Summary
Denne protokollen beskriver konfokal mikroskopi påvisning av G-protein-koblet reseptor (GPCR) internalisering i pattedyrceller. Den inneholder den grunnleggende cellekultur, transfeksjon, og konfokal mikroskopi og fremgangsmåte tilveiebringer en effektiv og lett tolkbar metode for å påvise subcellulære lokalisering og internalisering av fusjons uttrykt GPCR.
Introduction
Celler som har last trafikkmaskiner for transport av ekstracellulære materialer, for eksempel ligander, mikroorganismer, næringsstoffer og transmembranproteiner-inn i cellen for å få informasjon, energi, og andre formål 1, 2. Det er viktig for cellulær homeostase, vev funksjon, og total celleoverlevelse. Den cellebaserte ekspresjon av fluorescerende fusjonsproteiner er en effektiv måte å studere lokalisering og internalisering av transmembranreseptorer, slik som G-protein-koblede reseptorer (GPCR), i signaliseringsveier 3.
Ekspresjon av fusjonsproteinene kodet med grønt fluorescerende protein (GFP) fra maneter Aequorea Victoria, kombinert med direkte fluorescens-deteksjonsteknikker, har fått bred aksept i protein-målsøkende forskning 4, 5, 6. GFP-baserte detectividere har den fordel at den tillater sanntids avbildning av levende celler mens man unngår fikseringsartifakter 7. En rekke allsidige kloningsvektorer er konstruert for å lette ekspresjonen av proteinfusjoner til GFP i forskjellige celler 8, 9. Den pEGFP-N1-vektoren er en utbredt og kommersialisert plasmid-vektor som koder for en forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP), som har blitt optimalisert fra villtype-GFP for lysere fluorescens og høyere ekspresjon i pattedyrceller. For å observere det fluorescente signalet av EGFP uttrykt i pattedyrceller, bør den fluorescens mikroskopi utføres med eksitasjon ved 488 nm og emisjon ved 507 nm, fortrinnsvis med konfokal mikroskopi.
Overvåking av subcellulære lokalisering og ligand-mediert internalisering av reseptorene er en vanlig teknikk for å undersøke signaloverføring og funksjon av GPCR 10 opp>, 11. I de fleste tilfeller fører til internalisering desensibilisering av GPCR (dempningen av stimulus respons på tross av nærvær av agonister) 12, 13. De internalisert reseptorene kan bli innlemmet i lysosomet og brytes ned, eller de kan resirkuleres tilbake til celleoverflaten, avhengig av naturen av reseptorene og cellelinjene anvendt i eksperimentene.
De gonadotropinfrigjørende hormon-reseptorer (GnRHRs) tilhører den GPCR familien og har en typisk GPCR proteinstruktur, med et ekstracellulært aminoterminal, en intracellulær -COOH terminal, og syv transmembran (TM) domener 14. Den transfeksjon av rekombinant plasmid Sj GnRHR-EGFP (med GnRHR genet fra Sepiella japonica) og den konfokal mikroskopi påvisning av EGFP-merket Sj GnRHR (uttrykt i HEK293 celler) ble rapportert previouslu, og GFP fluorescens ble etablert som en reporter for transmembranprotein lokaliserings analyser 15. Nå, internalisering av Sj GnRHR, aktivert av S. japonica gonadotropin-frigjørende hormon (GnRH Sj), ble demonstrert i tids- og doseavhengig oppførsel ved hjelp av konfokal mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellefremstilling
- Cell utvinning
- Overfør kryokonserverte humane embryoniske nyre 293 (HEK293) celler fra en flytende nitrogentanken til et 37 ° C vannbad, og det hele rystes kontinuerlig i 1 - 2 min.
- Tilsett 10 ml ekvilibrert vekstmedium (Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM), 10% føtalt bovint serum (FBS), og 1% penicillin-streptomycin-løsning) til en 10-cm cellekulturskål. Tilsett den opptinte celler til den ekvilibrerte vekstmediet.
- Cellene inkuberes i et 37 ° C med vannkappe CO2 inkubator med en fuktig atmosfære inneholdende 95% luft og 5% CO2 i 2 - 4 timer.
- Etter 2 - 4 timer, kontrollere at cellene er festet til. Erstatte den ekvilibrerte vekstmedium og kulturen for en annen i 24 - 48 timer.
MERK: Endring av ekvilibrerte vekstmediet er nyttig fordi det fjerner dimetylsulfoksid (DMSO) og beskytter mot celleskader.
- <strong> Cell passasjen
- Etter 24 - 48 timer, når cellene er dyrket til nær konfluens forkaste den ekvilibrerte vekstmedium og vaske cellene med 2 ml av fosfat-bufret saltvann (PBS). Swirl fatet forsiktig.
- Kast PBS og tilsett 1 ml trypsin-EDTA (saltløsning, 0,25% trypsin og 0,02% EDTA). Å helt fordøye cellene, virvle fatet forsiktig og aspirer av Trypsin-EDTA løsning. Sett formen i 37 ° C med vannkappe CO2 inkubator i 3 min.
NB: I løpet av denne perioden, tilberede tre nye 10 cm cellekulturplater og tilsett 10 ml ekvilibrert vekstmedium til hver. - Ved hjelp av et lysmikroskop, bestemme om cellene løftet fra bunnen av skålen. Tilsett 2 ml ekvilibrert vekstmedium til skålen. Bland ved pipettering og umiddelbart Pipetter 0,6 ml av cellesuspensjonen til hver av de nye retter. Bland forsiktig ved pipettering og la cellene inkubert ved 37 ° C og 5% CO2.
2. Celleutsåing
- Etter 24 - 48 timer, når passasjeførte cellene er dyrket til nær konfluens forkaste den ekvilibrerte vekstmedium og vaske cellene med 2 ml PBS. Swirl fatet forsiktig.
- Kast PBS og tilsett 1 ml trypsin-EDTA. Å helt fordøye cellene, virvle fatet forsiktig og aspirer av Trypsin-EDTA. Sett formen i 37 ° C med vannkappe CO2 inkubator i 3 min.
NB: I løpet av denne periode, fremstille en 6-brønners plate ved å tilsette 2 ml ekvilibrert vekstmedium til hver brønn. - Tilsett 1 ml ekvilibrert vekstmedium til skålen, hvis under mikroskopisk observasjon, cellene ut til å ha løftet fra skålbunnen. Bland ved pipettering og umiddelbart Pipetter 0,1 ml av cellesuspensjon (volumet justeres i henhold til den cellevekst tetthet) til hver brønn av den fremstilte 6-brønns plate (celle-mindre seks-brønns plate med 2 ml ekvilibrert vekstmedium). bland forsiktig ved pipettering og la celleneinkubere ved 37 ° C og 5% CO2.
3. Cell Transfeksjon
- Transfeksjon metode 1, med liposomformuleringer
MERK: Se tabellen for material for transfeksjon reagens 1.- Dagen etter at cellene skal være 85-95% sammenflytende.
- Tilsett 3 pg av plasmid-DNA (500 ng / pl) og 100 pl av redusert serum media til en steril mikrosentrifugerør, og bland forsiktig. Inkuber i 5 min ved romtemperatur.
- Forbered 9 pl reagens 1 og 100 ul av redusert serummediet i en annen mikrosentrifugerør, og bland forsiktig. Inkuber i 5 min ved romtemperatur.
- Kombiner den fortynnede plasmidet blandingen med fortynnet reagens 1 (totalvolum = 215 ul). Bland forsiktig og inkuber i 20 minutter ved romtemperatur.
- Aspirer medium av celler dyrket plate, og tilsett 1,5 ml frisk DMEM uten FBS.
- Legg 215 ul av DNA-transfection reagens blanding til hver brønn tilsatt, og bland forsiktig ved å svinge platen.
- Inkuber ved 37 ° C og 5% CO2 i 4 - 8 timer. Erstatt med frisk DMEM med 10% FBS.
- Inkuber cellene ved 37 ° C og 5% CO2 i ytterligere 24 - 48 timer før kjøring av noen eksperimenter.
- Transfeksjon, metode 2, med liposomformuleringer
MERK: Se tabellen for material for transfeksjon reagens 2.- Tilsett 2 ug plasmid-DNA (500 ng / ul), 4 ul av reagens 2, og 100 ul reduserte serum media inn i en steril mikrosentrifugerør. Bland forsiktig og inkuber i 15 minutter ved romtemperatur.
- Tilsett transfeksjon blanding til cellene på en dråpevis måte.
- Etter transfeksjon, inkubere cellene i 24 - 48 timer ved 37 ° C og 5% CO2, før den går noen eksperimenter.
4. Cell Culture på dekkglass
- Rebevege vekstmediet fra kultur 6-brønners plate.
- Vask cellemonolaget med 1 ml PBS uten kalsium og magnesium.
- Tilsett 0,5 ml trypsin-EDTA. Swirl fatet forsiktig og aspirer off Trypsin-EDTA. Inkuber kulturplaten i 3 minutter ved 37 ° C og 5% CO2. Den faktiske inkubasjon tiden varierer med den anvendte cellelinjen.
NB: I løpet av denne perioden, forberede en ny 12-brønners plate og tilsett 15 mm diameter sterile dekkglass til hver brønn. Dekkglass belagt med lysin, laminin, kollagen eller kan forbedre cellefesting til HEK293-celler som lett løsner. - Når cellene er frittliggende, tilsett 1 ml forvarmet komplett vekstmedium til hver brønn. Bland ved pipettering og umiddelbart overføre det nødvendige antall celler til den 12-brønns plate med dekkglass. Legg friskt komplett vekstmedium til hver brønn for å justere det totale volum til 1 mL
- Cellene inkuberes i 16 - 24 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
MERK: Etter 30 -60 min, vil hoveddelen av cellene har klebet til de sterile dekkglass.
5. konfokalmikroskopi Detection
- cellulær lokalisering
- Etter 16 - 24 timer, når cellene er dyrket til nær konfluens på sterile dekkglass i en 12-brønnsplate, legger membranen probe, DII, til hver brønn, hvilket gir en endelig konsentrasjon på 5 uM. La cellene inkuberes i 30 minutter ved 37 ° C og 5% CO2.
- Etter 30 minutter fjernes ekvilibrert vekstmedium og vaske cellene to ganger i kald PBS (2 - 8 ° C).
- Fikser cellene ved tilsetting av 1 ml av en 4% paraformaldehydoppløsning (PBS) i hver brønn. Beveg lett i 15 min.
Forsiktig: Paraformaldehyd er moderat giftig ved hudkontakt eller inhalering, og betegnet som en sannsynlig karsinogen for mennesker. Kjemikalier avtrekksskap, ventilerte balanse kabinetter eller andre beskyttelsestiltak bør brukes i løpet av veiing og håndtering av paraformaldehyd. </ Li> - Vask de fikserte cellene to ganger i PBS. Legg 200-300 mL av DAPI (4' , 6-diamidino-2-fenylindol) løsning (0,5 mg / ml) til hver brønn og inkuber i 10 min ved romtemperatur.
- Vask cellene to ganger med PBS. Fjern forsiktig dekkglassene fra platen og transportere bort overflødig PBS. Inverter på objektglass som er lastet med en dråpe av monteringsmedium (50% volum / volum glycerol / vann). Fjern overskudd av monteringsmedium fra skinnene.
- Cellular intern
- Etter 16 - 24 timer, når cellene er dyrket til nær konfluens på sterile dekkglass i en 12-brønnsplate, fjerne den ekvilibrerte vekstmediet og tilsett friskt, varmet DMEM-medium (37 ° C). Cellene inkuberes i 1 time ved 37 ° C og 5% CO2.
- Behandle cellene med forskjellige konsentrasjoner (0, 10 -12, 10 -9, og 10 6 M) av liganden i 30 minutter og behandle dem med 10 -6 M ligand i forskjellige tidsrom (0,10, 30 og 60 min).
- Vask cellene to ganger i kald PBS (2 - 8 ° C). Fikser cellene ved tilsetting av 1 ml av en 4% paraformaldehydoppløsning (PBS) i hver brønn. Beveg lett i 15 min.
- Vask cellene to ganger i PBS. Fjern forsiktig dekkglassene fra platen og veke av det overskytende PBS. Inverter på objektglass som er lastet med en dråpe av monteringsmedium (50% volum / volum glycerol / vann). Fjern overskudd av monteringsmedium fra skinnene.
- konfokalmikroskopi
- Slå på maskinvaren i konfokalmikroskop, herunder kvikksølvlampe makt, PC mikroskop, skanner og laser. Logg inn til operativsystemet konto, starter programvaren, kontrollere konfigurasjonen og velg laser. Slå på de ulike enheter innenfor konfokalmikroskopi system i rekkefølge i henhold til instruksjonene.
- Plasser forberedt lysbilder på mikroskopet scenen. Plasser prøven over objektivlinsen ved hjelp av scenen kontrolleren. Legg en dråpe sedertre olje påtil dekk når oljeneddyppingsobjektivet linsen er valgt. Plasser dekkglass på lysbilder som vender mot objektivet.
- Finn celler av interesse under fluorescerende mikroskopi.
- Bytt til skannemodus. Velge lasereffekten og spektralområdet av utslipps fluoroforen. Fange opp de høykvalitets konfokale bilder ved å avstemme laserintensiteten og andre parametere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser et eksempel på et system konfokalt mikroskop. Figur 2 viser ekspresjon av pEGFP-N1 i HEK293-celler. GFP signal ble detektert i cytoplasma og cellekjernen. Figur 3 viser subcellulære lokalisering av GnRHR fra S. japonica i HEK293 celler, i tråd med våre tidligere publiserte resultater 15. Fusjonsproteinet med EGFP-koden i den C-terminale ende av Sj GnRHR (Sj GnRHR-EGFP) dukket grønn i dette forsøket når under CLSM. Kjernen farget med DAPI ble avslørt i blått. DII flekker fremhevet i cellemembranen i rødt. Den gule signal på celleoverflaten i det flettede bildet antydet at sammentreff av rødt og grønt, noe som viser plasmamembranlokalisering av Sj GnRHR.
Figurene 4 og 5 skjermresultatene av Sj GnRHR internaliseforsøk i HEK293 celler. For å visualisere internalisering av Sj GnRHR, ble cellene behandlet med gonadotropin-frigjørende hormon (Sj GnRH) 15 ved forskjellige konsentrasjoner i 30 minutter (figur 4), eller de ble behandlet med en enkelt konsentrasjon (minst 10 - 6 M) av forskjellige varigheter ( Figur 5). I fravær av Sj GnRH, kontrollen (CTL) reseptorfusjonsprotein hadde plasmamembranlokalisering. Som vist i figur 4, ved forskjellige ligandkonsentrasjoner, internalisering av den Sj GnRHR fortsatte i en dose-avhengig måte, og reseptoren ble helt internalisert fra celleoverflaten med 10-6 M ligand. Som vist i figur 5, resultatene av tidsforløpet analyse av reseptor-internalisering med 10 - 6 M liganden viste at internalisertSj GnRHR var detekterbar 10 minutter etter agonist-stimulering, og ekstrem internalisering forekom ved 60 min. Observasjon med konfokal mikroskopi av disse to figurer viste at den fluorescerende Sj GnRHR-EGFP-fusjonsprotein ble primært lokalisert i plasmamembranen og var dramatisk og raskt internalisert i cellen i respons til Sj GnRH peptidet i HEK293-celler.
Figur 1. Et eksempel på et system konfokalt mikroskop. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Konfokalmikroskopi av GFP Protein i kontroll pEGFP-N1-transfekterte celler HEK293 . Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Lokalisering av Sj GnRHR-EGFP-fusjonsprotein i HEK293-celler ved hjelp av konfokal mikroskopi. Kjernen farvet med DAPI er vist i blått. DII flekker, som er vist i rødt, fremhever cellemembranen. Sj GnRHR-EGFP-fusjonsproteinet er vist i grønt. I det sammenslåtte bildet, indikerer gul sammentreff av de røde og grønne signaler. Alle bildene representerer minst tre uavhengige eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
ig4.jpg"/>
Figur 4. internalisering av Sj GnRHR-EGFP Fusion Protein i HEK293 celler i en tid Course ved konfokalmikroskopi. HEK293 celler transfektert med Sj GnRHR-EGFP-plasmidet ble aktivert ved behandling med forskjellige konsentrasjoner av GnRH i 30 min. Kontrollen tilfellet var uten GnRH stimulering (CTL). Alle bildene representerer minst tre uavhengige eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Internalisering av Sj GnRHR-EGFP-fusjonsprotein i HEK293-celler på en doseavhengig måte ved hjelp av konfokal mikroskopi. HEK293 celler transfektert med Sj GnRHR-EGFP-plasmidet ble aktivert ved behandling med 10 - 6 M ligand for forskjellig durations. Kontrollen tilfellet var uten GnRH stimulering (CTL). Alle bildene representerer minst tre uavhengige eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen som presenteres her tilveiebringer en effektiv og lett tolkbar metode for å påvise subcellulære lokalisering og internalisering av uttrykt GPCR fusjonsprotein i HEK293-celler. Teknikken kan lett tilpasses til mange forskjellige gener og celletyper, slik som for cellulær lokalisering og internalisering av den corazonin reseptoren fra Bombyx mori i HEK293 og BMN celler 16.
Vellykket bruk av dette kraftige analysen bygger på noen viktige faktorer. Fremst er god helse av cellene, som er avgjørende for effektiv transfeksjon og datakvalitet. Transfeksjonen inkubasjonstid, intervallet mellom transfeksjon og andre eksperimenter, og passasjen av transfekterte celler for å dekke kilebeltet før avbildning, er alle trinn hvor skade på dyrkede celler er mulig. Derfor opprettholde god helse av cellene er en viktig forutsetning for alle trinnene i dette eksperimentet. Dessuten unngår tett komprimert celler i tette kulturer er avgjørende for å skaffe bilder med høy kvalitet med konfokal mikroskopi. For å minimalisere påvirkning av det fluorescerende koden på lokaliseringen av de GPCR, genererte vi reseptorer med EGFP fusjonert til det intracellulære C-terminus. En vellykket og effektiv transfeksjon av genet inn i cellene er også viktig. Transfeksjonseffektiviteten kan variere sterkt i forskjellige cellelinjer. Derfor kan optimaliseringen av visse trinn i protokollen være nødvendig, avhengig av den spesielle celletype som brukes. For eksempel, i transfeksjon metode 1, inkuberingen varigheten av transfekterte celler i DMEM uten FBS kan bli optimalisert i henhold til cellen tilstand. I tillegg til doseringen av DNA-plasmid, bør dosen av liposom-reagens og reduserte serum media bli justert i henhold til spesifikke cellelinjer. Ellers kan det electrotransfection teknikk gjennomføres i stedet for liposom-reagens formidlet transfeksjon feller akseptable transfeksjonseffektivitet i en spesiell cellelinje. Imidlertid er ytterligere maskinvare er nødvendig, og cellene i suspensjonen og i et lite volum er vanskelig å transfektere med electrotransfection. Den virkelige styrke av den aktuelle analyse ligger imidlertid i sammenligning mellom endringer i de samme celler under identiske dyrkningsbetingelser etter akutte manipuleringer, slik som internalisering av Sj GnRHR i respons til Sj GnRH ligand.
Internalisering er et av de dominerende mekanisme som kontrollerer GPCR signalering for å sikre at de riktige cellulære responser til stimuli 11. Vi kan lett observere endringer i intern gjennom avbildning med konfokal mikroskopi. Internalisering av Sj GnRHR i en dose- og tidsavhengig måte som er tydelig vist i figur 4.
Protokollen vi har beskrevet kan enkelt tilpasses til den subcellulære sporing av andre eukaryote pr-proteiner, slik som den nukleære østrogenreseptoren 17. Imidlertid vil den optimaliseringen av visse trinn i protokollen være nødvendig, avhengig av de spesielle celletyper som benyttes, noe som vil kreve ytterligere utforskning og praksis. Tatt i betraktning at den subcellulære beliggenheten av proteiner som har en stor innflytelse på identifisering av gener, proteinmodifiseringer, og signaliseringsveier, denne protokollen, basert på den publiserte forsknings, kan gi pålitelige data og informasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEK293 cell line | |||
| DMEM/High glucose | Hyclone | SH30022.01 | High glucose 4.0 mM L-glutamine |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | PuFei | 1101-100 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Genom | GNM10010 | |
| Penicillin-Streptomycin | Genom | GNM15140 | |
| 0.25% Trypsin & 0.02% EDTA | Genom | GNM25200 | |
| Opti-MEM (1x) | GIBCO, by Life Technologies | 31985-062 | reduced serum media |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668027 | Reagent 1 |
| X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent | Roche | 6366236001 | Reagent 2 |
| DAPI Staining Solution | Beyotime | C1006 | |
| DiI | Beyotime | C1036 | |
| Antifade Mounting Medium | Beyotime | P0126 | |
| Paraformaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent Co.(SCRC) | 80096618 | |
| 100 mm cell culture | CORNING | 430167 | |
| 6-well plate | ExCell Bio | CS016-0092 | |
| 12-well plate | ExCell Bio | CS016-0093 | |
| Cover Glass | NEST | 801007 | |
| Microscope Slides | Citoglas | 10127105P-G | |
| Thermo Scientific Forma CO2 Incubator | Thermo | 3111 | |
| TCS SP5II laser scanning confocal microscope | Leica | 5100001311 |
References
- Mellman, I.
- Hausott, B., Klimaschewski, L. Membrane turnover and receptor trafficking in regenerating axons. Eur J Neuro. 43, 309-317 (2016).
- Kallal, L., Benovic, J. L. Using green fluorescent proteins to study G-protein-coupled receptor localization and trafficking. Trends Pharmacol Sci. 21, 175-180 (2000).
- Prasher, D. C., Eckenrode, V. K., Ward, W. W., Prendergast, F. G., Cormier, M. J. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. Gene. 111, 229-233 (1992).
- Spector, D. L., Goldman, R. D. Constructing and Expressing GFP Fusion Proteins. CSH protocols. 2006, (2006).
- Drew, D. E., von Heijne, G., Nordlund, P., de Gier, J. W. Green fluorescent protein as an indicator to monitor membrane protein overexpression in Escherichia coli. FEBS Lett. 507, 220-224 (2001).
- von Arnim, A. G., Deng, X. W., Stacey, M. G. Cloning vectors for the expression of green fluorescent protein fusion proteins in transgenic plants. Gene. 221, 35-43 (1998).
- Webb, C. D., Decatur, A., Teleman, A., Losick, R. Use of green fluorescent protein for visualization of cell-specific gene expression and subcellular protein localization during sporulation in Bacillus subtilis. J Bacteriol. 177, 5906-5911 (1995).
- Kain, S. R., et al. Green fluorescent protein as a reporter of gene expression and protein localization. BioTechniques. 19, 650-655 (1995).
- Fukunaga, S., Setoguchi, S., Hirasawa, A., Tsujimoto, G. Monitoring ligand-mediated internalization of G protein-coupled receptor as a novel pharmacological approach. Life Sci. 80, 17-23 (2006).
- Yang, J., et al. Agonist-Activated Bombyx Corazonin Receptor Is Internalized via an Arrestin-Dependent and Clathrin-Independent Pathway. Biochemistry. 55, 3874-3887 (2016).
- Kohout, T. A., Lefkowitz, R. J. Regulation of G protein-coupled receptor kinases and arrestins during receptor desensitization. Mol Pharmacol. 63, 9-18 (2003).
- Ferguson, S. S., et al. Role of beta-arrestin in mediating agonist-promoted G protein-coupled receptor internalization. Science. 271, 363-366 (1996).
- Stojilkovic, S. S., Reinhart, J., Catt, K. J. Gonadotropin-releasing hormone receptors: structure and signal transduction pathways. Endocr Rev. 15, 462-499 (1994).
- Yan, Y. J., et al. Identification and Expression Profile of the Gonadotropin-Releasing Hormone Receptor in Common Chinese Cuttlefish, Sepiella japonica. J Exp Zool A Ecol Genet Physiol. , (2016).
- Yang, J., et al. Specific activation of the G protein-coupled receptor BNGR-A21 by the neuropeptide corazonin from the silkworm, Bombyx mori, dually couples to the G(q) and G(s) signaling cascades. J Biol Chem. 288, 11662-11675 (2013).
- Lu, Z. M., et al. Cloning, Characterization, and Expression Profile of Estrogen Receptor in Common Chinese Cuttlefish, Sepiella japonica. J Exp Zool A Ecol Genet Physiol. 325, 181-193 (2016).
