Summary
Denne protokol beskriver konfokal mikroskopi påvisning af G-protein-koblet receptor (GPCR) internalisering i pattedyrceller. Det omfatter grundlæggende cellekultur, transfektion, og konfokal mikroskopi procedure og tilvejebringer en effektiv og let fortolkelige metode til at påvise den subcellulære lokalisering og internalisering af fusion-udtrykte GPCR.
Introduction
Celler besidder fragt handel maskiner til at transportere ekstracellulære materialer-såsom ligander, mikroorganismer, næringsstoffer og transmembrane proteiner-ind i cellen for at få information, energi og andre formål 1, 2. Det er afgørende for cellulær homeostase, væv funktion, og den samlede celle overlevelse. Det cellebaserede ekspression af fluorescerende fusionsproteiner er en kraftfuld måde at studere lokaliseringen og internalisering af transmembrane receptorer, såsom G-proteinkoblede receptorer (GPCR), i signalveje 3.
Ekspressionen af fusionsproteiner mærket med grønt fluorescerende protein (GFP) fra goplen Aequorea victoria, kombineret med direkte fluorescens-detektionsteknikker, har vundet bred accept i protein-targeting forskning 4, 5, 6. GFP-baserede detectipå har den fordel, at den tidstro billeddannelse af levende celler samtidig undgå fikseringen artefakter 7. En række alsidige kloningsvektorer er blevet konstrueret til at lette ekspressionen af proteinfusioner til GFP i forskellige celler 8, 9. PEGFP-N1 vektor er en udbredt og kommercialiseret plasmidvektor der koder for et forstærket grønt fluorescerende protein (EGFP), der er optimeret fra vildtype GFP for lysere fluorescens og højere ekspression i mammale celler. At observere det fluorescerende signal af EGFP udtrykkes i pattedyrceller, bør fluorescensmikroskopi udføres med excitation ved 488 nm og emission ved 507 nm, fortrinsvis med konfokal mikroskopi.
Overvågning af subcellulære lokalisering og ligand-medieret internalisering af receptorer er en almindelig teknik til at undersøge signaltransduktion og funktion af GPCR'er 10 op>, 11. I de fleste tilfælde, internalisering fører til desensibilisering af GPCR'er (dæmpningen af stimulus respons på trods af tilstedeværelsen af agonister) 12, 13. De internaliserede receptorer kan inkorporeres i lysosomet og nedbrydes, eller de kan recirkuleres tilbage til celleoverfladen, afhængigt af arten af receptorerne og cellelinierne anvendt i forsøgene.
De gonadotropin-frigivende hormon-receptorer (GnRHR) tilhører GPCR-familien og har en typisk GPCR proteinstruktur, med et ekstracellulært aminoterminalt, et intracellulært -COOH terminal, og syv transmembrane (TM) domænerne 14. Transfektion af rekombinant plasmid Sj GnRH-R-EGFP (med GnRH-R-genet fra Sepiella japonica) og konfokal mikroskopi detektion af EGFP-mærkede Sj GnRH-R (udtrykt i HEK293-celler) blev rapporteret previously, og GFP-fluorescens blev etableret som en reporter for transmembran proteinlokalisering assays 15. Nu, internalisering af Sj GnRH-R, aktiveret af S. japonica gonadotropin-frigørende hormon (Sj GnRH), blev demonstreret i tids- og dosisafhængige måder ved konfokal mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellefremstilling
- Cell opsving
- Overfør kryokonserverede humane embryonale nyre 293 (HEK293) celler fra en flydende nitrogen beholder til et 37 ° C vandbad og ryst kontinuerligt til 1 - 2 min.
- Tilføje 10 ml ækvilibreret vækstmedium (Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM), 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin-opløsning) til en 10 cm celledyrkningsskål. Forsigtigt tilføje de optøede celler til den ækvilibrerede vækstmedium.
- Inkubér cellerne i et 37 ° C vandkappe CO2-inkubator med en fugtig atmosfære indeholdende 95% luft og 5% CO2 i 2 - 4 timer.
- Efter 2 - 4 timer, kontrollere, at cellerne er bundet. Erstatte den ækvilibrerede vækstmedium og kultur i yderligere 24 - 48 h.
BEMÆRK: Ændring den ækvilibrerede vækstmedium er nyttigt, fordi det fjerner dimethylsulfoxid (DMSO) og beskytter mod celleskader.
- <strong> Cell passage
- Efter 24 - 48 timer, når cellerne er vokset til nær konfluens, kassere den ækvilibrerede vækstmedium og vaske cellerne med 2 ml phosphatbufret saltvand (PBS). Swirl fadet forsigtigt.
- Kassér PBS og tilsættes 1 ml trypsin-EDTA (saltopløsning, 0,25% trypsin og 0,02% EDTA). For helt at fordøje cellerne, hvirvle skålen omhyggeligt og aspireres fra trypsin-EDTA-opløsning. Sætte fadet i 37 ° C vandkappe CO2-inkubator i 3 min.
BEMÆRK: I denne periode forberede tre nye 10-cm cellekulturskåle og tilsæt 10 ml ækvilibreret vækstmedium til hver. - Anvendelse af et lysmikroskop, afgøre, om cellerne er løftet fra bunden af skålen. Tilsæt 2 ml af ligevægt vækstmedium til fadet. Bland ved pipettering og straks pipetteres 0,6 ml af cellesuspensionen til hver af de nye retter. Bland forsigtigt ved pipettering og tillade cellerne at inkubere ved 37 ° C og 5% CO2.
2. Cell Seedning
- Efter 24 - 48 timer, da de passerede celler er vokset til nær konfluens, kassere den ækvilibrerede vækstmedium og vaske cellerne med 2 ml PBS. Swirl fadet forsigtigt.
- Kassér PBS og tilsættes 1 ml trypsin-EDTA. For helt at fordøje cellerne, hvirvle skålen omhyggeligt og aspireres fra Trypsin-EDTA. Sætte fadet i 37 ° C vandkappe CO2-inkubator i 3 min.
BEMÆRK: I denne periode fremstille en plade med 6 brønde ved tilsætning af 2 ml ækvilibreret vækstmedium til hver brønd. - Tilsæt 1 ml ækvilibreret vækstmedium til fadet, hvis, under mikroskopisk observation, at cellerne har løftet fra skålen bunden. Bland ved pipettering og straks pipetteres 0,1 ml cellesuspension (volumenet justeres i overensstemmelse med cellevæksten densitet) til hver brønd i den fremstillede plade med 6 brønde (celle-mindre plade med 6 brønde med 2 ml ækvilibreret vækstmedium). bland forsigtigt ved pipettering og tillade cellerneat inkubere ved 37 ° C og 5% CO2.
3. Cell transfektion
- Transfektionsmetode 1, med liposomformuleringer
BEMÆRK: Se venligst tabellen Materialer til transfektion reagens 1.- Den følgende dag, sikrer, at celler skal 85 - 95% sammenflydende.
- Tilsæt 3 ug plasmid-DNA (500 ng / pl) og 100 pi reduceret serum medier til et sterilt mikrocentrifugerør, og blandes forsigtigt. Der inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Forberede 9 pi reagens 1 og 100 pi reduceret serum medier i en anden mikrocentrifugerør, og blandes forsigtigt. Der inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Kombiner den fortyndede plasmid blandingen med fortyndet Reagens 1 (totalt volumen = 215 pi). Bland forsigtigt og inkuberes i 20 minutter ved stuetemperatur.
- Aspirer medium off celler-dyrkede plade, og tilsæt 1,5 ml frisk DMEM uden FBS.
- Tilføj 215 uL DNA-transffdeling reagensblanding til hver brønd dråbevis og blandes forsigtigt ved omrystning af pladen.
- Der inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2 i 4 - 8 timer. Erstatte med frisk DMEM med 10% FBS.
- Cellerne inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2 i yderligere 24 - 48 timer før drift af eventuelle forsøg.
- Transfektion metode 2, med liposomformuleringer
BEMÆRK: Se venligst tabellen Materialer til transfektion reagens 2.- Tilsæt 2 ug plasmid-DNA (500 ng / pl), 4 pi Reagens 2, og 100 pi reducerede serum medier i et sterilt mikrocentrifugerør. Bland forsigtigt og inkuberes i 15 minutter ved stuetemperatur.
- Tilføje transfektionsblandingen til cellerne på en dråbevis måde.
- Efter transfektion inkuberes celler i 24 - 48 timer ved 37 ° C og 5% CO2, før drift af eventuelle forsøg.
4. Cell Culture på dækglas
- Reflytte vækstmediet fra dyrkningspladen 6 brønde.
- Vask cellemonolaget med 1 ml PBS uden calcium og magnesium.
- Tilsæt 0,5 ml Trypsin-EDTA. Swirl fadet omhyggeligt og aspireres fra trypsin-EDTA. Inkubér dyrkningspladen i 3 minutter ved 37 ° C og 5% CO2. Den faktiske inkubationstid varierer med anvendte cellelinje.
BEMÆRK: I denne periode udarbejde en ny plade med 12 brønde og tilføj diameter på 15 mm steril dækglas til hver brønd. Dækglas overtrukket med lysin, laminin, eller collagen kan forbedre cellevedhæftning til HEK293-celler, der let løsrive. - Når celler er fritliggende, tilsættes 1 ml forvarmet fuldstændigt vækstmedium til hver brønd. Bland ved pipettering og straks overføre den nødvendige antal celler på 12-brønds plade med dækglas. Tilføje frisk fuldstændigt vækstmedium til hver brønd for at justere det totale volumen til 1 ml
- Inkubér cellerne i 16 - 24 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
BEMÆRK: Efter 30 -60 min, vil hovedparten af cellerne er klæbet til de sterile dækglas.
5. konfokal mikroskopi Detection
- Cellulær lokalisering
- Efter 16 - 24 timer, når cellerne er vokset til næsten konfluens på sterile dækglas i 12-brønds plade, tilføje membranen probe, Dil, til hver brønd, hvilket gav en slutkoncentration på 5 uM. Lade cellerne inkuberes i 30 minutter ved 37 ° C og 5% CO2.
- Efter 30 minutter fjernes den ækvilibrerede vækstmedium og vaskes cellerne to gange i kold PBS (2 - 8 ° C).
- Fikseres cellerne ved tilsætning af 1 ml af en 4% paraformaldehyd-opløsning (i PBS) til hver brønd. Ryst forsigtigt i 15 min.
Forsigtig: Paraformaldehyd er moderat toksisk ved hudkontakt eller indånding, og betegnet som en sandsynlig humant carcinogen. Kemikalier stinkskabe, ventilerede balance indhegninger eller andre beskyttelsesforanstaltninger bør anvendes under vejning og håndtering af paraformaldehyd. </ Li> - Vask de fikserede celler to gange i PBS. Tilføje 200-300 pi DAPI (4' , 6-diamidino-2-phenylindol) opløsning (0,5 ug / ml) til hver brønd og inkuberes i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Vask cellerne to gange med PBS. fjern forsigtigt dækglassene fra pladen og væge overskydende PBS. Invert på mikroskopobjektglas lastet med en dråbe monteringsmedium (50% volumen / volumen glycerol / vand). Fjern overskydende montering medium fra dias.
- Cellulær internalisering
- Efter 16 - 24 timer, når cellerne er vokset til næsten konfluens på sterile dækglas i 12-brønds plade, fjerne den ækvilibrerede vækstmedium og tilføje frisk, opvarmet DMEM-medium (37 ° C). Inkubér cellerne i 1 time ved 37 ° C og 5% CO2.
- Behandle cellerne med forskellige koncentrationer (0, 10 -12, 10 -9, og 10 -6 M) af ligand i 30 minutter og behandle dem med 10 -6 M ligand for forskellige tidspunkter (0,10, 30 og 60 min).
- Vask cellerne to gange i kold PBS (2 - 8 ° C). Fikseres cellerne ved tilsætning af 1 ml af en 4% paraformaldehyd-opløsning (i PBS) til hver brønd. Ryst forsigtigt i 15 min.
- Vask cellerne to gange i PBS. fjern forsigtigt dækglassene fra pladen og væge det overskydende PBS. Invert på mikroskopobjektglas lastet med en dråbe monteringsmedium (50% volumen / volumen glycerol / vand). Fjern overskydende montering medium fra dias.
- Konfokal mikroskopi
- Tænd for hardwaren i konfokalmikroskop, herunder kviksølvlampen magt, PC mikroskop, scanner, og laser. Login til operativsystemet konto, starte softwaren, kontrollere konfigurationen og vælg laser. Tænd de forskellige enheder af konfokal mikroskopi system i orden i henhold til vejledningen.
- Placer forberedt glider på mikroskopet scenen. Placer prøven over objektivlinsen hjælp scenen controlleren. Tilsæt en dråbe cedertræ olie påat dækglasset når immersionsolien linse er valgt. Placer dækglas på dias vender linsen.
- Find cellerne af interesse under fluorescerende mikroskopi.
- Skift til scanning-tilstand. Vælg laser magt og det spektrale område af emissionen fluoroforen. Fang den høje kvalitet konfokale billeder ved tuning laser intensitet og andre parametre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser et eksempel på et konfokalt mikroskop system. Figur 2 viser ekspressionen af pEGFP-N1 i HEK293-celler. GFP signal blev påvist i cytoplasmaet og kernen. Figur 3 viser den subcellulære lokalisering af GnRH-R fra S. japonica i HEK293-celler, i overensstemmelse med vores tidligere offentliggjorte resultater 15. Fusionsproteinet med EGFP-tag ved C-terminalen af Sj GnRH-R (Sj GnRH-R-EGFP) optrådte grøn i dette eksperiment, når under CLSM. Kernen farvet med DAPI blev afsløret i blåt. Dii farvning fremhævet cellemembranen i rødt. Den gule signal på celleoverfladen i det flettede billede indikerede sammenfald af rød og grøn, hvilket viser plasmamembranen lokalisering af Sj GnRH-R.
4 og 5 displayresultaterne af Sj GnRH-R internalisering assays i HEK293-celler. At visualisere internalisering af Sj GnRH-R, blev celler behandlet med gonadotropin-releasing hormon (Sj GnRH) 15 ved forskellige koncentrationer i 30 minutter (figur 4), eller de blev behandlet med en enkelt koncentration (10 - 6 M) for forskellige varigheder ( figur 5). I fravær af Sj GnRH, kontrol (CTL) receptorfusionen havde plasmamembran lokalisering. Som vist i figur 4, ved forskellige ligandkoncentrationer, internaliseringen af Sj GnRH-R fortsatte på en dosis-afhængig måde, og receptoren blev fuldstændig internaliseret fra celleoverfladen med 10 - 6 M ligand. Som vist i figur 5, resultaterne af tidsforløbet analyse af receptorinternalisering til punkt 10 - 6 M ligand viste, at internaliseretSj GnRH-R var påviselig 10 min efter agoniststimulering, og ekstrem internalisering opstod med 60 min. Observation med konfokal mikroskopi af disse to figurer viste, at det fluorescerende Sj GnRH-R-EGFP-fusionsproteinet blev primært lokaliseret i plasmamembranen og var dramatisk og hurtigt internaliseret i cellen som reaktion på Sj GnRH peptidet i HEK293-celler.
Figur 1. Et eksempel på en konfokalmikroskop System. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. konfokal mikroskopi af GFP-protein i Kontrol pEGFP-N1-transficerede HEK293-celler . Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Lokalisering af Sj GnRH-R-EGFP-fusionsprotein i HEK293 celler ved konfokal mikroskopi. Kernen farvet med DAPI, er vist i blåt. Dil farvning, vist med rødt, fremhæver cellemembranen. Sj GnRH-R-EGFP-fusionsproteinet er vist i grøn. I det flettede billede, gul indikerer sammenfaldet af de røde og grønne signaler. Alle billeder repræsenterer mindst tre uafhængige forsøg. Klik her for at se en større version af dette tal.
ig4.jpg"/>
Figur 4. Internalisering af Sj GnRH-R-EGFP-fusionsprotein i HEK293 Celler i en Tidsforløb af konfokal mikroskopi. HEK293-celler transficeret med Sj GnRH-R-EGFP plasmid blev aktiveret ved behandling med forskellige koncentrationer af GnRH i 30 minutter. kontrol tilfælde var uden GnRH-stimulering (CTL). Alle billeder repræsenterer mindst tre uafhængige forsøg. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Internalisering af Sj GnRH-R-EGFP-fusionsprotein i HEK293-celler på en dosisafhængig måde ved konfokal mikroskopi. HEK293-celler transficeret med Sj GnRH-R-EGFP plasmid blev aktiveret ved behandling til punkt 10 - 6 M ligand for forskellige durations. kontrol tilfælde var uden GnRH-stimulering (CTL). Alle billeder repræsenterer mindst tre uafhængige forsøg. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen præsenteres her tilvejebringer en effektiv og let fortolkelige metode til at påvise den subcellulære lokalisering og internalisering af udtrykt GPCR fusionsprotein i HEK293-celler. Teknikken kan let tilpasses til mange forskellige gener og celletyper, såsom til den cellulære lokalisering og internalisering af corazonin receptoren fra Bombyx mori i HEK293 og BMN celler 16.
Den vellykkede anvendelse af denne kraftfulde analyse bygger på et par vigtige faktorer. Først og fremmest er det et godt helbred af cellerne, hvilket er afgørende for effektiv transfektion og datakvalitet. Transfektionen inkubationstid intervallet mellem transfektion og andre forsøg og passagen af transficerede celler til at dække smutter før billeddannelse, er alle skridt, hvor beskadigelse af dyrkede celler er mulig. Derfor opretholde et godt helbred af cellerne er en vigtig forudsætning for alle trin i dette eksperiment. Desuden undgår tæt sammenpressede celler i tætte kulturer er afgørende for at erhverve billeder af høj kvalitet med konfokal mikroskopi. At mindske virkningen af det fluorescerende mærke på lokaliseringen af GPCR'er frembragte vi receptorer med EGFP fusioneret til det intracellulære C-terminalen. En vellykket og effektiv transfektion af genet i cellerne er også vigtig. Transfektionseffektivitet kan variere meget i forskellige cellelinier. Derfor kan optimeringen af visse trin i protokollen være nødvendigt, afhængigt af den særlige celletype anvendes. For eksempel i transfektionsmetode 1, inkubationen varigheden af transficerede celler i DMEM uden FBS kunne optimeres i overensstemmelse med cellens tilstand. Ud over den dosis af DNA-plasmidet, bør doseringen af liposomet reagens og reducerede serummedier justeres efter specifikke cellelinier. Ellers kan electrotransfection teknik udføres i stedet for liposom-reagens medieret transfektion feller acceptable transfektionseffektivitet i et specifikt cellelinie. Imidlertid yderligere hardware påkrævet, og celler i suspension og i et lille volumen er vanskelige at transficere ved electrotransfection. Sande styrke den nuværende assay ligger imidlertid i sammenligningen mellem ændringer i de samme celler under identiske dyrkningsbetingelser efter akutte manipulationer, såsom internalisering af Sj GnRH-R i afhængighed af Sj GnRH ligand.
Internalisering er en af de fremherskende mekanismer, der styrer GPCR signalering for at sikre passende cellulære reaktioner på stimuli, 11. Vi kan nemt observere ændringer i internalisering gennem billeddannelse med konfokal mikroskopi. Internalisering af Sj GnRH-R på en dosis- og tidsafhængig måde er tydeligt afsløret i figur 4.
Protokollen vi har beskrevet kan let tilpasses til den subcellulære sporing af andre eukaryote PRoteins, såsom nukleare estrogenreceptoren 17. optimering af visse trin i protokollen, vil dog være nødvendigt, afhængigt af de særlige celletyper anvendt, hvilket vil kræve yderligere udforskning og praksis. Ikke desto mindre i betragtning af at den subcellulære lokalisering af proteiner har en stor indflydelse på identifikation af gener, proteinmodifikationer, og signalveje, denne protokol, baseret på den offentliggjorte forskning, kan give pålidelige data og information.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEK293 cell line | |||
| DMEM/High glucose | Hyclone | SH30022.01 | High glucose 4.0 mM L-glutamine |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | PuFei | 1101-100 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Genom | GNM10010 | |
| Penicillin-Streptomycin | Genom | GNM15140 | |
| 0.25% Trypsin & 0.02% EDTA | Genom | GNM25200 | |
| Opti-MEM (1x) | GIBCO, by Life Technologies | 31985-062 | reduced serum media |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668027 | Reagent 1 |
| X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent | Roche | 6366236001 | Reagent 2 |
| DAPI Staining Solution | Beyotime | C1006 | |
| DiI | Beyotime | C1036 | |
| Antifade Mounting Medium | Beyotime | P0126 | |
| Paraformaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent Co.(SCRC) | 80096618 | |
| 100 mm cell culture | CORNING | 430167 | |
| 6-well plate | ExCell Bio | CS016-0092 | |
| 12-well plate | ExCell Bio | CS016-0093 | |
| Cover Glass | NEST | 801007 | |
| Microscope Slides | Citoglas | 10127105P-G | |
| Thermo Scientific Forma CO2 Incubator | Thermo | 3111 | |
| TCS SP5II laser scanning confocal microscope | Leica | 5100001311 |
References
- Mellman, I.
- Hausott, B., Klimaschewski, L. Membrane turnover and receptor trafficking in regenerating axons. Eur J Neuro. 43, 309-317 (2016).
- Kallal, L., Benovic, J. L. Using green fluorescent proteins to study G-protein-coupled receptor localization and trafficking. Trends Pharmacol Sci. 21, 175-180 (2000).
- Prasher, D. C., Eckenrode, V. K., Ward, W. W., Prendergast, F. G., Cormier, M. J. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. Gene. 111, 229-233 (1992).
- Spector, D. L., Goldman, R. D. Constructing and Expressing GFP Fusion Proteins. CSH protocols. 2006, (2006).
- Drew, D. E., von Heijne, G., Nordlund, P., de Gier, J. W. Green fluorescent protein as an indicator to monitor membrane protein overexpression in Escherichia coli. FEBS Lett. 507, 220-224 (2001).
- von Arnim, A. G., Deng, X. W., Stacey, M. G. Cloning vectors for the expression of green fluorescent protein fusion proteins in transgenic plants. Gene. 221, 35-43 (1998).
- Webb, C. D., Decatur, A., Teleman, A., Losick, R. Use of green fluorescent protein for visualization of cell-specific gene expression and subcellular protein localization during sporulation in Bacillus subtilis. J Bacteriol. 177, 5906-5911 (1995).
- Kain, S. R., et al. Green fluorescent protein as a reporter of gene expression and protein localization. BioTechniques. 19, 650-655 (1995).
- Fukunaga, S., Setoguchi, S., Hirasawa, A., Tsujimoto, G. Monitoring ligand-mediated internalization of G protein-coupled receptor as a novel pharmacological approach. Life Sci. 80, 17-23 (2006).
- Yang, J., et al. Agonist-Activated Bombyx Corazonin Receptor Is Internalized via an Arrestin-Dependent and Clathrin-Independent Pathway. Biochemistry. 55, 3874-3887 (2016).
- Kohout, T. A., Lefkowitz, R. J. Regulation of G protein-coupled receptor kinases and arrestins during receptor desensitization. Mol Pharmacol. 63, 9-18 (2003).
- Ferguson, S. S., et al. Role of beta-arrestin in mediating agonist-promoted G protein-coupled receptor internalization. Science. 271, 363-366 (1996).
- Stojilkovic, S. S., Reinhart, J., Catt, K. J. Gonadotropin-releasing hormone receptors: structure and signal transduction pathways. Endocr Rev. 15, 462-499 (1994).
- Yan, Y. J., et al. Identification and Expression Profile of the Gonadotropin-Releasing Hormone Receptor in Common Chinese Cuttlefish, Sepiella japonica. J Exp Zool A Ecol Genet Physiol. , (2016).
- Yang, J., et al. Specific activation of the G protein-coupled receptor BNGR-A21 by the neuropeptide corazonin from the silkworm, Bombyx mori, dually couples to the G(q) and G(s) signaling cascades. J Biol Chem. 288, 11662-11675 (2013).
- Lu, Z. M., et al. Cloning, Characterization, and Expression Profile of Estrogen Receptor in Common Chinese Cuttlefish, Sepiella japonica. J Exp Zool A Ecol Genet Physiol. 325, 181-193 (2016).
