Introduction
Het hart is het eerste functionele orgel te ontwikkelen in het embryo 1, 2. In combinatie met de bloedsomloop, levert zuurstof, voedingsstoffen, en een mechanisme afval tijdens de ontwikkeling. Drie weken na de bevruchting, het menselijk hart klopt voor het eerst en het juiste regulering wordt onderhouden door cardiomyocyten (CM). Het onomkeerbare verlies van deze gespecialiseerde cellen is dan ook de fundamentele kwestie onderliggende progressieve hartfalen. Terwijl sommige organismen zoals de zebravis en Xenopus het potentieel voor cardiale herstel, het zoogdierhart volwassene beperkter 3, 5, 6. Aldus gezien de kritische functie van het hart, is het niet verwonderlijk dat hartziekte is de belangrijkste doodsoorzaak in de wereld is, en 600.000 sterfgevallen in de Verenigde Staten alleen 7. Dewaardo or, op cellen gebaseerde therapieën om efficiënt te repareren of te vervangen de geblesseerde myocard zijn van groot klinisch belang.
De oorspronkelijke studie van Yamanaka en collega 8 toonde dat geforceerde expressie van vier transcriptiefactoren voldoende volledig gedifferentieerde fibroblastcellen omzetten pluripotente stamcellen. Echter, het tumorigene vermogen van pluripotente stamcellen strategieën kritisch belang bij het gebruik voor therapeutische doeleinden is. Dit motiveerde de wetenschappelijk gebied om te zoeken naar alternatieve methoden om cellen transdifferentiëren terwijl het vermijden van een pluripotent podium. Onlangs hebben verschillende groepen de haalbaarheid van deze strategie getoond door weergave van de directe omzetting van muizen fibroblasten geïnduceerde cardiomyocyt-achtige cellen (iCLMs) met de ectopische expressie van transcriptiefactoren GATA4, MEF2C, Tbx5 en later hand2 (GMT en GHMT respectievelijk) 9, 10. Furthermore kan dezelfde strategie worden uitgevoerd in vivo en in mensen afgeleide weefsels 9, 11, 12. Recente studies hebben bijkomende factoren of signaleringsroutes die kunnen worden gemoduleerd cardiale herprogrammering efficiëntie 13, 14, 15 verder te verbeteren gemarkeerd. Samengevat, deze studies tonen het potentieel van gerichte transdifferentiatie regeneratieve therapieën. Echter, de lage efficiëntie van CM herprogrammering, het onbekende moleculaire mechanismen, inconsistent reproduceerbaarheid als gevolg van methodologische verschillen 16, en de heterogene aard van iCLMs blijven ongeadresseerde.
Om iCLM heterogeniteit direct evalueren, hebben we een discrete en robuuste eencellige assay voor de identificatie van sarcomeer ontwikkeling en cardiale lineage specification-twee noodzakelijke kenmerken functionele cardiomyocyten. Er zijn minstens drie belangrijke types van CM in het hart als gedefinieerd door hun locatie en unieke elektrische eigenschappen: atriale (AM), ventriculaire (VM) en pacemaker (PM) 17, 18, 19, 20. In een georkestreerde combinatie, ze laten de juiste pompen van bloed. Tijdens het hart letsel, misschien één of alle subtypes worden beïnvloed, en de aard van celtherapie nodig zou hebben op een case-by-case basis worden aangepakt. Momenteel hebben de meeste strategieën gericht op de totale productie van hartspiercellen, terwijl weinig werk wordt gedaan om de moleculaire mechanismen die subtype specificatie regelt bestuderen.
De volgende studie beschrijft hoe om goed te kwantificeren goed georganiseerde sarcomeren en identificeren van een gevarieerde set van cardiomyocyt subtypes. Met behulp van een pacemaker (PM) -specifieke reporter muis, zijn we in staat om een i toe te passenmmunocytochemical benadering van geïnduceerde atriale-achtige myocyten (IAM), veroorzaakte ventriculaire-achtige myocyten (IVM), en geïnduceerde PM-achtige myocyten (IPMS) 21 te onderscheiden. Op basis van onze observaties, alleen cellen die sarcomeer organisatie vertonen zijn in staat om spontaan kloppen. Deze unieke herprogrammering platform maakt het mogelijk voor de beoordeling van de rol van bepaalde parameters in sarcomeer organisatie, subtype specificatie, en de efficiëntie van CM herprogrammering op single-cell resolutie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimentele procedures waarbij dieren praktijken werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite op UT Southwestern Medical Center.
1. Isolatie van Hcn4-GFP E12.5 muis embryonale fibroblast (MEF)
- Opzetten getimede paringen tussen homozygote Hcn4-GFP mannen en CD-1 vrouwtjes.
- Sacrifice zwangere vrouw op E12.5 door kooldioxide euthanasie en de daaropvolgende cervicale dislocatie.
- Verwijder baarmoederhoorns met ontleden tang zoals eerder beschreven 22, 23, en plaats ze in een petrischaal op ijs met 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) zonder Ca2 + of Mg2 +.
- Voer alle volgende stappen in de weefselkweek kap met behulp van steriele techniek.
- Verwijder het embryo van de baarmoeder en vruchtwater sac met een schaar en forceps ontleden. Houd de placenta bevestigd voor een betere behandeling. pregnant CD-1 vrouwtjes meestal baren tussen de 10 en 14 pups.
- Met behulp van ontleden tang, neem de geïsoleerde embryo's en snel spoel ze twee keer in 70% (v / v) EtOH.
NB: De wast moet snel om celdood te minimaliseren. - Verwijder het hoofd, de ledematen, de staart, en de inwendige organen, zoals het hart van de geïsoleerde embryo's.
- Plaats de resterende weefsel in een 10-cm schaal met 1 mL 1 x PBS en fijn gehakt met een steriel scheermesje ongeveer 1 mm3 groot.
- Transfer gehakt weefsel in een 50 ml conische buis met PBS.
- Spin bij 300 g gedurende 3 min. Zorgvuldig aspireren overtollige PBS.
- Voeg 1 ml steriel 0,25% trypsine-EDTA per embryo. Incubeer cellen in een 37 ° C waterbad gedurende 15 minuten. Meng de buis om de 4 min. Over-vertering van het weefsel zal aanzienlijk lager de opbrengst.
- Vortex celmengsel op maximale snelheid (3200 rpm) voor 4 s.
- Voeg 2 ml fibroblast media per embryo en meng. filter through een 100 um zeef cel met een pipet om de cellen te helpen door de zeef. Zie tabel 1 voor de formulering van alle latere media.
- Spin bij 300 g gedurende 4 min. Zorgvuldig aspireren supernatant.
- Voeg 10 ml vers fibroblast media per 3 embryo's en vermaal 6-10 keer.
- Plate de cellen in 1 15-cm weefselkweek schotel voor elke 3 embryo's voorbereid. Cultuur overnacht in een 37 ° C, 5% CO2 incubator.
- Na de nacht incubatie, vervang dan de media met verse 30 ml media per plaat. Plaats cellen terug in de incubator 's nachts.
LET OP: Controleer Hcn4-GFP + cell besmetting onder een fluorescentiemicroscoop. De cultuur moet GFP zijn - en slechts geworden GFP + bij herprogrammering. - De volgende dag, oogst cellen met 3 ml verse voorverwarmde 0,25% trypsine-EDTA. Tellen en vries cellen. Gewoonlijk bevriezen cellen op 3 x 10 6 cellen per ml. De verwachte yield moet 3 x 10 6 cellen per embryo.
2. Retrovirus Productie en herprogrammeren
Let op: De volgende protocol vereist productie en behandeling van besmettelijke retrovirussen. Voer de volgende stappen in een Biosafety Level 2 kabinet onder BSL-2 richtlijnen en steriele techniek. Gebruik 10% bleekmiddel te ontdoen van alle materialen worden blootgesteld aan retrovirussen.
- Retrovirus productie en MEF voorbereiding
Opmerking: Het volgende protocol is retrovirale productie in 6-well platen en MEF infectie in 24-well platen. Voor andere formaten, zie Tabel 2. MEF worden uitgeplaat op dag -1, zodat de timing moet op passende wijze worden gecoördineerd voor elk experiment (zie paragraaf 2.3 en figuur 2).- Onderhouden Plat-E (PE) cellen volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Kort cultuur PE cellen in DMEM gesupplementeerd met 10% FBS, 1 ug / ml puromycin, 10 ug / ml blasticidine, penicilline en streptomycine. Passage cellen 1: 4 om de twee dagen dat de kweek 70-90% samenvloeiing bereikt.
- Dag -2: De dag voor transfectie, zaad Plat-E cellen op 1 x 10 6 cellen / putje op 6-wells plaat in transfectiemedium. De cellen moeten 70-80% confluent bij de transfectie worden.
- Transfectie met een commerciële transfectie agens.
OPMERKING: De commerciële reagentia moeten bij kamertemperatuur (KT) vóór transfectie. Voor de DNA-transfectie, voeg ieder retroviraal plasmide-DNA afzonderlijk (G, H, M en T) een GHMT cocktail 9 vormen.- Dag 1: In een 15 ml conische buis polystyreen, meng 60 pl gereduceerd serum medium met 6 pl transfectiereagens per reactie voor een 6-well plaat formaat. Incubeer het mengsel gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
Opmerking: omdat de transfectiereagens hier gebruikt bindt aan kunststoffen, eendd direct naar gereduceerd serum medium aan een afname van transfectie-efficiëntie te vermijden. - Voeg een totaal van 2 ug GHMT cocktail per reactie en tik voorzichtig te mengen. Doe niet vortex. Incubeer het reactiemengsel gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg het mengsel uit stap 2.2.3 op de PE-cellen in een druppelsgewijs wijze.
- Incubeer de getransfecteerde Plat-E cellen overnacht in een 37 ° C, 5% CO2 incubator. Noteer de tijd van transfectie.
- Dag 1: In een 15 ml conische buis polystyreen, meng 60 pl gereduceerd serum medium met 6 pl transfectiereagens per reactie voor een 6-well plaat formaat. Incubeer het mengsel gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Seeding van Hcn4-GFP muis embryonale fibroblasten.
- 1 uur voor plating MEF, voor te bereiden van een 24-wells plaat voor immunocytochemie.
- Voeg een 12 mm fibronectine dekglaasje per putje.
- Coat putjes met 300 pl collageen oplossing (bijvoorbeeld surecoat) en incuberen in een 37 ° C incubator gedurende 1 uur.
- Zuig coating oplossing onmiddellijk voor MEF plating.
- Ontdooi een bevroren flesje Hcn4-GFP MEFs en wassen x1 met voorverwarmde fibroblast media bij 500 xg gedurende 5 minuten.
- Bepaal de levensvatbaarheid van de cellen met behulp van trypan blauw uitsluiting of vergelijkbare kleurstoffen. Bereken het aantal levensvatbare cellen per ml kweek met de volgende formule:
% Levensvatbare cellen = [1.00 - (Aantal blauwe cellen / totaal aantal cellen)] x 100- Bereken totaal aantal levensvatbare cellen met behulp van de volgende formule:
Levensvatbare cellen =% levensvatbare cellen x verdunningsfactor x 10.000 x totale volume van de celsuspensie
- Bereken totaal aantal levensvatbare cellen met behulp van de volgende formule:
- Zaad 3 x 10 4 cellen per putje op een 24-well plaat met vooraf bereide collageen oplossing fibronectine dekglaasje.
- 1 uur voor plating MEF, voor te bereiden van een 24-wells plaat voor immunocytochemie.
- Transductie en herprogrammering van MEF
LET OP: Volgens de instructies van de fabrikant, goed onderhouden Plat-E cellen produceren een gemiddelde titer van 1 x 10 7 infectie eenheden / ml. Hoewel de titer niet direct gemeten voor elk experiment wordt een GFP controle altijd opgenomen als een surrogaat voor infectie-efficiëntie.Hoge GFP expressie en intensiteit (GFP +> 95%) correleert meestal met succesvolle-GHMT bemiddelde generatie iCLMs.- Dag 0: 24 h na transfectie, filtreer de PE retrovirale medium door een 0,45 urn poriegrootte vrij van oppervlakteactieve celluloseacetaatfilter en overbrengen naar een 15 ml conische buis. polybreen voegen tot een eindconcentratie van 8 ug / ml. vullen cellen voorzichtig met 2 ml vers medium transfectie.
OPMERKING: Cellen gemakkelijk los te maken van de plaat als media te snel wordt veranderd. - Zuig het medium van de gekweekte MEF en voeg de vers verzameld retrovirale medium; het moet 1,7 ml van media opbrengst per putje van een 6-wells plaat. Voeg ~ 800 ul per putje van een 24-well plaat. Terug MEF plaat naar de incubator en incubeer overnacht.
- Dag 1: Herhaal stap 2.4.1 en 2.4.2. Gooi cellen na de 2e virus collectie. Terug besmette MEF tot de couveuse en laat ze rusten 's nachts.
- Dag 2: 48 uur na inductie, zuigen de cel geconditioneerde media en wassen x1 met 1x PBS. Voeg 500 ul voorverwarmd iCLM media per putje van een plaat met 24 putjes.
- Vervang iCLM media om de 2-3 dagen. Plate met 14 dagen na virale inductie voor immunocytochemie (ICC) analyse van cardiale herprogrammering.
- Dag 0: 24 h na transfectie, filtreer de PE retrovirale medium door een 0,45 urn poriegrootte vrij van oppervlakteactieve celluloseacetaatfilter en overbrengen naar een 15 ml conische buis. polybreen voegen tot een eindconcentratie van 8 ug / ml. vullen cellen voorzichtig met 2 ml vers medium transfectie.
3. Immunokleuring van geherprogrammeerd MEF
- 14 dagen na inductie voorzichtig zuigen de media.
- Spoel elk putje met 300 pl ijskoude 1x PBS. Aspireren overtollige oplossing.
- Fix cellen met 250 ul van 4% paraformaldehyde (PFA) oplossing per putje van een plaat met 24 putjes. Incubeer 15 minuten bij kamertemperatuur.
OPMERKING: - 2 weken vóór kleuring vaste cellen voor 1 worden opgeslagen in PBS bij 4 ° C. - Doorlaatbaar cellen door wassen x3 putjes met 300 pl 0,1% PBS-Triton 100 (PBST). Incubeer 5 minuten bij kamertemperatuur tussen wasbeurten. Aspireren overtollige oplossing na de laatste wasbeurt.
- Blok 10min bij kamertemperatuur met 1 x Universal Block Buffer bij 300 ul / putje.
- Bereid (ICC) vlekken buffer: Voeg 1: 1 van 1x PBS en 1x Universal blokkerende buffer. Verdunde primaire antilichamen ICC kleurbuffer antilichamen en incubeer overnacht bij 4 ° C. Raadpleeg bij materialen voor de aanbevolen verdunningen.
- Vlekken op een paar van de dia's met de muis α-actinine, kip αGFP, en konijn NPPA voor iPM en Iam identificatie.
- Vlekken op een paar van de dia's met de muis α-actinine, kip αGFP, en konijn Myl2 voor iPM en IVM identificatie.
- De volgende dag was x3 putjes met 300 pl 0,1% PBST. Incubeer 5 minuten bij kamertemperatuur tussen wasbeurten. Aspireren overtollige oplossing na de laatste wasbeurt.
- Bereid het secundaire antilichaam verdunningen in ICC vlekken buffer. Raadpleeg bij materialen voor de aanbevolen verdunningen. Incubate secundaire antilichamen 1 uur bij kamertemperatuur, beschermd tegen het licht.
- Vlekken op alle dia's met de volgende secundaire antibodies: muis Alexa-555, kip Alexa-488, en konijn Alexa-647.
- Was x3 putjes met 300 pl 0,1% PBST. Incubeer 5 minuten bij kamertemperatuur tussen wasbeurten. Beschermen tegen licht.
- Voeg 2,4 ul van fixeermiddelen bevattende 1,5 ug / ml 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) een microscoopglaasje. Haal de dekglaasje uit de bron van de 24-well plaat, verwijderen overtollige oplossing, en over te dragen aan het glaasje met montage media. Druk de dekglaasje om overtollige volume en de lucht te verwijderen.
- Seal dia's met voorkeur nagellak of plastic kit. Store gemonteerde dia's bij 4 ° C beschermd tegen licht.
4. Identificatie van Cardiac subtypen met behulp van confocale microscopie
Opmerking: Voor beeldvorming, een confocale microscoop uitgerust met ten minste 2 fluorescerende detectoren kunnen spectrale detectie bij 405, 488, 555 en 639 nm golflengte is noodzakelijk om IPMS, IAMS en iMVS identificeren. image cellen met een Plan-Apochromat 20X / 0.75 objectief of beter. Met behulp van beeldanalyse van de fabrikant software, scannen zoom beelden kunnen bereiken 40X-olie-immersie kwaliteit foto's.
- Beeldbank: neem 8-bits afbeeldingen met DAPI, Alexa-488, Alexa-555 en Alexa-647 kanalen (l.). Pixel verblijftijd van 6 s, 1024 framemaat, lijn stap voor stap 2, en middeling van 2 voldoende is voor beelden met hoge resolutie.
- Voor elke dia, te beginnen van de ene kant en beginnen met het scannen op en neer in de rode fluorescerende kanaal (ch.) Voor α-actinine + sarcomeer + cellen (zie figuur 3 en figuur 5A voor voorbeelden). Sarcomeer strepen worden gemakkelijker visueel identificeren de golflengte 555 nm.
- Zodra een α-actinine + sarcomeer + cel is geïdentificeerd, over te schakelen naar de groene ch. en houdt opmerking als het positief is (IPM). Schakel over naar de computer om de ver-rode 647 ch beoordelen. (IAM of IVM).
OPMERKING: Cellen dieα-actinine + / sarcomeer + / Hnc4-GFP + / NPPA - / Myl2 - worden aangeduid als IPMS. GFP expressie wordt gezien gehele cellen (Figuur 4A). - Vlek dia's met α-actinine (muis-Alexa555), Hcn4-GFP (kip-Alexa488), NPPA (konijn-Alexa647) en DAPI. Cellen die zijn α-actinine + / sarcomeer + / Hnc4-GFP - / + NPPA zijn IAM. NPPA vlekken verschijnen perinucleaire en gestippelde (figuur 4B).
- Vlek dia's met α-actinine (muis-Alexa555), Hcn4-GFP (kip-Alexa488), Myl2 (konijn-Alexa647). Cellen positief voor α-actinine + / sarcomeer + / Hnc4-GFP - / + Myl2 zijn IVMS. Myl2 vlekken zal een gegroefde vorm langs de sarcomeer filament vertonen. Door variaties in de kwaliteit van de kleuring en het Z-vlak, strepen niet altijd gemakkelijk zichtbaar (figuur 4C) zijn.
- Zodra een α-actinine + sarcomeer + cel is geïdentificeerd, over te schakelen naar de groene ch. en houdt opmerking als het positief is (IPM). Schakel over naar de computer om de ver-rode 647 ch beoordelen. (IAM of IVM).
Opmerking: Om het werkelijke aantal potentieel geherprogrammeerd MEFs beoordelen worden 2 putjes van een plaat met 24 putjes gezaaid parallel aan de experimentele putjes en worden geoogst één dag na uitplaten. Het totale aantal cellen uitgeplaat wordt dan bepaald door het middelen van de twee putten. Dit wordt de werkelijke totale cellen uitgeplaat (totaalVitamine).
- sarcomeer +
- Inspecteer visueel elke cel op een dekglaasje voor een goede α-actinine + / sarcomeer + (Rechts panelen Figuur 3) en record (figuur 5B-i).
- Tabelleren het totale aantal α-actinine + / + sarcomeer op elke dekglaasje en delen door de werkelijke totale geplateerde cellen (totaalVitamine) (figuur 5B-iii). Als bijvoorbeeld totaalVitamine = 12.500 cellen en 100 cellen werden a-actinine + / + sarcomeer dan 0,8% van de geïllustreerde MEFs werden geprogrammeerd. Een gemiddeldereprograming experiment opbrengst 1% α-actinine + / + cellen sarcomeer (figuur 5C).
- subtype +
LET OP: Voor de volgende stappen, zie figuur 5B / C voor een representatieve iCLM kwantificering workflow. Kort voor elke sarcomeer + cel tabelleren als het is uniek voor zowel subtype (figuur 5B-i). Bereken% Subtype (figuur 5B-iii) door het aantal subtype + delende via gemiddelde sarcomeer + cellen x 100 (figuur 5B-i). De absolute subtype% efficiëntie (figuur 5B-iv) berekenen, deelt het subtype + celaantal figuur 5B-i door het totale aantal cellen gezaaid x 100 (figuur 5B-ii).- Voor elk van de α-actinine + / + cellen sarcomeer, beoordelen of ze GFP +, NPPA + of Myl2
- Tabelleren totale aantal α-actinine + / sarcomeer + / Hnc4-GFP + / NPPA - / Myl2 -, actinine + / sarcomeer + / Hnc4-GFP - / NPPA + en α-actinine + / sarcomeer + / Hnc4-GFP - / Myl2 + cellen (Figuur 5B-i).
- Om het percentage van elk subtype te berekenen, verdeel het aantal Subtype + cellen door het totale aantal α-actinine + / sarcomeer + cellen in die goed en vermenigvuldig dat met 100. GHMT genereert IPMS, Iams, en iVMS op ongeveer gelijke verhoudingen (figuur 5B-iii).
- Het absolute aantal subtype + cellen berekenen, deelt het totale aantal subtype + cellen voor de experimentele conditie door totaalVitamine en vermenigvuldig met 100 (figuur 5B-ii). Gemiddeld IPMs vertegenwoordigt 0,3% van de totale geïnfecteerde celpopulatie IAMS 0,3%, eniVMS 0,25% (Figuur 5B-iv).
- Voor elk van de α-actinine + / + cellen sarcomeer, beoordelen of ze GFP +, NPPA + of Myl2
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gebruikmakend van de PM-reporter muizen ontwikkelden we een multiplex immunokleuring strategie om diverse endogene myocyten te identificeren als weergegeven in figuur 1. Na de herprogrammering stappen getoond in figuur 2, kan inductie van subtype-specifieke CM al op dag 4 21 worden gedetecteerd, zij het laag-debiet. Overdag 14, kan het experiment gestopt en beoordeeld sarcomeer ordening (figuur 3) en subtype-specificatie (figuur 4). Figuur 5 geeft een overzicht van de workflow van dia voorbereiding voor ICC (Figuur 5 Panel A), en de kwantificering van iCLM subtype-specifieke cellen (Figuur 5 B Configuratiescherm / C).
Figuur 1: Subtype Diversiteit van endogeneHartspiercellen. (AB) Immunocytochemie (ICC) kleuring van neonatale atriale hartspiercellen uit Hcn4-GFP reporter muizen voor α-actinine (sarcomeer marker, rood), Hcn4-GFP (PM marker, groen), en NPPA (atriale marker, oranje). (C) Immunocytochemie kleuring van neonatale ventriculaire hartspiercellen uit Hcn4-GFP reporter muizen voor α-actinine (sarcomeer marker, rood), Hcn4-GFP (PM marker, groen), en Myl2 (ventriculaire marker, oranje). DAPI (blauw): nucleaire kleuring. Schaalbalken: 20 urn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Culture Medium. Tabel samenvatting voor de bereiding van de verschillende mediums tijdens GHMT geïnduceerde herprogrammering. Tabel 2: Zaaien, Transfectie en inductie-indelingen.(A) samenvattende tabel voor de plating en transfectie van cellen. (B) zaaidichtheid en geschatte infectie-eenheden (of virale supernatant) nodig MEFs induceren in cardiomyocyt-achtige cellen. 
Figuur 2: herprogrammeren Timeline Schematische. Schematische weergave van GHMT geïnduceerde Hcn4-GFP MEF. De drie belangrijkste stadia worden afgebeeld. 
Figuur 3: Mate van sarcomeer Organisatie. ICC kleuring van Hcn4-GFP MEF 14 dagen na GHMT transductie voor α-actinine (sarcomeer marker, rood) toont een divers scala aan sarcomeer organisatie. De mate van organisatie neemt toe van links naar rechts panelen. Representatieve foto's van elk niveau (n = 3). Schaal bar: 20 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 
Figuur 4: Subtype-specifieke geherprogrammeerd Cardiomyo cyten. (AC) ICC kleuring van GHMT-getransduceerde Hcn4-GFP MEF voor α-actinine (sarcomeer marker, rood), Hcn4-GFP (PM marker, groen), NPPA (atriale marker, oranje), of Myl2 (ventriculaire marker, oranje) . DAPI (blauw): nucleaire kleuring. Schaalbalken: 20 urn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 
Figuur 5: Image Acquisition and Analysis Workflow. Schematische weergave voor beeldanalyse. Panel A toont de prioriteitsvolgorde van het toewijzen van sarcomeer + en subtype-specificiteit voor een cel. Paneel B (i-iv) en C tonen de verwachte resultaten van een gemiddelde GHMT-iCLM experiment. Kernpunten en formules worden in het groen.OM / files / ftp_upload / 55456 / 55456fig5large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. iCLM media bestanddeel Volume (ml) eindconcentratie DMEM 270 medium 199 90 FBS 50 10% Insuline-transferrine-Selenium G 2.5 0,50% MEM vitamine oplossing 10 2% MEM Aminozuren 20 4% Niet- essentiële aminozuren 10 2% Antibiotica-Antimycotica 10 2% B-27 supplement 10 2% Hitte-geïnactiveerd paardenserum 25 5% Na-pyruvaat 2.5 1,5 mM Plat-E media (PE) bestanddeel Volume (ml) eindconcentratie DMEM 450 FBS 50 10% Penicilline / streptomycine 5 1% puromycine 0.05 1 ug / ml blasticidine 0.5 10 ug / ml Fibroblast medium (FB) bestanddeel0; Volume (ml) eindconcentratie DMEM 450 FBS 50 10% Penicilline / streptomycine 5 1% Glutamax 5 1% Transfectie medium (TxF) - Gefilterd (0,45 pm) bestanddeel Volume (ml) eindconcentratie DMEM 450 FBS 50 10% Immunocytochemie (ICC) vlekken buffer bestanddeel Volume (ml) eindconcentratie 1x PBS 5 1x Universal blokkerende buffer 5 A) Cell zaaien en transfectie Plate / Dish Oppervlak (cm2) Zaaidichtheid (cellen) Groeimedium (ml) Totale hoeveelheid DNA te transfecteren (gg) Transfectiereagens (pl) Verminderde Serum Media (pl) 15 cm plaat 152 1,00E + 06 20 25 75 600 10 cm plaat 55 5.50E + 06 10 9 27 300 6 cm plaat 21 2.20E + 06 4 3.5 10.5 105 6 goed / x1 9 1,00E + 06 2 2 6 60 12 goed / x1 4 4.00E + 05 1 0.5 1.5 15 24 goed / x1 2 2.00E + 05 0.5 0.3 0.9 9 48 goed / x1 1 1.70E + 05 0.25 0.15 0.45 4.5 B) fibroblast zaaien en inductie Plate / Dish Fibroblast zaaien dichtheid (miljoenen) Geschatte infectie eenheden iCLM 6 cm plaat 0,22-0,33 5.00E + 7 (~ 5 ml) 6 goed / x1 0,1-0,15 3.00E + 7 (~ 3 ml) 12 goed / x1 0,04-0,06 1.30E + 7 (~ 1 ml) 24 goed / x1 0,02-0,03 6.50E + 6 (~ 0,8 mL) 48 goed 0,001-0,015 3.00E + 6 (~ 0,4 mL)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De huidige studie geeft een directe herprogrammering strategie voor de omzetting van MEF in een gevarieerde set van cardiale subtypes via-retrovirus gemedieerde expressie van het cardiale transcriptiefactoren GATA4, MEF2C, Tbx5 en hand2 (GHMT). Met behulp van een multiplex immunokleuring aanpak in combinatie met een PM-specifieke reporter muis, zijn we in staat om IAM, iVMS en IPMS identificeren enkele resolutie cel. Een dergelijke bepaling maakt een experimenteel in vitro systeem kan isoleren van de individuele bijdragen van transcriptiefactoren aan subtype diversiteit en sarcomeer ontwikkeling. Tegelijkertijd kan dit inzicht nieuwe transcriptiefactoren of kleine moleculen die iCLMs voorkeur voor een bepaalde lijn brengen. Niettemin zijn er verschillende kritische stappen voor de succesvolle uitvoering van deze test. Hieronder gaan we in op de impact van virale titer, fibroblast kwaliteit, en imaging analyse in een algemeen iCLM experiment.
In onze studie hebben we empLoy ecotrope-retrovirussen om E12.5 MEFs herprogrammeren. Wij merkten het retrovirale titer is direct gerelateerd aan de kwaliteit van de cellen. Hoge passage nummer (> 35) en slechte kweektechnieken ernstige invloed op de kwaliteit van de retrovirale deeltjes; Daarom zijn er verschillende overwegingen in gedachten te houden. Plat-E cellen produceren geen VSV-G pseudo-virus, en die niet kunnen ultracentrifugatie of vriescycli 24, 25 te weerstaan. Om de levensduur van de cellen te behouden, is het noodzakelijk om de voorraad aan te houden met antibiotische selectie. Maar ze moeten worden in antibiotica vrije media tijdens de virale productie gehandhaafd. In onze ervaring, de transfectiereagens hier gebruikt biedt de hoogste efficiëntie van de transfectie in cellen. Als andere transfectiewerkwijzen worden gebruikt, het vergelijken van de virale titers geproduceerd essentieel 26. Hoewel er aanbevelingen van de fabrikant om te oogstenhet virale supernatant 48 uur na transfectie, we geconstateerd dat twee 24-h harvesting rondes op hogere rendementen herprogrammering met vermijding toxische effecten meestal geassocieerd met hogere titer virale preps. Bovendien, hoewel een aantal studies het haalbaar commerciële virale supernatant concentrators 27 blijkt, er is gebruikt in deze reguliere protocol om een hogere doorvoer te handhaven.
Naast de hoge titer virale cocktails, fibroblast kwaliteit is van cruciaal belang voor een succesvolle herprogrammering assay 28. Als dit juist getimed, moet vers geïsoleerde MEF worden benut als gevolg van hun hogere rendementen in vergelijking met bevroren voorraden. Dit kan samenhangen met de aard van retrovirussen, aangezien zij een zeer proliferatieve gastheer nodig teneinde er 29. Bovendien MEF zaaidichtheid speelt een cruciale rol. We hebben een tabel opgenomen met de seeding dichtheden in dienstin onze experimenten (Tabel 2). Verder passeren van de MEF ook een significante daling herprogrammering efficiëntie.
Immunocytochemie (ICC) is onze standaardtechniek voor de analyse van sarcomeer organisatie en subtype specificatie. Met behulp van een PM-GFP reporter muis, waren we in staat om een antilichaam panel voor het aantonen van drie belangrijke cardiale subtypes (AM, VM en PM) vormen. Vanwege beperkingen van antilichaamspecies beschikbaarheid en de beperking van 4-kanalen op een standaard microscoop confocale opstelling, twee dekglaasjes per subtype nodig zijn prevalentie van alle drie subtypen kwantificeren. Een dekglaasje zal vlek voor α-actinine / GFP (Hcn4) / Myl2, en één voor α-actinine / GFP (Hcn4) / NPPA. Gebaseerd op onze eerdere waarneming dat sarcomeer structuur een gemeenschappelijk kenmerk van alle CM's en een mogelijke voorwaarde voor subtype specificatie 21, de eerste stap in onze analyse de bepaling sarcomeer +cellen. Toch, als gevolg van de subjectieve aard, vaststelling van het niveau van de sarcomeer organisatie is misschien wel het moeilijkste deel van deze test; Dit kan worden beperkt door het gemiddelde kwantificering meerdere waarnemer of door het ontwikkelen computationele cel segmentatiesoftware om het proces te 30 automatiseren. Met behulp van endogene cellen als een referentiepunt, ontdekten we een drempel voor goed georganiseerde sarcomeer + en gebruikt dat om iCLMs (figuur 3) te scoren. Gezien deze parameters, wordt een gemiddelde experiment tot 20 geven - 30% α-actinine + cellen, maar slechts 1% zijn a-actinine + / + sarcomeer. Van de 1% sarcomeer + cellen, ~ 30% zal NPPA +, Myl2 + of Hcn4-GFP +.
Gezien het feit dat hartspiercellen structureel complex, bevolking op basis van genexpressie (bijvoorbeeld qRT-PCR) of doorstroomcytometrie analyses kunnen de ingewikkelde morfologische ch niet vangenanges die optreden tijdens iCLM herprogrammering. In tegenstelling patch klemmen en calcium voorbijgaande beeldvorming zijn zeer stringent eencellige functionele assays, maar gespecialiseerde vaardigheden en uitrusting nodig zijn om deze experimenten uit te voeren. Dus de beschreven methode is uniek omdat het een eenvoudige benadering van belangrijke structurele en functionele parameters van iCLM herprogrammering bestuderen zonder aanzienlijk afbreuk doorvoer.
Ondanks de vele recente ontwikkelingen in de directe herprogrammering, nog veel werk moet worden gedaan om beter inzicht in de moleculaire mechanismen die cardiale herprogrammering, en meer in het bijzonder, subtype specificatie regelt. Deze mechanismen zullen vooral belangrijk geworden om directe herprogrammering te vertalen naar klinische toepassingen. Daarom, in deze studie beschrijven we een platform rechtstreeks kan moduleren afzonderlijke parameters om de bijdrage sarcomeer ontwikkeling, subtype specificatie en iCLM rijpheid beoordelen. Moreover, kan dit systeem verder worden ontwikkeld om te werken in een high-throughput formaat waardoor complexe screenen van kleine moleculen of extracellulaire matrices voor de volgende stap in de regeneratieve cardiologie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma | D5796 | Component of iCLM media, Plat-E media, fibroblast, and Transfection media |
| Medium 199 | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | Component of iCLM media |
| Fetal bovine serrum (FBS) | Sigma | F2442 | Component of iCLM media, Plat-E media, fibroblast, and Transfection media |
| Insulin-Transferrin-Selenium G | Thermo Fisher Scientific | 41400-045 | Component of iCLM media |
| MEM vitamin solution | Thermo Fisher Scientific | 11120-052 | Component of iCLM media |
| MEM amino acids | Thermo Fisher Scientific | 1601149 | Component of iCLM media |
| Non-Essential amino acids | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | Component of iCLM media |
| Antibiotic-Antimycotics | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Component of iCLM media |
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | Component of iCLM media |
| Heat-Inactivated Horse Serum | Thermo Fisher Scientific | 26050-088 | Component of iCLM media |
| NaPyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360-70 | Component of iCLM media |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 1514022 | Component of Plat-E media and fibroblast media |
| Puromycin | Thermo Fisher Scientific | A11139-03 | Component of Plat-E media |
| Blasticidin | Gemini Bio-Products | 400-128P | Component of Plat-E media |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | Component of Fibroblast media |
| Confocal laser scanning LSM700 | Zeiss | For confocal analysis | |
| FuGENE 6 transfection Reagent | Promega | E2692 | Transfection reagent |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985-070 | Transfection reagent |
| Polybrene | Millipore | TR-1003-G | Induction reagent. Use at a final concentration of 8 μM/mL |
| Platinium-E (PE) Retroviral Packagin Cell Line, Ecotropic | CellBiolabs | RV-101 | Retroviral pacaking cell line |
| Trypsin 0.25% EDTA | Thermo Fisher Scientific | For MEFs and Plat-E dissociation | |
| Mouse anti α-Actinin (Clone EA-53) | Sigma | A7811 | Antibody for confocal analysis. Use at 1:200 |
| Chicken anti-GFP IgY | Thermo Fisher Scientific | A10262 | Antibody for confocal analysis. Use at 1:200 |
| Rabbit Pab anti-NPPA | Abgent | AP8534A | Antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Rabbit Pab anti Myl2 IgG | ProteinTech | 10906-1-AP | Antibody for confocal analysis. Use at 1:200 |
| Vectashield solution with DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Vector Labs | H-1500 | Dye for confocal analysis |
| Superfrost Plus Microscope slides | Thermo Fisher Scientific | 12-550-15 | 25 x 75 x 1.0 mm |
| BioCoat Fibronectin 12 mm coverslips | NeuVitro Corp | GG-12-1.5 | Coverslips for confocal analysis |
| 100 μm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| 0.45 μm Syringes filters SFCA 25MM | Thermo Fisher Scientific | 09-740-106 | For virus filtration |
| 6 mL Syringes | Covidien | 8881516937 | For virus filtration |
| Goat anti-Chicken IgY (H&L) A488 | Abcam | AB150169 | Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Donkey anti-rabbit A647 IgG(H+L) | Thermo Fisher Scientific | A31573 | Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Goat anti-mouse IgG(H+L) A555 | Thermo Fisher Scientific | A21422 | Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400 |
| Triton X-100 | Sigma | 93443-100ml | For cell permeabilization |
| Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS) | Sigma | D8537 | |
| Power Block 10x Universal Blocking reagent | Thermo Fisher Scientific | NC9495720 | Dilute to 1x in H2O |
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution (PFA) | Electro Microscopy Sciences | 15710 | Use at 4% diluted in dH2O |
| 6 cm plates | Olympus | 25-260 | |
| 6-well plates | Genesee Scientific | 25-105 | |
| 24-well plates | Genesee Scientific | 25-107 | |
| 10 cm Tissue culture dishes | Corning | 4239 | |
| 15 cm Tissue culture dishes | Thermo Fisher Scientific | 5442 | |
| 15 mL Conical tubes | Corning | 4308 | |
| 50 mL Conical tubes | Corning | 4249 | |
| 0.4% Trypan blue solution | Sigma | T8154 | For viability |
| Ethyl Alcohol 200 proof | Thermo Fisher Scientific | 7005 | |
| Bleach | Thermo Fisher Scientific | 6009 |
References
- Sissman, N. J. Developmental landmarks in cardiac morphogenesis: comparative chronology. Am J Cardiol. 25 (2), 141-148 (1970).
- Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nat Rev Genet. 6 (11), 826-835 (2005).
- Ali, S. R., et al. Existing cardiomyocytes generate cardiomyocytes at a low rate after birth in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (24), 8850-8855 (2014).
- Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
- Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493 (7432), 433-436 (2013).
- Lin, Z., Pu, W. T. Strategies for cardiac regeneration and repair. Sci Transl Med. 6 (239), 239rv231 (2014).
- Writing Group, M., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), e38-e360 (2016).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
- Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485 (7400), 593-598 (2012).
- Fu, J. D., et al. Direct reprogramming of human fibroblasts toward a cardiomyocyte-like state. Stem Cell Reports. 1 (3), 235-247 (2013).
- Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Akt1/protein kinase B enhances transcriptional reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (38), 11864-11869 (2015).
- Zhou, Y., et al. Bmi1 Is a Key Epigenetic Barrier to Direct Cardiac Reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 382-395 (2016).
- Zhao, Y., et al. High-efficiency reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes requires suppression of pro-fibrotic signalling. Nat Commun. 6, 8243 (2015).
- Miki, K., Yoshida, Y., Yamanaka, S. Making steady progress on direct cardiac reprogramming toward clinical application. Circ Res. 113 (1), 13-15 (2013).
- Atkinson, A., et al. Anatomical and molecular mapping of the left and right ventricular His-Purkinje conduction networks. J Mol Cell Cardiol. 51 (5), 689-701 (2011).
- Bootman, M. D., Smyrnias, I., Thul, R., Coombes, S., Roderick, H. L.
- Miquerol, L., Beyer, S., Kelly, R. G. Establishment of the mouse ventricular conduction system. Cardiovasc Res. 91 (2), 232-242 (2011).
- Später, D., Hansson, E. M., Zangi, L., Chien, K. R. How to make a cardiomyocyte. Development. 141 (23), 4418-4431 (2014).
- Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).
- Conner, D. A. Current Protocols in Molecular Biology. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), (2012).
- Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (17), 8033-8037 (1993).
- Ichim, C. V., Wells, R. A. Generation of high-titer viral preparations by concentration using successive rounds of ultracentrifugation. J Transl Med. 9, 137 (2011).
- Qian, L., Berry, E. C., Fu, J. D., Ieda, M., Srivastava, D. Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro. Nat Protoc. 8 (6), 1204-1215 (2013).
- Yang, R., et al. Direct conversion of mouse and human fibroblasts to functional melanocytes by defined factors. Nat Commun. 5, 5807 (2014).
- Muraoka, N., Ieda, M. Direct reprogramming of fibroblasts into myocytes to reverse fibrosis. Annu Rev Physiol. 76, 21-37 (2014).
- Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. Retroviruses. Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. , (1997).
- Bass, G. T., et al. Automated image analysis identifies signaling pathways regulating distinct signatures of cardiac myocyte hypertrophy. J Mol Cell Cardiol. 52 (5), 923-930 (2012).
