I., Thul, R., Coombes, S., Roderick, H. L.
- Miquerol, L., Beyer, S., Kelly, R. G. Establishment of the mouse ventricular conduction system. Cardiovasc Res. 91 (2), 232-242 (2011).
- Später, D., Hansson, E. M., Zangi, L., Chien, K. R. How to make a cardiomyocyte. Development. 141 (23), 4418-4431 (2014).
- Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).
- Conner, D. A. Current Protocols in Molecular Biology. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), (2012).
- Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (17), 8033-8037 (1993).
- Ichim, C. V., Wells, R. A. Generation of high-titer viral preparations by concentration using successive rounds of ultracentrifugation. J Transl Med. 9, 137 (2011).
- Qian, L., Berry, E. C., Fu, J. D., Ieda, M., Srivastava, D. Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro. Nat Protoc. 8 (6), 1204-1215 (2013).
- Yang, R., et al. Direct conversion of mouse and human fibroblasts to functional melanocytes by defined factors. Nat Commun. 5, 5807 (2014).
- Muraoka, N., Ieda, M. Direct reprogramming of fibroblasts into myocytes to reverse fibrosis. Annu Rev Physiol. 76, 21-37 (2014).
- Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. Retroviruses. Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. , (1997).
- Bass, G. T., et al. Automated image analysis identifies signaling pathways regulating distinct signatures of cardiac myocyte hypertrophy. J Mol Cell Cardiol. 52 (5), 923-930 (2012).
