Summary
Questo protocollo descrive rilevamento microscopia confocale del recettore accoppiato alla proteina G (GPCR) internalizzazione in cellule di mammifero. Esso comprende la coltura di cellule di base, trasfezione, e la procedura microscopia confocale e fornisce un metodo efficiente e facilmente interpretabili per rilevare la localizzazione subcellulare e internalizzazione del GPCR fusione espressa.
Introduction
Cellule possiedono macchine traffico merci da trasportare extracellulare materiali, ad esempio leganti, microrganismi, nutrienti e proteine transmembrana-nella cella per informazioni, energia e altri scopi 1, 2. È fondamentale per l'omeostasi cellulare, la funzione dei tessuti, e la sopravvivenza delle cellule complessiva. L'espressione a base di cellule di proteine di fusione fluorescenti è un potente strumento per studiare la localizzazione e internalizzazione di recettori transmembrana, come G recettori accoppiati alle proteine (GPCR), in vie di segnalazione 3.
L'espressione di proteine di fusione contrassegnate con proteina fluorescente verde (GFP) dalla medusa Aequorea victoria, combinato con tecniche di rivelazione di fluorescenza diretta, ha guadagnato un largo consenso nel proteina-targeting di ricerca 4, 5, 6. detecti GFP-basedsulla presenta il vantaggio di consentire l'imaging in tempo reale delle cellule viventi evitando artefatti fissaggio 7. Una serie di vettori di clonaggio versatili è stato costruito per facilitare l'espressione di proteine per fusioni GFP in varie cellule 8, 9. Il vettore pEGFP-N1 è un vettore plasmidico utilizzato e commercializzato codificante una maggiore proteina fluorescente verde (EGFP), che è stato ottimizzato da wild-type per GFP luminosa fluorescenza e più alta espressione in cellule di mammifero. Per osservare il segnale fluorescente EGFP espresso in cellule di mammifero, la microscopia a fluorescenza deve essere condotta con l'eccitazione a 488 nm e l'emissione a 507 nm, preferibilmente con microscopia confocale.
Monitoraggio della localizzazione subcellulare e internalizzazione ligando mediata da recettori è una tecnica comune per indagare la trasduzione del segnale e funzione della GPCR 10 up>, 11. Nella maggior parte dei casi, porta alla internalizzazione desensibilizzazione dei GPCR (l'attenuazione della risposta stimolo nonostante la presenza di agonisti) 12, 13. I recettori internalizzati possono essere incorporati nella lisosoma e degradati, oppure possono essere riciclati alla superficie cellulare, a seconda della natura dei recettori e le linee cellulari utilizzate negli esperimenti.
I recettori dell'ormone di rilascio delle gonadotropine (GnRHRs) appartengono alla famiglia GPCR e hanno una struttura tipica proteina GPCR, con un terminale ammino extracellulare, un terminale -COOH intracellulare, e sette transmembrana (TM) 14 domini. La trasfezione di plasmidico ricombinante Sj GnRHR-EGFP (con il gene GnRHR da Sepiella japonica) e la rilevazione di microscopia confocale GnRHR Sj EGFP-tag (espressi in cellule HEK293) è stata riportata Precemalizioso, e la fluorescenza GFP è stato stabilito come reporter per saggi di localizzazione della proteina transmembrana 15. Ora, l'interiorizzazione di Sj GnRHR, attivato da S. japonica gonadotropina-releasing hormone (GnRH Sj), è stata dimostrata in maniere tempo-e dose-dipendenti mediante microscopia confocale.
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Protocol
1. Preparazione delle cellule
- il recupero delle cellule
- Trasferire le cellule renali 293 crioconservate embrionali umane (HEK293) da un serbatoio di azoto liquido bagnomaria C 37 ° e agitare continuamente per 1 - 2 min.
- Aggiungere 10 ml di mezzo di crescita Equilibrated (mezzo di Dulbecco modificato da Eagle (DMEM), 10% siero bovino (FBS), e 1% di soluzione di penicillina-streptomicina fetale) a 10 cm piatto di coltura cellulare. Delicatamente aggiungere le cellule scongelate al mezzo di crescita equilibrata.
- Incubare le cellule in una camicia d'acqua CO 2 incubatore a 37 ° C con un'atmosfera umidificata contenente il 95% di CO aria e 5% 2 per 2 - 4 h.
- Dopo 2 - 4 h, controllare che le cellule sono allegati. Sostituire il terreno di crescita equilibrata e la cultura per un altro 24-48 ore.
NOTA: La modifica del mezzo di crescita equilibrata è utile perché elimina dimetilsolfossido (DMSO) e protegge contro i danni cellulari.
- <strong> passaggio della cella
- Dopo 24 - 48 h, quando le cellule sono cresciute a confluenza vicino, scartare il mezzo di crescita equilibrata e lavare le cellule con 2 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Agitare delicatamente il piatto.
- Eliminare il PBS e aggiungere 1 ml di tripsina-EDTA (soluzione salina, 0,25% tripsina, e 0,02% EDTA). Per digerire completamente le cellule, agitare il piatto con attenzione e aspirare via la soluzione tripsina-EDTA. Mettere il piatto nel 37 ° C con camicia d'acqua CO 2 incubatore per 3 min.
NOTA: Durante questo periodo, preparare tre piatti nuovi coltura cellulare 10 cm e aggiungere 10 ml di terreno di crescita equilibrata a ciascuno. - Utilizzando un microscopio ottico, determinare se le cellule hanno sollevato dal fondo del recipiente. Aggiungere 2 ml di terreno di crescita equilibrata al piatto. Mescolare pipettando e pipettare immediatamente 0,6 ml di sospensione cellulare per ciascuno dei nuovi piatti. Mescolare delicatamente pipettando e permettono alle cellule di incubare a 37 ° C e 5% CO 2.
2. Cella Semina
- Dopo 24 - 48 h, quando le cellule sono cresciute a diversi passaggi vicino confluenza, scartare il mezzo di crescita equilibrata e lavare le cellule con 2 ml di PBS. Agitare delicatamente il piatto.
- Eliminare il PBS e aggiungere 1 ml di tripsina-EDTA. Per digerire completamente le cellule, agitare il piatto con attenzione e aspirare fuori dalla tripsina-EDTA. Mettere il piatto nel 37 ° C con camicia d'acqua CO 2 incubatore per 3 min.
NOTA: Durante questo periodo, preparare una piastra da 6 pozzetti aggiungendo 2 mL di terreno di crescita equilibrata in ciascun pozzetto. - Aggiungere 1 ml di mezzo di crescita equilibrata al piatto, se, sotto osservazione microscopica, le cellule hanno sollevato dal fondo piatto. Mescolare pipettando e subito pipettare 0,1 ml di sospensione cellulare (il volume viene regolato in funzione della densità crescita cellulare) in ciascun pozzetto della preparato il 6 pozzetti (lastra alveolare inferiore 6 pozzetti con 2 ml di mezzo di crescita equilibrata). Mescolare delicatamente pipettando e consentire alle celluleincubare a 37 ° C e 5% CO 2.
3. cellule trasfezione
- Metodo trasfezione 1, con formulazioni liposomi
NOTA: Si prega di consultare la tabella dei materiali per il reagente di trasfezione 1.- Il giorno seguente, in modo che le cellule dovrebbero essere 85-95% confluenti.
- Aggiungere 3 pg di DNA plasmidico (500 ng / ml) e 100 ml di mezzi di siero ridotta in una provetta sterile, e mescolare delicatamente. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Preparare 9 ml di reagente 1 e 100 ml di mezzi di siero ridotta in un'altra provetta e mescolare delicatamente. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Combinare la miscela plasmide diluito con reagente diluito 1 (volume totale = 215 ml). Mescolare delicatamente e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente.
- media Aspirare la piastra cellule in coltura, e aggiungere 1,5 ml DMEM fresco senza FBS.
- Aggiungere 215 microlitri di DNA-trasfessione miscela reagente in ogni pozzetto, goccia a goccia, e mescolare delicatamente agitando la piastra.
- Incubare a 37 ° C e 5% CO 2: 4 - 8 ore. Sostituire con DMEM fresco con il 10% FBS.
- Incubare le cellule a 37 ° C e 5% CO 2 per altre 24 - 48 ore prima di eseguire qualsiasi esperimenti.
- Metodo trasfezione 2, con formulazioni liposomi
NOTA: Si prega di consultare la tabella dei materiali per il reagente di trasfezione 2.- Aggiungere media siero 2 pg di DNA plasmidico (500 ng / ml), 4 ml di reagente 2, e 100 microlitri ridotti in una provetta sterile. Mescolare delicatamente e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
- Aggiungere la miscela di trasfezione per le cellule in modo goccia a goccia.
- Dopo la trasfezione, le cellule incubare per 24 - 48 ore a 37 ° C e 5% di CO 2, prima di eseguire qualsiasi esperimenti.
4. coltura cellulare in copertina Slips
- Rispostare il mezzo di crescita della coltura 6 pozzetti.
- Lavare il monostrato di cellule con 1 ml di PBS senza calcio e magnesio.
- Aggiungere 0,5 ml di tripsina-EDTA. Agitare il piatto con attenzione e aspirare fuori tripsina-EDTA. Incubare la piastra di coltura per 3 minuti a 37 ° C e 5% CO 2. Il tempo di incubazione effettiva dipende dalla linea cellulare utilizzato.
NOTA: Durante questo periodo, preparare un nuovo 12-pozzetti e aggiungere 15 mm di diametro copertura sterile scivola a ciascun pozzetto. coprioggetto rivestiti con lisina, laminina, o collagene può migliorare l'adesione cellulare per cellule HEK293 che facilmente si staccano. - Quando le cellule vengono staccate, aggiungere mezzo di crescita completo 1 ml preriscaldata a ciascun pozzetto. Mescolare pipettando e trasferire immediatamente il numero di cellule per piastra 12 pozzetti con coprioggetto. Aggiungi terreno di coltura completo fresco ad ogni pozzetto per regolare il volume totale di 1 ml
- Incubare le cellule per 16 - 24 ore a 37 ° C e 5% CO 2.
NOTA: Dopo il 30 -60 min, la maggioranza delle cellule avrà aderito alle coprioggetto sterili.
5. Microscopia confocale Detection
- localizzazione cellulare
- Dopo 16 - 24 h, quando le cellule sono cresciute a confluenza in prossimità delle sterili coprioggetto nella piastra 12 pozzetti, aggiungere la sonda membrana, DII, a ciascun pozzetto, dando una concentrazione finale di 5 mM. Permettono alle cellule di incubare per 30 minuti a 37 ° C e 5% CO 2.
- Dopo 30 min, rimuovere il mezzo di crescita equilibrata e lavare le cellule due volte in PBS freddo (2 - 8 ° C).
- Fissare le cellule aggiungendo 1 ml di una soluzione di paraformaldeide al 4% (in PBS) a ciascun pozzetto. Agitare delicatamente per 15 min.
Attenzione: Paraformaldeide è moderatamente tossico per contatto con la pelle o per inalazione, e designato come probabile cancerogeno umano. Chemicals cappe, recinzioni equilibrio sfiato o altre misure di protezione dovrebbe essere usato per il trattamento di pesatura e di paraformaldeide. </ Li> - Lavare le cellule fissate due volte in PBS. Aggiungere 200-300 ml di DAPI (4' , 6-diamidino-2-fenilindolo) soluzione (0,5 ug / mL) a ciascun pozzetto e incubare per 10 min a temperatura ambiente.
- Lavare le cellule due volte con PBS. rimuovere accuratamente i vetrini dalla piastra e stoppino in eccesso PBS. Capovolgere su vetrini da microscopio caricato con una goccia di mezzo di montaggio (50% v / v di glicerolo / acqua). Rimuovere l'eccesso di soluzione di montaggio dal diapositive.
- internalizzazione cellulare
- Dopo 16 - 24 h, quando le cellule sono cresciute a confluenza in prossimità delle sterili coprioggetto nella piastra 12 pozzetti, rimuovere il mezzo di crescita equilibrata e aggiungere fresco, riscaldato DMEM (37 ° C). Incubare le cellule per 1 ora a 37 ° C e 5% CO 2.
- Trattare le cellule con differenti concentrazioni (0, 10 -12, 10 -9 e 10 -6 M) del ligando per 30 min e trattarli con 10 -6 M ligando per tempi diversi (0,10, 30 e 60 min).
- Lavare le cellule due volte in PBS freddo (2 - 8 ° C). Fissare le cellule aggiungendo 1 ml di una soluzione di paraformaldeide al 4% (in PBS) a ciascun pozzetto. Agitare delicatamente per 15 min.
- Lavare le cellule due volte in PBS. rimuovere accuratamente i vetrini dalla piastra e evacuano l'eccesso di PBS. Capovolgere su vetrini da microscopio caricato con una goccia di mezzo di montaggio (50% v / v di glicerolo / acqua). Rimuovere l'eccesso di soluzione di montaggio dal diapositive.
- Microscopia confocale
- Accendere l'hardware del microscopio confocale, tra cui la potenza della lampada al mercurio, microscopio PC, scanner e laser. Effettua il login per account del sistema operativo, avviare il software, controllare la configurazione e selezionare laser. Accendere le diverse unità del sistema di microscopia confocale in ordine secondo le istruzioni.
- Porre i vetrini preparati sul palco microscopio. Posizionare il campione sul lente dell'obiettivo utilizzando il controller palco. Aggiungere una goccia di olio di cedro sua coprivetrino quando è selezionata la lente immersione in olio. Posizionare i vetrini su vetrini di fronte alla lente.
- Trova le cellule di interesse sotto il microscopio a fluorescenza.
- Passare alla modalità di scansione. Scegliere la potenza del laser e la gamma spettrale del fluoroforo emissione. Catturare le immagini di alta qualità confocale di intensità del laser messa a punto e di altri parametri.
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Representative Results
La figura 1 mostra un esempio di un sistema di microscopia confocale. La figura 2 presenta l'espressione di pEGFP-N1 in cellule HEK293. Il segnale GFP è stato rilevato nel citoplasma e nucleo. La Figura 3 mostra la localizzazione subcellulare di GnRHR da S. japonica in cellule HEK293, coerente con i risultati precedentemente pubblicati 15. La proteina di fusione con il tag EGFP al C-terminale di Sj GnRHR (Sj GnRHR-EGFP) è apparso verde in questo esperimento quando sotto CLSM. Il nucleo macchiato con DAPI è stato rivelato in blu. colorazione DII evidenziato la membrana cellulare in rosso. Il segnale giallo sulla superficie cellulare nell'immagine unita indicata la coincidenza di rosso e verde, dimostrando la localizzazione di membrana plasmatica Sj GnRHR.
Le figure 4 e 5 mostrai risultati dei saggi di internalizzazione Sj GnRHR in cellule HEK293. Per visualizzare l'internalizzazione di Sj GnRHR, le cellule sono state trattate con gonadotropina-releasing hormone (Sj GnRH) 15 a differenti concentrazioni per 30 min (Figura 4), oppure sono stati trattati con una singola concentrazione periodo (10 - 6 M) per differenti durate ( figura 5). In assenza di Sj GnRH, il controllo (CTL) fusione recettore aveva localizzazione di membrana plasmatica. Come mostrato in figura 4, a diverse concentrazioni di ligando, l'internalizzazione della Sj GnRHR procedette in modo dose-dipendente, e il recettore è stato completamente internalizzato dalla superficie cellulare con il 10 - ligando 6 M. Come mostrato in figura 5, i risultati dell'analisi andamento temporale di internalizzazione recettoriale su 10 - 6 M ligando dimostrato che internalizzataSj GnRHR era rilevabile 10 minuti dopo la stimolazione con agonisti e estrema internalizzazione verificato da 60 min. Osservazione al microscopio confocale da queste due figure rivelato che la proteina di fusione Sj GnRHR-EGFP fluorescenza è stato principalmente localizzata nella membrana plasmatica ed era notevolmente e rapidamente internalizzato nella cellula in risposta al peptide Sj GnRH in cellule HEK293.
Figura 1. Un esempio di un microscopio confocale sistema. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Microscopia confocale di GFP proteina nel controllo pEGFP-N1-trasfettate HEK293 cellule . Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Localizzazione di Sj GnRHR-EGFP Fusion Protein in HEK293 cellule al microscopio confocale. Il nucleo colorati con DAPI è mostrato in blu. colorazione DII, mostrato in rosso, mette in evidenza la membrana cellulare. Sj GnRHR-EGFP proteina di fusione è mostrato in verde. Nell'immagine risultante dalla fusione, il giallo indica la coincidenza dei segnali rossi e verdi. Tutte le immagini rappresentano almeno tre esperimenti indipendenti. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 4. Interiorizzazione Sj GnRHR-EGFP Fusion Protein in cellule HEK293 in Corso Time di microscopia confocale. Cellule HEK293 trasfettate con Sj GnRHR-EGFP plasmide sono state attivate mediante trattamento con diverse concentrazioni di GnRH per 30 min. Il caso di controllo era senza stimolazione GnRH (CTL). Tutte le immagini rappresentano almeno tre esperimenti indipendenti. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. Interiorizzazione Sj GnRHR-EGFP Fusion Protein in cellule HEK293 in modo dose dipendente da microscopia confocale. Cellule HEK293 trasfettate con Sj GnRHR-EGFP plasmide sono state attivate mediante trattamento con il 10 - 6 M ligando per differenti durations. Il caso di controllo era senza stimolazione GnRH (CTL). Tutte le immagini rappresentano almeno tre esperimenti indipendenti. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il protocollo presentato qui offre un metodo efficiente e facilmente interpretabili per rilevare la localizzazione subcellulare e l'interiorizzazione della proteina di fusione GPCR espresso in cellule HEK293. La tecnica può essere facilmente adattato per molti geni differenti e tipi di cellule, come per la localizzazione cellulare e internalizzazione del recettore corazonin da Bombyx mori in cellule HEK293 e Bmn 16.
L'applicazione di successo di questo potente saggio si basa su alcuni fattori chiave. Più importante è la buona salute delle cellule, che è essenziale per la trasfezione efficiente e di qualità dei dati. Il tempo di incubazione transfezione, l'intervallo tra trasfezione ed altri esperimenti, e il passaggio di cellule trasfettate per coprire scivola prima di imaging, sono tutti passi in cui danni alle cellule in coltura è possibile. Pertanto, il mantenimento della buona salute delle cellule è un presupposto importante per tutte le fasi di questo esperimento. Inoltre, evitando cellule strettamente compressi in colture dense è vitale per acquisire immagini di alta qualità con microscopia confocale. Per ridurre al minimo l'influenza del tag fluorescente sulla localizzazione dei GPCR, abbiamo generato recettori con EGFP unito alla intracellulare C-terminale. La trasfezione efficace ed efficiente del gene nelle cellule è anche importante. efficienza di trasfezione può variare notevolmente in diverse linee cellulari. Pertanto, l'ottimizzazione di alcune fasi del protocollo può essere necessario, a seconda del particolare tipo cellulare utilizzato. Ad esempio, nel metodo di trasfezione 1, la durata dell'incubazione delle cellule trasfettate in DMEM senza FBS potrebbe essere ottimizzato secondo la condizione della cella. Oltre al dosaggio del DNA plasmidico, il dosaggio del reagente liposoma e mezzi di siero ridotte devono essere regolati secondo linee cellulari specifici. In caso contrario, la tecnica electrotransfection potrebbe essere condotta invece di liposomi reagente di trasfezione mediata fo accettabile efficienza di trasfezione in una linea cellulare specifica. Tuttavia, è necessario hardware aggiuntivo, e le cellule in sospensione e in un piccolo volume sono difficili da trasfettare da electrotransfection. La vera forza del dosaggio attuale, tuttavia, consiste nel confronto tra i cambiamenti nelle stesse cellule in condizioni di coltura identiche dopo manipolazioni acuti, quali l'internalizzazione di Sj GnRHR in risposta al ligando Sj GnRH.
Internalizzazione è uno dei meccanismi che controllano predominanti GPCR segnalazione per assicurare le risposte cellulari appropriate agli stimoli 11. Possiamo facilmente osservare i cambiamenti nel interiorizzazione attraverso l'imaging con microscopia confocale. L'internalizzazione di Sj GnRHR in maniera dose e dipendente dal tempo si rivela chiaramente nella figura 4.
Il protocollo che abbiamo descritto può essere facilmente adattato al tracciamento subcellulare di altri pr eucarioticaoteins, come il recettore degli estrogeni 17 nucleare. Tuttavia, l'ottimizzazione di alcune fasi del protocollo sarà necessario, a seconda delle particolari tipi cellulari usate, che richiederanno ulteriore esplorazione e pratica. Tuttavia, considerando che la localizzazione subcellulare delle proteine ha una grande influenza sulla identificazione dei geni, modifiche delle proteine, e vie di segnalazione, questo protocollo, in base alla ricerca pubblicata, in grado di fornire dati e informazioni affidabili.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEK293 cell line | |||
| DMEM/High glucose | Hyclone | SH30022.01 | High glucose 4.0 mM L-glutamine |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | PuFei | 1101-100 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Genom | GNM10010 | |
| Penicillin-Streptomycin | Genom | GNM15140 | |
| 0.25% Trypsin & 0.02% EDTA | Genom | GNM25200 | |
| Opti-MEM (1x) | GIBCO, by Life Technologies | 31985-062 | reduced serum media |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668027 | Reagent 1 |
| X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent | Roche | 6366236001 | Reagent 2 |
| DAPI Staining Solution | Beyotime | C1006 | |
| DiI | Beyotime | C1036 | |
| Antifade Mounting Medium | Beyotime | P0126 | |
| Paraformaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent Co.(SCRC) | 80096618 | |
| 100 mm cell culture | CORNING | 430167 | |
| 6-well plate | ExCell Bio | CS016-0092 | |
| 12-well plate | ExCell Bio | CS016-0093 | |
| Cover Glass | NEST | 801007 | |
| Microscope Slides | Citoglas | 10127105P-G | |
| Thermo Scientific Forma CO2 Incubator | Thermo | 3111 | |
| TCS SP5II laser scanning confocal microscope | Leica | 5100001311 |
References
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