Summary
我々は2人のまたは3次元の胚様体を生成するために、マウスの胚性幹細胞を使用するためのテクニックを説明します。私たちは、その後、レチノイン酸によって胚様体細胞の神経分化を誘導する方法を説明し、どのように前駆細胞マーカーの免疫蛍光およびイムノブロッティングによりそれらの分化の状態を分析します。
Abstract
（典型的には、日E3.5で）胚盤胞の内部塊から単離されたマウス胚性幹細胞（ESC）は、初期胚発生を研究するためのin vitroモデル系として使用することができます。白血病抑制因子（LIF）の非存在下で、ESCの神経前駆細胞にデフォルトで分化します。彼らが原因初期段階の胚との類似性に球状凝集体は、胚様体（EB）と呼ばれる3次元（3D）に集めことができます。 EBは、それらが2次元（2D）の拡張を成長させることによって展開ここで、フィブロネクチンでコーティングしたカバースリップ上に播種し、またはそれらは球状体として成長し続けると、3つの胚葉に分化する3次元コラーゲンマトリックスに埋め込むことができる：内胚葉、中胚葉、および外胚葉。 3Dコラーゲン文化がより密接に、2DのEBより生体内環境を模倣します。 2D EB培養物は、分化を追跡するために、免疫蛍光法およびイムノブロッティングによる分析を容易にします。私たちは、二段階の神経differentiaを開発しましたションプロトコル。第1のステップでは、EBを、ハンギングドロップ法によって生成され、そして、同時に、レチノイン酸（RA）への曝露によって分化するように誘導されます。第二工程において、RAの非存在下での2Dまたは3D形式の神経分化が進行します。
Introduction
ESCは胚盤胞の内部細胞塊に由来します。彼らは起源の生物の任意の細胞型に分化する能力を持っている、すなわち、これらの細胞は、多能性があります。 ESC のin vitro分化は、発生経路とメカニズムを調べるための実験システムとして幅広い重要です。それは、細胞や組織の機能不全を補正するための新しい治療アプローチをテストするための強力かつ柔軟なモデルシステムを提供しています。 EBは、初期胚発生時の細胞分化の多くの側面を再現します。胚致死は難しい胚欠陥1,2の細胞の基礎を決定することができる場合、特に、EBを使用することができます。 EBを懸滴または液体懸濁液技術3のいずれかによって形成することができます。前者の利点は、このように、実験の再現性を容易に、一貫したサイズおよび密度のEBSを生成する能力です。
4の10種類によって認識される基底膜成分です。
RAは、神経分化5,6を誘導するビタミンAの小さな親油性代謝物です。 RAの高濃度は、神経遺伝子の発現を促進し、EB形成の7,8の間中胚葉遺伝子発現を抑制する。 RAは、レチンアルデヒドデヒドロゲナーゼ9により最終製品にレチンアルデヒド酸化、続いてのいずれかでアルコールまたはレチノールデヒドロゲナーゼによってレチンアルデヒドへの酸化ビタミンAによって製造されます。神経分化は、細胞質からRAの輸送を必要としますセルラRA結合タンパク質2（CRABP2）によって核へ。核内で、RAは、RAR-RXRヘテロ二量体10からなるその同族受容体複合体に結合します。これは、転写コアクチベーターの動員、および転写9、11の開始をもたらします。さらに、RAは、このようにBMPとSMAD 12シグナル伝達拮抗、リン酸化（活性）SMAD1の分解を促進します。これらの活動に加えて、RAは、Pax6の発現、神経分化13を支持する転写因子を増加させます。 RAシグナリングはサーチュイン1（SIRT1）、核ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD +）により変調される- CRABP2を脱アセチル化依存性酵素、核へのトランスロケーションを妨害し、したがってRAは、RAR-RXRヘテロダイマー14,15に結合すると、 16。
e_contentは">ここで説明するRA処理したEBのプロトコルを設計する際の我々の目標は、神経前駆細胞へのESCの分化を調節するシグナル伝達経路のin vitroでの解析を容易にするために、神経分化を最適化することである。このプロトコルの利点の一つの促進であります免疫蛍光法による細胞機能の分析。3DのEBが十分な抗体が貫通し、画像に困難であるれていない。EB解離2D単層に特定の時点で神経分化中には、共焦点顕微鏡による細胞の免疫標識及びイメージングを容易にします。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
マウス胚線維芽細胞の1文化（MEFの）
- MEF培地中、15％ウシ胎児血清（FBS）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM、高グルコース）を、準備します。
- 室温（RT）で30分間0.5％ゼラチン溶液でコート100ミリメートル細胞培養皿を。
- サイトメーターを使用したMEFを数えます。ゼラチン溶液を除去し、直ちに37℃に予め温めMEF培地を注ぎます。急速100mmのゼラチンコートディッシュあたり2.8×10 6のMEFを播種次いで、2分間37℃の水浴中でマイトマイシンC処理したMEFのバイアルを解凍します。他のサイズのお皿を使用している場合はそれに応じて細胞数を調整します。 37°C、5％CO 2で一晩のMEFをインキュベートします。
- 翌日のメディアを変更します。 MEF層まで2-3日間培養が合流です。
2.マウスESC文化
- 15％FBSおよび10を補充したESC培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM）を調製3 U / mlの白血病抑制因子（LIF）、0.1mMの非必須アミノ酸、55mMの2-メルカプトエタノール、ペニシリン（100U / ml）、ストレプトマイシン（100μg/ mLの）、ゲンタマイシン（200μgの/ mL）に溶解し、0.2％マイコプラズマ抗生物質。
- ステップ1で調製した皿からMEF培地を除去し、37℃で予熱したESC培地で置き換えます。
- MEF層の上にESCバイアルおよび種子細胞を解凍。 ESCがコンフルエンスに達するまで、37℃、5％CO 2でインキュベートします。
- MEFののコンフルエントな単層を含む新しい細胞培養皿を準備します。通路へのESCは、PBSで1回洗浄し、37℃、5％CO 2で2-5分間0.25％トリプシン/ EDTAを用いて取り外します。剥離細胞を、15％FBSを含む新鮮なIMDMを添加することによりトリプシン処理を停止し、15 mLの試験管に細胞懸濁液を転送し、そして室温で5分間、160×gで遠心分離。
- 上清を除去し、それぞれの新しいMEFで被覆された皿への細胞の新鮮なIMDM通路五分の一でのESCを再懸濁。細胞までインキュベート（通常4〜5日）の合流に達します。
3.ゼラチンでコーティングされたプレート上のMEFと文化のESCを撤回
- ECSSは、ステップ2.4のように0.25％トリプシン/ EDTAを用いてそれらとのMEFを切り離し、コンフルエンスに達した新鮮なIMDM中で細胞を再懸濁し、非接着細菌ペトリ皿に移し、37℃、5％COで40分間インキュベート後2。
- 注意深くESCを繰り返しピペッティングを回避5mLのピペットを用いて新たなゼラチンコートプレートにMEFを含有培地を移します。 ESCのが付着しないので、ペトリ皿に残った細胞は、MEFのです。
- パッセージのESC 3〜4日毎に。あまり頻繁に継代はESCの多能性を減らすことができます。それは差別を好むこととして、60％の密集度を超えないようにしてください。
- MEFのは確かのMEFが存在しないにするために、20Xの対物レンズを用い、細胞培養顕微鏡によってもはや検出されるまで繰り返して、必要に応じて、3.2から3.3まで3回以上のステップはありません。
- ESCをチェックすることにより、ESCの多能性を確認してください細胞は、典型的なESC多角形形態（ 図1A）との密なコロニーを形成するかどうかを確認するために培養。定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（QRT-PCR）17によってテストセル幹細胞性、17をイムノブロッティング、またはコア多能性転写の免疫蛍光17（ 図2）の要因に依存します。
4. EBの形成
- DMSO中10mMでのオールトランスRAのストック溶液を調製し、そして1.5 mLのアリコートに光保護微量遠心管。解決策は2週間まで-80℃で安定しています。光から保護します。
- ステップ2.4のようにトリプシン処理のESC;単一細胞懸濁液として、LIFを含まない新鮮なIMDMでreplate。
- 血球計数器を用いて細胞をカウントし、0.5μMのRAを有するIMDM中、5×10 5細胞/ mLの懸濁液を調製します。
- プレート100 8チャンネルピペットを用いて100 mmのペトリ皿当たり20μL-滴200μLのヒント、反転食器、乾燥からぶら下がっ滴を防ぐために、PBSで反転蓋を埋めます。光からRA含有培地を保護します。
- ハンギング培養EBを、4日間、37℃、5％CO 2で低下します。
5. 2D EB文化
- RTで30分間30 / mlのフィブロネクチンでコーティング12ミリメートルの円形カバーガラス。 24ウェルプレートのウェルに各カバースリップを置き、そしてウェル当たり1 mLのIMDMを加えます。
- 収穫3日成長ドロップEBを200μLピペットチップとの一つずつをぶら下げと同じピペットチップを使用して、フィブロネクチンでコーティングしたカバースリップ上にウェル当たり20のEBSをそれらをシード。
注：彼らはカバースリップに良好に接着するので3日間のEBは、4日間のEB上で好ましいです。 - LIFなしIMDM-15％FBSと文化を続行します。 3〜4日毎に培地交換してください。必要に応じてタンパク質分泌分析のために用いられる培地を収集します。
分泌タンパク質の6の検出
- EBのメディの500μLを転送UMへの10kDaカットオフの遠心フィルタ、4°Cで60分間20,000×gでスピン。
- 遠心フィルター内の過度の濃縮を防ぐために、すべての15-20分を残りのメディアを調べます。残りの培地の体積は25μlに低下したときに遠心分離を停止します。
- 製造者の指示に従って、フィルタを反転し、4℃で160×gでスピンした後に残った濃縮培地を収集します。
- 特異的抗体17を用いたイムノブロッティングによって分泌されるタンパク質を検出します。
7. 3D EB文化
- ステップ5.2で説明したように懸滴中で4日間成長させたEBを収集し、そして1.5mLの遠心管（チューブ当たり30件のEB）に置きます。
- （ 材料/機器の表を参照）、3Dコラーゲン培養キットの説明書に従ってコラーゲンゲル溶液を調製します。コラーゲン溶液と5×DMEM（キット構成要素）の適切な量を希釈します。 n個を追加eutralization溶液（キット構成要素）と、すぐによく混ぜ、氷の上にこれを維持します。
- EBSを含む1.5mlチューブに冷却したコラーゲン溶液の適切な体積をピペット穏やか1mLのピペットチップを用いて、6ウェルプレートのウェルに移します。泡を作ることは避けてください。
- 直ちにコラーゲンの重合を開始するために60分間、37°C、5％CO 2にプレートを転送します。
- IMDMでEBを含有するプレートを重ねます。
- 3〜4日毎に培地交換。
8. EB解離
- 200μlのピペットチップを用いて、一枚ずつ（ステップ4から）4日目のEBを収集し、15％FBSを有する非接着性細菌ペトリ皿を含有するIMDMに転送します。さらに4日間、37℃、5％CO 2で培養。彼らは一番下に取り付けていないことを確認するために二回、毎日のEBを確認してください。穏やか底にEBの付着を防止するために、皿を振ります。
- 5分間遠心185×gでのEBで卓上遠心機でRT、。
- 上清を除去します。ペレットは、各チューブに100μLを超えてはなりません。
- PBS中20％FBSを補充したIチューブ当たりコラゲナーゼEBを1mLの0.25％のタイプを、ペレット化するために追加。
- 、37°C、5％CO 2で1時間EB-コラゲナーゼ混合物をインキュベート1mLのピペットチップを使用して、穏やかに20分毎にそれをピペッティング。
- PBSで穏やかに3倍の細胞を洗浄。細胞凝集体が存在している場合は、それらを削除するには、100ミクロンのメッシュでセルストレーナーを使用しています。
- IMDMでゼラチン被覆の60mm皿に細胞をReplate。次いで、37℃、5％CO 2でインキュベートします。
解離EBの9.トランスフェクション
- QRT-PCRおよび免疫ブロット法、0.5％ゼラチンでコート6ウェルプレートのために。
- 免疫蛍光法、RTで30分間30 / mlのフィブロネクチンで被覆ガラスカバースリップのために。 24ウェルプレートのウェルに各カバースリップを置きます。 IMDMを追加します。
- シード4.75×10 5または1×10 5
- トランスフェクション前に70％コンフルエンスまで細胞を成長させます。
- 製造業者の指示に従って、（ マテリアル/機器 の表を参照のこと）非リポソーム脂質幹細胞最適試薬17で細胞をトランスフェクトします。
注：我々が使用した試薬は、一般的には50％のトランスフェクション効率に達した（ 代表的な結果を参照してください）。 - QRT-PCRにより、または、それぞれ、17 2、3日、トランスフェクション後に免疫ブロット法によってサンプルを分析。
免疫蛍光によってEB分化の10分析
- 洗浄2DのEBまたはPBSで解離3D EBを、室温で30分間、PBS中の4％パラホルムアルデヒドで固定します。固定された細胞は浮遊細胞残屑を除去するためにPBSで3回洗浄します。
注：パラホルムアルデヒドは皮膚や眼への刺激性です。それを取り扱う際は注意してください。 その後、RTで20分間、細胞を透過性PBSで3回洗浄するPBS中1％トリトンX-100を加えます。 - PBSを除去し、30分間PBS中5％BSAでブロックします。
- 1％BSA中の一次抗体希釈液を調製/ PBS、0.03％のトリトンX-100を補いました。一次抗体溶液によってブロッキング液を交換してください。 RTで3時間インキュベート、または4℃で一晩、次いで細胞をPBSで3回洗浄します。
- 製造元の指示に従ってPBSで二次抗体を適用します。次いで、細胞をPBSで3回洗浄し、RTで1時間インキュベートします。
- マウントは、光学顕微鏡のための抗フェード媒体をガラススライド上にカバースリップ。
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Representative Results
OCT4、Nanogの、およびSOX2は、ESCの自己再生および多能性を付与するコア転写因子です。我々は、野生型からとSYX、RhoAの特異交換因子SYXをコードする遺伝子は、破壊された遺伝子改変マウスの株からESCの神経分化を比較するために上記のプロトコルを適用しました。我々は、血管新生18でSYXを関与していました。 ESCは、および場合SYXの神経分化をテストするために進ん- - / -私たちは、EBの行動の違いはSYX + / +およびSYXから集約気づい/ -のESCは、彼らのSYX + / +対応のものよりも高速です。
SYXの初期状態を比較するために、+ / +及びSYX - / -のESCは、我々は、OCT4、Nanogの、およびSOX2、コア転写因子Tの存在量を遺伝子型毎に定量帽子は、ESCの自己複製と多分化能を付与します。プロトコルのステップ10で説明したように、ESCのはのOct4、Sox2及びNanogの抗体によって免疫標識しました。 SYX + / +及びSYX 3つの転写因子の存在量- / -免疫蛍光法（ 図2）及び17をイムノブロット（ 図2）によって決定されるのESCは、類似していました。
3Dコラーゲンマトリクス（ 図1B）に移植EBを2日間移植後、10×対物レンズを用いて細胞培養顕微鏡上に表示されている細胞の拡張を発芽開始します。 200μm以下の5〜10芽の間、6日目に正常SYXでに対し、SYX + / +のEBで観察することができる- / - 200マイクロメートルよりも長い大部分は30〜50個の芽が頻繁に観察されたEBを、 （ 図1C）。
- / - SYX + / + 2DのEB（ 図3A）からよりにおけるページ= "1">我々は、細胞がより速くSYXから拡張ことを観察しました。 / - - SYX + / +およびSYXから延長した細胞の神経分化の割合を比較するためにEBSを、我々は、神経幹細胞マーカーであるネスチン、中間フィラメント調節タンパク質19で2次元培養6日後にそれらを免疫標識。ネスチンの存在量はSYXから延びる細胞において実質的に高かった- / -のEB（ 図3B）。我々は、その後13日間の2D EBから解離した細胞において、ネスチンおよびチューブリンβ3（Tubβ3）の存在量、軸索細胞骨格タンパク質20を比較しました。そのSYX + / +対応（ 図3C）に比べたEB - / -両方のタンパク質がSYXから解離した細胞においてより豊富でした。私たちは、immunobloの定量化によって同様の結果を得ました同じタンパク質17のめの設定。
図4は、構成的に緑色蛍光タンパク質（GFP）でトランスフェクトされた細胞は、（ 材料/機器の表を参照）幹細胞の最適なトランスフェクション試薬を用いて活性のRhoA（RhoAの-Q63L）を-fused示します。
図1：SYX + / +及びSYXからスプラウト創発- / - 3D培養におけるEBS。 （A）SYX + / +およびSYX - / -のESCは、神経分化を誘導する前にクラスタ化されたコロニーに成長しました。吊りに形成されたEBの（B及びC）の画像は、0.5μMRAで低下し、その後の工程7.1-7.4に記載されるように、RAなしで3Dコラーゲンマトリックスに挿入されます。画像が示された目標で6日目に撮影した（スケールB ARS = AとCが100μm、Bには200μm）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：多能性コア転写因子の存在。代表SYX + / +及びSYXに示されるコア多能性マーカーの存在量を示す画像- / -のESC（スケールバー=50μM）。ヤンらを参照してください。免疫標識方法の詳細については、 図17（スケールバー=50μmで、DAPI、2-（4-アミジノフェニル）-1H-インドール-6-カルボキサミジン）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
グレ3" SRC = "/ファイル/ ftp_upload / 55621 / 55621fig3.jpg" />
図3：EB細胞における神経分化マーカーの可視化。 2D EBの（A）位相画像は、細胞がより速くSYXから展開することを示すエッジ- / - （=200μmのスケールバー）SYX + / + EBからより。神経分化マーカーであるネスチンが6日2D SYXから拡大細胞においてより豊富であったことを示す（B）免疫蛍光画像- / -そのSYX + / +対応物（スケールバー=50μM）から以下のEB。そのSYX + / +対応物（スケールバー=50μM）から以下のEB - / - （C）免疫蛍光画像は、ネスチンおよびTubβ3神経分化マーカーは13日3D SYXから解離した細胞においてより豊富であったことを示します。 争うにはこちらをクリックしてください。この図のWA拡大版。
図4：トランスフェクション試薬の効率の可視化。 GFPに融合した構成的に活性のRhoAによってトランスフェクトのESCを示す免疫蛍光画像の3つの複製プロトコル（スケールバー=50μM）の工程9.5で使用した試薬のトランスフェクション効率を示しました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルでは、我々は、マウスESCの神経分化を研究するため、比較的簡単で、アクセス方法を提示します。以前のプロトコルでは、RA、または直ちにEBドロップ・アグリゲーション21を吊り下げた後に、それぞれ、2日目又はEBのハンギングドロップ8又は懸濁培養7によるの4日目に培地に添加しました。私たちが考案したプロトコルでは、RAは、以前に追加されました。懸濁培養によって形成されたEBにRAの初期の導入にもかかわらず、このプロトコルは、神経分化マーカー8のより高い発現を生じました。
ここでは、RAを適用し、ハンギングドロップ培養開始時に神経分化を誘導好みます。それらは単一細胞懸濁液中に残っている場合、この変更は、EB凝集前のESCに等しいRA露出を可能にします。 RAは、凝集のEBに追加されたときに、EB内塊中の細胞は、RA concentrati下部を感知する可能性があります外層中の細胞より上。それは外胚葉層7,8の神経分化に有利な内胚葉および中胚葉の胚層の発達を抑制するため、EBの凝集開始時のRAのアプリケーションも有利です。私たちは、RAの治療は、10個のマーカー17の近くの豊かさを調べることによって、神経分化を促進したことを確認しました。
このプロトコルでは3つの重要な考慮事項があります。最初は、高純度のESC集団を達成するためにMEFフィーダー細胞の最大の除去です。第二は、RAの光感度である：その原液と吊り滴がRAの適用後に、光から保護されなければなりません。 RAの原液は、新鮮な溶液を調製することが必要になるまで、わずか2週間安定です。第三の考慮事項は、RA濃度です。私たちのパイロット実験では、10μMのRA遅れ細胞の成長とプロの濃度であることを発見しましたRAは、高いconncentrations 22においてアポトーシスを引き起こす23,24ができる可能性があるため、低濃度に比べて小さいサイズのEBSをduced。我々は、0.5μMのRA濃度のいずれかより高い25のまたはより低い濃度でより十分に形成されたEBのより多くを生成すること、及びEBを約200ミクロンの平均直径に達したことを観察しました。大きなEBは、10X対物レンズのフィールドのサイズを超えると、画像に難しく、結果として、ありました。したがって、我々は最適なRA濃度として0.5μMを選びました。
彼らは凍結切片のために脆すぎるので、3D EBの免疫蛍光による分析には問題があります。さらに、我々は、凍結EB部分がコーティングされていない静電処理したガラススライドによく付着しないことがわかりました。一部のEBは、基板にうまく接続していないため、2D EB文化の調製は、余分な懸滴の集約が必要です。 EBディ比較的遅いssociationは、コラゲナーゼとのインキュベーション中に1.5 mLのマイクロチューブに上下EBSをピペッティングすることによって加速することができます。
神経に分化したESCは、パーキンソン病を患っている患者26の脳内の黒質で失わ破損した内因性細胞、 例えばドーパミン作動性ニューロンを交換するために使用することができます。ヒトESCの分化の現在の技術は、EB形成（ 同上 。）を必要としないが、EBは依然として、分子レベルでの神経分化の詳細な分析のための有用なツールです。
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Disclosures
著者は、彼らは、競合や金融利害関係を持たない宣言します
Acknowledgments
この研究は、AHにNIHの助成R01 HL119984によってサポートされていました
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| MEFs | EMD Millipore | PMEF-CF | ESC feeder layer |
| ESC | EMD Millipore | CMTI-2 | |
| Cell culture dish (60 mm) | Eppendorf | 30701119 | Cell culture |
| Cell culture dish (100 mm) | Falcon | 353003 | Cell culture |
| Petri dish (100 mm) | Corning | 351029 | Hanging drops |
| 24-well plate | Greiner Bio-One | 662160 | 2D EBs |
| 6-well plate | Eppendorf | 30720113 | Transfection |
| Dark 1.5 mL centrifuge tube | Celltreat Scientific Products | 229437 | RA stock solution |
| Microscope cover-glass | Fisherbrand | 12-545-80 | Circular, 12 mm diameter |
| Superfrost-plus microscope slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| 3D collagen culture kit | EMD Millipore | ECM675 | 3D culture |
| Effectene Transfection Reagent | Qiagen | 301427 | Stem cell transfection |
| Microcon Centrifugal Filters (10 kDa) | EMD Millipore | MRCPRT010 | Protein concentration |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM | Lonza | 12-709F | MEFs culture |
| IMDM | Gibco | 12440-046 | ESCs culture |
| Fetal bovine serum (FBS) | EMD Millipore | ES-009-B | ESCs culture |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G2625 | Dish coating |
| LIF | R&D Systems | 8878-LF-025 | To maintain ESC pluripotency |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solutions | Gibco | 11140050 | Cell culture |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | Cell culture |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Cell culture |
| Gentamicin | Gibco | 15750060 | Cell culture |
| MycoZap Plus-PR | Lonza | VZA-2022 | Cell culture |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 | Cell culture |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| All-trans-retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625-50MG | Induction of neural differentiation |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030-50G | Blocking and antibody dilution |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-100ML | Cell membrane permeabilization |
| Cell strainer | Corning | 352360 | |
| Prolong Gold anti-fade reagent with DAPI | Life Tech. | P36931 | Mounting reagent |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Cell fixation |
| Fibronectin | R&D Systems | 1030-FN | Dish coating |
| PBS | Gibco | 10010049 | |
| Collagenase type I | Worthington Biochem. Corp | LS004196 | EB dissociation |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary Antibodies | |||
| Nestin (Rat-401) | Santa Cruz Biotech | sc-33677 | Detection of neural differentiation |
| Oct4 | Santa Cruz Biotech | sc-5279 | Detection of neural differentiation |
| Nanog | Bethyl Laboratories | A300-398A | Detection of neural differentiation |
| Sox2 | Cell Signaling | 3579 | Detection of neural differentiation |
| Tubulin b3 (AA10) | Santa Cruz Biotech | sc-80016 | Detection of neural differentiation |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary Antibodies | |||
| Donkey anti-Mouse-Alexa555 | Life Tech. | A31570 | Immunofluorescence |
| Donkey anti-mouse-Alexa488 | Life Tech. | A21202 | Immunofluorescence |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| Wide-field microscope | Nikon | Eclipse TS100 | Cell culture imaging |
| Confocal microscope | Nikon | C2 | Immunofluorescence imaging |
References
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