Summary
Опишем методику с использованием мышиных эмбриональных стволовых клеток для создания двух или трех размерных эмбриональных телец. Затем мы объясним, как вызывать нейронную дифференцировку эмбриональных клеток организма с помощью ретиноевой кислоты, и как анализировать их состояние дифференцировки клеток-предшественников иммунофлюоресценцией маркеров и иммуноблоттингом.
Abstract
Мышиные эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) , выделенные из внутренней массы бластоцисты (обычно в день E3.5), может быть использован как в пробирке модельной системы для изучения раннего эмбрионального развития. При отсутствии фактора ингибирования лейкемии (LIF), ЭСК дифференцируются по умолчанию в клетки нервных предшественников. Они могут быть накопили в трехмерной (3D) сферический агрегат называется эмбриональное тело (EB) из-за его сходство с ранней стадией эмбриона. ЭТ может быть высевал на фибронектин покрытия покровных, где они расширяются путем выращивания двумерный (2D) расширений, или имплантированный в 3D-матрицах коллагена, где они продолжают расти, как сфероиды и дифференцируются в трех зародышевых слои: эндодермы, мезодермальную и эктодермальных. 3D коллаген культура имитирует среду в естественных условиях более тесно , чем 2D ЭТ. Культура 2D EB облегчает анализ иммунофлюоресценции и иммуноблоттингом для отслеживания дифференциации. Мы разработали два этапа нейронные отличительныеПротокол Тион. На первом этапе, ЭТ генерируются с помощью метода висячей капле, и, одновременно, индуцируются дифференцироваться под воздействием ретиноевой кислоты (RA). На втором этапе, нейронная дифференциация протекает в формате 2D или 3D в отсутствии RA.
Introduction
ЭСК происходит из бластоцисты внутренней клеточной массы. Эти клетки плюрипотентные, то есть они обладают способностью дифференцироваться в любой тип клеток организма происхождения. ESC дифференцировки в пробирке имеет широкий интерес в качестве экспериментальной системы для исследования путей и механизмов развития. Он предлагает мощную и гибкую систему модели для тестирования новых терапевтических подходов для коррекции клеточной и тканевой дисфункции. ЭТ резюмировать многие аспекты дифференцировки клеток на ранних стадиях эмбриогенеза. В частности, ЭТ может быть использован , когда эмбриональная летальность делает его трудно определить клеточную основу эмбриональных дефектов 1, 2. ЭТ может быть образован либо за счет висячей капли или жидких методов подвески 3. Преимущество первого является способность генерировать ЭТ последовательного размера и плотности, что облегчает экспериментальную воспроизводимость.
4.
РА представляет собой небольшой липофильный метаболит витамина А , который индуцирует дифференцировку нейронную 5, 6. Высокие концентрации RA способствуют экспрессии генов и нейронную репрессирует экспрессию гена мезодермального в процессе формирования EB 7, 8. РА получают путем окисления витамина А , чтобы ретинальдегида либо спиртом или ретинола дегидрогеназы, с последующим окислением ретинальдегида до конечного продукта с помощью ретинальдегида дегидрогеназы 9. Нейронная дифференциация требует транспорта РА из цитоплазмы к ядру с помощью клеточного белка РА-2 (связывание CRABP2). В ядре РА связывается с родственным рецепторным комплексом , состоящим из гетеродимер RAR-RXR 10. Это приводит к тому набору транскрипционных ко-активаторы и инициации транскрипции 9, 11. Кроме того, РА способствует деградации фосфорилированного (активной) Smad1, таким образом антагонизма BMP и СМАД сигнализации 12. В дополнение к этим деятельности, РА повышает экспрессию Pax6, фактор транскрипции , который поддерживает нейронную дифференциацию 13. Сигнализации РА модулируется Sirtuin-1 (Sirt1), ядерным никотинамидадениндинуклеотид (НАД +) - зависимый фермент , который деацетилирует CRABP2, препятствуя его транслокацию в ядро, и , следовательно , с РА связывания с RAR-RXR гетеродимер 14, 15, 16.
e_content "> Наша цель при разработке RA-обработанную протокол EB , описанный здесь , чтобы оптимизировать нейронную дифференциацию для того , чтобы облегчить анализ витро сигнальных путей , которые регулируют ESC дифференцировку в нейрональные клетки - предшественники. Одним из преимуществ этого протокола является содействие анализ функции клеток с помощью иммунофлюоресценции. 3D ЭТ не хорошо проникает антитела и их трудно изображение. EB диссоциации в 2D монослой в определенные моменты времени в ходе дифференцировка нервная облегчает иммунноокрашивание и визуализацию клеток с помощью конфокальной микроскопии.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Культура мышиных эмбриональных фибробластов (МЭФ)
- Подготовка MEF среды, среда Игла, модифицированная Eagle (DMEM, высокая глюкоза), с добавлением 15% бычьей эмбриональной сывороткой (FBS).
- Coat 100 мм чашки для культивирования клеток с 0,5% -ным раствором желатина в течение 30 мин при комнатной температуре (RT).
- Граф MEFs с помощью цитометра. Удалить раствор желатина и сразу же заливают MEF среды предварительно нагревают до 37 ° С. Быстро разморозить флаконы митомицина обработанных MEFs в водяной бане С 37 ° С в течение 2 мин, затем семена 2,8 × 10 6 MEFs на 100 мм желатин покрытия блюда. Отрегулировать число клеток соответственно при использовании посуды других размеров. Инкубируйте MEFs в течение ночи при 37 ° C, 5% CO 2.
- Изменение среды на следующий день. Культура в течение 2-3 дней до MEF слоя вырожденная.
2. Мышь ESC Культура
- Подготовка ESC среды, модифицированная среда Дульбекка Исков (IMDM) с добавлением 15% FBS и 103 ед / мл фактора ингибировани лейкоза (LIF), 0,1 мМ заменимых аминокислот, 55 мМ 2-меркаптоэтанола, пенициллином (100 ед / мл), стрептомицина (100 мкг / мл), гентамицин (200 мкг / мл), и 0,2% микоплазма антибиотик.
- Удалить MEF среды из тарелки, полученного на стадии 1, и заменить 37 ° C подогретого среды ESC.
- Размораживание флакона ESC и семенные клетки в верхней части слоя MEF. Инкубируют при 37 ° C, 5% CO 2, пока не достигнут ЭСК слияния.
- Подготовить новые блюда культуры клеток, содержащих сливающийся монослой MEFs. Для того, чтобы отрывок ЭСК, промыть один раз PBS и снять с 0,25% трипсином / EDTA в течение 2-5 мин при температуре 37 ° С, 5% СО 2. Остановить трипсинизации путем добавления свежей IMDM с 15% FBS с отсоединение клеток, передачи клеточной суспензии в 15 мл пробирку и центрифугируют при 160 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Удалить супернатант, ресуспендирования ESCs со свежим IMDM и проходом одну пятой части клеток к каждому новому блюду MEF покрытия; не инкубировать до клетокдостичь слияния (обычно 4-5 дней).
3. Вывод MEFs и ESCs культуры на пластинах покрытые желатином
- После того, как ECSS достигли слияния, отделить их и MEFs 0,25% трипсина / EDTA, как на стадии 2.4, ресуспендирования клеток в свежей среде IMDM, передать в неадгезивную бактериологической чашке Петри, и инкубируют в течение 40 мин при 37 ° C, 5% CO 2.
- Тщательно передача ЭСК и MEFs-среду, содержащий на новую пластину желатина покрытия с использованием 5 мл пипетки, избегая повторное пипетирование. Клетки, оставшиеся в чашках Петри являются MEFs, поскольку ЭСК не придерживаются.
- Прохождение ЭСК через каждые 3-4 дня. Менее частые пассажи могут уменьшить ESC плюрипотентность. Не более 60% слияния, как это может способствовать дифференциации.
- Повторите шаги 3.2-3.3 три раза или более, по мере необходимости, пока MEFs больше не обнаруживаются с помощью клеточной культуры микроскопа, используя объектив 20X, чтобы убедиться, что MEFs нет.
- Проверьте ESC плюрипотентностью путем проверки ESCкультуры , чтобы увидеть , если клетки образуют плотные колонии с типичной ESC многоугольной морфологии (рис 1А). Стволовости Тест клеток с помощью количественной обратной транскриптазы полимеразной цепной реакции (ПЦР-Qrt) 17, 17, иммуноблоттинг или иммунофлуоресценции ядра плюрипотентности факторов транскрипции 17 (рисунок 2).
4. Е. Б. Формирование
- Подготовьте все-транс-RA маточного раствора в концентрации 10 мМ в ДМСО, и аликвоты в 1,5 мл защищенном от света микроцентрифужные пробирки. Раствор стабилен при температуре -80 ° С в течение до двух недель. Защита от света.
- Trypsinize ЭСК как на шаге 2.4; replate в свежей среде IMDM без LIF, как одной клеточной суспензии.
- Граф клеток с помощью гемоцитометра, и подготовить 5 × 10 5 клеток / мл суспензии в IMDM с 0,5 мкМ RA.
- Пластина 100 мкл 20-капли на 100 мм чашки Петри с помощью 8-канальной пипетки и 200 мклы советов, инвертныеблюда, а также заполнить перевернутую крышку с PBS, чтобы предотвратить висячие капли от высыхания. Защита RA-содержащих питательные среды от воздействия света.
- Культура ЭТ в висячей капли при 37 ° C, 5% CO 2, в течение 4 дней.
5. 2D EB Культура
- Coat 12 мм круглой покровные стекла с 30 мкг / мл фибронектина в течение 30 мин при комнатной температуре. Место каждого покровное в лунку 24-луночного планшета, и добавить 1 мл IMDM на лунку.
- Урожай 3 день взрослый висячей капли ЭТ один за другим с 200 мкл наконечниками пипетки и семя их на покровных фибронектина покрытием, 20 ЭТ на лунку, используя те же наконечники пипеток.
Примечание: 3-дневный ЭТ предпочтительнее более 4 дней ЭТ, потому что они придерживаются лучше покровных. - Продолжить культуру с IMDM-15% FBS без LIF. Замените среду каждые 3-4 дня. Сбор использованной среды для анализа секреции белка по мере необходимости.
6. Обнаружение секретируемых белков
- Передача 500 мкл EB лечебмкм до 10 кДа-отрезные центробежные фильтры, спина при 20000 мкг в течение 60 мин при 4 ° C.
- Проверьте среду, остающуюся внутри центробежных фильтров каждые 15-20 минут, чтобы предотвратить чрезмерное обогащение. Стоп центрифугирование, когда объем оставшейся среды упала до 25 мкл.
- Собрать оставшуюся Концентрированную среду после того, как инвертирующий фильтр и вращается со скоростью 160 мкг при 4 ° С, в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Обнаружить секретируемые белки с помощью иммуноблоттинга со специфическими антителами 17.
7. 3D EB Культура
- Сбор ЭТ, выращенный в течение 4 дней в подвесных капель, как описано на стадии 5.2, и поместите их в 1,5 мл центрифужных пробирок (30 ЭТ на пробирку).
- Готовят раствор геля коллагена следуя инструкциям набора коллагена культуры 3D (см Материалы / оборудование Стол). Развести соответствующие объемы раствора коллагена и 5-кратным DMEM (набор компонентов); добавить пРешение eutralization (набор компонентов) и хорошо перемешать немедленно, и сохранить это на льду.
- Пипетировать соответствующий объем охлажденного раствора коллагена в 1,5 мл пробирку, содержащую ЭТ, и осторожно перенести в лунки 6-луночного планшета с использованием 1 мл пипетки. Избегайте пузырьков.
- Сразу передачи пластины до 37 ° C, 5% CO 2, в течение 60 мин для инициирования полимеризации коллагена.
- Перекрытие EB-содержащий пластину с IMDM.
- Изменение средних каждые 3-4 дня.
8. EB диссоциация
- Собирают день 4 ЭТ (со стадии 4) один за другим, с 200 мкл наконечниками пипетки и передавать их на неадгезивную бактериологические чашки Петри, содержащей IMDM с 15% FBS; культуры при 37 ° C, 5% CO 2 в течение более 4 дней. Проверяйте ЭТ в два раза каждый день, чтобы убедиться, что они не прикрепляются к нижней части; встряхните блюдо, чтобы предотвратить EB прикрепление к основанию.
- Центрифуга ЭТ при 185 х г в течение 5 мин приРТ, в лабораторной центрифуге.
- Удалить супернатант. Осадок не должен превышать 100 мкл в каждой пробирке.
- Добавить в осаждали ЭТ 1 мл 0,25% тип I коллагеназы на пробирку, дополненную 20% FBS в PBS.
- Инкубируйте EB-коллагеназы смесь в течение 1 ч при 37 ° C, 5% CO 2, пипеткой осторожно каждые 20 мин, используя 1 мл наконечники пипеток.
- Вымойте клетки мягко 3x с PBS. Если клеточные агрегаты присутствуют, используют клеточный фильтр с сеткой 100 мкм, чтобы удалить их.
- Replate клетки на желатиновой оболочкой 60 мм чашках в IMDM. Затем инкубируют при 37 ° C, 5% CO 2.
9. Трансфекция диссоциированных ЭТ
- Для QRT-ПЦР и иммуноблоттинга, пальто 6-луночный планшет с 0,5% желатина.
- Для иммунофлюоресценции, пальто покровные стекла с 30 мкг / мл фибронектина в течение 30 мин при комнатной температуре. Место каждого покровное в лунку 24-луночного планшета. Добавить IMDM.
- Семенной 4,75 × 10 5 или 1 × 10 5
- Расти клетки до 70% слияния до трансфекции.
- Трансфекции клеток с помощью nonliposomal липидного стволовых клеток оптимального реагента 17 (см Материалы / Оборудование таблицу), в соответствии с инструкциями изготовителя.
Примечание: реагент мы использовали , как правило , достигается эффективность трансфекции в 50% (см Представитель Результаты). - Анализ образцов от QRT-ПЦР или с помощью иммуноблоттинга 17 2 или 3 дня после трансфекции, соответственно.
10. Анализ EB дифференциации с помощью иммунофлуоресценции
- Промывочный 2D ЭТ или диссоциирован 3D ЭТ с PBS и исправить с 4% параформальдегидом в PBS в течение 30 мин при комнатной температуре. Промыть фиксированные клетки 3x с PBS для удаления плавающих остатков клеток.
Примечание: параформальдегид кожи и раздражение глаз; Соблюдайте осторожность при обращении с ним. Добавить 1% Triton X-100 в PBS, чтобы клетки проницаемыми в течение 20 минут при комнатной температуре, затем промывают 3 раза с PBS. - Удалить PBS и блокируют с 5% BSA в PBS в течение 30 мин.
- Готовят разбавления первичного антитела в 1% BSA / PBS с добавлением 0,03% Triton X-100. Заменить блокирующий раствор с помощью раствора первичного антитела. Инкубирую в течение 3 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4 ° С, затем промыть клетки 3x с PBS.
- Применение вторичного антитела в PBS в соответствии с инструкциями изготовителя. Инкубировать в течение 1 ч при комнатной температуре, затем промыть клетки 3 раза с PBS.
- Гора покровные на стеклах с анти-выцветанию среды для оптической микроскопии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Oct4, Nanog и SOX2 являются основными факторами транскрипции, которые придают ESC самообновлению и плюрипотентности. Мы применили вышеуказанный протокол для сравнения нейронную дифференцировку ЭСК от дикого типа и от штамма генетически модифицированных мышей , где Syx, ген , кодирующий для RhoA-специфического фактора обмена Syx, нарушается. Мы замешан Syx в ангиогенез 18. Мы заметили , что различия в поведении ЭТ агрегируются из Syx + / + и Syx - / - ЭСК, и продолжил , чтобы проверить , если нейронная дифференциация Syx - / - ЭСК быстрее , чем их Syx + / + аналоги.
Для сравнения начального состояния Syx + / + и Syx - / - ЭСК, мы количественно в каждом генотипу содержаний Oct4, Nanog, и SOX2, основные факторы транскрипции тШляпа совещаться ESC самообновлению и плюрипотентности. Как описано в шаге 10 протокола, ЭСК были immunolabeled по Oct4, Sox2 и Nanog антител. Содержания 3 факторов транскрипции в Syx + / + и Syx - / - ЭСК были похожи, как определено с помощью иммунофлуоресценции (рисунок 2) и иммуноблоттинг 17 (рисунок 2).
ЭТ имплантированный в 3D коллагеновой матрицы (Фигура 1В) начинают всходы клеточных расширений, которые видны на клеточной культуру микроскопе с 10 - кратным объективом, 2 дня после имплантации. В день 6, от 5 до 10 проростков 200 мкм или менее может быть , как правило , наблюдаемых в Syx + / + ЭТ, тогда как в Syx - / - EBS, 30-50 ростки часто наблюдаются, большинство из которых больше чем 200 мкм (Фигура 1С).
Syx - / - чем от Syx + / + 2D ЭТ (фиг.3А). Для сравнения скорости нервной дифференцировки клеток , которые простирались от Syx + / + и Syx - / - ЭТ, мы immunolabeled их через 6 дней 2D культуры нейронных стволовые клетки маркеров нестинами, промежуточная нить регуляторного белком 19. Обилие нестин было значительно выше в клетках , проходящих от Syx - / - ЭТ (фигура 3В). Затем мы сравнили обилие нестин и тубулина (& beta ; 3 Tubβ3), в аксонов цитоскелета белка 20, в клетках диссоциированных из 13-дневного 2D ЭТ. Оба белка были более распространены в клетках диссоциированных из Syx - / - ЭТ , чем в их Syx + / + аналогами (рис 3C). Аналогичные результаты были получены путем количественного immunobloчал одних и тех же белков 17.
На рисунке 4 показан клетки , трансфицированные конститутивно зеленый флуоресцентный белок (GFP) конъюгированной активного RhoA (RhoA-Q63L) с использованием реагента для трансфекции стволовых клеток-оптимальные (см Материалов / оборудование Стола).
Рисунок 1: Рассада Выход из Syx + / + и Syx - / - EBS в 3D культуры. (A) Syx + / + и Syx - / - ЭСК вырос в сгруппированных колониях до индукции нервной дифференцировки. (В и С) изображения , сформированные в ЭТ висит капель с 0,5 мкМ RA, а затем вставляют в 3D коллагеновой матрице без RA, как описано в шагах 7.1-7.4. Изображения были получены на 6-й день от указанных целей (Масштаб б АРС = 100 мкм, А и С, 200 мкм, B). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Наличие Плюрипотентность Ключевых факторов транскрипции. Типичные изображения , показывающие содержания указанных основных маркеров плюрипотентности в Syx + / + и Syx - / - ЭСК (Шкала бар = 50 мкм). См Янг и др. 17 для деталей метода иммунноокрашивания (Масштаб бар = 50 мкм; DAPI, 2- (4-амидинофенил) -1H - индол-6-карбоксамидин). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
фигура 3" SRC = "/ файлы / ftp_upload / 55621 / 55621fig3.jpg" />
Рисунок 3: Визуализация нейронных маркеров дифференцировки в EB клетках. (А) Фазовые изображения 2D EB края , показывающие , что клетки расширяется быстрее от Syx - / - чем от Syx + / + ЭТ (Scale бар = 200 мкм). (Б) иммунофлуоресценция изображение , показывающее , что нейронный маркер дифференцировки нестин был более обильным в клетках расширяющихся от 6 дней 2D Syx - / - ЭТ , чем от их Syx + / + аналогов (Шкала бар = 50 мкм). (С) иммунофлуоресценции изображения , показывающие , что нейронные маркеры дифференцировки нестин и Tubβ3 были более распространены в клетках диссоциированных из 13 день 3D Syx - / - ЭТ , чем от их Syx + / + аналоги (Scale бар = 50 мкм). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы соперничаютв большая версия этой фигуры.
Рисунок 4: Визуализация Эффективность трансфекции реагента. Три дублирующие группы из иммунофлюоресценции изображений, показывающих ESCs трансфицированных с помощью конститутивно активного RhoA, слитые с GFP, чтобы проиллюстрировать эффективность трансфекции реагента, используемого на стадии 9.5 протокола (Шкала бар = 50 мкм). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом протоколе мы представляем относительно простой и доступный метод для изучения нейронной дифференцировки мышиных ЭСК. В предыдущих протоколах, РА был добавлен в среду в день 2 или 4 -й день в EB-висячей капли 8 или суспензионной культуры 7, соответственно, или сразу же после того , как Е.Б. висит агрегации капель 21. В протоколе мы сконструировали, RA был добавлен ранее. Несмотря на ранее введение RA к ЭТ , образованное суспензионной культура, этот протокол получает более высокую экспрессию нейральных маркеров дифференцировки 8.
Здесь мы благоприятствование применения RA и индуцировать нейронную дифференциацию в начале культуры висячей капли. Эта модификация позволяет равное воздействие RA к ESCs, когда они все еще находятся в одной клеточной суспензии, перед тем агрегации EB. При РА добавляются в агрегированный ЭТ, клетка внутренней массы EB, вероятно, чувствует более низкий к Концентрац РАна чем клетки в наружном слое. Применение RA в начале агрегации EB является выгодным и потому , что подавляет развитие слоя энтодермального и мезодермальные зародышевого в пользу нейронной дифференцировки эктодермального слоя 7, 8. Мы подтвердили , что лечение РА способствует нейронной дифференциации путем изучения численности около 10 маркеров 17.
Есть три важных соображения в этом протоколе. Во-первых, максимальное удаление MEF фидерных клеток для достижения ESC популяции с высокой степенью чистоты. Во-вторых, светочувствительность RA: его маточный раствор и висячие капли должны быть защищены от света после применения РА. Исходный раствор РА является стабильным только в течение двух недель, после чего должен быть получен свежий раствор. Третье соображение является концентрация РА. В наших пилотных экспериментах, мы обнаружили, что при концентрации роста 10 мкМ РА запаздывающих клеток и пронаведенный ЭТ меньшего размера по сравнению с более низкими концентрациями, возможно потому , что РА может вызвать апоптоз при высоких conncentrations 22, 23, 24. Мы наблюдали , что концентрация РА 0,5 мкМ получают большее количество хорошо образованных ЭТ , чем при более высоких либо 25 или более низких концентрациях, а также о том , что ЭТ достиг средний диаметр около 200 мкм. Большой ЭТ превышает размер поля объектива 10X и были, следовательно, труднее изображения. Таким образом, мы выбрали 0,5 мкм в качестве оптимальной концентрации RA.
Анализ с помощью иммунофлуоресценции 3D ЭТ является проблематичным, поскольку они являются слишком хрупкими для замороженных срезов. Кроме того, мы обнаружили, что замороженные срезы EB не очень хорошо прилипают к непокрытым электростатический обработанным стеклам. Подготовка 2D Е.Б. культуры требует агрегации дополнительных висящих капель, потому что некоторый ЭТ не очень хорошо прикрепляться к субстрату. EB-диssociation, который является относительно медленным, может быть ускорен с помощью пипетки ЭТ вверх и вниз в 1,5 мл микроцентрифужной пробирки во время их инкубации с коллагеназой.
Neurally дифференцированных ЭСК могут быть использованы для замены поврежденных эндогенных клеток, например , дофаминергических нейронов , утраченных в черной субстанции в мозге пациентов , страдающих от болезни Паркинсона 26. В то время как современные методы человеческой дифференцировки ЭСК не требуют образования EB (там же .), ЭТ по - прежнему является полезным инструментом для детального анализа нейронной дифференциации на молекулярном уровне.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих или финансовых интересов
Acknowledgments
Это исследование было поддержано грантом NIH R01 HL119984 в AH
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| MEFs | EMD Millipore | PMEF-CF | ESC feeder layer |
| ESC | EMD Millipore | CMTI-2 | |
| Cell culture dish (60 mm) | Eppendorf | 30701119 | Cell culture |
| Cell culture dish (100 mm) | Falcon | 353003 | Cell culture |
| Petri dish (100 mm) | Corning | 351029 | Hanging drops |
| 24-well plate | Greiner Bio-One | 662160 | 2D EBs |
| 6-well plate | Eppendorf | 30720113 | Transfection |
| Dark 1.5 mL centrifuge tube | Celltreat Scientific Products | 229437 | RA stock solution |
| Microscope cover-glass | Fisherbrand | 12-545-80 | Circular, 12 mm diameter |
| Superfrost-plus microscope slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| 3D collagen culture kit | EMD Millipore | ECM675 | 3D culture |
| Effectene Transfection Reagent | Qiagen | 301427 | Stem cell transfection |
| Microcon Centrifugal Filters (10 kDa) | EMD Millipore | MRCPRT010 | Protein concentration |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM | Lonza | 12-709F | MEFs culture |
| IMDM | Gibco | 12440-046 | ESCs culture |
| Fetal bovine serum (FBS) | EMD Millipore | ES-009-B | ESCs culture |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G2625 | Dish coating |
| LIF | R&D Systems | 8878-LF-025 | To maintain ESC pluripotency |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solutions | Gibco | 11140050 | Cell culture |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | Cell culture |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Cell culture |
| Gentamicin | Gibco | 15750060 | Cell culture |
| MycoZap Plus-PR | Lonza | VZA-2022 | Cell culture |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 | Cell culture |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| All-trans-retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625-50MG | Induction of neural differentiation |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030-50G | Blocking and antibody dilution |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-100ML | Cell membrane permeabilization |
| Cell strainer | Corning | 352360 | |
| Prolong Gold anti-fade reagent with DAPI | Life Tech. | P36931 | Mounting reagent |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Cell fixation |
| Fibronectin | R&D Systems | 1030-FN | Dish coating |
| PBS | Gibco | 10010049 | |
| Collagenase type I | Worthington Biochem. Corp | LS004196 | EB dissociation |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary Antibodies | |||
| Nestin (Rat-401) | Santa Cruz Biotech | sc-33677 | Detection of neural differentiation |
| Oct4 | Santa Cruz Biotech | sc-5279 | Detection of neural differentiation |
| Nanog | Bethyl Laboratories | A300-398A | Detection of neural differentiation |
| Sox2 | Cell Signaling | 3579 | Detection of neural differentiation |
| Tubulin b3 (AA10) | Santa Cruz Biotech | sc-80016 | Detection of neural differentiation |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary Antibodies | |||
| Donkey anti-Mouse-Alexa555 | Life Tech. | A31570 | Immunofluorescence |
| Donkey anti-mouse-Alexa488 | Life Tech. | A21202 | Immunofluorescence |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| Wide-field microscope | Nikon | Eclipse TS100 | Cell culture imaging |
| Confocal microscope | Nikon | C2 | Immunofluorescence imaging |
References
- Hopfl, G., Gassmann, M., Desbaillets, I. Differentiating embryonic stem cells into embryoid bodies. Methods Mol Biol. 254, 79-98 (2004).
- Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6 (2), 88-95 (2000).
- Dang, S. M., Kyba, M., Perlingeiro, R., Daley, G. Q., Zandstra, P. W. Efficiency of embryoid body formation and hematopoietic development from embryonic stem cells in different culture systems. Biotechnol Bioeng. 78 (4), 442-453 (2002).
- Johansson, S., Svineng, G., Wennerberg, K., Armulik, A., Lohikangas, L.
- Blumberg, B. An essential role for retinoid signaling in anteroposterior neural specification and neuronal differentiation. Semin Cell Dev Biol. 8 (4), 417-428 (1997).
- Ross, S. A., McCaffery, P. J., Drager, U. C., De Luca, L. M.
- Bain, G., Ray, W. J., Yao, M., Gottlieb, D. I. Retinoic acid promotes neural and represses mesodermal gene expression in mouse embryonic stem cells in culture. Biochem Biophys Res Commun. 223 (3), 691-694 (1996).
- Okada, Y., Shimazaki, T., Sobue, G., Okano, H. Retinoic-acid-concentration-dependent acquisition of neural cell identity during in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells. Dev Biol. 275 (1), 124-142 (2004).
- Duester, G. Retinoic acid synthesis and signaling during early organogenesis. Cell. 134 (6), 921-931 (2008).
- Niederreither, K., Dolle, P. Retinoic acid in development: towards an integrated view. Nat Rev Genet. 9 (7), 541-553 (2008).
- Maden, M. Retinoic acid in the development, regeneration and maintenance of the nervous system. Nat Rev Neurosci. 8 (10), 755-765 (2007).
- Sheng, N., et al. Retinoic acid regulates bone morphogenic protein signal duration by promoting the degradation of phosphorylated Smad1. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 18886-18891 (2010).
- Gajovic, S., St-Onge, L., Yokota, Y., Gruss, P. Retinoic acid mediates Pax6 expression during in vitro differentiation of embryonic stem cells. Differentiation. 62 (4), 187-192 (1997).
- Dong, D., Ruuska, S. E., Levinthal, D. J., Noy, N. Distinct roles for cellular retinoic acid-binding proteins I and II in regulating signaling by retinoic acid. J Biol Chem. 274 (34), 23695-23698 (1999).
- Sessler, R. J., Noy, N. A ligand-activated nuclear localization signal in cellular retinoic acid binding protein-II. Mol Cell. 18 (3), 343-353 (2005).
- Tang, S., et al. SIRT1-Mediated Deacetylation of CRABPII Regulates Cellular Retinoic Acid Signaling and Modulates Embryonic Stem Cell Differentiation. Mol Cell. 55 (6), 843-855 (2014).
- Yang, J., et al. RhoA inhibits neural differentiation in murine stem cells through multiple mechanisms. Sci Signal. 9 (438), ra76 (2016).
- Garnaas, M. K., et al. Syx, a RhoA guanine exchange factor, is essential for angiogenesis in Vivo. Circ Res. 103 (7), 710-716 (2008).
- Chou, Y. H., Khuon, S., Herrmann, H., Goldman, R. D. Nestin promotes the phosphorylation-dependent disassembly of vimentin intermediate filaments during mitosis. Mol Biol Cell. 14 (4), 1468-1478 (2003).
- Arai, T., Matsumoto, G. Subcellular localization of functionally differentiated microtubules in squid neurons: regional distribution of microtubule-associated proteins and beta-tubulin isotypes. J Neurochem. 51 (6), 1825-1838 (1988).
- Arnhold, S., Klein, H., Semkova, I., Addicks, K., Schraermeyer, U. Neurally selected embryonic stem cells induce tumor formation after long-term survival following engraftment into the subretinal space. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (12), 4251-4255 (2004).
- Liu, Y., et al. Retinoic acid receptor beta mediates the growth-inhibitory effect of retinoic acid by promoting apoptosis in human breast cancer cells. Mol Cell Biol. 16 (3), 1138-1149 (1996).
- Altucci, L., et al. Retinoic acid-induced apoptosis in leukemia cells is mediated by paracrine action of tumor-selective death ligand TRAIL. Nat Med. 7 (6), 680-686 (2001).
- Pettersson, F., Dalgleish, A. G., Bissonnette, R. P., Colston, K. W. Retinoids cause apoptosis in pancreatic cancer cells via activation of RAR-gamma and altered expression of Bcl-2/Bax. Br J Cancer. 87 (5), 555-561 (2002).
- Kothapalli, C. R., Kamm, R. D. 3D matrix microenvironment for targeted differentiation of embryonic stem cells into neural and glial lineages. Biomaterials. 34 (25), 5995-6007 (2013).
- Cai, J., et al. BMP and TGF-beta pathway mediators are critical upstream regulators of Wnt signaling during midbrain dopamine differentiation in human pluripotent stem cells. Dev Biol. 376 (1), 62-73 (2013).
