Summary
Detta protokoll beskriver konfokalmikroskopi detektering av G-proteinkopplade receptorer (GPCR) internalisering i däggdjursceller. Den innefattar den grundläggande cellkultur, transfektion, och konfokal mikroskopi förfarandet och tillhandahåller ett effektivt och enkelt tolkningsbara metod att detektera den subcellulära lokaliseringen och internalisering av fusions-uttryckt GPCR.
Introduction
Celler har last trafficking maskiner för att transportera extracellulära material-sådana som ligander, mikroorganismer, näringsämnen och transmembranproteiner-in i cellen efter information, energi, och andra ändamål 1, 2. Det är avgörande för cellulär homeostas, vävnadsfunktion och övergripande cellöverlevnad. Den cellbaserade expression av fluorescerande fusionsproteiner är ett kraftfullt sätt att studera lokaliseringen och internalisering av transmembranreceptorer, såsom G-proteinkopplade receptorer (GPCR), i signalvägar 3.
Uttrycket av fusionsproteiner märkta med grönt fluorescerande protein (GFP) från maneten Aequorea Victoria, i kombination med direkt fluorescensdetektionstekniker, har vunnit stor acceptans i protein-måls forskning 4, 5, 6. GFP-baserade detectipå har fördelen att tillåta realtids avbildning av levande celler och samtidigt undvika fixerings artefakter 7. En serie mångsidiga kloningsvektorer har konstruerats för att underlätta uttrycket av proteinfusioner till GFP i olika celler 8, 9. Den pEGFP-N1-vektor är en allmänt använd och kommersialiserat plasmidvektor som kodar en förstärkt grönt fluorescerande protein (EGFP), som har optimerats från vildtyps-GFP för ljusare fluorescens och högre uttryck i däggdjursceller. Att observera den fluorescerande signalen hos EGFP uttryckt i däggdjursceller bör fluorescensmikroskopi utföras med excitation vid 488 nm och emission vid 507 nm, företrädesvis med konfokalmikroskopi.
Övervaka den subcellulära lokaliseringen och ligand-medierad internalisering av receptorer är en vanlig teknik för att undersöka signalomvandling och funktionen av GPCR 10 11. I de flesta fall leder interna till desensibilisering av GPCR (dämpningen av stimulus respons trots närvaro av agonister) 12, 13. De internaliserade receptorer kan införlivas i lysosomen och bryts ned, eller de kan återvinnas tillbaka till cellytan, beroende på naturen av receptorerna och de cellinjer som användes i experimenten.
De gonadotropin-frisättande hormonreceptorer (GnRHRs) hör till den GPCR familjen och har en typisk GPCR proteinstruktur, med en extracellulär aminoterminal, en intracellulär -COOH terminal, och sju transmembran (TM) domäner 14. Transfektion av rekombinanta plasmiden Sj GnRHR-EGFP (med GnRHR-genen från Sepiella japonica) och konfokal mikroskopi detektion av EGFP-märkt Sj GnRHR (uttryckt i HEK293-celler) rapporterades previously, och GFP-fluorescens var etablerad som en reporter för transmembranproteinlokaliseringsanalyser 15. Nu, internaliseringen av Sj GnRHR, aktiverad av S. japonica gonadotropinfrisättande hormon (Sj GnRH), visades i tids- och dosberoende sätt genom konfokalmikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellberedning
- cell återhämtning
- Överföra de kryokonserverade humana embryonala njur-293 (HEK293) -celler från en flytande kväve tank till en 37 ° C vattenbad och skaka kontinuerligt under 1 - 2 min.
- Lägga 10 ml ekvilibrerad tillväxtmedium (Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM), 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin-streptomycin-lösning) till en 10-cm cellkulturskål. lägg försiktigt de upptinade cellerna till den ekvilibrerade tillväxtmediet.
- Inkubera cellerna i en 37 ° C vatten-mantlade CO 2 inkubator med en fuktad atmosfär innehållande 95% luft och 5% CO 2 2 - 4 timmar.
- Efter 2 - 4 h, ta att cellerna är fastade. Ersätta den ekvilibrerade tillväxtmedium och odling under ytterligare 24-48 h.
OBS: Ändra jämviktad tillväxtmediet är användbart eftersom det tar bort dimetylsulfoxid (DMSO) och skyddar mot cellskador.
- <strong> Cell passage
- Efter 24 - 48 h, när cellerna har vuxit till nära konfluens, kassera jämviktad tillväxtmedium och tvätta cellerna med 2 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Snurra skålen försiktigt.
- Kassera PBS och tillsätt 1 ml Trypsin-EDTA (saltlösning, 0,25% trypsin och 0,02% EDTA). För att helt smälta cellerna snurra skålen försiktigt och aspirera av trypsin-EDTA-lösning. Sätta skålen i 37 ° C vatten-mantlade CO 2 inkubator under 3 minuter.
OBS: Under denna period, förbereda tre nya 10-cm cellkulturskålar och tillsätt 10 ml ekvilibrerad tillväxtmedium till varje. - Med användning av ett ljusmikroskop, bestämma om cellerna har lyft från botten av skålen. Tillsätt 2 ml ekvilibrerad tillväxtmedium till skålen. Blanda genom pipettering och omedelbart pipettera 0,6 ml av cellsuspensionen till var och en av de nya rätter. Blanda försiktigt genom pipettering och tillåta cellerna att inkubera vid 37 ° C och 5% CO2.
2. Cell Seeding
- Efter 24 - 48 h, när de passe cellerna har vuxit till nära konfluens, kassera jämviktad tillväxtmedium och tvätta cellerna med 2 ml PBS. Snurra skålen försiktigt.
- Kassera PBS och tillsätt 1 ml Trypsin-EDTA. För att helt smälta cellerna snurra skålen försiktigt och aspirera av trypsin-EDTA. Sätta skålen i 37 ° C vatten-mantlade CO 2 inkubator under 3 minuter.
OBS: Under denna period, förbereda en 6-brunnsplatta genom tillsats av 2 ml av ekvilibrerad tillväxtmedium till varje brunn. - Tillsätt 1 ml av ekvilibrerad tillväxtmedium till skålen, om, enligt mikroskopisk observation, att cellerna har lyft från skålen botten. Blanda genom pipettering och omedelbart pipettera 0,1 ml cellsuspension (volymen justeras i enlighet med den celltillväxtdensiteten) till varje brunn i den beredda 6-brunnar (cell mindre 6-brunnars platta med 2 ml ekvilibrerad tillväxtmedium). Blanda försiktigt genom att pipettera och låta cellernainkubera vid 37 ° C och 5% CO2.
3. Cell Transfektion
- Transfektion metod 1, med liposomformuleringar
OBS: Se tabellen av material för transfektionsreagens 1.- Följande dag, se till att celler ska vara 85-95% sammanflytande.
- Lägg 3 ^ g av plasmid-DNA (500 ng / | il) och 100 mikroliter av reducerat serum media till ett sterilt mikrocentrifugrör, och blanda försiktigt. Inkubera i 5 min vid rumstemperatur.
- Förbereda 9 mikroliter av reagens 1 och 100 mikroliter av reducerat serummedier i en annan mikrocentrifugrör, och blanda försiktigt. Inkubera i 5 min vid rumstemperatur.
- Kombinera den utspädda plasmiden blandningen med utspädda Reagens 1 (total volym = 215 | il). Blanda försiktigt och inkubera i 20 min vid rumstemperatur.
- Aspirera mediet off celler-odlade plattan, och tillsätt 1,5 ml nytt DMEM utan FBS.
- Lägga 215 mikroliter av DNA-transfektion reagensblandning till varje brunn droppvis, och blanda försiktigt genom att snurra plattan.
- Inkubera vid 37 ° C och 5% CO 2 4 - 8 timmar. Ersätta med färskt DMEM med 10% FBS.
- Inkubera cellerna vid 37 ° C och 5% CO2 under ytterligare 24 - 48 h före kör några experiment.
- Transfektion metod 2, med liposomformuleringar
OBS: Se tabellen av material för transfektionsreagens 2.- Lägg 2 ^ g plasmid-DNA (500 ng / | il), 4 mikroliter av reagens 2, och 100 mikroliter minskade serummedier i en steril mikrocentrifugrör. Blanda försiktigt och inkubera i 15 min vid rumstemperatur.
- Lägga till transfektionsblandningen till cellerna på ett droppvis sätt.
- Efter transfektion inkubera celler under 24 - 48 h vid 37 ° C och 5% CO 2, innan du kör några experiment.
4. Cell Culture på täckglas
- Reflytta tillväxtmediet från odlings 6-brunnsplatta.
- Tvätta cellmonoskiktet med en ml PBS utan kalcium och magnesium.
- Lägga 0,5 ml Trypsin-EDTA. Snurra skålen noga och aspirera bort trypsin-EDTA. Inkubera odlingsplattan för 3 min vid 37 ° C och 5% CO2. Den faktiska Inkubationstiden varierar med använda cellinjen.
OBS: Under denna period, förbereda en ny 12-brunnsplatta och tillsätt 15 mm diameter sterilt täckglas till varje brunn. Täckglas belagda med lysin, laminin eller kollagen kan förbättra cellvidhäftning för HEK293-celler som lätt lossnar. - När celler lossnat, tillsätt 1 ml förvärmda komplett tillväxtmedium till varje brunn. Blanda genom pipettering och omedelbart överföra det erforderliga antalet celler till 12-brunnar med täckglas. Lägg färskt komplett odlingsmedium till varje brunn för att justera den totala volymen till 1 ml
- Inkubera cellerna i 16 - 24 h vid 37 ° C och 5% CO 2.
OBS: Efter 30 -60 min, kommer majoriteten av cellerna har vidhäftat till de sterila täckglas.
5. konfokalmikroskopi Detection
- cellulär lokalisering
- Efter 16 - 24 h, när cellerna har vuxit till nära konfluens på de sterila täckglas i 12-brunnar, lägg membransonden, Dil, till varje brunn, vilket gav en slutlig koncentration av 5 pM. Tillåta cellerna att inkubera i 30 min vid 37 ° C och 5% CO2.
- Efter 30 minuter, ta bort den ekvilibrerade tillväxtmedium och tvätta cellerna två gånger i kall PBS (2 - 8 ° C).
- Fixera cellerna genom tillsats av 1 ml av en 4% paraformaldehydlösning (i PBS) till varje brunn. Skaka försiktigt för 15 min.
Försiktighet: Paraformaldehyd är måttligt giftigt vid hudkontakt eller inandning, och betecknas som en trolig cancerframkallande hos människor. Kemikalier dragskåp, ventilerade balans kapslingar eller andra skyddsåtgärder ska användas under vägning och hantering av paraformaldehyd. </ Li> - Tvätta de fixerade cellerna två gånger i PBS. Lägga 200-300 mikroliter av DAPI (4' , 6-diamidino-2-fenylindol) lösning (0,5 | ig / ml) till varje brunn och inkubera under 10 min vid rumstemperatur.
- Tvätta cellerna två gånger med PBS. Försiktigt bort täckglas från plattan och veken bort överflödigt PBS. Invertera på objektglas laddade med en droppe monteringsmedium (50% vol / vol glycerol / vatten). Ta bort överflödigt monteringsmedium från bilderna.
- Cellular interna
- Efter 16 - 24 h, när cellerna har vuxit till nära konfluens på de sterila täckglas i 12-brunnars platta, ta bort den ekvilibrerade tillväxtmedium och tillsätta färsk, värmde DMEM-medium (37 ° C). Inkubera cellerna i en timme vid 37 ° C och 5% CO2.
- Behandla cellerna med olika koncentrationer (0, 10 -12, 10 -9, och 10 -6 M) av ligand för 30 min och behandla dem med 10 -6 M ligand för olika tidpunkter (0,10, 30, och 60 min).
- Tvätta cellerna två gånger i kall PBS (2 - 8 ° C). Fixera cellerna genom tillsats av 1 ml av en 4% paraformaldehydlösning (i PBS) till varje brunn. Skaka försiktigt för 15 min.
- Tvätta cellerna två gånger i PBS. Försiktigt bort täckglas från plattan och veken bort överskottet PBS. Invertera på objektglas laddade med en droppe monteringsmedium (50% vol / vol glycerol / vatten). Ta bort överflödigt monteringsmedium från bilderna.
- konfokalmikroskopi
- Slå på hårdvaran i konfokalmikroskop, inklusive kvicksilverlampa makt, PC mikroskop, scanner och laser. Logga in på operativsystemet konto startar programmet kontrollerar konfigurationen och väljer laser. Slå på de olika enheterna i konfokalmikroskopi systemet i ordning enligt instruktioner.
- Placera förberedda bilderna på mikroskop scenen. Placera provet över objektivlinsen med hjälp av scenen styrenheten. Tillsätt en droppe cederolja påatt täckglas när oljeimmersionslins väljs. Placera täckglas på objektglas som vetter mot linsen.
- Hitta cellerna av intresse under fluorescensmikroskopi.
- Växla till skanningsläge. Välja lasereffekten och den spektrala området av fluoroforen emission. Fånga konfokala bilder av hög kvalitet genom att ställa laserintensitet och andra parametrar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 visar ett exempel på ett konfokalt mikroskopsystem. Figur 2 visar expressionen av pEGFP-N1 i HEK293-celler. GFP signal detekterades i cytoplasman och kärnan. Figur 3 visar den subcellulära lokaliseringen av GnRHR från S. japonica i HEK293-celler, vilket överensstämmer med våra tidigare publicerade resultat 15. Fusionsprotein med EGFP-taggen vid C-terminalen av Sj GnRHR (Sj GnRHR-EGFP) tycktes grönt i detta experiment, när enligt CLSM. Kärnan färgas med DAPI avslöjades i blått. Dil färgning markerade cellmembranet i rött. Den gula signalen på cellytan i den sammanslagna bilden indikerade koincidens av rött och grönt, vilket visar plasmamembranlokalisering av Sj GnRHR.
Figurerna 4 och 5 visningresultaten av Sj GnRHR internaliseringsanalyser i HEK293-celler. Att visualisera internaliseringen av Sj GnRHR, behandlades celler med gonadotropinfrisättande hormon (Sj GnRH) 15 vid olika koncentrationer under 30 min (figur 4), eller de behandlades med en enda koncentration (10-6 M) under olika varaktigheter ( figur 5). I frånvaro av Sj GnRH, kontrollen (CTL) receptorfusions hade plasmamembranlokalisering. Såsom visas i figur 4, vid olika ligandkoncentrationer, internaliseringen av den Sj GnRHR fortsatte på ett dos-beroende sätt, och receptorn var helt internalis från cellytan med 10-6 M ligand. Såsom visas i fig 5, resultaten av tidsförloppet analys av receptorinternalisering med 10-6 M ligand visade att internalisSj GnRHR kunde detekteras 10 min efter agoniststimulering, och extrem interna skedde genom 60 min. Observation med konfokalmikroskopi av dessa två figurer visade att det fluorescerande Sj GnRHR-EGFP-fusionsproteinet primärt lokaliserat i plasmamembranet och var dramatiskt och snabbt internaliseras i cellen som svar på Sj GnRH-peptid i HEK293-celler.
Figur 1. Ett exempel på ett konfokalmikroskop System. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. konfokalmikroskopi av GFP Protein i Kontroll pEGFP-N1-transfekterade HEK293-celler . Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Lokalisering av Sj GnRHR-EGFP-fusionsprotein i HEK293-celler med konfokalmikroskopi. Kärnan färgas med DAPI visas i blått. Dil färgning, visas i rött, belyser cellmembranet. Sj GnRHR-EGFP-fusionsproteinet visas i grönt. I den sammanslagna bilden, gul indikerar sammanfaller de röda och gröna signaler. Alla bilder representerar minst tre oberoende experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
ig4.jpg"/>
Figur 4. Internalisering av Sj GnRHR-EGFP-fusionsprotein i HEK293 celler i en Tidsförlopp av konfokalmikroskopi. HEK293-celler transfekterade med Sj GnRHR-EGFP-plasmiden aktiverades genom behandling med olika koncentrationer av GnRH för 30 min. Kontrollfallet var utan GnRH-stimulering (CTL). Alla bilder representerar minst tre oberoende experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Internalisering av Sj GnRHR-EGFP-fusionsprotein i HEK293-celler på ett dosberoende sätt genom konfokalmikroskopi. HEK293-celler transfekterade med Sj GnRHR-EGFP-plasmiden aktiverades genom behandling med 10-6 M ligand för olika durations. Kontrollfallet var utan GnRH-stimulering (CTL). Alla bilder representerar minst tre oberoende experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det protokoll som presenteras här ger en effektiv och lätt tolkningsbar metod att detektera den subcellulära lokaliseringen och internalisering av uttryckt GPCR-fusionsprotein i HEK293-celler. Tekniken kan lätt anpassas för många olika gener och celltyper, såsom för den cellulära lokaliseringen och internalisering av corazonin receptor från Bombyx mori i HEK293 och BMN cellerna 16.
En framgångsrik tillämpning av denna kraftfulla analys bygger på några viktiga faktorer. Främst är det god hälsa hos cellerna, vilket är viktigt för effektiv transfektion och datakvalitet. Transfektionen inkubationstid, intervallet mellan transfektion och andra experiment, och passagen av transfekterade celler för att täcka glider innan avbildning, är alla steg där skada på de odlade cellerna är möjlig. Därför är en viktig förutsättning för alla steg i detta experiment upprätthålla god hälsa av cellerna. Dessutom undviker tätt komprimerade celler i täta kulturer är avgörande för att förvärva bilder av hög kvalitet med konfokalmikroskopi. Att minimera inverkan av den fluorescerande taggen på lokalisering av GPCR, genererade vi receptorer med EGFP fuserad till den intracellulära C-terminalen. Den framgångsrika och effektiv transfektion av genen in i cellerna är också viktigt. Transfektionseffektivitet kan variera stort i olika cellinjer. Därför kan en optimering av vissa steg i protokollet vara nödvändigt, beroende på den speciella celltypen som används. Exempelvis i transfektion metod 1, inkubationen varaktighet av transfekterade celler i DMEM utan FBS kunde optimeras enligt den celltillstånd. I tillägg till dosen av det DNA-plasmiden, bör dosen av liposomen reagenset och minskade serummedier justeras enligt specifika cellinjer. Annars kan electrotransfection tekniken utföras istället för liposom-reagens medierad transfektion feller acceptabla transfektionseffektiviteten i ett visst cellinje. Emellertid ytterligare hårdvara krävs, och celler i suspension och i en liten volym är svåra att transfektera med electrotransfection. Den sanna styrkan för den aktuella analysen, ligger dock i jämförelsen mellan förändringar i samma celler under identiska odlingsbetingelser efter akuta manipulationer, såsom internalisering av Sj GnRHR som svar på Sj GnRH-liganden.
Internalisering är en av de dominerande mekanismer som styr GPCR signalering för att se till de lämpliga cellsvar på stimuli 11. Vi kan lätt konstatera förändringar i internalisering genom avbildning med konfokalmikroskopi. Internalisering av Sj GnRHR på ett dos- och tidsberoende sätt framgår klart i figur 4.
Det protokoll vi har beskrivit kan enkelt anpassas till den subcellulära spårning av andra eukaryota proteins, såsom den nukleära östrogenreceptor 17. Emellertid kommer optimering av vissa steg i protokollet vara nödvändigt, beroende på de särskilda celltyper som används, vilket kommer att kräva ytterligare utforskning och praxis. Icke desto mindre, med tanke på att den subcellulära lokaliseringen av proteiner har ett stort inflytande på identifieringen av gener, proteinmodifikationer, och signalvägar, detta protokoll, baserat på den publicerade forskningen, kan tillhandahålla tillförlitliga uppgifter och information.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEK293 cell line | |||
| DMEM/High glucose | Hyclone | SH30022.01 | High glucose 4.0 mM L-glutamine |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | PuFei | 1101-100 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Genom | GNM10010 | |
| Penicillin-Streptomycin | Genom | GNM15140 | |
| 0.25% Trypsin & 0.02% EDTA | Genom | GNM25200 | |
| Opti-MEM (1x) | GIBCO, by Life Technologies | 31985-062 | reduced serum media |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668027 | Reagent 1 |
| X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent | Roche | 6366236001 | Reagent 2 |
| DAPI Staining Solution | Beyotime | C1006 | |
| DiI | Beyotime | C1036 | |
| Antifade Mounting Medium | Beyotime | P0126 | |
| Paraformaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent Co.(SCRC) | 80096618 | |
| 100 mm cell culture | CORNING | 430167 | |
| 6-well plate | ExCell Bio | CS016-0092 | |
| 12-well plate | ExCell Bio | CS016-0093 | |
| Cover Glass | NEST | 801007 | |
| Microscope Slides | Citoglas | 10127105P-G | |
| Thermo Scientific Forma CO2 Incubator | Thermo | 3111 | |
| TCS SP5II laser scanning confocal microscope | Leica | 5100001311 |
References
- Mellman, I.
- Hausott, B., Klimaschewski, L. Membrane turnover and receptor trafficking in regenerating axons. Eur J Neuro. 43, 309-317 (2016).
- Kallal, L., Benovic, J. L. Using green fluorescent proteins to study G-protein-coupled receptor localization and trafficking. Trends Pharmacol Sci. 21, 175-180 (2000).
- Prasher, D. C., Eckenrode, V. K., Ward, W. W., Prendergast, F. G., Cormier, M. J. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. Gene. 111, 229-233 (1992).
- Spector, D. L., Goldman, R. D. Constructing and Expressing GFP Fusion Proteins. CSH protocols. 2006, (2006).
- Drew, D. E., von Heijne, G., Nordlund, P., de Gier, J. W. Green fluorescent protein as an indicator to monitor membrane protein overexpression in Escherichia coli. FEBS Lett. 507, 220-224 (2001).
- von Arnim, A. G., Deng, X. W., Stacey, M. G. Cloning vectors for the expression of green fluorescent protein fusion proteins in transgenic plants. Gene. 221, 35-43 (1998).
- Webb, C. D., Decatur, A., Teleman, A., Losick, R. Use of green fluorescent protein for visualization of cell-specific gene expression and subcellular protein localization during sporulation in Bacillus subtilis. J Bacteriol. 177, 5906-5911 (1995).
- Kain, S. R., et al. Green fluorescent protein as a reporter of gene expression and protein localization. BioTechniques. 19, 650-655 (1995).
- Fukunaga, S., Setoguchi, S., Hirasawa, A., Tsujimoto, G. Monitoring ligand-mediated internalization of G protein-coupled receptor as a novel pharmacological approach. Life Sci. 80, 17-23 (2006).
- Yang, J., et al. Agonist-Activated Bombyx Corazonin Receptor Is Internalized via an Arrestin-Dependent and Clathrin-Independent Pathway. Biochemistry. 55, 3874-3887 (2016).
- Kohout, T. A., Lefkowitz, R. J. Regulation of G protein-coupled receptor kinases and arrestins during receptor desensitization. Mol Pharmacol. 63, 9-18 (2003).
- Ferguson, S. S., et al. Role of beta-arrestin in mediating agonist-promoted G protein-coupled receptor internalization. Science. 271, 363-366 (1996).
- Stojilkovic, S. S., Reinhart, J., Catt, K. J. Gonadotropin-releasing hormone receptors: structure and signal transduction pathways. Endocr Rev. 15, 462-499 (1994).
- Yan, Y. J., et al. Identification and Expression Profile of the Gonadotropin-Releasing Hormone Receptor in Common Chinese Cuttlefish, Sepiella japonica. J Exp Zool A Ecol Genet Physiol. , (2016).
- Yang, J., et al. Specific activation of the G protein-coupled receptor BNGR-A21 by the neuropeptide corazonin from the silkworm, Bombyx mori, dually couples to the G(q) and G(s) signaling cascades. J Biol Chem. 288, 11662-11675 (2013).
- Lu, Z. M., et al. Cloning, Characterization, and Expression Profile of Estrogen Receptor in Common Chinese Cuttlefish, Sepiella japonica. J Exp Zool A Ecol Genet Physiol. 325, 181-193 (2016).
