Summary
يصف هذا البروتوكول كشف الفحص المجهري متحد البؤر من مستقبلات البروتين يقترن-G (GPCR) تدخيل في خلايا الثدييات. ويشمل الثقافة الأساسية الخلية، ترنسفكأيشن، وإجراء الفحص المجهري متحد البؤر، ويوفر وسيلة فعالة وللتفسير بسهولة للكشف عن توطين التحت خلوية واستيعاب GPCR-أعرب الانصهار.
Introduction
خلايا تمتلك البضائع الآلات الاتجار لنقل مواد مثل بروابط، والكائنات الدقيقة، والمغذيات، والبروتينات في الغشاء الخلية للحصول على معلومات، والطاقة، وغيرها من الأغراض 1، 2 خارج الخلية. ومن الأهمية بمكان للالتوازن الخلوي، وظيفة الأنسجة، وبقاء الخلية بشكل عام. التعبير القائم على خلية من البروتينات الانصهار فلوري هو وسيلة قوية لدراسة توطين واستيعاب مستقبلات الغشاء، مثل G مستقبلات البروتين يقترن (GPCR)، في مسارات الإشارات 3.
وقد اكتسب التعبير عن البروتينات الانصهار ذات الكلمات الدلالية مع الأخضر بروتين فلوري (GFP) من فيكتوريا قنديل البحر Aequorea، جنبا إلى جنب مع تقنيات الكشف عن مضان المباشر، قبولا واسعا في استهداف بروتين البحوث 4، 5، 6. detecti القائم GFPعلى ديها ميزة تسمح للتصوير في الوقت الحقيقي من الخلايا الحية مع تجنب القطع الأثرية تثبيت 7. وقد تم بناؤها سلسلة من ناقلات الاستنساخ متعددة لتسهيل التعبير عن اندماج البروتين GFP في مختلف خلايا 8 و 9. متجه pEGFP-N1 هو متجه البلازميد تستخدم على نطاق واسع وتسويقها ترميز لتعزيز البروتين الفلوري الأخضر (EGFP)، والتي تم الأمثل من النوع البري GFP لأكثر إشراقا مضان والتعبير العالي في خلايا الثدييات. لمراقبة أعربت إشارة الفلورسنت من EGFP في خلايا الثدييات، ينبغي إجراء الفحص المجهري مضان مع الإثارة في 488 نانومتر، وانبعاث في 507 نانومتر، ويفضل مع المجهر متحد البؤر.
رصد توطين التحت خلوية واستيعاب بوساطة يجند مستقبلات هي تقنية مشتركة للتحقيق في نقل الإشارة وظيفة GPCRs 10 11. في معظم الحالات، واستيعاب يؤدي إلى الحساسية من GPCRs (تخفيف من الاستجابة التحفيز على الرغم من وجود منبهات) 12، 13. ويمكن إدراج المستقبلات المنضوية في يحلول والمتدهورة، أو أنها يمكن إعادة تدويرها مرة أخرى إلى سطح الخلية، وهذا يتوقف على طبيعة المستقبلات وخطوط الخلايا المستخدمة في التجارب.
مستقبلات هرمون موجهة الغدد التناسلية الافراج عن (GnRHRs) تنتمي إلى عائلة GPCR ولديها بنية البروتين GPCR نموذجي، مع محطة الأمينية خارج الخلية، محطة -COOH داخل الخلايا، وسبعة الغشاء (TM) 14 المجالات. وأفاد ترنسفكأيشن البلازميد المؤتلف صج GnRHR-EGFP (مع الجين GnRHR من Sepiella تفرضه اليابان) وكشف الفحص المجهري متحد البؤر من الموسومة EGFP صج GnRHR (معبرا في الخلايا HEK293) بريفيوخبيث، وتأسست مضان GFP كمراسلة للبروتين الغشاء فحوصات توطين 15. الآن، واستيعاب صج GnRHR، تفعيلها من خلال S. الجابونيكا بين الافراج عن هرمون موجهة الغدد التناسلية (SJ نره])، وقد تجلى في الأدب زمنية وتعتمد على الجرعة عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. خلية التحضير
- انتعاش خلية
- نقل الجنينية الكلى 293 (HEK293) الخلايا البشرية cryopreserved من خزان النتروجين السائل ل37 ° C حمام الماء ويهز مستمر 1 - 2 دقيقة.
- إضافة 10 مل من متوسط النمو معايرتها (وسط المعدلة النسر Dulbecco وفي (DMEM)، و 10٪ الجنين المصل البقري (FBS)، و 1٪ البنسلين ستربتومايسين الحل) إلى 10 سم، وطبق ثقافة الخلية. إضافة بلطف الخلايا إذابة إلى وسط النمو معايرتها.
- احتضان الخلايا في 37 ° C CO 2 حاضنة تغلف المياه مع جو مرطب يحتوي على 95٪ الجوية و 5٪ CO 2 ل2-4 ساعة.
- بعد 2-4 ساعة، تأكد من أن يتم إرفاق الخلايا. استبدال المتوسطة النمو معايرتها والثقافة لمدة 24 آخر - 48 ساعة.
ملاحظة: تغيير المتوسطة النمو معايرتها هو مفيد لأنه يزيل سلفوكسيد ثنائي ميثيل (DMSO) ويحمي الخلايا من التلف.
- <قوي> مرور خلية
- بعد 24 - 48 ساعة، وعندما نمت الخلايا لالتقاء القريب، تجاهل المتوسطة النمو معايرتها وغسل الخلايا مع 2 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). دوامة طبق بلطف.
- تجاهل PBS وإضافة 1 مل من التربسين-EDTA (المالحة، 0.25٪ التربسين، و 0.02٪ EDTA). لهضم تماما الخلايا، دوامة الطبق بعناية ونضح من الحل التربسين-EDTA. وضع الطبق في 37 ° C CO 2 حاضنة تغلف الماء لمدة 3 دقائق.
ملاحظة: خلال هذه الفترة، وإعداد ثلاثة أطباق جديدة خلية ثقافة 10 سم وإضافة 10 مل من متوسط النمو معايرتها لكل منهما. - باستخدام المجهر الضوئي، تحديد ما إذا كان قد رفع الخلايا من الجزء السفلي من الطبق. إضافة 2 مل من متوسط النمو معايرتها إلى الطبق. مزيج من قبل pipetting والماصة على الفور 0.6 مل من خلية إلى تعليق كل من الأطباق الجديدة. المزيج بلطف قبل pipetting وتسمح للخلايا لاحتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
2. خلية البذر
- بعد 24 - 48 ساعة، وعندما نمت الخلايا passaged إلى قرب التقاء، تجاهل المتوسطة النمو معايرتها وغسل الخلايا مع 2 مل من برنامج تلفزيوني. دوامة طبق بلطف.
- تجاهل PBS وإضافة 1 مل من التربسين-EDTA. لهضم تماما الخلايا، دوامة الطبق بعناية ونضح قبالة التربسين-EDTA. وضع الطبق في 37 ° C CO 2 حاضنة تغلف الماء لمدة 3 دقائق.
ملاحظة: خلال هذه الفترة، وإعداد لوحة 6 جيدا بإضافة 2 مل من متوسط النمو معايرتها إلى كل بئر. - إضافة 1 مل من متوسط النمو معايرتها إلى الطبق، إذا، تحت الملاحظة المجهرية، والخلايا قد رفع من قاع الطبق. مزيج من قبل pipetting وعلى الفور الماصة 0.1 مل من تعليق خلية (يتم ضبط حجم وفقا لكثافة نمو الخلايا) إلى كل بئر من إعداد لوحة 6 جيدا (خلايا أقل 6 جيدا لوحة مع 2 مل من متوسط النمو معايرتها). المزيج بلطف قبل pipetting وتسمح للخلايالاحتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
3. خلية ترنسفكأيشن
- طريقة ترنسفكأيشن 1، مع التركيبات الحويصلية
ملاحظة: يرجى الاطلاع على جدول المواد للترنسفكأيشن الكاشف 1.- في اليوم التالي، وضمان أن الخلايا يجب أن يكون 85-95٪ متموجة.
- إضافة 3 ميكروغرام من البلازميد (500 نانوغرام / ميكرولتر) و 100 ميكرولتر من وسائل الاعلام المصل خفضت إلى أنبوب microcentrifuge العقيمة، وتخلط بلطف. احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- إعداد 9 ميكرولتر من الكاشف 1 و 100 ميكرولتر من وسائل الاعلام المصل انخفاض في أنبوب microcentrifuge آخر، وتخلط بلطف. احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- الجمع بين خليط البلازميد المخفف مع الكاشف المخفف 1 (إجمالي حجم = 215 ميكرولتر). المزيج بلطف واحتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- نضح المتوسطة من لوحة الخلايا مثقف، وإضافة 1.5 مل DMEM جديدة دون FBS.
- إضافة 215 ميكرولتر من الحمض النووي transfection كاشف المزيج على كل قطرة قطرة جيدا، وتخلط بلطف يحوم اللوحة.
- احتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 ل4-8 ساعة. استبدال DMEM جديدة مع 10٪ FBS.
- احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 24 آخر - 48 ساعة قبل تشغيل أي التجارب.
- طريقة ترنسفكأيشن 2، مع صيغ الحويصلية
ملاحظة: يرجى الاطلاع على جدول المواد للترنسفكأيشن الكاشف 2.- إضافة 2 ميكروغرام من البلازميد (500 نانوغرام / ميكرولتر)، و 4 ميكرولتر من الكاشف 2، و 100 ميكرولتر تخفيض وسائل الاعلام المصل في أنبوب microcentrifuge العقيمة. المزيج بلطف واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- يضاف خليط ترنسفكأيشن إلى الخلايا بطريقة قطرة قطرة.
- بعد ترنسفكأيشن، واحتضان الخلايا لمدة 24 - 48 ساعة عند 37 ° C وCO 2 5٪، قبل تشغيل أي التجارب.
4. زراعة الخلايا على زلات تغطية
- إعادةنقل متوسطة النمو من ثقافة لوحة 6 جيدا.
- غسل أحادي الطبقة الخلية مع 1 مل من برنامج تلفزيوني بدون الكالسيوم والمغنيسيوم.
- إضافة 0.5 مل التربسين-EDTA. دوامة الطبق بعناية ونضح قبالة التربسين-EDTA. احتضان لوحة الثقافة لمدة 3 دقائق عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. فترة حضانة الفعلي يختلف مع خط الخلية المستخدمة.
ملاحظة: خلال هذه الفترة، وإعداد جديدة لوحة 12 جيدا وإضافة 15 مم غطاء معقم ينزلق إلى كل بئر. زلات تغطية المغلفة مع يسين، laminin، أو الكولاجين قد تحسن مرفق الخلية لخلايا HEK293 أن فصل بسهولة. - عندما يتم فصل الخلايا، إضافة استعد قبل 1 مل متوسطة النمو الكامل إلى كل بئر. مزيج من قبل pipetting ونقل على الفور العدد المطلوب من الخلايا إلى صفيحة ال 12 جيدا مع زلات الغطاء. إضافة متوسطة النمو الكامل الطازجة إلى كل بئر لضبط الحجم الكلي ل1 مل
- احتضان الخلايا لمدة 16-24 ساعة عند 37 ° C وCO 2 5٪.
ملاحظة: بعد 30 -60 دقيقة، والغالبية العظمى من الخلايا وانضمت إلى زلات غطاء العقيمة.
5. الكشف المجهري متحد البؤر
- توطين الخلوية
- بعد 16-24 ساعة، وعندما نمت الخلايا لالتقاء القريب على زلات غطاء العقيمة في لوحة ال 12 أيضا، إضافة التحقيق الغشاء، الجاذبة، إلى كل بئر، وإعطاء تركيز النهائي من 5 ميكرومتر. السماح للخلايا لاحتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
- بعد 30 دقيقة، وإزالة المتوسطة النمو معايرتها وغسل الخلايا مرتين في برنامج تلفزيوني الباردة (2-8 درجة مئوية).
- إصلاح الخلايا عن طريق إضافة 1 مل من محلول بارافورمالدهيد 4٪ (في PBS) إلى كل بئر. تستنهض الهمم بلطف لمدة 15 دقيقة.
تحذير: امتصاص العرق بشكل معتدل السامة عن طريق ملامسة الجلد أو الاستنشاق، ويعين على أنه مسرطن بشري محتمل. المواد الكيميائية يستشيطون غضبا اغطية والأسوار التوازن تنفيس أو تدابير وقائية أخرى يجب أن يستعمل أثناء التعامل مع وزنها وامتصاص العرق. </ لى> - غسل الخلايا الثابتة مرتين في برنامج تلفزيوني. إضافة 200-300 ميكرولتر من دابي (4، 6 diamidino-2-phenylindole) حل (0.5 ميكروغرام / مل) إلى كل بئر واحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني. إزالة بعناية زلات غطاء من لوحة والفتيل قبالة الزائدة PBS. عكس على الشرائح المجهر محملة قطرة واحدة من متوسطة تركيب (50٪ ت / ت الجلسرين / الماء). إزالة المتوسطة المتزايدة الزائدة من الشرائح.
- استيعاب الخلوي
- بعد 16-24 ساعة، وعندما نمت الخلايا لالتقاء القريب على زلات غطاء العقيمة في لوحة ال 12 أيضا، وإزالة المتوسطة النمو معايرتها وإضافة جديدة، تحسنت DMEM المتوسطة (37 ° C). احتضان الخلايا لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
- علاج الخلايا مع تركيزات مختلفة (0، 10 -12، 10 -9، و 10 -6 M) يجند لمدة 30 دقيقة وتعاملهم مع 10 -6 M يجند في أوقات مختلفة (0،10، 30، و 60 دقيقة).
- غسل الخلايا مرتين في برنامج تلفزيوني الباردة (2-8 درجة مئوية). إصلاح الخلايا عن طريق إضافة 1 مل من محلول بارافورمالدهيد 4٪ (في PBS) إلى كل بئر. تستنهض الهمم بلطف لمدة 15 دقيقة.
- غسل الخلايا مرتين في برنامج تلفزيوني. إزالة بعناية زلات غطاء من لوحة والفتيل قبالة الزائدة PBS. عكس على الشرائح المجهر محملة قطرة واحدة من متوسطة تركيب (50٪ ت / ت الجلسرين / الماء). إزالة المتوسطة المتزايدة الزائدة من الشرائح.
- المجهر متحد البؤر
- تشغيل الأجهزة المجهر متحد البؤر، بما في ذلك الطاقة مصباح الزئبق، المجهر PC، الماسح الضوئي، والليزر. تسجيل الدخول إلى حساب نظام التشغيل، وإطلاق البرنامج، والتحقق من التكوين واختيار الليزر. تشغيل وحدات مختلفة من نظام الفحص المجهري متحد البؤر في النظام وفقا للتعليمات.
- ضع الشرائح التي أعدت على المسرح المجهر. ضع العينة على العدسة الشيئية باستخدام وحدة تحكم المرحلة. إضافة قطرة واحدة من زيت الأرز علىإلى ساترة عند تحديد عدسة الغمر النفط. ضع زلات غطاء على الشرائح التي تواجه العدسة.
- العثور على خلايا الفائدة تحت المجهر الفلورسنت.
- التبديل إلى وضع المسح الضوئي. اختيار قوة الليزر والنطاق الطيفي للfluorophore الانبعاثات. التقاط صور ذات جودة عالية مبائر من شدة ضبط الليزر وغيرها من المعالم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويبين الشكل 1 مثالا لنظام المجهر متحد البؤر. ويبين الشكل 2 التعبير عن pEGFP-N1 في الخلايا HEK293. تم الكشف عن إشارة GFP في السيتوبلازم والنواة. ويبين الشكل 3 توطين التحت خلوية من GnRHR من S. تفرضه اليابان في الخلايا HEK293، بما يتفق مع نتائجنا نشرت سابقا 15. البروتين الانصهار مع العلامة EGFP في C-محطة من سج GnRHR (SJ GnRHR-EGFP) ظهر الأخضر في هذه التجربة عندما تحت CLSM. تم الكشف عن نواة ملطخة دابي في الزرقاء. أبرز تلطيخ الجاذبة غشاء الخلية باللون الأحمر. وأشارت إشارة صفراء على سطح الخلية في الصورة المدمجة تزامن الأحمر والأخضر، مما يدل على توطين غشاء البلازما من GnRHR صج.
أرقام 4 و 5 عرضنتائج فحوصات استيعاب صج GnRHR في الخلايا HEK293. لتصور استيعاب صج GnRHR، تم علاج الخلايا مع إطلاق موجهة الغدد التناسلية هرمون (SJ نره]) 15 بتركيزات مختلفة لمدة 30 دقيقة (الشكل 4)، أو أنهم يعاملون معاملة مع تركيز واحد (10-6 M) لفترات مختلفة ( الشكل 5). في غياب نره سج، وكان التحكم (CTL) مستقبلات الانصهار غشاء البلازما توطين. كما هو مبين في الشكل (4)، بتركيزات مختلفة يجند، واستيعاب للصج GnRHR شرع بطريقة تعتمد على الجرعة، ومستقبلات المنضوية تماما من على سطح الخلية التي تحتوي على 10 - يجند 6 M. كما هو مبين في الشكل (5)، ونتائج التحليل مرة خلال استيعاب مستقبلات مع 10 - تظاهر 6 M يجند أن المنضويةكان صج GnRHR كشف 10 دقيقة بعد التحفيز ناهض، وحدث استيعاب المدقع بحلول 60 دقيقة. كشفت المراقبة مع المجهر متحد البؤر من هذين الرقمين أن الفلورسنت صج GnRHR-EGFP انصهار بروتين كان مترجم في المقام الأول في غشاء البلازما وكان بشكل كبير وبسرعة المنضوية في الخلية ردا على الببتيد صج نره في الخلايا HEK293.
الشكل 1. مثال لنظام مجهر متحد البؤر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. متحد البؤر المجهري من البروتين GFP في مراقبة pEGFP-N1-transfected HEK293 الخلايا . الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. توطين البروتين صج GnRHR-EGFP فيوجن في خلايا HEK293 التي كتبها متحد البؤر المجهري. يظهر نواة ملطخة دابي في الزرقاء. تلطيخ الجاذبة، كما هو موضح باللون الأحمر، يسلط الضوء على غشاء الخلية. ويرد صج GnRHR-EGFP انصهار بروتين باللون الأخضر. في الصورة المدمجة والأصفر يشير إلى تزامن الإشارات الحمراء والخضراء. تمثل كل الصور لا يقل عن ثلاث تجارب مستقلة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
ig4.jpg "/>
الشكل 4. التطبع البروتين صج GnRHR-EGFP فيوجن في خلايا HEK293 في دورة الزمن من قبل متحد البؤر المجهري. تم تنشيط خلايا HEK293 transfected مع سج GnRHR-EGFP البلازميد عن طريق العلاج مع تركيزات مختلفة من نره لمدة 30 دقيقة. وكانت القضية السيطرة من دون التحفيز نره (CTL). تمثل كل الصور لا يقل عن ثلاث تجارب مستقلة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5. التطبع البروتين صج GnRHR-EGFP فيوجن في خلايا HEK293 في الجرعة بطريقة تعتمد من قبل متحد البؤر المجهري. تم تنشيط خلايا HEK293 transfected مع سج GnRHR-EGFP البلازميد عن طريق العلاج مع 10-6 M يجند لد مختلفةurations. وكانت القضية السيطرة من دون التحفيز نره (CTL). تمثل كل الصور لا يقل عن ثلاث تجارب مستقلة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
بروتوكول المعروضة هنا يوفر وسيلة فعالة وللتفسير بسهولة للكشف عن توطين التحت خلوية واستيعاب أعرب GPCR انصهار بروتين في الخلايا HEK293. هذه التقنية يمكن تكييفها بسهولة للعديد من جينات مختلفة وأنواع الخلايا، مثل لتوطين الخلوية واستيعاب مستقبلات corazonin من دودة القز في HEK293 وBMN خلايا 16.
التطبيق الناجح لهذا الاختبار قوي يعتمد على عدد قليل من العوامل الرئيسية. قبل كل شيء هو الصحة الجيدة من الخلايا، وهو أمر ضروري لترنسفكأيشن كفاءة وجودة البيانات. الساعة ترنسفكأيشن الحضانة، الفترة الزمنية الفاصلة بين ترنسفكأيشن وتجارب أخرى، ومرور الخلايا transfected لتغطية زلات قبل التصوير، وكلها خطوات حيث الأضرار التي لحقت الخلايا المستزرعة ممكن. لذلك، والحفاظ على صحة جيدة للخلايا هو شرط هام لجميع الخطوات في هذه التجربة. وعلاوة على ذلك، وتجنب الخلايا مضغوط بإحكام في الثقافات كثيفة أمر حيوي من أجل الحصول على صور ذات جودة عالية مع المجهر متحد البؤر. للحد من تأثير العلامة الفلورسنت على توطين GPCRs، ولدت لنا مستقبلات مع EGFP تنصهر إلى داخل الخلايا C-محطة. ترنسفكأيشن ناجحة وفعالة من الجينات إلى خلايا مهم أيضا. قد تختلف كفاءة ترنسفكأيشن إلى حد كبير في خطوط مختلفة من الخلايا. لذلك، قد يكون الأمثل للخطوات معينة في البروتوكول الضروري، اعتمادا على نوع من الخلايا معينة المستخدمة. على سبيل المثال، في طريقة ترنسفكأيشن 1، يمكن أن يكون الأمثل مدة حضانة الخلايا transfected في DMEM بدون FBS وفقا لحالة الخلية. بالإضافة إلى جرعة من البلازميد DNA، يجب تعديل جرعة كاشف الجسيمات الشحمية وانخفاض وسائل الاعلام المصل وفقا لخطوط الخلايا المحددة. خلاف ذلك، يمكن إجراء تقنية electrotransfection بدلا من الحويصلية كاشف بوساطة ترنسفكأيشن وأو كفاءة ترنسفكأيشن مقبولة في خط خلية معينة. ومع ذلك، هناك حاجة إلى أجهزة إضافية، والخلايا في تعليق وفي حجم صغير من الصعب ل transfect التي كتبها electrotransfection. القوة الحقيقية للمقايسة الحالي، ومع ذلك، يكمن في المقارنة بين التغيرات في الخلايا نفسها في ظل ظروف ثقافة مماثلة بعد التلاعب الحادة، مثل استيعاب GnRHR صج ردا على يجند صج نره.
التطبع هي واحدة من الآليات السائدة السيطرة GPCR إشارات لضمان الاستجابات الخلوية المناسبة للمنبهات 11. يمكننا أن نلاحظ بسهولة التغييرات في استيعاب من خلال التصوير مع المجهر متحد البؤر. وكشفت تدخيل GnRHR صج في الجرعة وطريقة تعتمد على الوقت بشكل واضح في الشكل (4).
بروتوكول صفناها يمكن أن تتكيف بسهولة مع تعقب التحت خلوية من العلاقات العامة حقيقية النواة أخرىoteins، مثل مستقبلات هرمون الاستروجين النووي 17. ومع ذلك، فإن الاستفادة المثلى من خطوات معينة في البروتوكول يكون من الضروري، اعتمادا على أنواع الخلايا معينة المستخدمة، والتي سوف تحتاج إلى مزيد من الاستكشاف والممارسة. ومع ذلك، بالنظر إلى أن الموقع التحت خلوية من البروتينات له تأثير كبير على التعرف على الجينات، والتعديلات البروتين، ومسارات الإشارات، هذا البروتوكول، استنادا إلى الأبحاث المنشورة، يمكن أن توفر بيانات ومعلومات موثوقة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEK293 cell line | |||
| DMEM/High glucose | Hyclone | SH30022.01 | High glucose 4.0 mM L-glutamine |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | PuFei | 1101-100 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Genom | GNM10010 | |
| Penicillin-Streptomycin | Genom | GNM15140 | |
| 0.25% Trypsin & 0.02% EDTA | Genom | GNM25200 | |
| Opti-MEM (1x) | GIBCO, by Life Technologies | 31985-062 | reduced serum media |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668027 | Reagent 1 |
| X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent | Roche | 6366236001 | Reagent 2 |
| DAPI Staining Solution | Beyotime | C1006 | |
| DiI | Beyotime | C1036 | |
| Antifade Mounting Medium | Beyotime | P0126 | |
| Paraformaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent Co.(SCRC) | 80096618 | |
| 100 mm cell culture | CORNING | 430167 | |
| 6-well plate | ExCell Bio | CS016-0092 | |
| 12-well plate | ExCell Bio | CS016-0093 | |
| Cover Glass | NEST | 801007 | |
| Microscope Slides | Citoglas | 10127105P-G | |
| Thermo Scientific Forma CO2 Incubator | Thermo | 3111 | |
| TCS SP5II laser scanning confocal microscope | Leica | 5100001311 |
References
- Mellman, I.
- Hausott, B., Klimaschewski, L. Membrane turnover and receptor trafficking in regenerating axons. Eur J Neuro. 43, 309-317 (2016).
- Kallal, L., Benovic, J. L. Using green fluorescent proteins to study G-protein-coupled receptor localization and trafficking. Trends Pharmacol Sci. 21, 175-180 (2000).
- Prasher, D. C., Eckenrode, V. K., Ward, W. W., Prendergast, F. G., Cormier, M. J. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. Gene. 111, 229-233 (1992).
- Spector, D. L., Goldman, R. D. Constructing and Expressing GFP Fusion Proteins. CSH protocols. 2006, (2006).
- Drew, D. E., von Heijne, G., Nordlund, P., de Gier, J. W. Green fluorescent protein as an indicator to monitor membrane protein overexpression in Escherichia coli. FEBS Lett. 507, 220-224 (2001).
- von Arnim, A. G., Deng, X. W., Stacey, M. G. Cloning vectors for the expression of green fluorescent protein fusion proteins in transgenic plants. Gene. 221, 35-43 (1998).
- Webb, C. D., Decatur, A., Teleman, A., Losick, R. Use of green fluorescent protein for visualization of cell-specific gene expression and subcellular protein localization during sporulation in Bacillus subtilis. J Bacteriol. 177, 5906-5911 (1995).
- Kain, S. R., et al. Green fluorescent protein as a reporter of gene expression and protein localization. BioTechniques. 19, 650-655 (1995).
- Fukunaga, S., Setoguchi, S., Hirasawa, A., Tsujimoto, G. Monitoring ligand-mediated internalization of G protein-coupled receptor as a novel pharmacological approach. Life Sci. 80, 17-23 (2006).
- Yang, J., et al. Agonist-Activated Bombyx Corazonin Receptor Is Internalized via an Arrestin-Dependent and Clathrin-Independent Pathway. Biochemistry. 55, 3874-3887 (2016).
- Kohout, T. A., Lefkowitz, R. J. Regulation of G protein-coupled receptor kinases and arrestins during receptor desensitization. Mol Pharmacol. 63, 9-18 (2003).
- Ferguson, S. S., et al. Role of beta-arrestin in mediating agonist-promoted G protein-coupled receptor internalization. Science. 271, 363-366 (1996).
- Stojilkovic, S. S., Reinhart, J., Catt, K. J. Gonadotropin-releasing hormone receptors: structure and signal transduction pathways. Endocr Rev. 15, 462-499 (1994).
- Yan, Y. J., et al. Identification and Expression Profile of the Gonadotropin-Releasing Hormone Receptor in Common Chinese Cuttlefish, Sepiella japonica. J Exp Zool A Ecol Genet Physiol. , (2016).
- Yang, J., et al. Specific activation of the G protein-coupled receptor BNGR-A21 by the neuropeptide corazonin from the silkworm, Bombyx mori, dually couples to the G(q) and G(s) signaling cascades. J Biol Chem. 288, 11662-11675 (2013).
- Lu, Z. M., et al. Cloning, Characterization, and Expression Profile of Estrogen Receptor in Common Chinese Cuttlefish, Sepiella japonica. J Exp Zool A Ecol Genet Physiol. 325, 181-193 (2016).
