Summary
İki ya da üç boyutlu bir embriyoit gövdeleri oluşturmak için fare embriyonik kök hücreleri kullanılarak bir tekniği açıklar. Daha sonra progenitör hücre işaretleyici immünofloresan ve immün farklılaşma hallerindeki analiz retinoik asit ve ne göre embriyoit vücut hücrelerinin sinir farklılaşmasını uyarmak üzere açıklar.
Abstract
Blastosist (genellikle üçüncü gün E3.5 de) iç kütleden izole fare embriyonik kök hücreleri (ESCs), erken dönemde embriyo gelişimini incelemek için in vitro model sistemi olarak da kullanılabilir. lösemi inhibe edici faktör (LİF) yokluğunda, EKH nöral öncü hücrelerine varsayılan göre farklılık göstermektedir. Onlar yüzünden erken evre embriyo olan benzerliği küresel agrega Embriyoit gövdeyi (EB) adı verilen üç boyutlu (3D) içine topladığı edilebilir. EBS iki boyutlu (2D) uzantıları büyüterek genişletmek nerede, fibronektin kaplı lamelleri numaralı seribaşı, ya da küremsiler olarak büyümeye devam ve üç germ içine ayırt 3D kollajen matrislerinde implante edilebilir: endodermal, mezodermal ve ektodermal. 3D kollajen kültür 2D EBS daha yakından in vivo ortamda taklit eder. 2B EB kültür immunfloresan ve farklılaşmayı izlemek için imünolekelemeyle analizini kolaylaştırır. Biz iki adımlı nöral differentia geliştirdiksiyon protokolü. Birinci aşamada, EBS aynı zamanda, retinoik asit (RA) maruz bırakılarak ayırt etmek için uyarılan, asılı bırakma tekniği ile üretilen ve edilmektedir. İkinci aşamada, RA yokluğunda bir 2D veya 3D biçiminde sinir farklılaşma ilerler.
Introduction
EKH blastosist iç hücre kitlesi kaynaklanır. Menşe organizmanın herhangi bir hücre türü ayırt etme kapasitesine sahip, yani bu hücreler, embriyonik dokuda bulunurlar. ESC in vitro farklılaşma geliştirme yolunu ve mekanizmaları araştırmak için bir sistemde kadar geniş ilgi konusudur. Bu hücre ve doku disfonksiyonu düzeltmek için, yeni tedavi yaklaşımları test etmek için bir kuvvetli ve esnek bir model sistem sunmaktadır. EBS erken embriyogenez sırasında hücre farklılaşması birçok yönünü yeniden gündeme getirirler. Embriyo ölümüne yolaçtığı zor embriyonik kusurlar 1, 2, hücresel bir temel belirlemek için yapar Özellikle, EBS kullanılabilir. EBS asılı bırakma veya bir sıvı süspansiyon teknikleri 3 yoluyla oluşturulabilir. Eski avantajı böylece deneysel tekrarlanabilirlik kolaylaştırmak tutarlı boyut ve yoğunluğu EBS üretme yeteneğidir.
4 integrin hücre yüzeyine 10 türleri tarafından tanınan bir bazal lamina bileşenidir.
RA sinir farklılaşmasını 5, 6 indükler A vitamini küçük lipofilik metabolitidir. RA yüksek konsantrasyonlarda sinir gen ekspresyonunu teşvik etmek ve EB formasyonu 7, 8 boyunca mezodermal geni ifade etmek. RA retinaldehit dehidrojenaz 9 tarafından nihai ürüne retinaldehit oksidasyon takip eder ya da alkol ya da retinol dehidrojenazı ile, retinaldehit için bir oksidasyon vitamini ile üretilir. Sinir farklılaşma sitoplazmadan RA taşınmasını gerektirir Hücresel RA-bağlayıcı protein 2 (CRABP2) ile çekirdeğe. Çekirdekte RA, RAR-RXR heterodimerin 10 oluşan bunun kognat reseptörü kompleksine bağlanmaktadır. Bu transkripsiyonel eş-aktivatörleri alımı ve transkripsiyon 9, 11 başlatılması ile sonuçlanır. Ayrıca, RA ve böylece BMP ve Smad 12 sinyal antagonize fosforile (aktif) SMAD1 bozunmasını geliştirmesidir. Bu faaliyetlerin yanı sıra, RA Pax6 ifadesini nöral farklılaşma 13 destekleyen bir transkripsiyon faktörü artar. RA sinyal sirtuin-1 (SIRT1), nükleer nikotinamid adenin dinükleotid (NAD +) 'modüle edilir - çekirdeğe translokasyonu ile müdahale, CRABP2 deacetylates bağlı bir enzim ve bu nedenle RA, RAR-RXR heterodimerin 14, 15 bağlanma ile, 16.
e_content "> Burada anlatılan RA-tedavi EB protokolünü tasarlarken amacımız nöronal öncü hücrelerine ESC farklılaşmasını regüle sinyal yollarının in vitro analizini kolaylaştırmak amacıyla nöral farklılaşma optimize etmektir. Bu protokolün avantajlarından biri kolaylaştırılmasıdır immünfloresans. 3D EBS tarafından hücre fonksiyonunun analizi de antikorlar tarafından nüfuz ve nöral farklılaşma odaklı mikroskopi ile immunolabeling ve hücrelerin görüntüleme kolaylaştırır sırasında belirli zaman noktalarında 2D tek tabaka halinde görüntü. EB ayrışma zordur değildir.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Fare embriyonik fibroblastlar 1. Kültür (MEF'ler)
- MEF orta hazırlayın,% 15 fetal sığır serumu (FBS) ile takviye edilmiş Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı (DMEM yüksek glukoz).
- Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca (RT),% 0.5 jelatin çözeltisi ile kaplayın 100 mm'lik bir hücre kültür tabakları.
- Bir Sitometreyi kullanılarak MEFS sayın. jelatin çözeltisi çıkarın ve hemen MEF ortamı 37 ° C'ye kadar ön-ısıtılmış dökün. Hızla, daha sonra 2 dakika süre ile 37 ° C bir su banyosu içinde mitomisin C ile muamele edilmiş MEF'lerin şişeler çözülme 100 mm jelatin kaplı kap başına 2.8 x 10 6 MEFS tohum. Diğer boyutlardaki getirme tabağı kullanılarak Buna göre hücre sayısını ayarlar. Gece boyunca 37 ° C'de,% 5 CO2 de MEFS inkübe edin.
- ertesi gün orta değiştirin. MEF katmana kadar 2-3 gün Kültür birleşik olduğunu.
2. Fare ESC Kültürü
- ESC orta hazırlayın, Iscove'un değiştirilmiş Dulbecco ortamı (IMDM) içinde% 15 FBS ve 10 ile takviye3 U / ml, lösemi önleyici faktörü (LİF), 0.1 mM temel olmayan amino asitler, 55 mM 2-merkaptoetanol, penisilin (100 U / ml), streptomisin (100 ug / ml), gentamisin (200 ug / mL), ve% 0.2 mycoplasma antibiyotik.
- aşama 1 'de hazırlanan çanak MEF Ortamı çıkarın ve 37 ° C'lik önceden ısıtılmış ESC orta ile değiştirin.
- MEF tabakanın üstüne ESC şişe ve tohum hücreleri Defrost. EKH kaynaşmaya erişene kadar, 37 ° C,% 5 CO2 inkübe edin.
- MEF'lerin konfluent tek tabaka içeren yeni hücre kültürü yemekleri hazırlayın. Geçit için EKH, bir kez PBS ile yıkayın ve 37 ° C'de,% 5 CO2 2-5 dakika süreyle /% 0.25 tripsin ile EDTA ayırmak. , Ayırma hücrelere% 15 FBS ile taze IMDM ekleyerek tripsinizasyon durdurma oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 160 x g'de hücre, bir 15 ml tüp süspansiyon ve santrifüj aktarın.
- Süpernatant, taze IMDM ve geçit her yeni, MEF-kaplı çanak hücrelerin beşte biri ile tekrar süspansiyon EKH çıkarın; hücreler kadar kuluçkayaizdiham (tipik olarak 4-5 gün) ulaşır.
3. Jelatin kaplı levhalarda MEFS ve Kültür EKH çekin
- ECSS bir araya gelerek konfluens kez, taze IMDM hücrelerin tekrar süspansiyon, adım 2.4 gibi% 0.25 tripsin / EDTA ile ve MEFS ayırmak yapışkan olmayan bir bakteriyolojik petri tabağına transfer edin ve 37 ° C'de,% 5 COz, 40 dakika süre ile inkübe 2.
- Dikkatle tekrar pipetleme kaçınarak ESCs ve 5 ml pipet kullanarak yeni bir jelatin-kaplı plakaya orta MEF'ler içeren aktarın. EKH uymayan beri petri kaplarında kalan hücreler, MEF bulunmaktadır.
- Passage EKH her 3-4 günde. Daha az sıklıkla pasajı ESC pluripotensini azaltabilir. o farklılaşmayı lehine olabileceğinden% 60 izdiham aşmayın.
- MEF emin MEF mevcut değilse yapmak, bir 20X objektif kullanarak, bir hücre kültürü mikroskobu ile artık tespit olana kadar tekrarlayın, gerektiği gibi, 3.2-3.3 üç kez ya da daha fazla adımlar.
- ESC kontrol ederek ESC pluripotensini doğrulamaHücreler tipik ESC çokgen morfoloji (Şekil 1A) ile yoğun koloniler oluşturur eğer kültür görmek için. Ters transkriptaz polimeraz zincir 17 immunoblotting reaksiyonu (qRT-PCR), 17, ya da çekirdek pluripotense transkripsiyon immünofloresansla test hücre stemness 17 (Şekil 2) faktörleri.
4. EB oluşumu
- 1.5 ml hafif korunan mikrofüj tüplerine, all-trans-RA stok DMSO içinde 10 mM'de solüsyonu ve kısım hazırlayın. Çözelti, iki haftaya kadar -80 ° C 'de stabildir. Işıktan koruyun.
- adım 2.4 gibi tripsinize ESCs; tek bir hücre süspansiyonu olarak, LİF olmadan taze IMDM replate.
- Bir hemasitometre kullanarak hücreleri sayın ve 0.5 uM RA IMDM 5 x 10 5 hücre / ml süspansiyon hazırlamak.
- Levha 100, 8 kanallı pipet ile 100 mm petri kabı başına 20 uL-damla ve 200 uL uçları, tersyemekleri ve kurutma asılı damla önlemek için PBS ile ters kapak doldurun. Işıktan RA içeren kültür ortamı koruyun.
- Asılı Kültür EBS 4 gün, 37 ° C,% 5 CO2 de düşer.
5. 2B EB Kültürü
- Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 30 ug / ml fibronektin ile kaplayın, 12 mm yuvarlak cam lameller. 24 kuyucuklu bir plakanın bir oyuk her lamel yerleştirin ve her bir kuyucuk için 1 ml IMDM ekleyin.
- Hasat 3 gün yetiştirilen 200 mcL pipet uçlarıyla birer damla EBS birini asılı ve aynı pipet uçları kullanılarak, kuyu başına, fibronektin kaplı lamelleri 20 EBS onları tohum.
NOT: lamelleri daha iyi yapışır, çünkü 3 günlük EBS 4 günlük EBS üzerinde tercih edilir. - LIF olmadan IMDM-% 15 FBS ile kültürü devam edin. Her 3-4 gün orta değiştirin. Gerektiğinde, protein salgılanması analizi için kullanılan ortam toplayın.
Salgılanan Proteinlerin 6. Algılama
- EB medi 500 mcL aktarınum için 10 kDa'ya kesme santrifüj filtreler, 4 ° C'de 60 dakika boyunca 20,000 x g'de santrifüj.
- merkezkaç filtrelerin içindeki aşırı zenginleşmesini önlemek için her 15-20 dakika kalan orta inceleyin. Kalan ortamının hacmi 25 uL düştüğü zaman santrifüj durdurun.
- filtre tersine çevrilmesi ve 4 ° C'de 160 x g'de iplik, üretici talimatlarına göre sonra kalan konsantre edilir ortamı toplayın.
- Spesifik antikorların 17 ile immün salgılanan proteinleri algılar.
7. 3D EB Kültürü
- Adım 5.2'de tarif edildiği gibi damla asılı 4 gün için büyütülmüştür EBS toplamak ve 1.5 ml santrifüj tüp (tüp başına 30 EBS) koyun.
- 3D kolajen kültür kit talimatlarına (/ Ekipman Tablo Malzeme) takip eden kolajen jel çözeltisi hazırlayın. kolajen çözeltisi ve 5x DMEM (bir kit bileşeni) uygun hacimleri seyreltin; n eklemekeutralization çözeltisi (bir kit bileşeni) ve iyi derhal karıştırın ve buz üzerinde kalsın.
- EBS içeren 1.5 ml tüp içine soğutulmuş kolajen çözeltisinin uygun bir hacmi Pipet ve yavaşça 1 ml bir pipet kullanarak, 6 gözlü bir plakanın kuyularına aktarın. kabarcıkları yapmaktan kaçının.
- Hemen kolajen polimerizasyonu başlatmak için 60 dakika boyunca, 37 ° C'de,% 5 CO2 plaka transfer.
- IMDM EB içeren plaka kaplaması.
- Her 3-4 gün orta değiştirin.
8. EB Ayrışma
- 200 uL pipet uçlarıyla, tek tek (aşama 4'den), günde 4 EBS toplamak ve% 15 FBS ile yapışkan olmayan bakteriyel petri tabağı içeren IMDM aktarmak; 37 ° C, 4 gün daha% 5 CO2 kültür. dibe takmak olmadığından emin olmak için EBS iki kez her gün kontrol edin; nazikçe altına EB eki önlemek için yemek sallayın.
- 5 dk için 185 x g'de santrifüj EBSRT, bir tezgah üstü santrifüj içinde.
- süpernatantlar çıkarın. Topak, her bir tüp içinde 100 uL aşmamalıdır.
- PBS içinde% 20 FBS ile takviye edilmiş bir tüp başına kolajenaz EBS 1 ml% 0.25 türü, topak haline ekle.
- 37 ° C'de,% 5 CO2 de 1 saat için EB-kollajen karışımı inkübe 1 ml pipet uçları kullanılarak, yavaşça 20 dakikada bir pipetleme.
- PBS ile hafifçe 3x hücreleri yıkayın. hücre agregatları, mevcut olduğu takdirde, bunları çıkarmak için bir 100 um elek içeren bir hücre filtresi kullanılır.
- IMDM bir jelatin kaplı 60 mm'lik tabaklar üzerinde hücreleri Replate. Daha sonra, 37 ° C'de,% 5 CO2 inkübe edin.
Ayrılan EBS 9. transfeksiyonu
- qRT-PCR ve immüno kat% 0.5 jelatin ile bir 6-yuvalı plaka için.
- immünofloresan oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 30 ug / ml fibronektin ile kat cam kapak slipleri için. 24 kuyucuklu bir plakanın bir oyuk her lamel yerleştirin. IMDM ekleyin.
- Tohum 4.75 x 10 5 veya 1 x 10 5
- Transfeksiyondan önce% 70 konflüansa hücreleri büyütün.
- Üreticinin talimatlarını izleyerek (/ Ekipman Tablo Malzeme) bir lipozomal olmayan lipit kök hücre-optimum reaktif 17 tarafından hücrelere nükleik asit.
NOT: Kullanılan reaktif,% 50'lik bir transfeksiyon etkinliği ulaştı (Örnek Sonuçlar bakınız). - QRT-PCR ile ya da sırasıyla 17 2 veya 3 gün sonra transfeksiyon immünoblotlama ile örnekleri analiz.
Immünofloresansla EB Farklılaşma 10. Analizi
- Yıkama 2D EBS veya PBS ile ayrıştırılmış 3D EBS ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca PBS içinde% 4 paraformaldehit ile yapışması. Sabit hücreler, hücre enkaz yüzen kaldırmak için PBS ile 3 kez yıkanır.
NOT: Paraformaldehyde bir cilt ve göz tahriş edicidir; bunu tutarken dikkatli olun. daha sonra, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca hücreler geçirgen PBS ile 3 kez yıkama için PBS içinde% 1 Triton X-100 ilave edin. - PBS çıkarın ve 30 dakika boyunca PBS içerisinde% 5 BSA ile bloke eder.
- % 1 BSA içinde birincil antikor seyreltme hazırlayın / PBS% 0.03 triton-X-100 ile desteklenmiştir. Primer antikor solüsyonu ile bloke çözeltisi değiştirin. Oda sıcaklığında 3 saat süre ile inkübe veya gece boyunca 4 ° C 'de, daha sonra hücreler, PBS ile 3 kez yıkanır.
- üreticinin talimatlarına göre PBS ikincil antikor uygulayın. Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin, daha sonra hücreler, PBS ile 3 kez yıkayın.
- Dağı optik mikroskopi için bir anti-solma ortamı ile cam slaytlar lamelleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Oct4, Nanog ve Sox2 ESC kendini yenileme ve pluripotensini veren çekirdek transkripsiyon faktörleridir. Vahşi tip ve Syx, RhoA spesifik değişim faktörü Syx kodlayan bir gen, bozulur genetik olarak modifiye edilmiş bir fare suşundan elde ESC'lennin nöral farklılaşmasını karşılaştırma yukarıdaki protokol uygulanmıştır. Biz anjiyogenez 18'de syx karıştığı almıştı. / - - EKH ve syx nöral farklılaşma olmadığını test devam - / - ESCs onların Syx + / + muadillerine göre daha hızlıdır Biz EBS davranışlarında farklılıklar Syx + / + ve syx toplulastırılmıs ettim.
Syx başlangıç durumunu karşılaştırmak + / + ve Syx - / - EKH biz Oct4, Nanog ve Sox2 çekirdek transkripsiyon faktörleri t bolluklarını genotip her sayısalşapka ESC kendini yenileme ve pluripotensini kazandırmaktadır. protokolün adım 10'da tarif edildiği gibi, EKH Oct4, Sox2 ve Nanog antikorlarla immunolabeled edildi. Syx + / + ve Syx 3 transkripsiyon faktörleri bolluğu - / - immünofloresan (Şekil 2) ve 17 immunoblotting (Şekil 2) ile belirlenen EKH benzerdi.
3B kollajen matris implante EBS (Şekil 1B) 2 gün implantasyonu sonrası 10X objektif, bir hücre kültürü mikroskop görebilir hücre uzantıları çimlenme başlar. Normal olarak, Syx + / + EBS gözlenen Syx oysa olabilir 200 um ya da daha az 5 ila 10 filizi arasında 6 gün, üzerinde - / - EBS 30-50 lahanası sıklıkla gözlenir, çoğunluğu daha uzun 200 um olan (Şekil 1C).
syx uzanan hücreler - / - Syx + / + 2D EBS (Şekil 3A) den daha. / - - Syx + / + ve syx uzanan hücrelerin nöral farklılaşma oranını karşılaştırmak EBS, biz nöral kök hücre işaretleyici Nestin, bir ara filaman düzenleyici protein 19 ile 2D kültürünün 6 gün sonra onları immunolabeled. Nestin en bolluk Syx uzanan hücrelerde önemli ölçüde daha yüksek olduğu - / - EBS (Şekil 3B). Daha sonra 13 günlük 2D EBS ayrışmış hücrelerde Nestin ve tübülin p3 bolluk (Tubβ3), bir aksonal hücre iskeleti proteini 20 karşılaştırıldı. Bunların Syx + / + meslektaşları (Şekil 3C) daha EBS - / - Her iki protein Syx ayrışmış hücrelerinde daha çoktu. Biz immunoblo miktarı ölçülerek benzer sonuçlar eldeaynı proteinlerin 17 ayarını kontrol edin.
Şekil 4, temel olarak, yeşil floresan proteini (GFP) ile transfekte edilmiş hücrelerin (/ Ekipman Tablo Malzeme) bir sap-hücre uygun transfeksiyon ayıracı kullanılarak aktif RhoA (RhoA Q63L) -kaynaşmış gösterir.
Şekil 1: Syx + / + ve syx gelen Sprout Ortaya Çıkışı - / - 3D Kültür EBS. (A), Syx + / + ve Syx - / - EKH sinir farklılaşmanın başlaması öncesinde kümelenmiş koloniler büyüdü. Adımda 7.1-7.4 tarif edildiği gibi (B ve C) 0,5 uM RA damla asılı oluşan EBS görsel ve daha sonra, RA olmayan bir 3D kollajen matrisi içine yerleştirilir. Görüntüler belirtilen amaçlara göre 6. günde ele geçirildi (Ölçek b ars = A ve C 100 um, B 200 um). Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Şekil 2: pluripotensin Çekirdek Transkripsiyon Faktörleri varlığı. Örnek Syx + / + ve Syx belirtilen çekirdek pluripotense belirteçlerin bolluklarını gösteren görüntüler - / - EKH (Ölçü bar = 50 um). Yang ve diğ. Immünoyaftalama metodunun detayları 17 (Ölçü bar = 50 um, DAPI, 2- (4-amidinofenil) -1 H-indol-6-karboksamidin). Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Güre gösterir 3" src = "/ files / ftp_upload / 55621 / 55621fig3.jpg" />
Şekil 3: EB Hücrelerinde Sinir farklılaşma markörünü görselleştirilmesi. 2D EB (A) faz görüntü hücrelerinin daha hızlı Syx genişletilmiş gösteren kenarlarına - / - (= 200 um Ölçek çubuğu) Syx + / + EBS den daha. Nöral farklılaşma işareti Nestin 6 gün 2D Syx genişleyen hücrelerde daha bol olduğunu gösteren (B), immünofloresans görüntüleri - / - kendi Syx, + / + meslektaşları (Ölçü bar = 50 um) den daha EBS. Bunların Syx + / + muadilleri (Ölçü bar = 50 um) den daha EBS - / - (C) İmmünofloresans görüntü Nestin ve Tubβ3 sinir farklılaşma markerleri 13 gün 3D Syx ayrışmış hücrelerde daha bol olduğunu gösteren. Vie için lütfen tıklayınızBu rakamın wa büyük versiyonu.
Şekil 4: Transfeksiyon Reaktif Verimliliğinin Görselleştirme. GFP kaynaşmış yapısal olarak aktif RhoA tarafından transfekte EKH gösteren imüno-görüntü üç suret protokolü (Ölçü bar = 50 um) aşama 9.5 kullanılan reaktifin transfeksiyon etkinliğini göstermek için. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokolde, kemirgen ESC'lennin nöral farklılaşma çalışma için nispeten basit ve erişilebilir bir yöntem sunulmaktadır. Daha önceki protokollarda, RA günde 2 veya EB asılı damla, 8 gün 4 veya süspansiyon kültürü 7 tarafından ortam ilave edildi, EB damla agregasyonu 21 asılı, sırasıyla, ya da hemen sonra. Biz icat Protokolde, RA daha önce eklenmiştir. Süspansiyon kültürü ile oluşturulmuş EBS için RA'nın daha önce giriş rağmen, bu protokol sinir kullanılarak belirlenen 8 daha yüksek ekspresyonu gösterdi.
Burada, RA uygulayarak ve Asılı damla kültür başlangıcında nöral farklılaşma uyaran tercih. tek bir hücre süspansiyonu hala bu modifikasyon EB agregasyonu önce ESC'lennin eşit RA maruz kalmasını sağlar. RA birleştirilmiş EBS eklendiğinde, EB iç kütlesinde hücreleri, RA concentrati için daha düşük bir algılamak muhtemeldirDış tabakadaki hücrelerin daha üzerinde. Bu ektodermal tabakası 7, 8 nöral farklılaşma lehine endodermal ve mezodermal germ tabakası oluşumunun engellendiği için EB agregasyonu başlangıcında RA uygulanması da avantajlıdır. Biz RA tedavisi 10 belirteçler 17 yakın bolluğunu inceleyerek nöral farklılaşma teşvik doğruladı.
Bu protokolde üç kritik hususlar vardır. ilk önce bir yüksek saflıkta ESC popülasyonu elde etmek için MEF besleyici hücrelerin maksimum çıkarılmasıdır. İkinci RA'nın ışık hassasiyeti bellidir: stok çözeltisi ve asılı damla RA uygulamadan sonra ışıktan korunmalıdır. RA stok çözeltisi sadece taze çözüm hazırlanmalıdır bundan sonra iki hafta boyunca kararlıdır. üçüncü bir mesele RA konsantrasyonudur. Pilot deneylerde, biz 10 uM RA engelli hücre büyümesi ve pro bir konsantrasyonda bulunduÜlseratif kolitte daha küçük boyutlu EBS düşük konsantrasyonlarda kıyasla, büyük olasılıkla RA 24, yüksek conncentrations 22, 23 de apoptoza da neden olabildiği için. Biz, 0.5 uM'lik bir RA konsantrasyonu ya daha yüksek 25 ya da daha düşük konsantrasyonlarda daha iyi biçimli EBS daha büyük bir sayı üretilen ve EBS 200 um arasında bir ortalama çapa ulaştığı gözlemlenmiştir. Büyük EBS bir 10X objektif alanı boyutunu aşan ve görüntüye daha sert, dolayısıyla idi. Bu nedenle, optimal RA konsantrasyonu 0.5 uM seçtik.
onlar Frozen kesitte için çok kırılgan olduğu için 3D EBS immünofloresans ile analizi problemlidir. Ayrıca, dondurulmuş EB bölümleri kaplanmamış elektrostatik işlenmiş cam slaytlara iyi sopa yok olduğunu gördük. Bazı EBS maddeye iyi takmak yok çünkü 2B EB kültürünün hazırlanması, ekstra asılı damla toplamını gerektirir. EB dinispeten yavaş Derneğinin, kollajenaz ile inkübasyon sırasında yukarı ve aşağı 1.5 ml mikrofüj tüpüne EBS pipetleme hızlandırılabilir.
Nöral farklılaşmış EKH Parkinson hastalığı 26 muzdarip hastaların beyninde siyah maddede kayıp hasarlı endojen hücreleri, örneğin dopaminerjik nöronların yerine kullanılabilir. İnsan ESC farklılaşma mevcut teknikler İT formasyonu (ibid.) Gerektirmeyen birlikte, EBS moleküler seviyede nöral farklılaşma ayrıntılı analizi için bir araç vardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip veya mali çıkarları beyan
Acknowledgments
Bu çalışma AH NIH hibe R01 HL119984 tarafından desteklenmiştir
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| MEFs | EMD Millipore | PMEF-CF | ESC feeder layer |
| ESC | EMD Millipore | CMTI-2 | |
| Cell culture dish (60 mm) | Eppendorf | 30701119 | Cell culture |
| Cell culture dish (100 mm) | Falcon | 353003 | Cell culture |
| Petri dish (100 mm) | Corning | 351029 | Hanging drops |
| 24-well plate | Greiner Bio-One | 662160 | 2D EBs |
| 6-well plate | Eppendorf | 30720113 | Transfection |
| Dark 1.5 mL centrifuge tube | Celltreat Scientific Products | 229437 | RA stock solution |
| Microscope cover-glass | Fisherbrand | 12-545-80 | Circular, 12 mm diameter |
| Superfrost-plus microscope slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| 3D collagen culture kit | EMD Millipore | ECM675 | 3D culture |
| Effectene Transfection Reagent | Qiagen | 301427 | Stem cell transfection |
| Microcon Centrifugal Filters (10 kDa) | EMD Millipore | MRCPRT010 | Protein concentration |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM | Lonza | 12-709F | MEFs culture |
| IMDM | Gibco | 12440-046 | ESCs culture |
| Fetal bovine serum (FBS) | EMD Millipore | ES-009-B | ESCs culture |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G2625 | Dish coating |
| LIF | R&D Systems | 8878-LF-025 | To maintain ESC pluripotency |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solutions | Gibco | 11140050 | Cell culture |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | Cell culture |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Cell culture |
| Gentamicin | Gibco | 15750060 | Cell culture |
| MycoZap Plus-PR | Lonza | VZA-2022 | Cell culture |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 | Cell culture |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| All-trans-retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625-50MG | Induction of neural differentiation |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030-50G | Blocking and antibody dilution |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-100ML | Cell membrane permeabilization |
| Cell strainer | Corning | 352360 | |
| Prolong Gold anti-fade reagent with DAPI | Life Tech. | P36931 | Mounting reagent |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Cell fixation |
| Fibronectin | R&D Systems | 1030-FN | Dish coating |
| PBS | Gibco | 10010049 | |
| Collagenase type I | Worthington Biochem. Corp | LS004196 | EB dissociation |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary Antibodies | |||
| Nestin (Rat-401) | Santa Cruz Biotech | sc-33677 | Detection of neural differentiation |
| Oct4 | Santa Cruz Biotech | sc-5279 | Detection of neural differentiation |
| Nanog | Bethyl Laboratories | A300-398A | Detection of neural differentiation |
| Sox2 | Cell Signaling | 3579 | Detection of neural differentiation |
| Tubulin b3 (AA10) | Santa Cruz Biotech | sc-80016 | Detection of neural differentiation |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary Antibodies | |||
| Donkey anti-Mouse-Alexa555 | Life Tech. | A31570 | Immunofluorescence |
| Donkey anti-mouse-Alexa488 | Life Tech. | A21202 | Immunofluorescence |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| Wide-field microscope | Nikon | Eclipse TS100 | Cell culture imaging |
| Confocal microscope | Nikon | C2 | Immunofluorescence imaging |
References
- Hopfl, G., Gassmann, M., Desbaillets, I. Differentiating embryonic stem cells into embryoid bodies. Methods Mol Biol. 254, 79-98 (2004).
- Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6 (2), 88-95 (2000).
- Dang, S. M., Kyba, M., Perlingeiro, R., Daley, G. Q., Zandstra, P. W. Efficiency of embryoid body formation and hematopoietic development from embryonic stem cells in different culture systems. Biotechnol Bioeng. 78 (4), 442-453 (2002).
- Johansson, S., Svineng, G., Wennerberg, K., Armulik, A., Lohikangas, L.
- Blumberg, B. An essential role for retinoid signaling in anteroposterior neural specification and neuronal differentiation. Semin Cell Dev Biol. 8 (4), 417-428 (1997).
- Ross, S. A., McCaffery, P. J., Drager, U. C., De Luca, L. M.
- Bain, G., Ray, W. J., Yao, M., Gottlieb, D. I. Retinoic acid promotes neural and represses mesodermal gene expression in mouse embryonic stem cells in culture. Biochem Biophys Res Commun. 223 (3), 691-694 (1996).
- Okada, Y., Shimazaki, T., Sobue, G., Okano, H. Retinoic-acid-concentration-dependent acquisition of neural cell identity during in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells. Dev Biol. 275 (1), 124-142 (2004).
- Duester, G. Retinoic acid synthesis and signaling during early organogenesis. Cell. 134 (6), 921-931 (2008).
- Niederreither, K., Dolle, P. Retinoic acid in development: towards an integrated view. Nat Rev Genet. 9 (7), 541-553 (2008).
- Maden, M. Retinoic acid in the development, regeneration and maintenance of the nervous system. Nat Rev Neurosci. 8 (10), 755-765 (2007).
- Sheng, N., et al. Retinoic acid regulates bone morphogenic protein signal duration by promoting the degradation of phosphorylated Smad1. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 18886-18891 (2010).
- Gajovic, S., St-Onge, L., Yokota, Y., Gruss, P. Retinoic acid mediates Pax6 expression during in vitro differentiation of embryonic stem cells. Differentiation. 62 (4), 187-192 (1997).
- Dong, D., Ruuska, S. E., Levinthal, D. J., Noy, N. Distinct roles for cellular retinoic acid-binding proteins I and II in regulating signaling by retinoic acid. J Biol Chem. 274 (34), 23695-23698 (1999).
- Sessler, R. J., Noy, N. A ligand-activated nuclear localization signal in cellular retinoic acid binding protein-II. Mol Cell. 18 (3), 343-353 (2005).
- Tang, S., et al. SIRT1-Mediated Deacetylation of CRABPII Regulates Cellular Retinoic Acid Signaling and Modulates Embryonic Stem Cell Differentiation. Mol Cell. 55 (6), 843-855 (2014).
- Yang, J., et al. RhoA inhibits neural differentiation in murine stem cells through multiple mechanisms. Sci Signal. 9 (438), ra76 (2016).
- Garnaas, M. K., et al. Syx, a RhoA guanine exchange factor, is essential for angiogenesis in Vivo. Circ Res. 103 (7), 710-716 (2008).
- Chou, Y. H., Khuon, S., Herrmann, H., Goldman, R. D. Nestin promotes the phosphorylation-dependent disassembly of vimentin intermediate filaments during mitosis. Mol Biol Cell. 14 (4), 1468-1478 (2003).
- Arai, T., Matsumoto, G. Subcellular localization of functionally differentiated microtubules in squid neurons: regional distribution of microtubule-associated proteins and beta-tubulin isotypes. J Neurochem. 51 (6), 1825-1838 (1988).
- Arnhold, S., Klein, H., Semkova, I., Addicks, K., Schraermeyer, U. Neurally selected embryonic stem cells induce tumor formation after long-term survival following engraftment into the subretinal space. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (12), 4251-4255 (2004).
- Liu, Y., et al. Retinoic acid receptor beta mediates the growth-inhibitory effect of retinoic acid by promoting apoptosis in human breast cancer cells. Mol Cell Biol. 16 (3), 1138-1149 (1996).
- Altucci, L., et al. Retinoic acid-induced apoptosis in leukemia cells is mediated by paracrine action of tumor-selective death ligand TRAIL. Nat Med. 7 (6), 680-686 (2001).
- Pettersson, F., Dalgleish, A. G., Bissonnette, R. P., Colston, K. W. Retinoids cause apoptosis in pancreatic cancer cells via activation of RAR-gamma and altered expression of Bcl-2/Bax. Br J Cancer. 87 (5), 555-561 (2002).
- Kothapalli, C. R., Kamm, R. D. 3D matrix microenvironment for targeted differentiation of embryonic stem cells into neural and glial lineages. Biomaterials. 34 (25), 5995-6007 (2013).
- Cai, J., et al. BMP and TGF-beta pathway mediators are critical upstream regulators of Wnt signaling during midbrain dopamine differentiation in human pluripotent stem cells. Dev Biol. 376 (1), 62-73 (2013).
