Summary
Aqui, apresentamos uma bicamada lipídica suportada no contexto de uma plataforma microfluídica para estudar as interações proteína-fosfoinositide usando um método livre de rótulas baseado na modulação do pH.
Abstract
Numerosas proteínas celulares interagem com superfícies de membrana para afetar processos celulares essenciais. Essas interações podem ser direcionadas para um componente lipídico específico dentro de uma membrana, como no caso de fosfoinositidos (PIPs), para garantir a localização e / ou ativação subcelular específica. PIPs e domínios de ligação celular PIP foram estudados extensivamente para entender melhor seu papel na fisiologia celular. Aplicamos um teste de modulação de pH em bicamadas lipídicas (SLBs) suportadas como uma ferramenta para estudar interações proteína-PIP. Nestes estudos, a fosfatidiletanolamina conjugada orto- Sulforododina B, utilizada para o pH, é utilizada para detectar interações proteína-PIP. Após a ligação de uma proteína a uma superfície de membrana contendo PIP, o potencial interfacial é modulado ( isto é, mudança no pH local), deslocando o estado de protonação da sonda. Um estudo de caso do uso bem sucedido do ensaio de modulação de pH é apresentado usando fosfolipase C delta1 PleckstrNo domínio da Homologia (PLC-δ1 PH) e da fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato (PI (4,5) P 2 ) como exemplo. A constante de dissociação aparente ( K d, app ) para essa interação foi de 0,39 ± 0,05 μM, semelhante a K d, valores de aplicativos obtidos por outros. Como observado anteriormente, o domínio PH de PLC-δ1 é PI (4,5) P 2 específico, mostra fraca ligação no sentido de fosfatidilinositol-4 fosfato, e nenhuma ligação a SLBS fosfatidilcolina pura. O ensaio PIP-on-a-chip é vantajoso em relação aos ensaios tradicionais de ligação a PIP, incluindo, mas não limitado a, baixo volume de amostra e nenhum requerimento de marcação de ligando / receptor, a capacidade de testar interações de membrana de alta e baixa afinidade com pequenas e pequenas Grandes moléculas e uma relação sinal / ruído melhorada. Consequentemente, o uso da abordagem PIP-on-a-chip facilitará a elucidação de mecanismos de uma ampla gama de interações de membrana. Além disso, este método poderia ser potencialmente vocêNa identificação de terapias que modulam a capacidade da proteína para interagir com as membranas.
Introduction
Inúmeras interacções e processos bioquímicos ocorrem em superfícies de membranas fluidas de duas dimensões. Os organelos fechados em membrana em células eucarióticas são únicos, não apenas nos processos bioquímicos e seu proteoma associado, mas também na sua composição lipídica. Uma classe excepcional de fosfolípidos é fosfoinositides (PIPs). Embora constituam apenas 1% do lipidoma celular, eles desempenham um papel crucial na transdução de sinal, autofagia e tráfico de membrana, entre outros 1 , 2 , 3 , 4 . A fosforilação dinâmica do grupo de cabeça de inositol pelas quinases PIP celulares dá origem a sete grupos principais PIP que são mono-, bis- ou trisfosforilados 5 . Além disso, os PIPs definem a identidade subcelular das membranas e servem como locais de encaixe de membrana especializados para proteínas / enzimas contendo um ou mais fosfoinosDomínios de vinculação, por exemplo, Pleopstrin Homology (PH), Phox Homology (PX) e epsin N-terminal Homology (ENTH) 6 , 7 . Um dos domínios de ligação ao PIP mais bem estudados é o da fosfolipase C (PLC) domínio PH -δ1 que interage especificamente com fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PI (4,5) P 2) dentro de uma gama micromolar nanomolar de baixa afinidade elevada 8 , 9, 10, 11.
Uma variedade de métodos in vitro qualitativos e quantitativos foram desenvolvidos e utilizados para estudar o mecanismo, termodinâmica e especificidade dessas interações. Entre os ensaios de ligação a PIP mais utilizados são a ressonância de plasmão de superfície (SPR), a calorimetria isotérmica (ITC), a espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN), o ensaio de flotação / sedimentação de lipossomas e transferências de lipidos (Fat-blots / PIP-strips)12 , 13 . Embora estes sejam amplamente utilizados, todos eles têm muitas desvantagens. Por exemplo, SPR, ITC e RMN requerem grandes quantidades de amostras, instrumentação cara e / ou pessoal treinado 12 , 13 . Alguns formatos de ensaio, tais como tampões lipídicos baseados em anticorpos, utilizam formas solúveis em água de PIPs e os apresentam de maneira não fisiológica 12 , 14 , 15 , 16 . Além disso, as transferências de lípidos não podem ser quantificadas de forma confiável e muitas vezes resultaram em observações falsas positivas / negativas 12 , 17 , 18 . Para superar esses desafios e melhorar o conjunto de ferramentas atual, um novo método livre de etiqueta foi estabelecido com base em uma bicamada lipídica suportada (SLB) no contexto de am Plataforma icrofluidica, que foi aplicada com sucesso no estudo das interações proteína-PIP ( Figura 1 ) 19 .
A estratégia empregada para detectar interações proteína-PIP é baseada na detecção de modulação de pH. Isto envolve um corante sensível ao pH que tem orto- Sifforodamina B ( o SRB) diretamente conjugado com o grupo de cabeça lipídica de fosfatidiletanolamina 20 . A sonda o SRB-PAPA (Figura 2A) é altamente fluorescente a um pH baixo e extinguiu-se a pH elevado com um pKa dentro de cerca de 6,7 7,5 mol% de PI (4,5) P 2 SLBS molecular contendo (Figura 5B). O domínio PLC-δ1 PH tem sido amplamente utilizado para validar as metodologias de ligação à proteína-PIP devido à sua alta especificidade em relação a PI (4,5) P 2 ( Figura 5A ) 21 , 22 ,"23 , 24 , 25. Assim, argumentamos que o domínio PH do PLC-δ1 pode ser usado para testar sua ligação ao PI (4,5) P 2 através do ensaio PIP-on-a-chip. A construção do domínio PH utilizado no presente estudo tem uma carga global positiva (pI 8,4), e, assim, atrai OH -. iões (Figura 5C) após ligação a PI (4,5) P 2 SLBS molecular contendo, o domínio PH traz as OH - iões para o superfície da membrana, que por sua vez modula o potencial interfacial e muda o estado de protonação do SRB-PAPA (Figura 5C) 26. Como uma função da concentração de domínio PH, a fluorescência é extinta (figura 6A). Finalmente, os dados normalizados é ajustar a uma isotérmica de ligação para determinar a afinidade do domínio PH-PI (4,5) P 2 interacção (Figura 6B, 6C). </ P>
Neste estudo, um protocolo detalhado é fornecido para realizar a ligação de proteínas aos SLBs contendo PIP dentro de uma plataforma microfluídica. Este protocolo leva o leitor a montar o dispositivo microfluídico e a preparação da vesícula para a formação de SLB e ligação de proteínas. Além disso, instruções para a análise de dados para extrair a informação de afinidade para o domínio PI-PLC-δ1 PH (4,5) P 2 interacção são fornecidos.
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Protocol
1. Limpando as lâminas de vidro
- Diluir a solução de limpeza 7x (ver Tabela de materiais ) 7 vezes com água desionizada em um prato de vidro de borosilicato de 100 mm de profundidade com um fundo plano e aquecê-lo até 95 ° C em uma placa quente nivelada durante 20 min ou até a solução turva ficar clara .
NOTA: A solução será quente, tenha cuidado para evitar lesões corporais. A Solução de Limpeza 7x é uma mistura proprietária de fosfato de hexasódio [oxido (fosfonatooxi) fosforil] oxifosforilo], 2- (2-butoxietoxi) etanol 1,4-bis (2-etilhexoxi) -1,4-dioxobutano -2-sulfonato e adições não-perigosas. - Usando pinças, coloque as lamelas (40 mm de comprimento x 22 mm de largura x 0,16-0,19 mm de altura) em um suporte de coloração de alumínio em direções alternadas. Mantenha um ponto vazio entre cada lamínula para evitar que eles se toquem.
- Submergir completamente o suporte de coloração com os lamínulas na solução de limpeza. Mantenha os lamínulas emA solução por 1 h.
NOTA: À medida que a água se evapora, continue adicionando água desionizada fresca para manter a concentração da solução inalterada. - Retire os estantes de coloração da solução de limpeza e lave as lamínulas com quantidades abundantes de água desionizada para remover o detergente.
- Secar os lamínulas com gás nitrogênio (aproximadamente 5 min por cremalheira) e, em seguida, colocar as lamínulas em um forno durante 6 h a 550 ° C para recozir.
NOTA: Este é um passo crucial que suaviza os recursos ásperos na superfície do vidro. - Coloque os lamínulas em um recipiente de plástico e mantenha-os afastados da poeira.
2. Fabricação de Blocos PDMS Micropatternados
- Misture o pré-polímero de polidimetilsiloxano (PDMS) e o agente de cura a uma proporção de 10: 1 (p / p) em um grande barco de pesagem de plástico e desgaseifique-o no vácuo durante 1 h com força de vácuo a 500 Torr ou menos.
NOTA: PDMS é um polímero de silicone transparente e inerte. Para obter o bloco PDMS desejado tHickness (0,5 cm), misture 55 g do pré-polímero com 5,5 g do agente de cura. - Coloque o mestre de silício que contenha múltiplas réplicas do mesmo microprocessador SU-8 em um grande barco de pesagem de plástico (10 cm de diâmetro de base) e despeje o PDMS desgaseificado. Em seguida, cure-o em um forno seco a 60 ° C durante a noite.
NOTA: Micropatterns são grandes o suficiente para serem vistos a olho nu. Cada padrão contém 8 microcanais (100 μm de largura x 40 μm de altura x 1 cm de comprimento) com espaçamento de 40 μm entre ( Figura 1A , 1B ). O molde de bolacha de silício composto por fotoresist SU-8 assado duro foi fabricado em uma instalação de nanofabricação 27 . Outras abordagens para a preparação do mestre incluem corrosão de ácido fluorídrico (HF), gravura a água a alta temperatura, xurografia e impressão 3D 28 , 29 , 30 , 31 . CommercAs fontes de preparação de silício de silicone também podem ser usadas. Os padrões para o dispositivo microfluídico foram projetados com um software de desenho (ver tabela de materiais). O arquivo original que contém o design do padrão é fornecido como um arquivo suplementar "Pattern Design.dwg", que pode ser fornecido diretamente ao fabricante. - Gentilmente, remova o PDMS do mestre de silício com as mãos. Marque os limites de cada micropatrone em retângulos usando um bisturi cirúrgico e uma régua. Em seguida, corte o PDMS em blocos.
- Punch 16 buracos (8 entradas e 8 saídas por bloco) em ambas as extremidades de cada microcanal com um punção de biópsia (1,0 mm de diâmetro do furo) conforme indicado na Figura 3B .
- Aplique fita sobre cada bloco PDMS para proteger os micropatrones contra danos e poeiras. Armazene-os em um recipiente de plástico.
3. Preparando pequenas vesículas unilamelares (SUVs)
NOTA: composição de bilayer de controle negativoÉ 99,5% molar de 1-palmitoil-2-oleoil- sn -glicero-3-fosfocolina (POPC) e 0,5% em moles de orto- Sulforodamina B-1-palmitoil-2-oleoil- sn -glicer-3-fosfoetanolamina ( o SRB- PAPA). Composição de teste bicamada é 92,0% em moles de POPC, de 0,5% molar o SRB-Pope, e 7,5% em moles de qualquer L-α-fosfatidilinositol-4-fosfato (PI4P) ou L-α-fosfatidilinositol-4,5-bifosfato (PI ( 4,5) P 2 ). Abaixo encontra-se o procedimento para a preparação de 92,0% em moles de POPC, de 0,5% molar o SRB-Pope, e 7,5 mol% de PI (4,5) P 2 SUVs molecular contendo. A síntese de o SRB-POPE utilizada neste estudo foi descrita anteriormente 20 .
- Calcule o volume de POPC, PI (4,5) P 2 e o SRB-POPE que precisa ser misturado, o que representa as seguintes quantidades totais: 2,22 mg de POPC, 0,26 mg de PI (4,5) P 2 , E 2,1 x 10 -5 mg de o SRB-POPE.
- Pipetar o volume calculado de POPC, PI (4,5) P 2 , <Em> o SRB-POPE em um único frasco de cintilação de vidro de 20 mL.
NOTA: as soluções de estoque POPC e o SRB-POPE vêm em uma solução de clorofórmio, enquanto que o estoque de PI (4,5) P 2 (e outros fosfoinositidos) vem em uma mistura de solventes com clorofórmio: metanol: água (20: 9: 1). Para obter precisão, molhe a ponta da pipeta com clorofórmio antes de usá-la. Por segurança, este passo deve ocorrer dentro de um exaustor químico. - Secar a mistura em uma corrente de gás nitrogênio dentro de um exaustor químico por 10 min ou até o solvente evaporar e uma fina película lipídica se forma no fundo do frasco para injectáveis.
- Desecar a mistura sob vácuo durante ≥ 3 h com uma força de vácuo de 10 mTorr para remover qualquer solvente orgânico residual.
NOTA: O tempo de dessecação de 3 h é suficiente para a escala de preparação SUV descrita neste protocolo, o que é adequado para 50 experimentos. Se for necessária uma escala maior de preparação SUV, pode ser realizada dessecação durante a noite. - Rehydrate the drFilme lipídico com 5 mL de tampão de corrida (HEPES 20 mM, NaCl 100 mM, pH 7,0) e colocá-lo em um banho ultra-sônico a uma freqüência de operação de 35 kHz durante 30 minutos à RT.
NOTA: misturar as quantidades de lípidos especificadas no passo 3.1 e adicionar 5 mL de tampão de corrida no passo 3.5 produz uma suspensão de vesícula a 0,5 mg / mL. Nesta fase, a suspensão de vesículas é uma mistura de vesículas unilamelares e multilamelares ( Figura 2B ). A solução aparecerá cor de rosa / roxo e relativamente turva. - Congelar-descongelar a suspensão de vesículas com nitrogênio líquido e banho-maria a 40 ° C para obter vesículas unilamelares. Repita o congelamento-descongelamento 10 vezes.
NOTA: (Opcional) Para garantir a ausência de vesículas não-unilamelares na suspensão, o passo de centrifugação pode ser aplicado 32 , 33 . - Extrude a suspensão de vesículas através de uma membrana de policarbonato gravada com pista de 0,10 μm usando uma extrusora de lipídios (verTabela de materiais) para enriquecer para SUVs. Repita a extrusão 10 vezes.
NOTA: Um tubo cônico de 15 mL pode ser usado para coletar as vesículas extrudidas. A solução deve estar vazia de turbidez nesta fase. O diâmetro SUV pode ser confirmado através de dispersão de luz dinâmica (DLS) ( Figura 2C ). SUVs são os mais adequados para formar SLBs 34 . - Cubra o tubo cônico com papel alumínio e guarde-o a 4 ° C até estar pronto para usar.
4. Montagem do dispositivo microfluídico
- Teste as entradas e saídas do bloco PDMS para bloquear, esguichando água desionizada através dos buracos usando uma garrafa de lavagem de água. Em seguida, secar o bloco PDMS com gás nitrogênio.
NOTA: Esta etapa também irá remover quaisquer partículas de poeira que possam ter sido presas dentro e / ou entre canais. Se necessário, lamínulas pré-limpas com esgotos com gás nitrogênio para remover partículas de poeira. - Coloque o bloco PDMS e o pré-limpadoLâmina de cobre (ver seção 1) dentro da câmara de amostra do sistema de plasma de oxigênio (ver tabela de materiais) para expor com plasma de oxigênio por 45 s com ajuste de energia a 75 Watts, velocidade de fluxo de oxigênio a 10 cm 3 / min e força de vácuo a 200 mTorr .
- Coloque a superfície padronizada do bloco PDMS em contato com o lamínula imediatamente após o tratamento com plasma de oxigênio. Pressione suavemente para remover as bolhas de ar em locais de contato.
- Coloque o dispositivo em uma placa quente nivelada a 100 ° C durante 3 min para aumentar a ligação.
- Use um toalhete sem molho ( p . Ex. Kimwipe) com 100% de etanol para remover partículas de poeira da parte superior (PDMS) e do fundo (vidro) do dispositivo. Em seguida, gravar o dispositivo em cima de um slide de microscópio de vidro.
NOTA: Não use uma quantidade excessiva de etanol e evite o etanol entrar nos canais de entrada e saída. Realizar esse passo enquanto o dispositivo ainda está quente é recomendado para garantir que o etanol se evapore imediatamente. Micr. De vidroOs slides de oscopia podem ser armazenados em solução de etanol a 100% para remover poeira e outros contaminantes.
5. Formando bolhas lipídicas suportadas (SLBs)
- Transferir 100 mL de PI (4,5) P 2 SUVs molecular contendo a partir do passo 3.8 para um tubo de microcentrífuga de 0,65 mL. Ajuste o pH da solução para ~ 3,2, adicionando 6,4 μL de ácido clorídrico 0,2 N.
NOTA: Confirme o pH da solução com um medidor de pH equipado com uma sonda de pH micro (ver tabela de materiais). - Pipetar 10 μL da solução de SUV ajustada em pH em cada canal através da entrada e aplicar pressão através da pipeta até a solução chegar à saída. Retire a ponta da pipeta e deixe-a em anexo ao dispositivo.
- Repita o passo acima para cada canal e, em seguida, incubar o dispositivo durante 10 minutos à RT.
NOTA: A injeção de vesículas em microcanais deve ser realizada imediatamente após a montagem do dispositivo. - Corte conjuntos de tubos de entrada e saídaCh 60 cm (tubo de entrada) e 8 cm (tubo de saída) longos, respectivamente.
NOTA: Cortando a tubagem na diagonal e criando uma borda afiada, facilita a inserção da tubulação nas entradas e nas saídas. O tubo de saída deve ter uma forma de arco. O comprimento da tubulação de entrada pode variar de acordo com a configuração do microscópio. O diâmetro interno da tubulação é de 0,05 cm. - Usando pinças, conecte o conjunto de tubos de saída ao dispositivo e, em seguida, fita o dispositivo em uma etapa de microscópio.
- Submergir uma extremidade da tubulação de entrada em 25 mL de tampão corrente contida em um tubo cônico e gravá-la para garantir que a tubulação esteja segura.
- Coloque o tubo cônico em um terreno mais alto (~ 20 cm) do que o dispositivo para empurrar a solução através dos microcanais via fluxo de gravidade; Um gatilho de laboratório pode ser usado para conseguir isso.
- Para cada tubo de entrada, use uma seringa para desenhar 1 mL de tampão corrente a partir da extremidade livre da tubulação. Remova a ponta da pipeta da entrada e insira aExtremidade livre da tubulação de entrada no dispositivo.
NOTA: Introduza uma queda do buffer de corrida na entrada para reduzir a probabilidade de uma bolha de ar ser introduzida no canal durante esta etapa. Depois que a tubulação de entrada estiver conectada ao dispositivo, use uma limpeza sem fiapos para remover o excesso de amortecedor. - Repita o passo acima para conectar todas as peças da tubulação de entrada ao dispositivo.
NOTA: O fluxo contínuo através dos canais ajuda a remover o excesso de vesículas e equilibrar a bicamada às condições experimentais. - Abra o software de controle do microscópio (veja a tabela de materiais). No painel esquerdo, clique na guia "Microscópio" e escolha o objetivo "10X".
- Clique nos ícones de imagem "Live" e "Alexa 568" na barra de ferramentas. Usando os botões de ajuste fino e de curso, concentre-se nos microcanais.
- Analise o dispositivo para verificar a qualidade dos SLBs e dos canais ( Figura 8 ). Então,Clique no ícone de imagem "FL Shutter Closed" na barra de ferramentas.
- Clique na guia "Aquisição" e, em "Ajustes básicos", selecione "Tempo de exposição". Defina o tempo de exposição para "200 ms".
- No painel esquerdo, clique em "Aquisição multidimensional" e, no menu de filtros, selecione o canal vermelho (marcado como "Alexa 568"). Em seguida, clique no menu "lapso de tempo", defina o intervalo de tempo para 5 min, duração até 30 min, e clique em "Iniciar".
NOTA: Com base na duração (30 min) e na taxa de fluxo (~ 1,0 μL / min), 30 μL de buffer de corrida são utilizados para equilibrar o SLB dentro de um canal, ou seja , são utilizados 240 μL de buffer de operação para todos os 8 canais. - Selecione a ferramenta "Círculo" na guia "Medir" e desenhe um círculo em qualquer canal. Clique com o botão direito enquanto o círculo é selecionado e escolha "Propriedades". Na guia "Perfil", marque "todo o T" para ver oIntensidade de fluorescência em função do tempo.
- Certifique-se de que esta curva alcance um planalto, o que indica equilíbrio, antes de prosseguir para o próximo passo.
- Abaixe a solução tampão em um solo ponto como o dispositivo para parar o fluxo.
- Salve o arquivo de lapso de tempo.
6. Teste de PLC-δ1 interacção com o domínio PH de PI (4,5) P 2 SLBS molecular contendo
- Prepare diluições do domínio PH utilizando o tampão corrente como diluente.
NOTA: Uma vez que existem oito canais dentro do dispositivo, use pelo menos dois deles para controles em branco. Escolha as extremidades distantes de cada lado e use os canais restantes para diluições de proteínas. As seguintes concentrações de domínio de PH foram testadas: 0,10, 0,25, 0,50, 1,00 e 2,50 μM. Aproximadamente 200 μL de cada diluição foi suficiente para alcançar o equilíbrio dentro de 30 min. - Um de cada vez, separe cada tubo de saída e aplique 200 μL de cada diluição de proteína emO canal de saída usando uma pipeta. Não aplique qualquer pressão, deixe a gravidade fazer o trabalho. Retire a ponta da pipeta e deixe-a em anexo ao dispositivo microfluídico.
- Repita o passo acima para cada canal e certifique-se de que as bolhas de ar não sejam introduzidas nos canais durante este processo.
- Abaixe o tubo de entrada para um solo abaixo do dispositivo microfluídico para começar a fluir a proteína através dos microcanais. Fixe a extremidade livre da tubulação para um recipiente de lixo. Flute as diluições de proteínas durante 30 min.
NOTA: Isso irá reverter o fluxo e permitir que a proteína seja introduzida nos canais. O tempo de equilíbrio e o volume das diluições de proteínas necessárias dependerão da afinidade da interação. - No painel esquerdo do software, no separador "Time Lapse", clique em "Iniciar" para iniciar a imagem novamente.
- Repita o passo 5.15 para garantir que o equilíbrio seja alcançado. Quando a experiência estiver completa, salve o lapso de tempoArquivo.
7. Avaliação da Fluidez da Membrana
NOTA: Os experimentos de recuperação de fluorescência após Photobleaching (FRAP) devem ser realizados com cada novo lote de SUVs e lamínulas de vidro limpo para garantir que os SLBs sejam fluidos.
- Siga o procedimento para a limpeza de lamínulas de vidro (1.1-1.6), fabricação de blocos de PDMS micropatternados (2.1-2.5), preparando SUVs (3.1-3.8), montando o dispositivo microfluídico (4.1-4.5) e formando SLBs (5.1-5.17) como anteriormente Descrito.
- Focalize o microscópio na bicamada, ajuste o tempo de exposição para 200 ms e o binning para 1.
- Photo-bleach um ponto circular usando um raio laser de 532 nm, 2 mW (raio de 13 μM). Imediatamente após o fotobleaching, comece a capturar uma série de imagens a cada 3 s para as primeiras 45 s, seguido de um intervalo de 30 s pelo restante do tempo (15 min de duração total). Uma vez concluída a aquisição de dados, salve o arquivo de lapso de tempo.
- Selecione o branqueado aRea usando a ferramenta de desenho de círculo para extrair valores de intensidade de fluorescência em função do tempo. Além disso, selecione mais duas áreas próximas, uma correspondente a uma região não branqueada e uma correspondente a uma região sem SLBs.
- Calcule a recuperação de fluorescência ( y ) usando a seguinte equação:
NOTA: Aqui F t representa a intensidade da região branqueada como função do tempo, F i representa a intensidade de fluorescência antes do branqueamento (use "1" como um valor normalizado neste caso); F 0 é a intensidade do fundo. - Trace a recuperação de fluorescência (eixo dos e-e) em função do tempo (eixo dos x) para gerar uma curva de FRAP. Em seguida, ajuste os dados a uma única função exponencial da seguinte maneira,
NOTA: Aqui A representa a fração móvel e
- Use o t 1/2 para calcular a constante de difusão ( D ):
NOTA: Aqui R representa o raio do raio laser (13 μm). A constante de difusão para uma bicamada fluida deve ser ≥1,0 μm 2 / s.
8. Processando dados
NOTA: A rotina da análise de dados dependerá do microscópio, do software de processamento de imagem e do software de ajuste de curva que esteja sendo usado.
- Abra os arquivos de lapso de tempo de antes (a partir do passo 5.17) e depois (a partir da etapa 6.6) titulando o domínio PH. Vá para o último quadro de cada arquivo de lapso de tempo e faça uma varredura de linha em todos os microcanais para obter o fluorescDados de intensidade de intensidade em função da distância em pixels ( Figura 6A ). Transfira os dados para um software de planilha.
- Para cada microcanal (antes e depois da adição do domínio PH), amostra alguns dados dentro do canal e ambos os lados do canal que representam a linha de base ( Figura 7A ).
NOTA: A intensidade de fluorescência do canal em branco deve ter permanecido inalterada. Todos os outros canais são normalizados para o canal em branco, por isso é crucial ter dois canais em branco e garantir que suas intensidades de fluorescência permaneçam consistentes umas com as outras. - Aplique a fórmula abaixo para normalizar os dados para o canal em branco; Um cálculo de amostra é fornecido na Figura 7B .
NOTA: Aqui a proteína ΔF representa a intensidade de fluorescência subtraída de fundo do canal de proteína, Δ; F em branco representa a intensidade de fluorescência subtraída de fundo do canal em branco, pré e posterior referem-se a etapas de titulação de proteínas anteriores e posteriores, e α representa o fator de correção que é a proporção das intensidades de fluorescência do canal de proteína e do canal em branco ([ F proteína / F em branco ] pré ) em um passo de titulação pré-proteína. Uma vez que a intensidade de fluorescência diminui em função da concentração do domínio PH, os dados normalizados serão negativos. - Usando um software de ajuste de curva (veja Tabela de Materiais ), trace a fluorescência normalizada como uma função da concentração do domínio PH e se encaixa em uma isoterma de Langmuir ( Figura 6C ):
NOTA: Aqui ΔF representa a mudança na intensidade de fluorescência em relação à mudança máxima em fluoIntensidade de incisão quando está presente uma concentração de saturação de proteína ( ΔF max ), enquanto que o aplicativo K d representa a constante de dissociação aparente, que é igual à concentração de proteína em massa ( [PLC-δ1 PH] ), na qual 50% de cobertura ( Complexo ligado à membrana). Esta é uma medida de ligação baseada em equilíbrio para que os dados normalizados sejam adequados a uma isoterma de Langmuir simples para extrair um parâmetro experimental aparente K d, app . Com base no software de montagem , o aplicativo K d, aplicativo para PLC-δ1 PH-PI (4,5) P 2 é de 0,39 ± 0,05 μM ( Figura 6B ).
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Representative Results
Utilizou-se o ensaio de modulação pH para estudar o PLC-δ1 PH domínio de PI (4,5) P 2 interacção dentro de um microdispositivo de PIP-on-a-chip (Figura 1). Através de um protocolo detalhado, demonstramos como preparar e montar componentes de dispositivos microfluídicos, fazer pequenas vesículas unilamelares (SUVs) ( Figura 2 ), formar SLBs dentro de um dispositivo ( Figura 3 ) e testar a ligação de proteínas aos SLB contendo PIP. Um diagrama de fluxo de um experimento de ligação SLB típico é representado na Figura 4 . O princípio do ensaio de modulação pH é ilustrado na Figura 5, utilizando o domínio PH-PI (4,5) P 2 de ligação como um exemplo. Os resultados obtidos a partir deste estudo sugerem que o domínio PH liga-se a PI (4,5) P 2 SLBS molecular contendo. Mais especificamente, observamos que após a ligação, o pH local tornou-se mais básico. este alteração local do pH foi detectada pelo o SRB-PAPA fluorescente sonda presente dentro SLBS, o qual foi, em seguida, temperada em conformidade (Figura 6A, 6C). A extinção foi dependente da concentração e saturable, de modo que ajustar os dados para uma isoterma de Langmuir resultou em um aplicativo K d, de 0,39 ± 0,05 μM ( Figura 6B , 6D ). O domínio PH mostrou seletividade em relação ao PI (4,5) P 2, uma vez que não se observou ligação a POPC (lipímetro zwitterionic) e ligação mais fraca para SLBs contendo PI4P ( K d, app = 1,02 ± 0,20 μM) ( Figura 6B ). Um cálculo de amostra é incluído para mostrar como os dados de fluorescência são processados ( Figura 7 ). Na Figura 8 , séries de imagens de microcanais são apresentadas para fornecer pistas visuais na determinação da qualidade dos SLBs e dos microcanais.
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Figura 1: dispositivo microfluídico PIP-on-a-chip para estudar interações proteína-PIP. ( A ) O dispositivo microfluídico tem 8 microcanais com 8 entradas e 8 tomadas. Soluções coloridas foram fluídas para tornar os canais visíveis nesta imagem. O dispositivo possui 2,0 cm de largura (x), 0,5 cm de altura (y) e 3,0 cm de comprimento (z). ( B ) O piso dos microcanais é de vidro, enquanto as paredes e os tetos são constituídos por polidimetilsiloxano (PDMS). Cada microcanal tem 100 μm de largura, 40 μm de altura e 1 cm de comprimento. O espaçamento entre dois microcanais adjacentes é de 40 μm. Bicemezes lipídicas (SLBs) suportadas são formadas no topo da superfície do vidro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Preparação de pequenas vesículas unilamelares (SUV) e estudos de controle de qualidade. ( A ) Componentes lipídicos utilizados na fabricação de vesículas: orto -Sulforodamina B-POPE ( o SRB-POPE), L-a-fosfatidilinositol-4-fosfato (PI4P), L-a-fosfatidilinositol-4,5-bisfosfato ( PI (4,5) P 2), e 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC). ( B ) Tipos de vesículas lipídicas: SUV, vesícula unilamelar grande (LUV), vesícula unilamelar gigante (GUV) e vesícula multilamelar (MLV). SUVs são mais adequados para a preparação de SLBs 34 . ( C ) Confirmação de dispersão de luz dinâmica (DLS) no tamanho da extrusão pós-lipídica de vesículas (através de filtro de 0,1 μm). O raio hidrodinâmico (Rh) de 53,9 nm confirma que o m Ean da distribuição do tamanho da vesícula é ~ 100 nm. Os resultados representam a medição a partir de PI (4,5) P 2 SUVs -containing. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Formação SLB em um suporte de vidro. ( A ) As vesículas da composição lipídica desejada são preparadas e depois fluem através de microcanais. As vesículas são adsorvidas na superfície do vidro e deformadas. Uma vez que uma cobertura de superfície crítica é alcançada, as vesículas se rompem espontaneamente para formar SLBs. Adaptado das referências 35 , 36 . ( B ) SLBs dentro de um dispositivo sob um objetivo 10X é mostrado. O conjunto de filtros Alexa 568 (excitação / emissão a 576/603 nm) é usado.Ource.jove.com/files/ftp_upload/55869/55869fig3large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.
Figura 4: Diagrama de fluxo de uma experiência típica de ligação SLB. Os componentes do dispositivo microfluídico, ou seja, o bloqueio PDMS padronizado e os lamínulas limpas, são tratados com plasma de oxigênio para tornar as superfícies hidrófilas e depois montadas. SUVs são fluidos através de microcanais para formar SLBs. As vesículas em excesso são removidas e os SLBs são equilibrados em condições experimentais fluindo uma solução tampão corrente. Então, as diluições de proteínas são fluídas através de microcanais. Finalmente, os dados de intensidade de fluorescência são analisados, normalizados e plotados em função da concentração de proteína. Os dados normalizados são adequados a uma função para extrair uma constante de dissociação aparente ( K d, app ) vaLue. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Princípios da detecção baseada em modulação de pH. ( A ) Estrutura de cristal de raio-X do domínio de PLC-δ1 PH em complexo com PI (4,5) Grupo de P 2 cabeça inositol 1,4,5-trisphosphate (Ins (1,4,5) P 3 ) (PDB ID: 1MAI) 37 . (B) O O sonda SRB-PAPA é altamente fluorescente a um pH baixo e extinguiu-se a pH elevado com um pKa de 6,7 dentro de 7,5 mol% de PI (4,5) P 2 contendo SLBS como indicado na curva de titulação de pH. ( C ) O domínio de PH utilizado neste estudo tem um ponto isoelétrico (pI) de 8,4, portanto, no pH experimental (7,0), a proteína é carregada positivamente. Levando um positivo líquido cHarge, a proteína atrai OH - iões. Quando o domínio PH liga-se a PI (4,5) P 2 contendo SLBS, que traz o OH - iões para a superfície da membrana, o potencial interfacial é modulado que por sua vez muda o estado de protonação do SRB-Pope, e a sua fluorescência É extinto em função dependente da concentração de domínio PH. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: PLC-δ1 ligação à membrana PH monitorada por modulação de pH. ( A ) A visão dos microcanais antes e depois de adicionar o domínio PH nas concentrações indicadas. (B) A comparação das afinidades para com a POPC, PI4P, e PI (4,5) P 2 SLBS molecular contendo. Ligação do domínio PH para 7,5 mol% de PI (4,5) P 2 SLBS molecular contendo produziu um K d, aplicação de 0,39 ± 0,05 uM. Observou-se ligação mais fraca com valores de SLBs contendo PI4P com 7,5% molar ( K d, aplicação de 1,02 ± 0,20 μM) e não foi observada ligação para SLB de POPC puro. As barras de erro indicam SEM (n = 3). O teste t de duas caudas foi usado para comparar as afinidades entre PI4P e PI (4,5) P 2 (* p = 0,0396). ( C ) As intensidades de fluorescência da varredura de linha através de microcanais são plotadas como uma função da distância em pixels para experiências de ligação POPC, PI4P e PI (4,5) P 2 . ( D ) Os dados de ligação padronizados e médios de POPC, PI4P e PI (4,5) P 2 são plotados como uma função da concentração do domínio PH do PLC-δ1 e, em seguida, se encaixam em uma isoterma de Langmuir para extrair o aplicativo K d . Veja a equação no passo 8.4 para obter detalhes."Target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Cálculo de amostra para processamento de dados. ( A ) Antes (preto) e após dados de varredura de linha de titulação de proteína (vermelha) para vazio (sem proteína) e canal de proteína, onde os dados de intensidade de fluorescência são apresentados como função da distância em pixels. As áreas sombreadas representam as regiões que foram utilizadas para extrair dados para os cálculos. Os dados de intensidade de fluorescência basais são extraídos logo antes e depois de cada canal. ( B ) Os dados são extraídos para canais em branco e proteína, tanto antes quanto depois da titulação de proteínas. As médias são tomadas para a linha de base e dentro de um canal de dados de fluorescência. Após a subtração de linha de base, os dados de fluorescência são normalizados para o canal em branco. Veja a equação no passo 8.3 para obter detalhes.
Figura 8: Avaliação da integridade de SLBs e microcanais. ( A ) Uma imagem que ilustra SLBs e microcanais de alta qualidade. ( B ) Fusão incompleta. ( C ) Microcanais fundidos. ( D ) Partícula de poeira presa dentro de um microcanal. ( E ) Bolhas de ar presas nos microcanais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Arquivo suplementar 1: Pattern_Design.dwgEm branco "> Clique aqui para baixar o arquivo.
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Discussion
Cada variante PIP, embora com baixas concentrações, está presente na superfície citosólica de organelas específicas, onde contribuem para o estabelecimento de uma composição física única e especificidade funcional da membrana organelar 1 . Um dos usos mais importantes dos PIPs é como uma plataforma de encaixe específica para a multiplicidade de proteínas que requerem localização e / ou ativação subcelular específica 6 , 7 . Devido ao seu papel na fisiologia e doença celular, é importante a capacidade de estudar as interações proteína-PIP in vitro , em um contexto fisiologicamente relevante. O formato de ensaio descrito aqui permite considerar interações proteína-PIP no contexto de uma bicamada lipídica fluida, na presença de uma mistura de fosfolípidos, com a apresentação normal do grupo de cabeça polar e cadeias de acilo gorduroso de comprimento natural.
Este ensaio, em combinaçãoCom a modulação do pH como seu sistema de detecção e SLBs como um sistema de membrana modelo configurado em uma plataforma microfluídica, oferece vantagens únicas em comparação com outras técnicas de ligação à membrana. Em primeiro lugar, a plataforma microfluídica economiza materiais devido aos requisitos de baixo volume tanto para proteínas quanto para lipídios utilizados (volume geral do canal de 40 nL, área de superfície SLB de 1,0 mm 2 ). Além disso, podem ser utilizadas composições lipídicas fisiologicamente relevantes, mantendo a fluidez bidimensional da membrana (≥1,0 μm 2 / s) 28 , 38 . O sistema de detecção fornece uma relação sinal / ruído melhorada em comparação com o monitoramento de ITC, SPR e microbalanças de cristal de quartzo com dissipação (QCM-D), o que permite testar não apenas interações proteína-membrana, mas interações de íons, moléculas pequenas, péptido-membrana, como Bem 19 , 20 , 39 , 40 . Além disso, a sonda fluorescente sensível ao pH é altamente estável e não se fotobleca nas condições experimentais testadas 19 , 20 , 41 . Outra vantagem desta plataforma é a capacidade de observar as superfícies da membrana visualmente. Certas interações podem induzir a formação de microdomínios lipídicos e / ou afetar a fluidez da membrana, que podem ser visualizadas diretamente e / ou testadas por meio de recuperação de fluorescência após fotoblanqueamento (FRAP), respectivamente 42 . O ensaio descrito aqui não exige nenhuma instrumentação cara além de um microscópio de fluorescência. Finalmente, e o mais importante, avaliar as interações de membrana na ausência de marcação de ligando / receptor faz com que o teste PIP-on-a-chip seja o método preferido sobre os tradicionais.
Embora o ensaio PIP-on-a-chip seja uma técnica poderosa, as proteínas da membrana periférica podem diferirNa composição global de resíduos catiônicos e aniónicos e sua distribuição dentro / em torno do site de ligação, o que cria certos desafios. Algumas proteínas têm locais de ligação a PIP compostos por muitos resíduos básicos, enquanto outros têm apenas alguns. Portanto, a relação H + / OH - no local de ligação será diferente, assim como a magnitude da alteração no pH local após a ligação. A estequiometria da interação e se a ligação PIP está ou não estabilizada por interações com outros lipídios ainda complica o caso. Consequentemente, o pI de uma proteína, especialmente para uma proteína grande, pode não ser o único indicador da mudança esperada de fluorescência. Enquanto algumas interações proteína-PIP resultarão em grandes mudanças de fluorescência, o resto pode resultar em pequenas mudanças de fluorescência. No último caso, pelo menos duas ações podem ser tomadas para aumentar a relação sinal / ruído: 1) usando níveis PIP maiores na bicamada para aumentar o número de proteínas recruited à superfície, isto é, aumentando o número de recrutados OH - e o número de moléculas de SRB-PAPA O temperados; 2) o aumento dos níveis do SRB-papa para melhorar a relação sinal-ruído.
Mesmo que a plataforma atual ofereça muitas vantagens para o estudo de proteínas da membrana periférica, tem alguns desafios para o estudo das proteínas transmembranares. Devido à proximidade do suporte de vidro SLB (a camada de água é de cerca de 1-2 nm dependendo da composição lipídica), a interação transmembrana de proteína-vidro pode promover a desnaturação de proteínas, levar a perda de função e imobilização 34 , 43 , 44 , 45 . Apesar de mais envolvidos, uma variedade de abordagens foram desenvolvidas para superar esses desafios, como a modificação de superfície do suporte de vidro para fornecer almofada de polímero ou incluindo lipopoligo(Por exemplo, lipídios PEGilados) dentro da bicamada para aumentar a distância de suporte de vidro SLB 34 , 46 , 47 , 48 .
Formar SLB de alta qualidade é o aspecto mais crítico do ensaio PIP-on-a-chip ( Figura 8A ). É recomendável usar lâminas limpas e SUVs frescos para assegurar a reprodutibilidade. Devido à presença de lípidos aniónicos, tais como PI (4,5) P 2, SUVs são negativamente carregada, o que reduz a eficiência ruptura SUV e afectar a fluidez das membranas (Figura 8B). Portanto, o ajuste do pH da solução SUV é crucial para protonar os fosfatos do grupo PI (4,5) P 2 e diminuir a repulsão eletrostática com o vidro para aumentar a eficiência de ruptura 49 , 50 . SUVs que não contêm lions aniónicosIpids, não requer nenhum ajuste de pH. Além disso, os SUVs devem ser injetados em canais logo após o tratamento e ligação de plasma de oxigênio, enquanto a superfície de cobertura de vidro ainda é hidrofílica, o que é necessário para a formação de SLB. Além da qualidade SLB, as partículas de poeira representam outro problema. Durante o processo de fabricação do dispositivo, uma partícula de poeira presa entre os canais pode causar a fusão do canal, enquanto que uma partícula de poeira presa dentro de um canal pode danificar o SLB e / ou reduzir a velocidade do fluxo da solução ( Figura 8C, 8D ). A área de trabalho deve ser limpa periodicamente para remover a poeira. Da mesma forma, a exposição de uma bolha de ar a um canal deve ser evitada em qualquer passo, o que, de outra forma, irá danificar o SLB de forma irreversível ( Figura 8E ).
Outro parâmetro a considerar ao planejar um ensaio PIP-on-a-chip é o buffer de armazenamento de proteínas. Se usado em altas concentrações, componentes individuais (Agentes estabilizantes, agentes redutores, sais, agentes antimicrobianos, reagentes quelantes, etc. ) podem afetar a integridade da fluorescência e / ou SLB. Portanto, o buffer de armazenamento deve ser titulado para testar seu efeito. Se um efeito for observado, os SLBs também devem ser equilibrados nas condições do buffer de armazenamento antes de avaliar a proteína para evitar uma deriva na fluorescência. Considerando que se trata de um ensaio baseado em modulação de pH, se possível, a proteína purificada também deve conter o mesmo componente tampão que o tampão de corrida (neste caso, HEPES 20 mM a pH 7,0) para minimizar a deriva na fluorescência causada pela falta de correspondência do tampão.
Em conclusão, demonstramos que o teste de modulação do pH pode ser usado com sucesso para investigar as interações proteína-PIP. Embora a ênfase tenha sido em PIPs, esta plataforma pode ser usada para testar interações com sistemas de membrana mais complexos que incluem outros lipídios fisiologicamente relevantes, como fosfatidilseriNe, fosfatidiletanolamina, ácido fosfatídico e colesterol, entre outros 28 , 39 , 42 , 51 . Além das proteínas celulares, esta plataforma de ensaio também pode ser benéfica para aqueles que estudam agentes patogênicos humanos. Por exemplo, as proteínas codificadas por vírus e bactérias demonstraram interagir com membranas celulares e algumas especificamente com PIPs 52 , 53 , 54 , 55 , 56 . Conseqüentemente, o ensaio PIP-on-a-chip pode fornecer um meio para descobrir e caracterizar inibidores de pequenas moléculas das interações proteína-PIP.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
DS e CEC foram apoiados, em parte, pela concessão AI053531 (NIAID, NIH); SS e PSC foram apoiados pela concessão N00014-14-1-0792 (ONR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coverslip | |||
| Glass Coverslips: Rectangles | Fisher Scientific | 12-544B | 22 x 40 x 0.16 - 0.19 mm, No. 1 1/2; Borosilicate Glass |
| 7X Cleaning Solution | MP Biomedicals | 976670 | Detergent |
| PYREX Crystallizing Dish | Corning | 3140-190 | Borosilicate glass dish with a flat bottom; Diameter x Height (190 x 100 mm); Distributor: VWR (89090-700) |
| Sentry Xpress 2.0 | Paragon Industries | SC-2 | Kiln |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS | |||
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 4019862 | Polydimethylsiloxane (PDMS); Distributor: Ellsworth Adhesives |
| PYREX Desiccator | VWR | 89134-402 | Vacuum Rated |
| Biopsy punch | Harris | 15110-10 | Harris Uni-Core; 1.0 mm diameter; Miltex Biopsy Punch with Plunger (Cat. No. 15110-10) can be used as an alternative |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Device | |||
| Plasma Cleaning System | PlasmaEtch | PE25-JW | 2-stage Direct Drive Oil Vacuum Pump, O2 service (Krytox Charged) |
| Digital Hot Plate | Benchmark | H3760-H | Purchased through Denville Scientific (Cat. No. 1005640) |
| Frosted Micro Slides | VWR | 48312-003 | Frosted, Selected, and Precleaned; Made of Swiss Glass; Thickness: 1 mm; Dimensions: 75 x 25 mm; GR 144 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mold | |||
| AutoCAD | Autodesk | v.2016 | Drafting software for the photomask design |
| Photomask | CAD/Art Services | N/A | Design with black background and clear features was printed at 20k dpi resolution on a transparent mask (5 x 7 in) by CAD/Art Services |
| Silicone Wafers | University Wafer | 1575 | Prime Grade, Single Side Polished; 100 mm (4 inch) Diameter; 525 um Thickness |
| SU-8 50 | MicroChem Corp. | N/A | Negative Tone Photoresist; Penn State Nanofabrication Facility Property |
| SU-8 Developer | MicroChem Corp. | N/A | Penn State Nanofabrication Facility Property |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SUV | |||
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850457C | POPC |
| L-α-phosphatidylinositol-4-phosphate | Avanti Polar Lipids | 840045X | PI4P |
| L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate | Avanti Polar Lipids | 840046X | PI(4,5)P2 |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine | Avanti Polar Lipids | 850757C | POPE; Required for the synthesis of oSRB-POPE |
| Lissamine Rhodamine B Sulfonyl Chloride (mixed isomers) | ThermoFisher Scientific | L-20 | Required for the synthesis of oSRB-POPE |
| pH Sensitive Fluorescent Lipid Probe (oSRB-POPE) | In-house | N/A | In-house Synthesis (Huang D. et al. 2013) |
| Glass Scintillation Vial | VWR | 66022-065 | 20 mL volume capacity |
| Aquasonic 250D | VWR | N/A | Ultrasonic Water Bath |
| Nuclepore Track-Etched Membranes | Whatman | 110605 | Polycarbonate Membrane; Diameter: 25 mm; Pore Size: 0.1 um; Distributor: Sigma-Aldrich |
| Chloroform | VWR | CX1054-6 | HPLC grade |
| LIPEX Extruder | Transferra Nanosciences | T.001 | LIPEX 10 mL Thermobarrel Extruder |
| Viscotek 802 DLS | Malvern Instruments | N/A | Dynamic Light Scattering; Penn State X-Ray Crystallography Facility Property |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Data Analysis | |||
| GraphPad Prism | GraphPad Software | v.6 | Curve-fitting software for data analysis |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | |||
| Axiovert 200M Epifluorescence Microscope | Carl Zeiss Microscopy | N/A | Microscope |
| AxioCam MRm Camera | Carl Zeiss Microscopy | N/A | Camera |
| X-Cite 120 | Excelitas Technologies | N/A | Light Source |
| Alexa 568 Filter Set | Carl Zeiss Microscopy | N/A | Ex/Em 576/603 nm |
| AxioVision LE64 v.4.9.1.0 Software | Carl Zeiss Microscopy | N/A | Image Processing Software |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other | |||
| Tips | VWR | 10034-132 | 200 uL pipette tips; Thin and smooth tip for applying the protein solution into the microfluidic channel |
| Tips | VWR | 53509-070 | 10 uL pipette tips; Thin and smooth tip for applying the vesicle solution into the microfluidic channel |
| Orion Star A321 pH meter | Thermo Scientific | STARA3210 | pH meter |
| Orion micro pH probe | Thermo Scientific | 8220BNWP | micro pH probe |
| N-(2-Hydroxyethyl)-Piperazine-N'-(2-Ethanesulfonic Acid) | VWR | VWRB30487 | HEPES, Free Acid |
| Sodium Chloride | VWR | BDH8014-2.5KGR | NaCl |
| Tubing | Allied Wire & Cable | TFT-200-24 N | Internal Diameter: 0.020-0.026 inches (0.051-0.066 cm); Wall Thickness: 0.010 inches (0.025 cm); Flexible Polytetrafluoroethylene Thin-Wall Tubing; Natural Color |
| Nitrogen Gas - Industrial | Praxair | N/A | Local Provider |
| Oxygen Gas - Industrial | Praxair | N/A | Local Provider |
| Liquid Nitrogen | Praxair | N/A | Local Provider |
References
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