Summary
אנו מתארים שיטה לשימוש בתאי גזע עובריים בעכברים ליצירה שניים או שלושה גופי embryoid ממדים. לאחר מכן נסביר כיצד להשרות התמיינות עצבית של תאי הגוף Embryoid ידי חומצה רטינואית, וכיצד לנתח מצב הבידול שלהם על ידי immunofluorescence סמן תא אב ו immunoblotting.
Abstract
תאי גזע עובריים עכבר (ESCs) מבודדים מן המסה הפנימית של הבלסטוציסט (בדרך כלל ב E3.5 יום), יכול לשמש כמערכת מודל במבחנה לחקר ההתפתחות העוברית המוקדמת. בהעדר גורם מעכבות לוקמיה (LIF), ESCs להבדיל כברירת מחדל לתוך תאים עצביים מבשר. הם יכולים להיות צברו לתוך תלת ממדים (3D) המצרפי כדורי כינת גוף embryoid (EB) בשל הדמיון שלה לעובר בשלב מוקדם. EBS ניתן זורעים על coverslips פיברונקטין מצופה, ושם מתפשטים ידי הגוברת שני ממדי (2D) הרחבות, או מושתל מטריצות קולגן 3D שבו הם להמשיך ולצמוח כפי spheroids, להתמיין שכבות נבט שלושה: endodermal, mesodermal, ו ectodermal. תרבות קולגן 3D המחקה את הסביבה vivo הדוק יותר מאשר EBS 2D. תרבות 2D EB מקלה על ניתוחים ידי immunofluorescence ו immunoblotting לעקוב בידול. פתחנו differentia שני שלבים עצבייםפרוטוקול tion. בשלב הראשון, EBS נוצרת על ידי טכניקת תליית הטיפה, וגם, בו זמנית, הם המושרה להבדיל ידי חשיפת חומצה רטינואית (RA). בשלב השני, התמיינות עצבית בפורמט 2D או 3D בהעדר RA.
Introduction
ESCs מקורם מסת התאים הפנימית הבלסטוציסט. תאים אלה הם pluripotent, כלומר יש להם את היכולת להתמיין לכל סוג תא של האורגניזם ממוצא. בידול ESC במבחנה הוא עניין רחב כמערכת ניסיונית חוקר מסלולים ומנגנונים התפתחותי. הוא מציע מערכת מודל חזקה וגמישה לבחון גישות טיפוליות חדשות תיקון של תפקוד תאים ורקמות. EBS לשחזר היבטים רבים של התמיינות תאים במהלך העובר מוקדם. בפרט, EBS ניתן להשתמש כאשר הקטלניות עובריים מקשה לקבוע את הבסיס התאי של מומים עובריים 1, 2. EBS יכול להיוצר גם על ידי Drop Hanging או טכניקות השעיה נוזלות 3. היתרון של לשעבר הוא היכולת ליצור EBS של גודל וצפיפות עקביים, ובכך להקל על שחזור ניסיוני.
= נער "jove_content"> אינטראקציה עם תאי מטריקס (ECM) חלבונים דבקים עשויה להשפיע על תנועתיות והישרדות של תאים חסידים. במערכת התרבות 2D, פיברונקטין מוחל לעתים קרובות כדי להגדיל את הידבקות התא למצע. פיברונקטין הוא מרכיב lamina בסיס מוכר על ידי 10 סוגים של פני שטח תא integrin heterodimers 4.
RA הוא מטבוליט lipophilic קטן של ויטמין A אשר גורמת בידול עצבי 5, 6. ריכוזים גבוהים של RA לקדם ביטוי גנים עצבי ואת מדחיקת ביטוי גני mesodermal במהלך היווצרות 7 EB, 8. RA מופק על ידי ויטמין A חמצון כדי retinaldehyde ידי אחד dehydrogenase אלכוהול או רטינול, ואחריו חמצון retinaldehyde למוצר הסופי על ידי retinaldehyde דהידרוגנז 9. בידול עצבי דורש הובלה של RA מן הציטופלסמה אל הגרעין ידי חלבון תאי RA-מחייב 2 (CRABP2). בגרעין, RA נקשר לקולטן מורכב מאותו המקור שלה מורכב heterodimer RAR-RXR 10. התוצאה היא גיוס של ממריצים-שיתוף תעתיק, וגם בהוצאת תעתיק 9, 11. יתר על כן, RA מקדמת את ההשפלה של פוספורילציה (פעיל) SMAD1, ובכך קומם BMP ו הסמאד איתות 12. בנוסף לפעילויות אלה, RA מגביר ביטוי Pax6, גורם שעתוק התומך בידול עצבי 13. איתות RA היא מווסתת על ידי הסירטואינים-1 (SIRT1) חברה dinucleotide אדנין nicotinamide גרעיני (NAD +) - אנזים תלוי כי הוא מסיר קבוצות אצטיל CRABP2, מפריעים טרנסלוקציה שלו אל גרעין, ולכן עם RA מחייב heterodimer RAR-RXR 14, 15, 16.
e_content "> מטרתנו בעיצוב פרוטוקול EB RA שטופל המתואר כאן היא למטב בידול עצבי כדי להקל במבחנת ניתוח של מסלולי איתות המווסתים בידול ESC לתוך תאים מבשרים עצביים. אחד היתרונות של פרוטוקול זה הוא סיוע של הניתוח של תפקוד תא על ידי immunofluorescence. EBS 3D אינו חדר היטב על ידי נוגדנים וקשים תמונה. דיסוציאציה EB לתוך בשכבת 2D בנקודות ספציפיות עת במהלך בידול עצבי מקל immunolabeling הדמיה של התאים על ידי מיקרוסקופ confocal.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. תרבות של פיברובלסטים עכבר עובריים (MEFs)
- כן בינוני MEF, המדיום של הנשר השונה של Dulbecco (DMEM, גבוהה גלוקוז), בתוספת 15% בסרום שור עובר (FBS).
- מנות תרבית תאים מעיל 100 מ"מ עם פתרון ג'לטין 0.5% למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
- רוזן MEFs באמצעות cytometer. סר פתרון ג'לטין ומייד שופכים בינוניים MEF מחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס. במהירות להפשיר בקבוקונים של MEFs mitomycin שטופלו צלזיוס באמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, אז הזרע 2.8 x 10 6 MEFs לכל 100 מ"מ צלחת ג'לטין מצופה. התאם מספר סלולארי בהתאם אם באמצעות מנות בגדלים אחרים. דגירה MEFs לילה בשעה 37 ° C, 5% CO 2.
- שינוי המדיום ביום הבא. תרבות במשך 2-3 ימים עד שכבת MEF היא ומחוברות.
2. עכבר ESC תרבות
- כן בינוני ESC, המדיום של Dulbecco השונה של Iscove (IMDM) השלים עם 15% FBS ו 103 גורם מעכבות לוקמיה U / mL (LIF), 0.1 חומצות אמינו חיוניות מ"מ, 55 מ"מ 2-mercaptoethanol, פניצילין (100 U / mL), סטרפטומיצין (100 מיקרוגרם / מ"ל), גנטמיצין (200 מיקרוגרם / מ"ל), ו 0.2% אנטיביוטיקה mycoplasma.
- הסר בינוני MEF מצלחת מוכן בשלב 1 ולהחליף עם 37 מעלות צלזיוס מראש חימם בינוני ESC.
- להפשיר בקבוקון ESC ותאי זרע על גבי שכבת MEF. לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, עד ESCs מגיע למפגש.
- הכן מאכלי תרבית תאים חדשים המכילים בשכבה ומחוברת של MEFs. כדי הפרוזדור, ESCs, לשטוף פעם עם PBS ולנתק עם 0.25% טריפסין / EDTA במשך 2-5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% 2 CO. עצור את trypsinization ידי הוספת IMDM טרי עם 15% FBS לתאים ניתוק, להעביר את ההשעיה התא צינור 15 מ"ל, ו צנטריפוגות ב 160 XG במשך 5 דקות ב RT.
- הסר את supernatant, ESCs גלול עם IMDM הטרי מעבר חמישי של תאים לכל צלחת MEF מצופית חדשה; לדגור עד תאיםמגיע למפגש (בדרך כלל 4-5 ימים).
3. משוך MEFs ו ESCs תרבות על צלחות ג'לטין מצופה
- לאחר ECSs הגיע המפגש, לנתק אותם MEFs עם 0.25% טריפסין / EDTA כמו בשלב 2.4, resuspend התאים IMDM טריים, מעבירים לצלחת פטרי בקטריולוגית הלא דביק, דגירה במשך 40 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- להעביר בזהירות ESCs ו MEFs המכילים בינונית לצלחת ג'לטין מצופים חדשה בעזרת פיפטה מיליליטר 5, הימנעות pipetting חזר. התאים הנותרים בצלחות פטרי הם MEFs, מאז ESCs לא ידבקו.
- המסדרון, ESCs כל 3-4 ימים. פחות passaging התכוף עשוי להפחית מגוונת" ESC. אין לעבור 60% המפגש, כפי שהוא עשוי להעדיף בידול.
- חזור על שלבי 3.2-3.3 שלוש פעמים או יותר, כנדרש, עד MEFs הם כבר לא ניתן לגילוי על ידי מיקרוסקופ תרבית תאים, באמצעות מטרת 20X, לעשות MEFs בטוח אינו נוכח.
- ודא מגוונת" ESC ידי בדיקת ESCהתרבות לראות אם התאים יוצרים מושבות צפופות עם מורפולוגיה מצולעים טיפוסית ESC (איור 1A). Stemness מבחן התא על ידי תגובת שרשרת של פולימראז טרנסקריפטאז כמותי הפוך (qRT-PCR) 17, immunoblotting 17, או immunofluorescence של שעתוק מגוונת" הליבה גורמי 17 (איור 2).
4. גיבוש EB
- הכן פתרון המניות כל-טרנס-RA ב 10 מ"מ ב DMSO, ו aliquot לתוך 1.5 מ"ל אור-מוגנים צינורות microfuge. הפתרון הוא יציב ב -80 מעלות צלזיוס למשך עד שבועיים. להגן עליו מפני אור.
- Trypsinize ESCs כמו בשלב 2.4; replate ב IMDM הטרי ללא LIF, כמו השעית תא בודד.
- ספירת תאים באמצעות hemocytometer, ולהכין 5 x 10 5 תאים / מ"ל ההשעיה ב IMDM עם 0.5 מיקרומטר RA.
- פלייט 100 20-μL-טיפות לכל צלחת פטרי 100 מ"מ עם פיפטה 8 ערוצים ו 200 טיפים μL, הפוךהמנות, ולמלא את המכסה ההפוכה עם PBS כדי למנוע טיפות תלויות לייבוש. הגן על תקשורת ותרבות RA-המכיל מאור.
- תרבות EBS ב תלוי טיפות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, עבור 4 ימים.
5. 2D EB תרבות
- מעיל 12 מ"מ זכוכית עגול coverslips עם 30 מיקרוגרם / מ"ל פיברונקטין עבור 30 דקות ב RT. מניחים כל coverslip בתוך באר של צלחת 24-היטב, ולהוסיף 1 מ"ל IMDM לכל טוב.
- קציר 3 יום שגודלו תלוי EBS טיפה אחת אחת עם 200 טיפים μL פיפטה וזרעי אותם על coverslips מצופה פיברונקטין, 20 EBS בכל טוב, תוך שימוש באותה טיפים פיפטה.
הערה: EBS 3 ימים עדיפים על פני EBS 4 ימים כי הם דבקים יותר טוב coverslips. - המשך התרבות עם FBS IMDM-15% ללא LIF. החלף בינוני כל 3-4 ימים. אסוף את המדיום המשמש לניתוח חלבון הפרשה לפי צורך.
6. איתור של חלבונים המופרשים
- העבר 500 μL של Medi EBאממ אל 10 מסננים צנטריפוגלי kDa-הסף, ספין על 20,000 XG במשך 60 דקות ב 4 ° C.
- בדוק את המדיום הנותרים בתוך המסננים צנטריפוגלי כל 15-20 דקות כדי למנוע העשרה מוגזמת. עצור צנטריפוגה כאשר היקף המדיום הנותרים נפל ל 25 μL.
- אסוף המדיום המרוכז הנותר לאחר היפוך מסנן ספינינג ב 160 XG ב 4 ° C, בעקבות הוראות היצרן.
- זיהוי חלבונים המופרשים על ידי immunoblotting עם נוגדנים ספציפיים 17.
7. 3D EB תרבות
- אסוף את EBS גדל במשך 4 ימים תלוי טיפות כפי שמתואר בשלב 5.2, ומניחים אותם 1.5 צינורות צנטריפוגה מ"ל (30 EBS לכל צינור).
- כן פתרון ג'ל קולגן ביצוע ההוראות של ערכת תרבות קולגן 3D (ראה חומרים / טבלת ציוד). לדלל כרכים מתאימים של פתרון קולגן 5x DMEM (רכיב ערכה); מוסיפים את nפתרון eutralization (רכיב ערכת) ומערבבים היטב מיד, ולשמור על הקרח.
- פיפטה נפח מתאים של פתרון קולגן מצונן לתוך צינור 1.5 מ"ל המכיל את EBS, בעדינות להעביר בארות צלחת 6-היטב באמצעות קצה פיפטה מ"ל 1. הימנע עושה בועות.
- מיד להעביר את הצלחת 37 ° C, 5% CO 2, עבור 60 דקות ליזום פילמור קולגן.
- מכסים את צלחת EB-המכיל עם IMDM.
- שנה בינונית כל 3-4 ימים.
8. EB דיסוציאציה
- אסוף היום 4 EBS (משלב 4) אחד אחרי השני, עם 200 טיפים μL פיפטה ולהעביר אותם IMDM המכיל בצלחת פטרי בקטריולוגית הלא דביק עם 15% FBS; תרבות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עבור 4 ימים נוספים. בדוק את EBS פעמים בכל יום, כדי לוודא שהם אינם מייחסים התחתונים; בעדינות לנער את המנה כדי למנוע עיקול EB לתחתית.
- צנטריפוגה EBS ב 185 XG במשך 5 דקות בRT, בצנטריפוגה המעבדתיים.
- הסר את supernatants. הגלולה לא תעלה על 100 μL בצינור אחד.
- הוסף pelleted EBS 1 מ"ל 0.25% מסוג I Collagenase לכל צינור, בתוספת FBS 20% ב PBS.
- דגירה את התערובת EB-collagenase עבור 1 ש 'ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, pipetting אותו בכל דקה 20 בעדינות, בעזרת 1 טיפים פיפטה מ"ל.
- שוטפים את התאים בעדינות 3x עם PBS. אם אגרגטים התא נמצאים, להשתמש מסננת תא עם רשת 100 מיקרומטר כדי להסיר אותם.
- Replate התאים על מנות ג'לטין מצופה 60 מ"מ IMDM. ואז לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
9. Transfection של ניתק EBS
- עבור qRT-PCR ו immunoblotting, מעיל צלחת 6-היטב עם 0.5% ג'לטין.
- עבור immunofluorescence, זכוכית coverslips מעיל עם 30 מיקרוגרם / מ"ל פיברונקטין עבור 30 דקות ב RT. מניחים כל coverslip בתוך באר של צלחת 24-היטב. להוסיף IMDM.
- זרע 4.75 x 10 5 או 1 x 10 5
- לגדל את התאים 70% המפגש לפני transfection.
- Transfect התאים על ידי ריאגנט שומני nonliposomal תאי גזע-אופטימלי 17 (ראה חומרים / טבלת ציוד), בעקבות הוראות היצרן.
הערה: ריאגנט השתמשנו בדרך כלל הגיעו יעילות transfection של 50% (ראה תוצאות נציג). - ניתוח דגימות ידי qRT-PCR או על ידי immunoblotting 17 2 או 3 ימים לאחר transfection, בהתאמה.
ניתוח 10. בידול EB ידי Immunofluorescence
- EBS 2D Wash או ניתק 3D EBS עם PBS ולתקן עם paraformaldehyde 4% ב PBS עבור 30 דקות ב RT. שוטף את התאים הקבועים 3x עם PBS להסיר צף פסולת תא.
הערה: Paraformaldehyde הוא מטרד עור ועיניים; לנקוט זהירות בעת טיפול זה. להוסיף 1% Triton X-100 ב PBS כדי permeabilize התאים עבור 20 דקות ב RT, ולאחר מכן לשטוף 3x עם PBS. - הסר PBS ולחסום עם 5% BSA ב PBS עבור 30 דקות.
- הכן דילול נוגדן ראשוני 1% BSA / PBS בתוספת טריטון 0.03% X-100. החלף את הפתרון חוסם ידי פתרון הנוגדן הראשוני. דגירה של 3 שעות ב RT, או לילה ב 4 ° C, ולאחר מכן לשטוף תאים 3X עם PBS.
- החל נוגדנים משני PBS על פי הוראות היצרן. דגירה של 1 ש 'ב RT, ולאחר מכן לשטוף תאים 3x עם PBS.
- Coverslips הר בשקופיות זכוכית עם מדיום אנטי לדעוך למיקרוסקופיה אופטית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Oct4, Nanog, ו Sox2 הם גורמי שעתוק הליבה המקנות התחדשות עצמית מגוונת" ESC. יישמנו בפרוטוקול לעיל כדי להשוות את הבידול העצבי של ESCs מן סוג בר מן זן של עכברים גנטיים השונים שבו Syx, גן המקודד את גורם RhoA הספציפי החילופי Syx, מופר. אנחנו סבכנו Syx ב אנגיוגנזה 18. שמנו לב להבדלי ההתנהגויות של EBS מצטברים מ- Syx + / + ו- Syx - / - ESCs, והמשיכו לבחון אם הבידול העצבי של Syx - / - ESCs הוא מהיר יותר מזה של עמיתיהם Syx + / + שלהם.
כדי להשוות את המצב ההתחלתי של Syx + / + ו- Syx - / - ESCs, אנו לכמת כל גנוטיפ שכיחותם של Oct4, Nanog, ו Sox2, ה- T גורמי שעתוק הליבה כובע להעניק התחדשות עצמית ESC ו מגוונת". כפי שמתואר בשלב 10 של הפרוטוקול, ESCs היו immunolabeled ידי Oct4, Sox2, ונוגדנים Nanog. השכיחויות של 3 הגורמים שעתוק Syx + / + ו- Syx - / - ESCs היו דומות, כפי שנקבע על ידי immunofluorescence (איור 2) ו immunoblotting 17 (איור 2).
EBS מושתל במטריצת קולגן 3D (איור 1B) להתחיל הנבטת רחבות הסלולר הנראות על מיקרוסקופ תרבית תאים עם מטרת 10X, 2 ימים לאחר ההשתלה. ביום 6, בין 5 ל -10 נבטים של 200 מיקרומטר או פחות ניתן לראות בדרך כלל Syx + / + EBS, ואילו Syx - / - EBS, 30-50 נבטים הם נצפו לעתים קרובות, שרובם נמצאים זמן רב יותר מאשר 200 מיקרומטר , (1C איור).
ב-page = "1"> הבחנו כי תאים מורחבים מהר מן Syx - / - מ מ Syx + / + 2D EBS (איור 3 א). כדי להשוות את שיעור הבידול העצבי של התאים, שהשתרעו מן Syx + / + ו- Syx - / - EBS, אנו immunolabeled אותם אחרי 6 ימים של תרבות 2D ידי nestin סמן תא גזע העצבי, חלבון רגולטורי סיבי ביניים 19. השפע של Nestin היה גבוה באופן משמעותי בתאים המשתרעים Syx - / - EBS (איור 3B). לאחר מכן, אנו לעומת שפע של β3 nestin טובולין (Tubβ3), חלבון שלד התא אקסונים 20, בתאים ניתק מן 13 ימים 2D EBS. חלבוני שניהם היו בשפע יותר בתאים ניתקו מן Syx - / - EBS מאשר עמיתיהם Syx + / + שלהם (איור 3 ג). השגנו תוצאות דומות על ידי כימות של immunoblotting מאותו החלבונים 17.
איור 4 מציג תאים transfected ידי חלבון פלואורסצנטי ירוק constitutively (GFP) -fused RhoA פעיל (RhoA-Q63L) באמצעות מגיב transfection גזע-אופטימלי תאים (ראה חומרים / ציוד טבלה).
איור 1: צמיחת Sprout מן Syx + / + ו- Syx - / - EBS בתרבות 3D. (א) Syx + / + ו- Syx - / - ESCs גדל במושבות התקבצו לפני האינדוקציה של בידול עצבי. (B ו- C) תמונות של EBS נוצרו תלוי טיפות עם 0.5 RA מיקרומטר, ולאחר מכן מוכנסים לתוך מטריצת קולגן 3D ללא RA, כמתואר בשלבי 7.1-7.4. תמונות נתפסו ביום 6 על ידי המטרות המצוינות (ב סולם ARS = 100 מיקרומטר A ו- C, 200 מיקרומטר B). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: נוכחות של גורמי שעתוק Core מגוונת". תמונות נציג מראה את שכיחותם של סמנים pluripotency הליבה המצוין Syx + / + ו- Syx - / - ESCs (בר סולם = 50 מיקרומטר). ראה ואח 'יאנג. 17 לפרטים של השיטה immunolabeling (בר סולם = 50 מיקרומטר; DAPI, 2- (4-amidinophenyl) -1H -indole-6-carboxamidine). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3" src = "/ files / ftp_upload / 55,621 / 55621fig3.jpg" />
איור 3: ויזואליזציה של סמני בידול עצביים בתאי EB. (א) תמונות שלב של 2D EB קצוות מראות כי תאים מורחבים מהר מן Syx - / - מ מ Syx + / + EBS (בר סולם = 200 מיקרומטר). (ב) תמונות Immunofluorescence מראות כי nestin סמן בידול העצבי היה שופע יותר בתאי הרחבה מ 6 היום 2D Syx - / - EBS מאשר עמיתיהם Syx + / + שלהם (בר סולם = 50 מיקרומטר). (ג) תמונות Immunofluorescence מראות כי סמני הבידול העצביים nestin ו Tubβ3 היו בשפע יותר בתאים ניתקו מן 13 היום 3D Syx - / - EBS מאשר עמיתיהם Syx + / + שלהם (בר סולם = 50 מיקרומטר). אנא לחץ כאן כדי להתחרותווה גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: ויזואליזציה של יעילות של מגיב transfection. שלושה משכפל של תמונות immunofluorescence מראה ESCs טרנספקציה ידי constitutively פעיל RhoA התמזגו GFP כדי להמחיש את יעילות transfection של מגיב בשימוש בשלב 9.5 של פרוטוקול (סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בפרוטוקול זה אנו מציגים שיטה פשוטה ונגישה יחסית ללמוד בידול עצבי של ESCs בעכברים. בשנת הפרוטוקולים קודמים, RA נוספה המדיום ביום 2 או יום 4 של הירידה התלויה-EB 8 או על ידי השעית תרבות 7, בהתאמה, או מייד לאחר EB תלוי צבירת ירידת 21. בפרוטוקול המצאנו, RA נוספה קודם לכן. למרות ההקדמה הקודמת של RA כדי EBS נוצרה על ידי תרבות השעיה, פרוטוקול זה מיוצר ביטוי גבוה של סמני בידול עצביים 8.
הנה, אנחנו זוכים לארח חלי RA ו גרימת בידול עצבי בתחילת תרבות Drop Hanging. שינוי זה מאפשר חשיפה RA שווה ESCs כאשר הם עדיין בתוך ההשעיה תא בודד, לפני קיבוץ EB. כאשר RA מתווסף EBS מצטבר, תאי המסה הפנימית EB צפויים לחוש נמוך כדי RA concentratiעל מ התאים בשכבה החיצונית. יישום של RA בתחילת צבירת EB הוא יתרון גם כי זה מדכא התפתחות שכבה ניבטת endodermal ו mesodermal לטובת בידול העצבי של שכבת ectodermal 7, 8. אנו מאשרים כי טיפול RA קדם בידול עצבי על ידי בחינת השפע של קרוב 10 סמנים 17.
ישנם שלושה שיקולים קריטיים בפרוטוקול זה. הראשון הוא הסרת מקסימלית של תאי מזין MEF להשיג אוכלוסיית ESC טוהרת גבוהה. השני הוא הרגישות לאור RA: פתרון המניות שלה ואת הטיפין התלויות חייבים להיות מוגנים מפני אור לאחר יישום RA. פתרון מניות RA הוא יציב רק במשך שבועות, שלאחריו חייב להיות מוכן פתרון טרי. השיקול השלישי הוא ריכוז RA. בניסויי הטייס שלנו, מצאנו כי בריכוז של צמיחת תאים מפגרת 10 מיקרומטר RA ופרוקטן בגודל לדיאנה EBS בהשוואה לריכוז נמוך, אולי בגלל RA יכול לגרום אפופטוזיס ב conncentrations גבוה 22, 23, 24. הבחנו כי ריכוז RA של 0.5 מיקרומטר הפיק מספר רב יותר של EBS בנוי היטב מ בכל צד 25 גבוה או בריכוזים נמוכים, וכי EBS הגיע קוטר ממוצע של כ 200 מיקרומטר. EBS הגדול עולה על גודלו של שדה מטרת 10X והיו, וכתוצאה מכך, קשה יותר לתמונה. לכן, בחרנו 0.5 מיקרומטר כמו ריכוז RA אופטימלי.
ניתוח על ידי immunofluorescence של 3D EBS הוא בעייתי משום שהם שבירים מדי עבור חתך קפוא. יתר על כן, מצאנו כי חלקים קפוא EB לא מקלים גם שקופיות זכוכית אלקטרוסטטי שטופלו ללא ציפוי. הכנת תרבות 2D EB דורשת אגרגציה של טיפות תלויות מיותרות, משום EBS מסוים אינו מייחסת גם את המצע. di EBssociation, אשר הוא איטי יחסית, יכול להיות מואץ על ידי pipetting EBS מעלה ומטה צינור 1.5 מ"ל microfuge במהלך הדגירה שלהם עם collagenase.
ניתן להשתמש ועצבית ESCs הבדיל להחליף תאים פגומים אנדוגניים, נוירונים דופאמינרגיים למשל לאיבוד nigra substantia במוח של חולים הסובלים ממחלת פרקינסון 26. בעוד טכניקות נוכחיות של בידול אדם ESC אינן דורשות היווצרות EB (שם.), EBS הם עדיין כלי שימושי עבור ניתוח מפורט של בידול עצבי ברמה המולקולרית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים או פיננסיים
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי מענק NIH R01 HL119984 כדי AH
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| MEFs | EMD Millipore | PMEF-CF | ESC feeder layer |
| ESC | EMD Millipore | CMTI-2 | |
| Cell culture dish (60 mm) | Eppendorf | 30701119 | Cell culture |
| Cell culture dish (100 mm) | Falcon | 353003 | Cell culture |
| Petri dish (100 mm) | Corning | 351029 | Hanging drops |
| 24-well plate | Greiner Bio-One | 662160 | 2D EBs |
| 6-well plate | Eppendorf | 30720113 | Transfection |
| Dark 1.5 mL centrifuge tube | Celltreat Scientific Products | 229437 | RA stock solution |
| Microscope cover-glass | Fisherbrand | 12-545-80 | Circular, 12 mm diameter |
| Superfrost-plus microscope slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| 3D collagen culture kit | EMD Millipore | ECM675 | 3D culture |
| Effectene Transfection Reagent | Qiagen | 301427 | Stem cell transfection |
| Microcon Centrifugal Filters (10 kDa) | EMD Millipore | MRCPRT010 | Protein concentration |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM | Lonza | 12-709F | MEFs culture |
| IMDM | Gibco | 12440-046 | ESCs culture |
| Fetal bovine serum (FBS) | EMD Millipore | ES-009-B | ESCs culture |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G2625 | Dish coating |
| LIF | R&D Systems | 8878-LF-025 | To maintain ESC pluripotency |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solutions | Gibco | 11140050 | Cell culture |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | Cell culture |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Cell culture |
| Gentamicin | Gibco | 15750060 | Cell culture |
| MycoZap Plus-PR | Lonza | VZA-2022 | Cell culture |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 | Cell culture |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| All-trans-retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625-50MG | Induction of neural differentiation |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030-50G | Blocking and antibody dilution |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-100ML | Cell membrane permeabilization |
| Cell strainer | Corning | 352360 | |
| Prolong Gold anti-fade reagent with DAPI | Life Tech. | P36931 | Mounting reagent |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Cell fixation |
| Fibronectin | R&D Systems | 1030-FN | Dish coating |
| PBS | Gibco | 10010049 | |
| Collagenase type I | Worthington Biochem. Corp | LS004196 | EB dissociation |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary Antibodies | |||
| Nestin (Rat-401) | Santa Cruz Biotech | sc-33677 | Detection of neural differentiation |
| Oct4 | Santa Cruz Biotech | sc-5279 | Detection of neural differentiation |
| Nanog | Bethyl Laboratories | A300-398A | Detection of neural differentiation |
| Sox2 | Cell Signaling | 3579 | Detection of neural differentiation |
| Tubulin b3 (AA10) | Santa Cruz Biotech | sc-80016 | Detection of neural differentiation |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary Antibodies | |||
| Donkey anti-Mouse-Alexa555 | Life Tech. | A31570 | Immunofluorescence |
| Donkey anti-mouse-Alexa488 | Life Tech. | A21202 | Immunofluorescence |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| Wide-field microscope | Nikon | Eclipse TS100 | Cell culture imaging |
| Confocal microscope | Nikon | C2 | Immunofluorescence imaging |
References
- Hopfl, G., Gassmann, M., Desbaillets, I. Differentiating embryonic stem cells into embryoid bodies. Methods Mol Biol. 254, 79-98 (2004).
- Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6 (2), 88-95 (2000).
- Dang, S. M., Kyba, M., Perlingeiro, R., Daley, G. Q., Zandstra, P. W. Efficiency of embryoid body formation and hematopoietic development from embryonic stem cells in different culture systems. Biotechnol Bioeng. 78 (4), 442-453 (2002).
- Johansson, S., Svineng, G., Wennerberg, K., Armulik, A., Lohikangas, L.
- Blumberg, B. An essential role for retinoid signaling in anteroposterior neural specification and neuronal differentiation. Semin Cell Dev Biol. 8 (4), 417-428 (1997).
- Ross, S. A., McCaffery, P. J., Drager, U. C., De Luca, L. M.
- Bain, G., Ray, W. J., Yao, M., Gottlieb, D. I. Retinoic acid promotes neural and represses mesodermal gene expression in mouse embryonic stem cells in culture. Biochem Biophys Res Commun. 223 (3), 691-694 (1996).
- Okada, Y., Shimazaki, T., Sobue, G., Okano, H. Retinoic-acid-concentration-dependent acquisition of neural cell identity during in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells. Dev Biol. 275 (1), 124-142 (2004).
- Duester, G. Retinoic acid synthesis and signaling during early organogenesis. Cell. 134 (6), 921-931 (2008).
- Niederreither, K., Dolle, P. Retinoic acid in development: towards an integrated view. Nat Rev Genet. 9 (7), 541-553 (2008).
- Maden, M. Retinoic acid in the development, regeneration and maintenance of the nervous system. Nat Rev Neurosci. 8 (10), 755-765 (2007).
- Sheng, N., et al. Retinoic acid regulates bone morphogenic protein signal duration by promoting the degradation of phosphorylated Smad1. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 18886-18891 (2010).
- Gajovic, S., St-Onge, L., Yokota, Y., Gruss, P. Retinoic acid mediates Pax6 expression during in vitro differentiation of embryonic stem cells. Differentiation. 62 (4), 187-192 (1997).
- Dong, D., Ruuska, S. E., Levinthal, D. J., Noy, N. Distinct roles for cellular retinoic acid-binding proteins I and II in regulating signaling by retinoic acid. J Biol Chem. 274 (34), 23695-23698 (1999).
- Sessler, R. J., Noy, N. A ligand-activated nuclear localization signal in cellular retinoic acid binding protein-II. Mol Cell. 18 (3), 343-353 (2005).
- Tang, S., et al. SIRT1-Mediated Deacetylation of CRABPII Regulates Cellular Retinoic Acid Signaling and Modulates Embryonic Stem Cell Differentiation. Mol Cell. 55 (6), 843-855 (2014).
- Yang, J., et al. RhoA inhibits neural differentiation in murine stem cells through multiple mechanisms. Sci Signal. 9 (438), ra76 (2016).
- Garnaas, M. K., et al. Syx, a RhoA guanine exchange factor, is essential for angiogenesis in Vivo. Circ Res. 103 (7), 710-716 (2008).
- Chou, Y. H., Khuon, S., Herrmann, H., Goldman, R. D. Nestin promotes the phosphorylation-dependent disassembly of vimentin intermediate filaments during mitosis. Mol Biol Cell. 14 (4), 1468-1478 (2003).
- Arai, T., Matsumoto, G. Subcellular localization of functionally differentiated microtubules in squid neurons: regional distribution of microtubule-associated proteins and beta-tubulin isotypes. J Neurochem. 51 (6), 1825-1838 (1988).
- Arnhold, S., Klein, H., Semkova, I., Addicks, K., Schraermeyer, U. Neurally selected embryonic stem cells induce tumor formation after long-term survival following engraftment into the subretinal space. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (12), 4251-4255 (2004).
- Liu, Y., et al. Retinoic acid receptor beta mediates the growth-inhibitory effect of retinoic acid by promoting apoptosis in human breast cancer cells. Mol Cell Biol. 16 (3), 1138-1149 (1996).
- Altucci, L., et al. Retinoic acid-induced apoptosis in leukemia cells is mediated by paracrine action of tumor-selective death ligand TRAIL. Nat Med. 7 (6), 680-686 (2001).
- Pettersson, F., Dalgleish, A. G., Bissonnette, R. P., Colston, K. W. Retinoids cause apoptosis in pancreatic cancer cells via activation of RAR-gamma and altered expression of Bcl-2/Bax. Br J Cancer. 87 (5), 555-561 (2002).
- Kothapalli, C. R., Kamm, R. D. 3D matrix microenvironment for targeted differentiation of embryonic stem cells into neural and glial lineages. Biomaterials. 34 (25), 5995-6007 (2013).
- Cai, J., et al. BMP and TGF-beta pathway mediators are critical upstream regulators of Wnt signaling during midbrain dopamine differentiation in human pluripotent stem cells. Dev Biol. 376 (1), 62-73 (2013).
