Expression, purification et activité antimicrobienne de S100A12

Les protéines S100 sont une classe de la famille EF de protéines de liaison au calcium avec un éventail varié de fonctions ¹ . Ils sont exprimés de manière spécifique aux tissus et aux cellules et régulent un large éventail de fonctions cellulaires ^{2 , 3} . Les protéines S100 sont exclusives aux protéines de liaison au calcium et présentent des fonctions intracellulaires et extracellulaires ^{4 , 5} . Dans la cellule, la liaison au Ca ²⁺ induit un changement de conformation qui expose une surface hydrophobe qui cible spécifiquement les partenaires de liaison aux protéines ⁶ . Ce mécanisme intracellulaire regroupe des processus importants tels que la prolifération cellulaire, la différenciation et le métabolisme énergétique. Dans le milieu extracellulaire, les protéines S100 présentent deux fonctions ⁷ . Dans un, ils agissent comme des protéines associées à un motif moléculaire associé (DAMP) et initient un pro-inflammatoireRéponse immunitaire de l'administration par l'interaction avec les récepteurs de reconnaissance de formes ^{8 , 9} . De plus, plusieurs membres de la classe de protéines S100 séquestrent des métaux de transition, une fonction qui sert à affamer les agents pathogènes microbiens dans un processus appelé immunité nutritionnelle ^{10 , 11} .

S100A12 (également connu sous le nom de calgranuline C et EN-RAGE) est fortement exprimé dans les macrophages et les neutrophiles et a été identifié comme un biomarqueur potentiel pour les maladies inflammatoires ^{12 , 13} . En plus de la liaison du calcium sur ses sites EF-Hand, S100A12 comporte deux sites de liaison de métal de transition à haute affinité situés aux extrémités opposées de l'interface dimère ^{14 , 15} . Chaque site de liaison est composé de trois résidus d'histidine et d'un résidu d'acide aspartique et peut chélater le zinc ou le cuivre <Sup class = "xref"> 16 ^{, 17} . Récemment, nous avons signalé que la famine de zinc dépendante de S100A12 est importante pour réguler la croissance de Helicobacter pylori et l'activité de facteurs de virulence pro-inflammatoires ¹⁸ .

H. pylori infecte l'estomac d'environ la moitié de la population humaine mondiale; Ce qui fait sans doute l'un des agents pathogènes bactériens les plus réussis ¹⁹ . L'infection par H. pylori peut conduire à des résultats significatifs de la maladie gastrique, y compris la gastrite, l'ulcère peptique et duodénal, le lymphome du tissu lymphoïde associé à la muqueuse (MALT) et l'adénocarcinome gastrique invasif (cancer de l'estomac). Le cancer de l'estomac est la principale cause de décès par cancer non cardiaque dans le monde et le plus grand facteur de risque associé au cancer de l'estomac est une infection par H. pylori .

H. pylori persiste dans la niche gastrique malgré un robouSt réponse immunitaire à l'agent pathogène, soulignant la nécessité d'une meilleure compréhension des mécanismes immunitaires de lutte contre cette infection bactérienne ^{20 , 21 , 22 , 23} . L' inflammation associée à H. pylori est caractérisée par une infiltration profonde des cellules polymorphonucléaires, ou des neutrophiles, qui déposent un répertoire de protéines antimicrobiennes, y compris S100A12, au site d'infection ^{18 , 24 , 25} . Dans le but de comprendre le dialogue complexe entre l'hôte et l'agent pathogène, nous avons cherché à affiner la technique pour purifier le S100A12 et l'utiliser pour étudier l'effet antimicrobien qu'il exerce sur ce pathogène médicalement pertinent. Le protocole ci-dessous décrit une technique améliorée pour la purification de S100A12 dans son état biologiquement actif; Capable de lier des métaux nutritifs avec des affini élevésEt les chélage des microorganismes envahissants. En outre, les méthodes ci-dessous mettent en évidence l'utilité de cette protéine en tant que réactif critique pour étudier le mécanisme par lequel les molécules antimicrobiennes innées limitent la croissance des agents pathogènes bactériens.

Les protéines de la famille S100A se sont accrues en tant que groupe important de molécules du système immunitaire inné qui participent à la signalisation immunitaire ainsi qu'à la défense de l'hôte ²⁷ . Le plus bien étudié est la calprotectine (MRP-8/14, calgranuline A / B, S100A8 / A9) ^{28 , 29 , 30} . La calprotéctine est une protéine associée aux neutrophiles qui forme un hétérodimère des sous-unités S100A8 et S100A9 qui se lient aux métaux de transition à l'interface dimère ³¹ . On a montré que la calprotéctine possède deux sites de liaison métallique: le site 1 peut lier Zn ²⁺ , Mn ²⁺ ou Fe ²⁺ , et le site 2 peut Liez Zn ^{2+ 31 , 32} . De nombreux rapports ont démontré que la calprotectine a des activités antimicrobiennes contre divers agents pathogènes, y compris Staphylococcus aureus , Candida albicans , Acinetobacter baumannii , Klebsiella pneumoniae , Escherichia coli et H. pylori , et que les effets inhibiteurs sont dus à l'activité de chélation du métal de la calprotectine ^{25 , 28 , 29} .

Les travaux antérieurs démontrent que la calprotectine exerce de nombreuses activités sur H. pylori, y compris la modification de la structure de lipide A dans la membrane externe, la rétention du système de sécrétion de type IV (qui est un facteur de virulence proinflammatoire majeur au sein de H. pylori ), induisant une formation de biofilm et réprimant La croissance et la viabilité de H. pylori de manière dose-dépendanteClass = "xref"> 25 ^{, 33} . De plus, les études génétiques et biochimiques révèlent que l'activité antibactérienne de la calprotectine contre H. pylori découle en grande partie de sa capacité à lier le zinc nutritif ²⁵ . H. pylori requiert du zinc, comme l'ont déterminé les recherches précédentes, qui utilisaient un milieu chimiquement défini pour déterminer les besoins en micronutriments pour que ce pathogène se développe et prolifère ³⁴ . En outre, la calprotectine était très abondante dans les tissus infectés par H. pylori et associée à des infiltrats neutrophiles, ce qui indique que l'hôte peut utiliser la calprotectine comme stratégie antimicrobienne pendant l'infection et une inflammation subséquente ^{25 , 35} .

Des preuves récentes provenant de techniques de dépistage protéomiques impartiales suggèrent que, dans des conditions où les espèces réactives d'oxygène sont nombreuses, CalprotecL'étain subit des modifications post-traductionnelles qui modifient le site de liaison de l'hexa-histidine, inhibant ainsi l'activité de liaison de métal de la protéine ³⁶ . En tant que tel, nous avons émis l'hypothèse que d'autres protéines de la famille S100A parmi le large répertoire de ces molécules pourraient potentiellement agir comme des chélateurs métalliques auxiliaires. Nous avons sélectionné S100A12 pour une étude approfondie car il n'a pas été identifié dans l'écran précité pour la modification post-traductionnelle, il a la capacité de lier le zinc et il est très abondant dans les tissus humains dérivés des individus infectés par H. pylori .

Notre travail indique que S100A12 peut inhiber la croissance et la viabilité de H. pylori de manière dose-dépendante dans la souche G27 de H. pylori et que l'activité antimicrobienne de cette protéine peut être inversée par l'ajout d'excès de nutriment au zinc. Ce travail complète notre travail précédent indiquant que S100A12 a exercé une activité antimicrobienne contre PMSS1 et 7.13 souches de H. pylori , démontrant sa large activité antibactérienne contre de nombreux isolats cliniques et souches adaptées au laboratoire de H. pylori ¹⁸ . Ensemble, ces résultats confirment l'importance du S100A12 comme mécanisme de lutte contre la prolifération et la prolifération des bactéries par immunité nutritionnelle. Des études futures de cette importante interaction hôte-bactérienne pourraient inclure l'exploitation de l'activité de S100A12 pour réduire le fardeau bactérien dans les tissus de l'hôte ou déterminer la contribution de cette protéine à la signalisation immunitaire dans le contexte de l' infection par H. pylori .

1. Expression de S100A12

1. Transformer les cellules BL21 DE3 compétentes avec un plasmide pGEMEX-S100a12 en utilisant un protocole de choc thermique ¹⁸ standard. Ajouter 1 à 5 μL de plasmide à 50 μL de bactéries dans un tube de microcentrifugeuse sur de la glace. Incuber pendant 20 min.
2. Choc thermique des cellules à 42 ° C pendant 30 s.
3. Incuber les cellules sur de la glace pendant 2 min.
4. Ajouter 500 μL de support SOC aux cellules. Incuber à 37 ° C avec agitation à 250 tr / min sur un agitateur orbitaire pendant 1 h.
5. Placer 150 μL de la réaction de transformation sur un milieu LB-agar (supplémenté avec 100 μg / mL d'ampicilline). Incuber pendant 12-16 h à 37 ° C.
6. Choisissez une colonie. Inoculer 2 mL de LB (supplémenté avec 100 μg / mL d'ampicilline).
7. Incuber pendant 4-6 h à 37 ° C sur un agitateur orbitaire (300 tr / min). Le DO ₆₀₀ devrait lire entre 1 à 3 unités d'absorbance.
8. Ajouter 500 μL de culture initiale à 50 mL d'autoindu ZYM-5052Ction media ²⁶ complété par 100 μg / mL d'ampicilline. Pour une meilleure aération et une expression maximale, utilisez une fiole Erlenmeyer bouchée de 250 ml. Agiter (300 tr / min) pendant 24 h, à 37 ° C.
9. Transférer la suspension bactérienne dans un tube centrifuge. Pelleter les cellules par centrifugation (4 000 xg, 10 min) à 4 ° C.
10. Décrivez les médias, enregistrez l'échantillon et collez la cellule à -80 ° C. L'échantillon est stable depuis des années.

2. Purification de S100A12 en utilisant une Chromatographie à basse pression

1. Remettre en suspension les cellules dans 30 ml de Tris 20 mM, pH 8,0.
2. Sonicate la suspension sur glace pour lyse des cellules. Utilisez une sortie de ~ 20 W, 5 s activée et 5 s de cycle d'arrêt pendant 5 min.
3. Transférer la solution aux tubes centrifuges à grande vitesse. Clarifier le lysat cellulaire par centrifugation, 20 000 xg pendant 30 min à 4 ° C.
4. Décanter le surnageant et transférer à un bêcher de polypropylène propre de 100 ml. Refroidissez la solution en plaçant le bécher sur la glace. Ajouter un agitateurR et ajouter lentement 11,20 g de sulfate d'ammonium. Laisser la solution remuer sur de la glace pendant 1 h supplémentaire. Cela créera une solution à 60% de sulfate d'ammonium et précipitera la plupart des protéines endogènes E. coli . S100A12 restera soluble.
5. Centrifuger la solution à 4 ° C, 20 000 xg pendant 20 minutes pour granuler la protéine précipitée.
6. Décanter le surnageant et transférer à un tube de dialyse (MWCO 3,500 kDa). Dialyze contre 1 L de Tris 20 mM, pH 8,0 à 4 ° C. Changez le tampon de dialyse deux fois. Attendre 4 h entre les changements.
7. Chromatographie d'échange d'anions
   1. Effectuer une chromatographie sur un système à basse pression. Le débit typique est de 1 mL / min.
   2. Equilibrer une colonne de Sepharose 5 ml avec 10 ml de Tris 20 mM, pH 8,0.
   3. Chargez la solution de ~ 40 ml de S100A12 en utilisant la pompe à échantillon (collectez le débit).
   4. Laver la colonne avec 10 ml de Tris 20 mM, pH 8.
   5. Développez la colonne avec un gradient de 0 à 30% (BuFfer B est 20 mM Tris, pH 8,0, 1 M NaCl) sur 19 volumes de colonne (CV, 95 ml). Recueillir des fractions de 5 ml.
   6. Prenez une aliquote de 10 μL de chaque fraction et analysez l'utilisation de MES SDS PAGE avec une coloration au Coomassie. Faire fonctionner le gel à l'aide d'une tension constante (20 V / cm) pendant 30 min.
   7. Fractions de piscine contenant S100A12. S100A12 fonctionne avec une protéine de ~ 10 kDa sur un gel dénaturant.
   8. Concentrer les fractions à 5 mL en utilisant un dispositif d'ultrafiltration (MWCO 10 kDa). Centrifuger à 3 000 xg pendant environ 8 min. Prenez la fraction supérieure.
8. Chromatographie d'exclusion de taille
   1. Equilibrer la colonne S75 avec 1 CV (120 ml) de Tris 20 mM pH 8, NaCl 100 mM.
   2. Injecter <5 ml de fractions S100A12 concentrées (à partir de la Chromatographie d'échange d'ions).
   3. Développez la colonne à un débit de 1 mL / m sur 120 mL. Recueillir des fractions de 5 ml.
   4. Prenez une aliquote de 10 μL de chaque fraction et analysez avec SDS PAGE avec une coloration au Coomassie. Valider l'identité protéique en utilisantWestern blot ou spectrométrie de masse (masse moléculaire calculée de la sous-unité monomère 10,575.0 Da, mesurée 10575.4 Da).
9. Fractions de piscine
   1. Mesurer l'absorbance de la protéine A ₂₈₀ en utilisant un spectrophotomètre. Utilisez le tampon SEC comme un blanc. Le coefficient d'extinction calculé pour l'homodimère S100A12 est de 5960 M ^-1 cm ^-1 .
      NOTE: Les rendements typiques sont de 35 à 45 mg de S100A12 pour 50 mL de culture.
   2. Aliquot S100A12 dans des tubes de microcentrifugeuse de 1,5 mL (1 mg / tube), un gel instantané dans l'azote liquide et stocker à -80 ° C.

3. Analyses d'activité antimicrobienne

1. Streak H. pylori souche G27 sur des grappes tryptiques de soja complétées par 5% de sang de mouton (plaques d'agar de sang). Cultiver 2-3 jours à 37 ° C dans l'air ambiant additionné de 5% de dioxyde de carbone.
2. Inoculer H. pylori dans du bouillon Brucella complété par un cholestérol 1x. Culture surTremblement de nuit (250 tr / min) à 37 ° C dans l'air ambiant additionné de 5% de dioxyde de carbone.
3. Diluer H. pylori 1:10 dans 50% de bouillon de Brucella, 50% de tampon de calprotectine plus 1x cholestérol et culture en milieu seul ou additionné de chlorure de zinc 100 uM plus 0, 100 ou 1000 μg / mL de S100A12 purifié. Culture de tremblement de nuit (250 tr / min) à 37 ° C dans l'air ambiant additionné de 5% de dioxyde de carbone.
4. Le lendemain, effectuez des dilutions en série et des plaques sur des plaques d'agar de sang. Permettre aux colonies bactériennes de croître pendant 2-3 jours à 37 ° C dans l'air ambiant additionné de 5% de dioxyde de carbone. Énumérer les unités de formation de colonies pour calculer la croissance bactérienne en présence ou en l'absence de S100A12 et / ou de zinc exogène.

S100A12 expression et purification

Une purification en trois étapes a produit ~ 40 mg de S100A12 recombinant à partir de 50 ml de culture bactérienne. La première étape était une précipitation au sulfate d'ammonium de protéines endogènes de E. coli . Cette étape a été suivie d'une Chromatographie d'échange d'anions ( figure 1A ). La protéine est suivie par une SDS-PAGE colorée au Bleu Brillant Coomassie ( Figure 1B ). La dernière étape de la procédure de purification consiste à regrouper des fractions contenant S100A12 pour la chromatographie d'exclusion de taille qui sépare les protéines par leur poids moléculaire et leur forme ( figure 2A ). S100A12 est un homodimère (92 acides aminés par sous-unité) et a une masse moléculaire totale d'environ 21 kDa. Les fractions recueillies à partir de la chromatographie d'exclusion de taille ont été analysées par SDS-PAGE et visualisées par coloration de Coomassie ( figure 2B </sTrong>).

S100A12 réprime la croissance bactérienne par une activité de chélation du zinc

Pour étudier l'activité antimicrobienne de S100A12, les analyses de viabilité bactérienne ont été réalisées par des techniques quantitatives de culture microbiologique ( figure 3 ). L'énumération des cellules bactériennes révèle que l'exposition à 100 μg / mL de S100A12 en présence ou en l'absence d'une source exogène de zinc nutritif n'influence pas significativement la viabilité bactérienne par rapport aux témoins sans addition de S100A12 (P> 0,05, ANOVA à sens unique). Cependant, l'exposition à 1000 μg / mL de S100A12 en milieu seul entraîne une diminution de la viabilité bactérienne de 69 fois par rapport au milieu seul (P = 0,0193, test t de Student , P> 0,05 one-way ANOVA); Un résultat qui a été inversé par l'ajout d'une source exogène de zinc nutritif (P = 0,023, test t de Student ). Ces résultats deL'activité antimicrobienne de S100A12 dépend de son activité de séquestration du zinc.

Figure 1: lyse cellulaire et purification S100A12 par chromatographie échangeuse d'anions . (A) Chromatogramme de la purification d'échange d'ions. Trace de l'absorbance UV à 280 nm montré en bleu, gradient de sel représenté en rose, fractions collectées marquées en rouge. ( B ) SDS PAGE gel des étapes de purification. Lanes: 1) poids moléculaire standard 2) fraction de lysat soluble 3) pastille de sulfate d'ammonium 4) surnageant de sulfate d'ammonium 5 à 14) fraction de Chromatographie Q 6-15. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Figure 2: résultats de la chromatographie d'exclusion de taille de la purification S100A12. (A) Chromatogramme des résultats d'exclusion de taille. Trace d'absorbance UV à 280 nm, montré en bleu, fractions collectées marquées en rouge. ( B ) gel de SDS PAGE de chromatographie d'exclusion de taille. Lanes: 1) marqueur de poids moléculaire 2) charge de l'échantillon 3-15) fractions 10-21. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3: Analyse quantitative de la culture de la viabilité bactérienne en réponse à l'exposition à la chélation de zinc dépendant de S100A12. Les bactéries ont été exposées à 0, 100 ou 100 μg / mL de S100A12 dans un milieu seul (barres grises), ou un milieu additionné de chlorure de zinc 100 μM(Barres noires). L'exposition à 1000 μg / mL en l'absence d'une source exogène de zinc nutritif entraîne une inhibition significative de la viabilité bactérienne (* P <0,05, test t de Student par rapport à l'affection moyenne + zinc). Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont pas d'intérêts financiers concurrents.