Summary
Vi beskriver en teknik til anvendelse af murine embryonale stamceller til generering af to- eller tredimensionale embryoide legemer. Vi derefter forklare, hvordan at inducere neural differentiering af embryoide kropsceller ved retinsyre, og hvordan man analyserer deres tilstand af differentiering ved progenitorcelle markør immunofluorescens og immunoblotting.
Abstract
Muse embryonale stamceller (ESC'er) isoleret fra den indre blastocyt (typisk ved dag E3.5), kan anvendes som in vitro modelsystem til undersøgelse tidlig fosterudvikling. I fravær af leukæmiinhiberende faktor (LIF), økonomiske og sociale råd differentiere som standard i neurale precursorceller. De kan samlet i en tredimensional (3D) sfæriske aggregat betegnes embryoid legeme (EB) på grund af dens lighed med den tidlige fase embryo. EB'er kan podes på fibronectinovertrukne dækglas, hvor de ekspanderer ved dyrkning todimensionale (2D) udvidelser, eller indført i 3D collagenmatricer hvor de fortsat vokser som sfæroider, og differentierer til de tre kimlag: endodermal, mesodermal og ectodermal. 3D kollagen kultur efterligner in vivo miljø tættere end 2D EB'er. 2D EB kultur letter analyse ved immunofluorescens og immunoblotting at spore differentiering. Vi har udviklet en to-trins neurale differentieringtion protokol. I det første trin, er EB'er genereres af hængende-dråbe-teknikken, og samtidig induceres til at differentiere ved udsættelse for retinsyre (RA). I det andet trin, neurale differentierings forløber i en 2D- eller 3D-format i fravær af RA.
Introduction
Økonomiske og sociale råd stammer fra blastocyst indre cellemasse. Disse celler er pluripotente, dvs. at de har kapacitet til at differentiere til en hvilken som helst celletype i organismen for oprindelse. ESC in vitro differentiering har bred interesse som et eksperimentelt system til at undersøge udviklingsmæssige veje og mekanismer. Det giver en potent og fleksibel modelsystem til afprøvning af nye terapeutiske metoder til korrektion af celler og væv dysfunktion. EB rekapitulere mange aspekter af celledifferentiering under tidlig embryogenese. Især kan EB'er anvendes, når embryoletalitet gør det vanskeligt at bestemme den cellulære grundlag af embryonale defekter 1, 2. EB'er kan dannes enten af hængende dråbe eller flydende suspensionsteknikker 3. Fordelen ved førstnævnte er evnen til at generere EB'er af ensartet størrelse og densitet, hvilket vil lette eksperimentelle reproducerbarhed.
4.
RA er en lille lipofil metabolit af vitamin A, som inducerer neural differentiering 5, 6. Høje koncentrationer af RA fremme neural genekspression og undertrykker mesodermal genekspression under EB formation 7, 8. RA fremstilles ved vitamin A oxidation til retinaldehyde ved enten alkohol eller retinol dehydrogenase, efterfulgt af retinaldehyde oxidation til slutproduktet ved retinaldehyde dehydrogenase 9. Neural differentiering kræver transport af RA fra cytoplasmaet til kernen ved cellulær RA-bindende protein 2 (CRABP2). I kernen, RA binder til dens beslægtede receptor kompleks bestående af en RAR-RXR heterodimer 10. Dette resulterer i rekruttering af transkriptionelle co-aktivatorer, og initiering af transkription 9, 11. Endvidere RA fremmer nedbrydningen af phosphoryleret (aktiv) SMAD1, således antagonisere BMP og SMAD signalering 12. Ud over disse aktiviteter, RA øger Pax6-ekspression, en transkriptionsfaktor, der understøtter neural differentiering 13. RA signalering moduleres ved sirtuin-1 (SIRT1), et nukleart nicotinamidadenindinucleotid (NAD +) - afhængigt enzym, deacetylerer CRABP2, interferere med dets translokation til kernen, og dermed med RA binding til RAR-RXR heterodimer 14, 15, 16.
e_content "> Vores mål i udformningen af RA-behandlede EB protokol beskrevet her er at optimere neural differentiering for at lette in vitro analyse af signalveje, der regulerer ESC differentiering til neuronale precursorceller. En af fordelene ved denne protokol er lettelse af analysen af cellefunktion ved immunofluorescens. 3D EB'er ikke godt gennemtrænges af antistoffer og er vanskelige at billedet. EB dissociation i en 2D monolag på bestemte tidspunkter i løbet af neural differentiering letter immunmærkning og afbildning af cellerne ved konfokal mikroskopi.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Dyrkning af muse embryonale fibroblaster (MEF)
- Forberede MEF medium, Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM høj glucose) suppleret med 15% føtalt bovint serum (FBS).
- Coat 100 mm celledyrkningsskåle med 0,5% gelatine-opløsning i 30 minutter ved stuetemperatur (RT).
- Tæl MEF'er ved hjælp af en cytometer. Fjern gelatineopløsningen og straks pour MEF medium forvarmet til 37 ° C. Hurtigt tø hætteglas med mitomycin C-behandlede MEF'er i et 37 ° C vandbad i 2 min, derefter frø 2,8 x 10 6 MEF'er per 100 mm gelatineovertrukket skål. Justere celleantal overensstemmelse hermed, hvis anvendelse retter af andre størrelser. Inkuber MEF'er natten over ved 37 ° C, 5% CO2.
- Skift mediet på den næste dag. Kultur i 2-3 dage, indtil den MEF lag er sammenflydende.
2. Kultur Mouse ESC
- Forberede ESC medium, Iscoves modificerede Dulbeccos medium (IMDM) suppleret med 15% FBS og 103 U / ml leukæmiinhiberende faktor (LIF), 0,1 mM ikke-essentielle aminosyrer, 55 mM 2-mercaptoethanol, penicillin (100 U / ml), streptomycin (100 pg / ml), gentamicin (200 pg / ml) og 0,2% mycoplasma antibiotikum.
- Fjern MEF medium fra skålen fremstillet i trin 1 og erstatte med 37 ° C forvarmet ESC medium.
- Afrimning en ESC hætteglas og frøceller oven på MEF lag. Der inkuberes ved 37 ° C, 5% CO2, indtil ØSR nå konfluens.
- Forberede nye celledyrkningsskåle indeholdende et sammenflydende monolag af MEF'er. Til passage ESC'erne, vaskes én gang med PBS og tag med 0,25% trypsin / EDTA i 2-5 minutter ved 37 ° C, 5% CO2. Standse trypsinisering ved tilsætning af frisk IMDM med 15% FBS til til adskillelse celler, overføre cellesuspensionen til et 15 ml rør og centrifugeres ved 160 xg i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Fjern supernatanten, resuspender økonomiske og sociale råd med frisk IMDM og passage en femtedel af cellerne til hver ny MEF-overtrukne skål; inkuber indtil cellernår konfluens (typisk 4-5 dage).
3. Træk MEF'er og kultur ØSR på gelatineovertrukne Plader
- Når ECSS nåede konfluens, løsnes dem og MEF'er med 0,25% trypsin / EDTA som i trin 2.4, cellerne resuspenderes i frisk IMDM, overførsel til en ikke-klæbende bakteriologisk petriskål, og der inkuberes i 40 minutter ved 37 ° C, 5% CO 2.
- overføre omhyggeligt økonomiske og sociale råd og MEF'er-holdigt medium til en ny gelatineovertrukket plade under anvendelse af en 5 ml pipette, undgå gentagen pipettering. Cellerne er tilbage i de petriskåle er MEF, da økonomiske og sociale råd ikke overholder.
- Passage de økonomiske og sociale råd hver 3-4 dage. Mindre hyppig passage kan reducere ESC pluripotens. Må ikke overstige 60% sammenløb, da det kan favorisere differentiering.
- Gentag trin 3.2-3.3 tre gange eller mere, efter behov, indtil MEF'er ikke længere påviselig ved en cellekultur mikroskop under anvendelse af et 20X objektiv, for at sikre MEF'er ikke er til stede.
- Bekræft ESC pluripotens ved at kontrollere ESCkultur for at se om de celler danner tætte kolonier med typiske ESC polygonal morfologi (figur 1A). Prøvningsrummet stemness ved kvantitativ revers transkriptase polymerasekædereaktion (QRT-PCR) 17, immunoblotting 17, eller immunfluorescens af kerne pluripotency transkriptionsfaktorer 17 (figur 2).
4. EB Formation
- Forberede all-trans-RA stamopløsning ved 10 mM i DMSO, og alikvot i 1,5 ml lys-beskyttet mikrocentrifugerør. Opløsningen er stabil ved -80 ° C i op til to uger. Beskyt mod lys.
- Trypsinisér ØSR som i trin 2.4; replate i frisk IMDM uden LIF, som en enkelt-cellesuspension.
- Tæl celler under anvendelse af et hæmocytometer, og fremstille en 5 x 10 5 celler / ml suspension i IMDM med 0,5 uM RA.
- Plade 100 20-pi-dråber pr 100-mm petriskål med en 8-kanals pipette og 200 pi tips, invertsukkerSkålene, og fylde det omvendte låg med PBS for at forhindre hængende dråber fra tørring. Beskyt RA-holdige dyrkningsmedier fra lys.
- Kultur EB'er i hængende dråber ved 37 ° C, 5% CO2 i 4 dage.
5. 2D EB Kultur
- Coat 12 mm cirkulært dækglas med 30 ug / ml fibronectin i 30 minutter ved stuetemperatur. Placer hver dækglas i en brønd i en plade med 24 brønde, og der tilsættes 1 ml IMDM pr.
- Harvest tre dage dyrket hængende dråbe EB'er én efter én med 200 uL pipettespidser og frø dem på fibronectinovertrukne dækglas, 20 EB'er per brønd, med de samme pipettespidser.
BEMÆRK: 3-dages EB er foretrække over 4 dages EB'er fordi de overholder bedre til dækglas. - Fortsæt kultur med IMDM-15% FBS uden LIF. Udskift medium hver 3-4 dage. Opsaml medium til proteinsekretion analyse efter behov.
6. Påvisning af secernerede proteiner
- Overfør 500 uL af EB medium til 10 kDa-cutoff centrifugalfiltre, centrifugering ved 20.000 xg i 60 minutter ved 4 ° C.
- Undersøg mediet tilbage inde de centrifugale filtre hver 15-20 min for at forhindre overdreven berigelse. Stoppe centrifugering når volumenet af det resterende medium er faldet til 25 pi.
- Opsamling af resterende koncentrerede medium efter invertering af filteret og centrifugering ved 160 xg ved 4 ° C, i overensstemmelse med producentens anvisninger.
- Registrere de udskilte proteiner ved immunblotting med specifikke antistoffer 17.
7. 3D EB Kultur
- Indsamle EB'er dyrkes i 4 dage i hængende dråber, som beskrevet i trin 5.2, og placere dem i 1,5 ml-centrifugerør (30 EB'er pr rør).
- Forberede kollagengel opløsning ifølge instruktionerne fra 3D-collagen kultur kit (se Materialer / Udstyr tabel). Fortyndet passende volumener kollagenopløsning og 5x DMEM (et kit komponent); tilsæt neutralization opløsning (et kit komponent) og bland godt med det samme, og holde dette på is.
- Pipette en passende mængde kølet kollagenopløsning i 1,5 ml rør indeholdende EB'erne, og overføre forsigtigt til brøndene i en plade med 6 brønde under anvendelse af en 1 ml pipettespids. Undgå at bobler.
- Overdrage pladen til 37 ° C, 5% CO2, i 60 min at initiere collagen polymerisation.
- Overlay EB-holdige plade med IMDM.
- Skift medium hver 3-4 dage.
8. EB Dissociation
- Opsaml dag 4 EB'er (fra trin 4) en efter en, med 200 pi pipettespidser og overføre dem til en ikke-klæbende bakteriologisk petriskål indeholdende IMDM med 15% FBS; dyrkning ved 37 ° C, 5% CO2 i 4 dage. Tjek EBS to gange hver dag for at sikre, at de ikke tillægger bunden; ryst forsigtigt fadet for at forhindre EB vedhæftning til bunden.
- Centrifuger EB'er ved 185 xg i 5 minutter vedRT, i en bordcentrifuge.
- Fjern supernatanterne. Pelleten må ikke overstige 100 pi i hvert rør.
- Tilføj til pelleteret EB'er 1 ml 0,25% type I collagenase per rør, suppleret med 20% FBS i PBS.
- Inkubér EB-collagenase blandingen i 1 time ved 37 ° C, 5% CO2, pipettering det forsigtigt hver 20 min, under anvendelse af 1 ml pipettespidser.
- Vask cellerne forsigtigt 3x med PBS. Hvis celleaggregater er til stede, anvendes en cellefilter med en 100-um mesh for at fjerne dem.
- Replate cellerne på et gelatineovertrukne 60 mm skåle i IMDM. Derefter inkuberes ved 37 ° C, 5% CO2.
9. Transfektion af dissocierede EB'er
- For QRT-PCR og immunoblotting, belægge en plade med 6 brønde med 0,5% gelatine.
- For immunfluorescens, coat dækglas med 30 ug / ml fibronectin i 30 minutter ved stuetemperatur. Placer hver dækglas i en brønd i en plade med 24 brønde. Tilføj IMDM.
- Frø 4.75 x 10 5 eller 1 x 10 5
- Dyrk cellerne til 70% konfluens før transfektion.
- Transficere cellerne ved en ikke-liposomale lipid stamceller-optimal reagens 17 (se Materialer / Udstyr tabel) efter producentens anvisninger.
BEMÆRK: Reagenset vi bruges typisk nået en transfektionseffektivitet på 50% (se Repræsentative resultater). - Analysere prøver ved QRT-PCR eller ved immunoblotting 17 2 eller 3 dage efter transfektion hhv.
10. Analyse af EB Differentiering efter immunofluorescens
- Vask 2D EB'er eller dissocieret 3D EB'er med PBS og fastgøres med 4% paraformaldehyd i PBS i 30 minutter ved stuetemperatur. Vask de fikserede celler 3x med PBS for at fjerne flydende cellerester.
BEMÆRK: Paraformaldehyd er en hud og øjenirriterende; være forsigtig, når du håndterer den. Tilsæt 1% Triton X-100 i PBS til permeabilisere cellerne i 20 minutter ved stuetemperatur, derefter vaskes 3x med PBS. - Fjern PBS og blokere med 5% BSA i PBS i 30 min.
- Forberede primært antistof fortynding i 1% BSA / PBS suppleret med 0,03% Triton X-100. Erstatte den blokerende opløsning ved det primære antistof opløsning. Inkuber i 3 timer ved stuetemperatur, eller natten over ved 4 ° C, vask derefter cellerne 3 gange med PBS.
- Anvende sekundært antistof i PBS ifølge producentens anvisninger. Inkuber i 1 time ved stuetemperatur, derefter vaske celler 3 gange med PBS.
- Mount Dækglas på objektglas med en anti-fade medium for optisk mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Oct4, Nanog, og SOX2 er de centrale transkriptionsfaktorer der bibringer ESC selvfornyelse og pluripotens. Vi anvendt den ovennævnte protokol til at sammenligne den neurale differentiering af økonomiske og sociale råd fra vild type og fra en stamme af genetisk modificerede mus, hvor Syx, et gen, der koder for RhoA-specifikke vekselkurs faktor Syx er afbrudt. Vi havde impliceret Syx i angiogenese 18. Vi har bemærket forskelle i adfærd af EB'er aggregeret fra Syx + / + og Syx - / - økonomiske og sociale råd, og fortsatte med at teste, om den neurale differentiering af Syx - / - økonomiske og sociale råd er hurtigere end deres Syx + / + modstykker.
At sammenligne den oprindelige tilstand af Syx + / + og Syx - / - økonomiske og sociale råd, vi kvantificeret i hver genotype mængderne af Oct4, Nanog, og SOX2, de grundlæggende transkriptionsfaktorer that give ESC selvfornyelse og pluripotens. Som beskrevet i trin 10 af protokollen blev ØSR immunmærket af Oct4, Sox2, og NANOG antistoffer. Mængderne af de 3 transkriptionsfaktorer i Syx + / + og Syx - / - økonomiske og sociale råd var ens, som bestemt ved immunfluorescens (figur 2) og immunoblotting 17 (figur 2).
EB'er implanteret i en 3D kollagenmatrix (figur 1B) start spiring cellulære udvidelser, der er synlige på en cellekultur mikroskop med et 10X objektiv, 2 dage efter implantation. På dag 6 mellem 5 og 10 spirer af 200 um eller mindre, kan normalt observeres i Syx + / + EB'er, mens der i Syx - / - EBS, 30-50 spirer er hyppigt forekommende, hvoraf størstedelen er længere end 200 um , (figur 1C).
Syx - / - end fra Syx + / + 2D EB'er (figur 3A). At sammenligne hastigheden af neural differentiering af celler, som strakte sig fra den Syx + / + og Syx - / - EB'er, vi immunmærket dem efter 6 dages 2D kultur af neural stamcelle nestin, et intermediært filament regulerende protein 19. Nestin overflod var væsentligt højere i celler, der strækker sig fra Syx - / - EB'er (figur 3B). Vi derefter sammenlignet overflod af nestin og tubulin β3 (Tubβ3), en axonal cytoskeleton protein 20, i celler dissocieret fra 13-dages 2D EB'er. Begge proteiner var mere talrige i celler dissocieret fra Syx - / - EB'er end i deres Syx + / + modstykker (figur 3C). Vi opnåede tilsvarende resultater ved kvantificering af immunoblorg ø ring af de samme proteiner 17.
Figur 4 viser celler transfekteret ved konstitutivt grønt fluorescerende protein (GFP) kondenseret aktive RhoA (RhoA-Q63L) under anvendelse af en stamcelle-optimal transfektionsreagens (se Materialer / Udstyr tabel).
Figur 1: Sprout Emergence fra Syx + / + og Syx - / - EBS i 3D kultur. (A) Syx + / + og Syx - / - ØSR voksede i klynger kolonier før induktion af neural differentiering. (B og C) billeder af EB'er dannet i hængende dråber med 0,5 uM RA, og derefter indsat i en 3D-kollagenmatrix uden RA, som beskrevet i trin 7,1-7,4. Billeder blev taget til fange på dag 6 af de angivne mål (Scale b ars = 100 um i A og C, 200 um i B). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Tilstedeværelse af Pluripotensbestemmende Core transkriptionsfaktorer. Repræsentative billeder, der viser mængderne af de angivne centrale pluripotensmarkør i Syx + / + og Syx - / - ØSR (Scale bar = 50 um). Se Yang et al. 17 for nærmere oplysninger om immunmærkning metoden (Scale bar = 50 um; DAPI, 2- (4-amidinophenyl) -1 H-indol-6-carboxamidin). Klik her for at se en større version af dette tal.
gur 3" src = "/ files / ftp_upload / 55.621 / 55621fig3.jpg" />
Figur 3: Visualisering af Neurale differentieringsmarkører i EB Cells. (A) Fase billeder af 2D EB kanter viser, at celler ekspanderes hurtigere fra Syx - / - end fra Syx + / + EB'er (Scale bar = 200 um). (B) Immunfluorescens billeder, der viser, at den neurale differentiering nestin var mere hyppigt forekommende i celler ekspanderende fra 6 dage 2D Syx - / - EBS end fra deres Syx + / + modstykker (Scale bar = 50 um). (C) Immunfluorescens billeder, der viser, at de neurale differentieringsmarkører nestin og Tubβ3 var mere talrige i celler dissocieret fra 13 day 3D Syx - / - EB'er end fra deres Syx + / + modstykker (Scale bar = 50 um). Klik her for at viewa større version af dette tal.
Figur 4: Visualisering af Virkningsgraden af transfektionsreagens. Tre gentagelser af immunofluorescens billeder, der viser ØSR transficeret med konstitutivt aktiv RhoA fusioneret til GFP at illustrere transfektionseffektiviteten af reagenset anvendt i trin 9.5 i protokollen (Scale bar = 50 um). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokol præsenterer vi en relativt enkel og tilgængelig metode til at studere neural differentiering af murine ESC'er. I tidligere protokoller blev RA tilsat til mediet på dag 2 eller dag 4 af EB hængende-dråbe 8 eller ved suspensionskultur 7 henholdsvis eller umiddelbart efter EB hængende dråbe aggregering 21. I den protokol vi udtænkt, blev RA tilføjet tidligere. Trods den tidligere introduktion af RA til EB'er dannet ved suspensionskultur, denne protokol producerede højere ekspression af neurale differentierings- 8 markører.
Her har vi foretrak at anvende RA og inducere neural differentiering i starten af den hængende dråbe kultur. Denne modifikation tillader lig RA eksponering for ØSR når de stadig er i en enkelt cellesuspension, før EB aggregering. Når RA sættes til aggregerede EB'er, celler i EB indre masse sandsynligvis at føle en lavere til RA Concentratipå end celler i det ydre lag. Anvendelse af RA ved starten af EB aggregering er også fordelagtigt, fordi det undertrykker endodermal og mesodermal kimlag udvikling til fordel for neural differentiering af ektodermale lag 7, 8. Vi bekræftede, at RA behandling fremmes neural differentiering ved at undersøge den overflod af tæt på 10 markører 17.
Der er tre kritiske overvejelser i denne protokol. Den første er maksimal fjernelse af MEF fødeceller at opnå en høj renhed ESC befolkning. Det andet er lysfølsomhed RA: dens stamopløsning og de hængende dråber skal beskyttes mod lys efter RA applikation. RA stamopløsning er stabil kun for to uger, hvorefter en frisk opløsning skal fremstilles. Den tredje overvejelse er RA koncentration. I vores pilotforsøg, fandt vi, at ved en koncentration på 10 uM RA retarderet cellevækst og proindført mindre størrelse EB'er forhold til lavere koncentrationer, muligvis fordi RA kan forårsage apoptose ved høje conncentrations 22, 23, 24. Vi observerede, at en RA koncentration på 0,5 uM producerede et større antal velformede EB'er end ved enten højere 25 eller lavere koncentrationer, og at EB'er nåede en gennemsnitlig diameter på omkring 200 um. Større EB overskrider området størrelsen af en 10X objektiv og var dermed sværere at billedet. Derfor valgte vi 0,5 pM som optimal RA koncentration.
Analyse ved immunfluorescens af 3D EBS er problematisk, fordi de er for skørt for frosset sektionering. Desuden fandt vi, at frosne EB sektioner ikke klæber godt til ubestrøget elektrostatisk-behandlede objektglas. Udarbejdelse af 2D EB kultur kræver sammenlægning af ekstra hængende dråber, fordi nogle EB'er ikke vedhæfte godt til underlaget. EB dissociation, som er relativ langsom, kan fremskyndes ved pipettering af EB'erne op og ned i et 1,5 ml mikrofugerør under deres inkubation med collagenase.
Neuralt differentierede økonomiske og sociale råd kan bruges til at erstatte skadede endogene celler, fx dopaminerge neuroner tabt i substantia nigra i hjernen hos patienter, der lider af Parkinsons sygdom 26. Mens de nuværende teknikker af human ESC differentiering ikke kræver EB formation (ibid.), EB er stadig et nyttigt værktøj til detaljeret analyse af neural differentiering på det molekylære niveau.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer de ikke har nogen konkurrerende eller økonomiske interesser
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af NIH tilskud R01 HL119984 til AH
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| MEFs | EMD Millipore | PMEF-CF | ESC feeder layer |
| ESC | EMD Millipore | CMTI-2 | |
| Cell culture dish (60 mm) | Eppendorf | 30701119 | Cell culture |
| Cell culture dish (100 mm) | Falcon | 353003 | Cell culture |
| Petri dish (100 mm) | Corning | 351029 | Hanging drops |
| 24-well plate | Greiner Bio-One | 662160 | 2D EBs |
| 6-well plate | Eppendorf | 30720113 | Transfection |
| Dark 1.5 mL centrifuge tube | Celltreat Scientific Products | 229437 | RA stock solution |
| Microscope cover-glass | Fisherbrand | 12-545-80 | Circular, 12 mm diameter |
| Superfrost-plus microscope slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| 3D collagen culture kit | EMD Millipore | ECM675 | 3D culture |
| Effectene Transfection Reagent | Qiagen | 301427 | Stem cell transfection |
| Microcon Centrifugal Filters (10 kDa) | EMD Millipore | MRCPRT010 | Protein concentration |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM | Lonza | 12-709F | MEFs culture |
| IMDM | Gibco | 12440-046 | ESCs culture |
| Fetal bovine serum (FBS) | EMD Millipore | ES-009-B | ESCs culture |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G2625 | Dish coating |
| LIF | R&D Systems | 8878-LF-025 | To maintain ESC pluripotency |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solutions | Gibco | 11140050 | Cell culture |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | Cell culture |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Cell culture |
| Gentamicin | Gibco | 15750060 | Cell culture |
| MycoZap Plus-PR | Lonza | VZA-2022 | Cell culture |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 | Cell culture |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| All-trans-retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625-50MG | Induction of neural differentiation |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030-50G | Blocking and antibody dilution |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-100ML | Cell membrane permeabilization |
| Cell strainer | Corning | 352360 | |
| Prolong Gold anti-fade reagent with DAPI | Life Tech. | P36931 | Mounting reagent |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Cell fixation |
| Fibronectin | R&D Systems | 1030-FN | Dish coating |
| PBS | Gibco | 10010049 | |
| Collagenase type I | Worthington Biochem. Corp | LS004196 | EB dissociation |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary Antibodies | |||
| Nestin (Rat-401) | Santa Cruz Biotech | sc-33677 | Detection of neural differentiation |
| Oct4 | Santa Cruz Biotech | sc-5279 | Detection of neural differentiation |
| Nanog | Bethyl Laboratories | A300-398A | Detection of neural differentiation |
| Sox2 | Cell Signaling | 3579 | Detection of neural differentiation |
| Tubulin b3 (AA10) | Santa Cruz Biotech | sc-80016 | Detection of neural differentiation |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary Antibodies | |||
| Donkey anti-Mouse-Alexa555 | Life Tech. | A31570 | Immunofluorescence |
| Donkey anti-mouse-Alexa488 | Life Tech. | A21202 | Immunofluorescence |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| Wide-field microscope | Nikon | Eclipse TS100 | Cell culture imaging |
| Confocal microscope | Nikon | C2 | Immunofluorescence imaging |
References
- Hopfl, G., Gassmann, M., Desbaillets, I. Differentiating embryonic stem cells into embryoid bodies. Methods Mol Biol. 254, 79-98 (2004).
- Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6 (2), 88-95 (2000).
- Dang, S. M., Kyba, M., Perlingeiro, R., Daley, G. Q., Zandstra, P. W. Efficiency of embryoid body formation and hematopoietic development from embryonic stem cells in different culture systems. Biotechnol Bioeng. 78 (4), 442-453 (2002).
- Johansson, S., Svineng, G., Wennerberg, K., Armulik, A., Lohikangas, L.
- Blumberg, B. An essential role for retinoid signaling in anteroposterior neural specification and neuronal differentiation. Semin Cell Dev Biol. 8 (4), 417-428 (1997).
- Ross, S. A., McCaffery, P. J., Drager, U. C., De Luca, L. M.
- Bain, G., Ray, W. J., Yao, M., Gottlieb, D. I. Retinoic acid promotes neural and represses mesodermal gene expression in mouse embryonic stem cells in culture. Biochem Biophys Res Commun. 223 (3), 691-694 (1996).
- Okada, Y., Shimazaki, T., Sobue, G., Okano, H. Retinoic-acid-concentration-dependent acquisition of neural cell identity during in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells. Dev Biol. 275 (1), 124-142 (2004).
- Duester, G. Retinoic acid synthesis and signaling during early organogenesis. Cell. 134 (6), 921-931 (2008).
- Niederreither, K., Dolle, P. Retinoic acid in development: towards an integrated view. Nat Rev Genet. 9 (7), 541-553 (2008).
- Maden, M. Retinoic acid in the development, regeneration and maintenance of the nervous system. Nat Rev Neurosci. 8 (10), 755-765 (2007).
- Sheng, N., et al. Retinoic acid regulates bone morphogenic protein signal duration by promoting the degradation of phosphorylated Smad1. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 18886-18891 (2010).
- Gajovic, S., St-Onge, L., Yokota, Y., Gruss, P. Retinoic acid mediates Pax6 expression during in vitro differentiation of embryonic stem cells. Differentiation. 62 (4), 187-192 (1997).
- Dong, D., Ruuska, S. E., Levinthal, D. J., Noy, N. Distinct roles for cellular retinoic acid-binding proteins I and II in regulating signaling by retinoic acid. J Biol Chem. 274 (34), 23695-23698 (1999).
- Sessler, R. J., Noy, N. A ligand-activated nuclear localization signal in cellular retinoic acid binding protein-II. Mol Cell. 18 (3), 343-353 (2005).
- Tang, S., et al. SIRT1-Mediated Deacetylation of CRABPII Regulates Cellular Retinoic Acid Signaling and Modulates Embryonic Stem Cell Differentiation. Mol Cell. 55 (6), 843-855 (2014).
- Yang, J., et al. RhoA inhibits neural differentiation in murine stem cells through multiple mechanisms. Sci Signal. 9 (438), ra76 (2016).
- Garnaas, M. K., et al. Syx, a RhoA guanine exchange factor, is essential for angiogenesis in Vivo. Circ Res. 103 (7), 710-716 (2008).
- Chou, Y. H., Khuon, S., Herrmann, H., Goldman, R. D. Nestin promotes the phosphorylation-dependent disassembly of vimentin intermediate filaments during mitosis. Mol Biol Cell. 14 (4), 1468-1478 (2003).
- Arai, T., Matsumoto, G. Subcellular localization of functionally differentiated microtubules in squid neurons: regional distribution of microtubule-associated proteins and beta-tubulin isotypes. J Neurochem. 51 (6), 1825-1838 (1988).
- Arnhold, S., Klein, H., Semkova, I., Addicks, K., Schraermeyer, U. Neurally selected embryonic stem cells induce tumor formation after long-term survival following engraftment into the subretinal space. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (12), 4251-4255 (2004).
- Liu, Y., et al. Retinoic acid receptor beta mediates the growth-inhibitory effect of retinoic acid by promoting apoptosis in human breast cancer cells. Mol Cell Biol. 16 (3), 1138-1149 (1996).
- Altucci, L., et al. Retinoic acid-induced apoptosis in leukemia cells is mediated by paracrine action of tumor-selective death ligand TRAIL. Nat Med. 7 (6), 680-686 (2001).
- Pettersson, F., Dalgleish, A. G., Bissonnette, R. P., Colston, K. W. Retinoids cause apoptosis in pancreatic cancer cells via activation of RAR-gamma and altered expression of Bcl-2/Bax. Br J Cancer. 87 (5), 555-561 (2002).
- Kothapalli, C. R., Kamm, R. D. 3D matrix microenvironment for targeted differentiation of embryonic stem cells into neural and glial lineages. Biomaterials. 34 (25), 5995-6007 (2013).
- Cai, J., et al. BMP and TGF-beta pathway mediators are critical upstream regulators of Wnt signaling during midbrain dopamine differentiation in human pluripotent stem cells. Dev Biol. 376 (1), 62-73 (2013).
