Summary
Polimeri semiflessibili visualizzano proprietà meccaniche uniche che sono ampiamente applicato da sistemi viventi. Tuttavia, gli studi sistematici sui biopolimeri sono limitati poiché proprietà quali la rigidità del polimero sono inaccessibili. Questo manoscritto descrive come questa limitazione è aggirata mediante nanotubi di DNA programmabili, permettendo studi sperimentali sull'impatto della rigidità del filamento.
Abstract
Proprietà meccaniche del complessa, a base di polimeri materia soffice, come cellule o reti di biopolimero, può essere inteso in né la cornice classica di polimeri flessibili né di barre rigide. Filamenti sottostante rimangono tese a causa della loro rigidità non vanishing di spina dorsale, che è quantificato tramite la lunghezza di persistenza (lp), ma sono anche soggetti a forti fluttuazioni termiche. Loro rigidità alla flessione finiti conduce delle reti di massa, permettendo la formazione di ponteggi stabile alle frazioni di volume basso fornendo al contempo maglie di grandi dimensioni meccaniche collettivo unico, non banale. Questo principio di fondo è prevalente in natura (ad esempio, in cellule o tessuti), riducendo al minimo l'alto contenuto molecolare e facilitando in tal modo diffusivo o trasporto attivo. Grazie alla loro implicazioni biologiche e potenziali applicazioni tecnologiche in idrogel biocompatibile, polimeri semiflessibili sono state oggetto Studio considerevole. Tuttavia, le indagini comprensibile è rimasto impegnative poiché hanno contato su polimeri naturali, quali i filamenti dell'actina, che non sono liberamente sintonizzabili. Nonostante queste limitazioni e a causa della mancanza di polimeri sintetici, meccanicamente sintonizzabile e semiflessibili, filamenti di actina sono stati stabiliti come sistema modello comune. Una limitazione importante è che la quantità centrale lp non può essere liberamente ottimizzato per studiare il suo impatto sulle strutture macroscopiche alla rinfusa. Questa limitazione è stato risolto impiegando strutturalmente programmabili nanotubi di DNA, attivazione controllata alterazione della rigidezza del filamento. Essi sono formati attraverso progetti basati su mattonelle, dove un insieme discreto di fili parzialmente complementari si ibridano in una struttura ad anello con una discreta circonferenza. Questi anelli presentano estremità appiccicosa, consentendo la polimerizzazione efficace in filamenti alcuni micron di lunghezza e visualizzare simile cinetica di polimerizzazione come biopolimeri naturali. A causa della loro meccanica programmabile, questi tubi sono strumenti versatili, romanzo per studiare l'impatto di lp sulla singola molecola così come la scala di massa. In contrasto con i filamenti dell'actina, rimangono stabili nel corso di settimane, senza degenerazione notevole, e la loro gestione è relativamente semplice.
Introduction
A causa di comportamenti complessi abilitati di loro proprietà meccaniche uniche, polimeri semiflessibili sono elementi costitutivi fondamentali della materia vivente. In contrasto con polimeri flessibili, polimeri semiflessibili adottano una configurazione tesa a causa della loro rigidità di spina dorsale non vanishing pur rimanendo soggetti a forti fluttuazioni termiche1. Così, modelli puramente stocastici non possono applicarsi ai loro comportamenti, come con gli estremi di polimeri completamente flessibile o rigide. La cosiddetta catena di vite senza fine-come modello2,3,4 è stato sviluppato per quantificare questa rigidità tramite lp, che è la costante di decadimento della correlazione tangente-tangente lungo il filamento4. Se lp è paragonabile alla lunghezza del contorno (l.c) del filamento, il polimero è considerato semiflessibili1. Loro organizzazione in reti o fasci analoga ai poli di una tenda, si stabilizza l'intero sistema collettivo alle frazioni di volume basso, che conduce a viscoelastico insolite proprietà5,6,7, 8,9. Queste strutture forniscono alta elasticità al grande maglia dimensioni10, mantenendo l'integrità meccanica pur facilitando diffusivo e processi di trasporto attivo. Questa proprietà è particolarmente adatta per sistemi biologici come il citoscheletro o la matrice extracellulare, ma è anche ampiamente usato in alimento ingegneria1,11,12.
Andando oltre il loro significato per la materia vivente, è fondamentale esaminare completamente le proprietà fisiche di queste strutture al fine di avere gli strumenti per sviluppare materiali biomimetici o idrogel romanzo. In termini di polimeri semiflessibili, ciò implica la determinazione sistematica delle proprietà collettiva delle reti derivanti dalle proprietà del singolo filamento come lp e lo sviluppo di un quadro teorico descrittivo. In studi pionieristici, l'actina cellulare biopolimero nasce come sistema modello per polimeri semiflessibili e ancora ampiamente è considerato il gold standard5,13,14,15 , 16 , 17. Tuttavia, gli studi esaustivi sono limitati con questo sistema poiché vengono associati per le proprietà intrinseche di questa proteina. Vari approcci teorici hanno mirato a costruire una descrizione dei comportamenti meccanici non banale a livello di singolo-filamento e hanno portato a in particolare diverse stime scala per la dipendenza del modulo di taglio lineare elastico altopiano, G 0 (vale a dire, il "elasticità" della rete), per quanto riguarda la concentrazione (c) e lp6,7,13,14, 15,18,19,20,21,22,23. Mentre la scala di concentrazione è facilmente accessibile in esperimenti con l'actina-basato o altri sistemi di modello e previsioni teoriche sono state rigorosamente verificati13,16,24, 25, la scala per quanto riguarda lp è rimasta sperimentalmente inaccessibile. Questo, tuttavia, è una limitazione importante poiché lp è anche una variabile indipendente che è la definizione quantità di polimeri semiflessibili.
Questa centrale, naturale limitazione imposta dalla fissa lp di actina o altri polimeri derivati biologicamente come il collagene è stato recentemente risolto impiegando tubi di DNA basato su mattonelle, che sono sintonizzabili in loro proprietà meccaniche 9 , 26 , 27 , 28. lievi variazioni nelle architetture dei tubi (per esempio, diverso numero di costituenti del DNA strands all'interno dell'anello di unità) resa valori distinti per lp, che può essere valutato tramite microscopia a fluorescenza, analizzando un tubo fluttuante o valutando le configurazioni curve dei tubi aderiti diversi, come descritto in precedenza9,28. Queste analisi hanno rivelato che i valori dip ldelle popolazioni differenti del tubo variano nel corso di più di un ordine di grandezza e che le tecniche di valutazione differenti producono risultati coerenti9,28.
Sorprendentemente, il ridimensionamento complessivo del taglio lineare elastico altopiano modulo G0 per quanto riguarda la concentrazione e lp è stato segnalato per essere in contrasto con tutti i precedenti approcci teorici 9, in particolare dimostrando una molto più forte del previsto dipendenza lp. Questi risultati sottolineano il valore di un nuovo sistema di modello per studiare le proprietà centrale di polimeri semiflessibili. Che impiegano n-tubi di helix DNA drammaticamente amplia l'ambito di queste indagini. Non solo può lp essere variato liberamente senza cambiare il materiale di base, ma la natura intrinseca programmabile del DNA può attivare l'esame sistematico di elementi aggiuntivi, come le reticolazioni o processi cinetici di commutazione. Inoltre, questi tubi sono solubili in acqua e, a differenza della maggior parte delle proteine, stabile a pH adeguato e condizioni ioniche per diverse settimane, senza degrado rilevabili9.
Per assemblare questi tubi, viene utilizzato un insieme discreto di oligonucleotidi di DNA, ognuna delle quali contiene due domini che condividono sequenze di basi complementari ai due fili vicini (a causa di specifiche sequenze, un singolo filamento non può formare strutture quali i perni di capelli). Le sequenze complementari ibridano in modo ciclico, formando anelli chiusi, metà-sovrapposizione dei segmenti doppia elica n interconnessi (Figura 1A e B). Questi formano anelli presso un discreto diametro (Figura 1) e la loro configurazione metà sovrapposte espone assiale estremità appiccicosa complementari alle estremità appiccicose di un altro anello. Questa aggiunta selettiva di corrispondenti oligonucleotidi innesca un accatastamento degli anelli, che conduce la polimerizzazione efficace di filamentose tubi di elica di DNA di dimensione n (nHT). Loro lunghezze contorno in genere misurano alcuni micron di lunghezza, e la loro distribuzione di lunghezza è paragonabile a quella di actina filamenti9,26,27,28. È stato dimostrato per nanotubi di DNA simili che esibiscono infatti la cinetica di polimerizzazione simile a quelli dei microtubuli e i filamenti dell'actina
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Protocol
1. preparazione di n HTs
Nota: qui, n indica il numero di diversi singoli filamenti di DNA coinvolti nella formazione dei tubi elica di una certa dimensione. Per n = 8, otto diversi singoli filamenti di DNA formano un anello di unità.
- Sequenze di DNA di acquisto (grado di purezza HPLC o superiore) da una sintesi di DNA adatta di servizio o eseguire sintesi di alta qualità e purificazione (sequenze esemplari riportati nella tabella 1).
- Oligonucleotidi risospendere liofilizzato in acqua purificata e segui la risospensione ulteriori passaggi riportati nel manuale corrispondente da parte della società. Regolare la quantità di acqua per ottenere una concentrazione finale di 200 µM.
- Determinare concentrazioni di DNA singolo fili per verificare i valori indicati dal distributore (ad es., tramite spettroscopia UV-Vis a 260 nm) poiché la stechiometria esatta è cruciale per il processo di assemblaggio. Calcolare la concentrazione di oligonucleotidi, tenendo conto del peso specifico molare e il coefficiente di estinzione per ogni oligonucleotide di DNA single-stranded.
Nota: I valori del coefficiente di estinzione intrinsecamente variano per le diverse sequenze e sono indicati nella documentazione di DNA acquistato in commercio. Possono anche essere calcolati secondo il modello più simile utilizzando un numero di strumenti disponibili gratuitamente online. Per rispettare la gamma lineare dello spettrometro, considera diluendo il campione utilizzato per la determinazione di concentrazione. - Utilizzando una micropipetta, mescolare il DNA fili-each allo stesso concentrazione-in un contenitore adatto per il termociclatore (ad es., un tubo PCR di 200 µ l) formare il desiderato n HTs (condizioni di buffer finale: 1xTE (10 mM Tris e 1 mM EDTA, pH 8) e 12,5 mM MgCl 2).
Nota: I campioni di DNA finale n HT sono costituiti da n - 1 fili, U 1 − U n − 1 e una T n strand. La concentrazione per trefolo può variare da sub-micromolar per più di 10 µM, a seconda delle esigenze dell'utente (ad es., < 1 µm per trefolo per la successiva diluizione di osservare singoli filamenti o concentrazioni più elevate per l'esame di meccanica di rete fitta). - Ibridare n HTs in un termociclatore (denaturazione per 10 min a 90 ° C, con un conseguente abbassamento rapido a 65 ° C; temperatura lenta diminuzione da 65 ° C a 55 ° C, con appaiamento complementare in 20 passaggi di temperatura di-0,50 K per 30 min ciascuna; e un rapido calo da 55 ° C a 20 ° C); vedere Figura 2A.
Nota: La procedura lenta diminuzione da 65 ° C può essere allungata per aumentare la lunghezza del tubo medio; Tuttavia, il successivo abbassamento rapido a 20 ° C è fondamentale per evitare l'aggregazione dei tubi polimerizzate. - Memorizzare l'ibridati n HTs per fino a 3 settimane a 4 ° C senza degrado rilevabile.
Nota: Per fluorescenza, microscopia, etichettata n HTs sono ibridate sostituendo (parzialmente) U1 con la U1-Cy3 modificate (tabella 1). Per tempi più lunghi di osservazione, è consigliabile l'aggiunta di agenti anti-candeggio stabiliti. - Attentamente diluire il campione fino alla concentrazione finale desiderata (ad es., 4 µM per reti o 20 nM per singolo filamento osservazioni) utilizzando il buffer di campione, se necessario. Per ridurre al minimo possibili fonti di errore, assemblare i campioni alla concentrazione finale desiderata.
2. Reologia di taglio
- Scegli un'appropriata geometria (piastrina-piastrina o cono-piatto) per il reometro di taglio dinamico. Per piccoli volumi (cioè, inferiore a 200 µ l), utilizzare la geometria del cono-piatto.
- Caricare l'esempio il taglio dinamico reometro.
- Passivare l'interfaccia aria-acqua del campione e l'ambiente attenendosi alla seguente procedura per evitare potenziali effetti evaporazione.
- Circondano il campione con 2,5 mL del bagno di tampone campione.
- Aggiungere un tensioattivo appena di sotto della concentrazione micellare.
- Utilizzare una siringa Hamilton per racchiudere il campione con un lipide per evitare il contatto diretto del campione con aria.
- Sigillo del pozzetto con un cappuccio dotato di spugne bagnate e, se possibile, con un bagno di acqua supplementare (non a contatto con il campione) per ulteriore sopprimere evaporazione.
- Avviare la misurazione utilizzando il software specifico reometro a temperatura ambiente; in alternativa, eseguire la misurazione a diverse temperature, come ad esempio 37 ° C (se sono necessarie condizioni fisiologiche).
Nota: L'esempio di raffreddamento è spesso accompagnata dalla condensazione del vapore acqueo dall'aria circostante, mentre riscaldamento porta ad una maggiore evaporazione. Entrambi gli effetti in maniera incontrollata possono cambiare la concentrazione del campione, quindi tutte le misurazioni in serie devono essere eseguite ad una temperatura costante. - Lasciare il campione equilibrare per 2 ore a temperatura ambiente. L'evoluzione temporale può essere monitorato con una spazzata di tempo (i dati di un punto al minuto; ceppo γ = 5%; frequenza f = 1Hz).
- Misurare le proprietà meccaniche con i protocolli di test desiderato. Iniziare con una serie di sweep di frequenza (f-spazza) perché lasciano intatto il campione e consentire ulteriori misurazioni.
Nota: Inoltre, breve f-spazza dovrebbe essere effettuati prima e dopo misurazioni più lungo (ad esempio lungo f-spazza con una risoluzione molto più elevata) per verificare che il campione è rimasto invariato durante tutto il protocollo di misurazione completo.- Eseguire un breve f-sweep (ad es., γ = 5%; f = 0,01 Hz a 30 Hz; punti di 5 dati ogni decennio).
- Eseguire una lunga f-sweep (ad es., γ = 5%; f = 0,001 Hz a 30 Hz; 21 punti dati per dieci anni); il regime di bassa frequenza può essere omesso se non è necessario per ridurre il tempo di misura.
- Eseguire un breve f-sweep.
- Eseguire un γ-sweep (ad es., f = 1 Hz; γ = 0,0125% a 100%; punti 20 dati ogni decennio).
Nota: Utilizzare il breve f - sweep in primo luogo, come è solito incoerente con precedente f - spazza perché reti solitamente rottura durante γ-sweep o staccano dalle piastre. In alternativa, utilizzare γ-rampa (per esempio, = 0.025 s -1, t = 60 s); Tuttavia, le rampe richiedono solitamente cambiando la modalità motore, così successive breve f-spazza avrebbe falsificato.
- Bin e/o liscio i dati raw con un kernel gaussiano.
3. fluorescenza-assistita di ricottura analisi DNA
- 8 Preparare aliquote di 12 µ l per ogni campione utilizzando 1-4 µM DNA strand, 12,5 mM MgCl 2 in 1 x buffer di TE e 1 x gel di acido nucleico macchia da un DMSO di 10.000 x stock. Fare un controllo negativo con nessun DNA, ma includono acido nucleico gel macchia.
- Trasferire le aliquote a un piatto PCR in tempo reale e sigillare con pellicola adesiva (ad esempio, una piastra a 96 pozzetti di reazione).
Nota: Le alte temperature utilizzate in termico ricottura protocolli evaporerà campioni. Così, assicurarsi che i pozzi sono ermeticamente chiusi con pellicola adesiva per impedire acqua aumento di evaporazione e concentrazione, specialmente durante gli esperimenti a lungo termine. - Centrifugare la piastra a 100 x g per 1 min a temperatura ambiente per rimuovere le bolle di gas; se le bolle di gas si espandono, i pozzi non possono essere analizzati.
- Caricare la piastra sigillata in un sistema PCR quantitativo in tempo reale.
- Esegue un programma di ricottura. Denaturare il DNA a 90 ° C per 10 min goccia la temperatura rapidamente a 72 ° C. Quindi, ridurre la temperatura lentamente di 0,5 ° C ogni 30 min. Dopo che il segnale è decaduto, accelerare la rampa di temperatura.
Nota: 72 ° C è sufficientemente di sopra della temperatura di ibridazione reale; così, il segnale viene registrato su un ampio intervallo di temperature adatto a determinare l'intervallo di temperatura necessaria. - Assicurarsi che il coperchio del ciclatore riscalda per almeno 100 ° C per evitare la condensazione del campione evaporato sulla pellicola adesiva.
- Durante il montaggio, eccitare i campioni con un laser a ioni di argon a 488 nm e rilevare la fluorescenza a 550 nm quando usando una macchia di gel di acido nucleico (o spettralmente simili). Per altre sostanze coloranti, scegli una combinazione di eccitazione/emissione appropriato. Misurare il segnale di fluorescenza più spesso possibile per aumentare la complessiva qualità del segnale utilizzando la fotocamera integrata.
Nota: Qui, le misurazioni sono state effettuate ogni 9 s. - Se fusione preimpostato e ricottura programmi vengono applicati, è possibile utilizzare il software fornito per analizzare i dati. Se non, sottrarre il precedente valore medio il valore medio per ogni passaggio di temperatura ottenere la variazione relativa del segnale fluorescente.
4. AFM Imaging
- Cleave mica (per esempio, mica " V1 ") collegando commercialmente disponibile nastro adesivo e strappando; deve essere rimosso lo strato superiore della mica.
- Usando una micropipetta, deposito pre-formate n HT in Mg 2 + contenente tampone pieghevole sulla mica appena spaccata e lasciarlo accontentarsi di 10 min.
- Spin i campioni a intervalli brevi 3-s a 2.000 x g su una centrifuga di piccolo tavolo per rimuovere il liquido residuo. Diversi n HTs deve essere ancora attaccato alla superficie mica.
- Utilizzare un suggerimento a sbalzo con un'elevata rigidità (ad es., 54 Nm -1) e determinare la propria frequenza di risonanza con il software interno di AFM.
- Record il profilo di altezza con l'AFM in aria in toccando modalità al scansione basso prezzo (ad es., 1 linea/s) per evitare di danneggiare o spostando la n HTS.
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Representative Results
L'Assemblea di nanotubi di DNA tramite una rampa di temperatura (Figura 2) è un metodo molto affidabile per formare questi polimeri semiflessibili artificiali. Questi polimeri hanno caratteristiche paragonabili alle loro controparti naturali, quali i filamenti dell'actina, ma forniscono un quadro sperimentale molto più ampio, poiché le loro proprietà meccaniche può essere controllably alterato9,27 . Come biopolimeri, essi possono essere organizzati in reti (Figura 3) e in particolare permettono di verificare l'impatto della rigidezza filamento su strutture di massa e proprietà. Come illustrato nella Figura 4, queste reti visualizzare un regime di deformazione lineare per ceppi fino al 10%, che ricorda da vicino le caratteristiche delle reti dei filamenti dell'actina. All'interno di questo regime, reologia di taglio lineare può essere facilmente applicata,, per esempio, per determinare la risposta elastica e viscosa di DNA reti di nanotube sondato alle diverse frequenze9. Questi test rivelano che tali reti principalmente comportano elasticamente (Figura 5). In contrasto con le misure con proteine, questi tubi non denaturare all'interfaccia aria-acqua del campione e quindi, sofisticato passivazione strategie sono necessari (Figura 6). Di conseguenza, la manipolazione dei campioni è piuttosto semplice e ha dimostrato di essere molto robusta, producendo risultati coerenti con basse variazioni di campione a campione.
Tuttavia, la domanda di se le "estremità appiccicose" libere dei spaiato single-stranded DNA ad entrambe le estremità di ogni tubo può indurre l'ibridazione indesiderato, stocastico eventi è rimasto. Per risolvere questo problema, sequenze complementari di "calotta terminale" che copre le estremità del tubo sono stati aggiunti al campione dopo il processo di ibridazione è stato completo. Tuttavia, la Figura 7 illustra che le estremità dei filamenti di coperchiamento non ha alcuna influenza rilevabile e che l'estremità del tubo non inducono alcun effetto di reticolazione transitoria nel rete9. Attaccare gli eventi solo svolgere un ruolo significativo quando il campione viene gestito troppo approssimativamente e i tubi rompono a causa di pipettaggio duro. Questi punti di rottura, infatti, sembrano indurre effetti di reticolazione, che conducono alle risposte non lineari del sistema, come ceppo di irrigidimento (Figura 8).
Se i campioni sono preparati con cura, può essere utilizzati per verificare l'impatto che la concentrazione di filamento (Figura 9A) o il filamento rigidità (figura 9B)9 hanno sulle proprietà meccaniche di reti che consiste polimeri semiflessibili. Per la prima volta, la connessione quantitativa tra la rigidità del filamento e l'elasticità di rete è stata studiata sperimentalmente e sistematicamente, producendo un comportamento di legge di potenza lineare, che contraddice le previsioni teoriche predominante. Questi risultati illustrano che i nanotubi di DNA sono un nuovo strumento versatile per studiare gli effetti di polimeri semiflessibili, che erano precedentemente sperimentalmente inaccessibile9,27. Ora, varie teorie possono essere sperimentalmente testate, che coinvolgono le dichiarazione circa le dipendenze sulla persistenza lunghezza lp dei filamenti. Inoltre, effetti molto fondamentali, quali reptation (Figura 10), possono essere studiati da varie prospettive impiegando tubi che variano in rigidità.
| Nome | Sequenza | ||
| U1: a1 *-b1 *-a2-b2 | GGCGATTAGG-ACGCTAAGCCA-CCTTTAGATCC-TGTATCTGGT | ||
| U1-Cy3: a1 *-b1 *-a2-b2 | Cy3-TTGGCGATTAGG-ACGCTAAGCCA-CCTTTAGATCC-TGTATCTGGT | ||
| U2: a2 *-b2 *-a3-b3 | GGATCTAAAGG-ACCAGATACA-CCACTCTTCC-TGACATCTTGT | ||
| U3: a3 *-b3 *-a4-b4 | GGAAGAGTGG-ACAAGATGTCA-CCGTGAGAACC-TGCAATGCGT | ||
| U4: a4 *-b4 *-a5-b5 | GGTTCTCACGG-ACGCATTGCA-CCGCACGACC-TGTTCGACAGT | ||
| U5: a5 *-b5 *-a6-b6 | GGTCGTGCGG-ACTGTCGAACA-CCAACGATGCC-TGATAGAAGT | ||
| U6: a6 *-b6 *-a7-b7 | GGCATCGTTGG-ACTTCTATCA-ATGCACCTCC-AGCTTTGAATG | ||
| U7: a7 *-b7 *-a8-b8 | GGAGGTGCAT-CATTCAAAGCT-AACGGTAACTA-TGACTTGGGA | ||
| U8: a8 *-b8 *-a9-b9 | TAGTTACCGTT-TCCCAAGTCA-AACACTAGAC-ACATGCTCCTA | ||
| U9: a9 *-b9 *-a10-b10 | GTCTAGTGTT-TAGGAGCATGT-CGAGACTACAC-CCTTGCCACC | ||
| U10: a10 *-b10 *-a11-b11 | TGTAGTCTCGG-GTGGCAAGGG-TACTACCGCT-CCATTAAGAAT | ||
| U11: a11 *-b11 *-a12-b12 | AGCGGTAGTA-ATTCTTAATGG-ATCCGTCTATC-TACACTATCA | ||
| U12: a12 *-b12 *-a13-b13 | ATAGACGGATT-GATAGTGTAG-AGACGAAATC-AGCAGAACTAA | ||
| U13: a13 *-b13 *-a14-b14 | GATTTCGTCT-TTAGTTCTGCT-CTGCGAAGTAA-TCAGCCGAGC | ||
| T4: a4 *-b4 *-a1-b1 | GGTTCTCACGG-ACGCATTGCA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| T5: a5 *-b5 *-a1-b1 | GGTCGTGCGG-ACTGTCGAACA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| T6: a6 *-b6 *-a1-b1 | GGCATCGTTGG-ACTTCTATCA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| T7: a7 *-b7 *-a1-b1 | GGAGGTGCAT-CATTCAAAGCT-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| T8: a8 *-b8 *-a1-b1 | TAGTTACCGTT-TCCCAAGTCA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| T9: a8 *-b8 *-a1-b1 | GTCTAGTGTT-TAGGAGCATGT-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| T10: a10 *-b10 *-a1-b1 | GTGTAGTCTCG-GGTGGCAAGG-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| T14: a14 *-b14 *-a1-b1 | TTACTTCGCAG-GCTCGGCTGA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| cappuccio terminale A1 | CCTAATCGCC | ||
| cappuccio terminale A2 | CCTTTAGATCC | ||
| cappuccio terminale A3 | CCACTCTTCC | ||
| cappuccio terminale A4 | CCGTGAGAACC | ||
| cappuccio terminale A5 | CCGCACGACC | ||
| tappo fine A6 | CCAACGATGCC | ||
| cappuccio terminale A7 | ATGCACCTCC | ||
| cappuccio terminale A8 | AACGGTAACTA | ||
| tappo fine B1 * | ACGCTAAGCCA | ||
| tappo fine B2 * | ACCAGATACA | ||
| cappuccio terminale B3 * | ACAAGATGTCA | ||
| cappuccio terminale B4 * | ACGCATTGCA | ||
| cappuccio terminale B5 * | ACTGTCGAACA | ||
| cappuccio terminale B6 * | ACTTCTATCA | ||
| cappuccio terminale B7 * | CATTCAAAGCT | ||
| tappo fine B8 * | TCCCAAGTCA | ||
Tabella 1: Esempio di DNA sequenze per l'ibridazione di nHTs visualizzati in Figura 1, che sono stati utilizzati anche in studi precedenti su nHTs9, classe = "xrif" > 26,27,28. Il dato insieme di sequenze consente l'assemblaggio di sette architetture differenti del tubo (ad es., a1 si ibrida con la sequenza complementare a1 *). Altre architetture di tubo non dati qui possono essere costituiti anche dall'aggiunta o la sottrazione dei fili accompagnati da secondo ciclizzazione del filo n con U1.
Figura 1: Tube assembly e architettura. (A) schematica dell'Assemblea di un 4HT è costituito da quattro distinti 42-mers. Filamenti di DNA single-stranded adiacente ibridano attraverso domini continui alternativi delle basi di 10-11, indicati da zecche lungo nere (le zecche nere breve indicano unhybridized basi). Questo motivo sfalsati di mezzo dotato di estremità appiccicosa su entrambi i lati lungo l'asse, consentendo la crescita assiale, indicato dalla freccia. I fili di contorno U1 e T4 dispongono anche di domini complementari e formano così un anello chiuso, come indicato dalla freccia a destra. Si noti che questo sketch è una rappresentazione 2D; nello stato ibridato, i fili formano doppie eliche e tutte le basi sono accoppiate. (B) schema Quasi-3D di un tetramero 4HT con due doppie eliche coperto nello strato distante ombreggiato. Doppie eliche formano per domini complementari e sono collegati a entrambe adiacenti doppie eliche del tubo una volta per ogni elemento di lunghezza di unità. Una filza di U2 è disegnata più spesso per chiarezza. (C) sono riportati esempi di architetture di sette differenti del tubo, con numeri di filo che vanno da 4 HT HT e l14p che variano da 1,2 a 26 µm. (D e E) immagini di Epi-fluorescente di Cy3-etichettato, adsorbito 5 HT e 10 HT illustrare le rigidezze diverse tramite contorni curvi in modo diverso. La sovrapposizione di colore rosso è il contorno di filamento trovato tramite analisi di immagine, con end-to-end distanza R e l la lunghezza contornoC. Figura adattata da Schuldt et al.9. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: rampa di temperatura e assembly corrispondente di nanotubi di DNA. (A) nanotubi di DNA sono assemblati in un termociclatore tramite un protocollo contenente che diverse temperatura distinto punti sopra approssimativamente 11 h. (B) In un sistema PCR quantitativo in tempo reale, la variazione relativa del segnale fluorescente dei fili colorati è una misura per DNA double-stranded neonato mentre sta attraversando la rampa di temperatura. A seconda del tipo di nanotubi di DNA, il tasso di assemblaggio possa differire. La più complessa la formazione della struttura, più ampia Assemblea, presumibilmente dal più fili (e pertanto più segmenti con sequenze distinte e le temperature di ricottura locali) bisogno di ibridare alle opportune posizioni, un processo che è guidato da stocastiche fluttuazioni termiche. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: immagine AFM di rappresentante di un'intricata rete di 8HTs a 4 µM. Il profilo di altezza di una rete preformata di 8HTs assorbita per una superficie di mica è stato registrato utilizzando modalità di spillatura in aria. Immagini AFM visualizzare una proiezione 2D della rete ma non consentono l'estrazione affidabile dei dati (ad es., maglie) per il caso 3D poiché i tubi così come le reti sono compressi in una configurazione 2D. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: intervallo lineare. Misure di deformazione (G' = 1 Hz) rivelano un ampio plateau elastico lineare, senza segni di effetti di reticolazione quali il comportamento non-lineare che si manifesta come ceppo di indurimento. Sopra un ceppo caratteristico (diverso per ogni nHT), il modulo elastico altopiano si interrompe in modo irreversibile. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard del valore medio di tutte le misure effettuate. Figura adattata da Schuldt et al.9. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: dipendenza dalla frequenza tipica di una rete intricata 6HT. Reti di tubi di DNA mostrano un altopiano vasto elasticità in quattro ordini di grandezza, a seconda della frequenza applicata. Come previsto per una rete di polimero, la parte elastica (G') Shear complesso modulo è significativamente più alto rispetto alla parte viscosa (Gcm). Figura adattata da Schuldt et al.9. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Senza effetti di interfaccia aria-liquido. Sweep di frequenza (f-spazza; γ = 5%) di 8HT campioni a 8 µM hanno rivelato che l'influenza degli effetti evaporazione e gelificazione all'interfaccia aria-acqua sono trascurabili. Equilibrazione diversi tempi, nonché due metodi conosciuti per ridurre drasticamente la proteina clustering all'interfaccia (tensioattivi e lipidi), sono stati utilizzati. Indipendente del metodo, senza indicazione della drastiche influenze di evaporazione o elasticità superficiale sono stati registrati. Qui, G' rappresenta il modulo elastico e G ' rappresenta il modulo viscoso (linee tratteggiate). Figura adattata da Schuldt et al.9. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: nessuna influenza di modificazione fine. Il modulo elastico altopiano rimane costante quando le estremità libere appiccicose di 8HTs con le loro rispettive sequenze complementari di tappatura. Figura adattata da Schuldt et al.9. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: influenza delle procedure di manipolazione del DNA preformato reti sulla misurazione. A seconda di come vengono gestite le reti preformate dopo l'ibridazione, le misurazioni possono differire. In questo esempio, il flusso di shear durante il pipettaggio i nanotubi di DNA è stato variato drasticamente e tubi rotto se maneggiate con cura troppo. Rottura porta a interazioni indesiderate tra esposti, singolo-fili complementari correlare ai segmenti rotti o rotti, che conduce ad un aumento nell'elasticità e induce effetti non-lineari, sUCH come ceppo di tempra (aumento dell'elasticità per curve di grandi stiramenti, verde). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 9: Nanotubi di DNA permettono lo studio delle dipendenzep l. (A) lo studio di reti di polimeri semiflessibili con nHTs consente l'indagine della risposta meccanica del sistema con l'aumento di concentrazione (spazzata di concentrazione), analoga a studi basati su biopolimeri come actina. (B) inoltre, le diverse architetture dei tubi facilitano la determinazione della risposta meccanica rispetto alla variabile lp dei filamenti sottostanti, che è praticamente impossibile con biofiltri polimeri semiflessibili. Per questo scopo, i dati da A sono replotted per affrontare il ridimensionamento del modulo elastico altopiano per quanto riguarda lp. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard del valore medio di tutte le misure effettuate. Figura adattata da Schuldt et al.9. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 10: dimensioni Reptation e mesh. Registrazione di immagini di fluorescenza di filamenti di reptating (con etichetta singola DNA 8HT incorporato in una rete senza etichetta; c = 14 µM) può essere utilizzato per verificare la natura intricata dei filamenti nella rete. Eventuali effetti di reticolazione impedirebbe questa diffusione unidimensionale. Inserto: Reptation analisi possono essere utilizzato per determinare la dimensione delle maglie ridimensionamento con concentrazioni, che confronta bene a misurazioni di actina e concorda con le predizioni teoriche30. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard del valore medio di tutte le misure effettuate. Figura adattata da Schuldt et al.9. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Per ottenere reti adeguatamente formate, assemblaggio i nanotubi di DNA è un passo cruciale. Errori durante il processo di sintesi influiscono negativamente sulla qualità di tubo; Pertanto, è consigliabile che HPLC o un processo più rigoroso essere usato per purificare i oligonucleotides. Poiché la formazione di discreti piuttosto che aggregati nanotubi di DNA, come pure la loro distribuzione di lunghezza, dipende la stechiometria equimolare dei oligonucleotides costituente n all'interno del set, è necessario misurare le concentrazioni di nuovo capi acquistati, poiché i valori indicati possono variare sostanzialmente dalla concentrazione effettiva. Questa può essere eseguita, ad esempio, mediante spettroscopia UV-Vis ad una lunghezza d'onda di assorbanza di 260 nm. Vorremmo notare che pesi molecolari e coefficienti di estinzione variano tra le diverse sequenze; Pertanto, i valori di tradurre l'assorbanza in concentrazione dovrebbero essere determinati per ogni oligonucleotide di DNA. Quando si utilizzano attrezzature ottimizzata per volumi di piccolo campione, ad esempio un NanoDrop, ogni punto di misura dovrebbe essere preso più volte e in media. Rispettare la gamma lineare di rilevazione dello spettrometro. Diluire la frazione utilizzata per la determinazione di concentrazione se necessario. Lievi imprecisioni possono avere un grande impatto sulla stechiometria corretta e la qualità della formazione del tubo; di conseguenza, il pipettaggio di singoli filamenti deve essere più preciso possibile. Successivamente, la soluzione campione finale deve essere accuratamente miscelata pipettando lentamente il campione su e giù prima di posizionarla nel termociclatore. Se i fili sono stati modificati con le tinture fluorescenti per la visualizzazione, tutti i passaggi devono essere eseguiti in un ambiente al riparo da luce diretta e la successiva aggiunta di agenti anti-candeggio stabiliti (cioè, l'ossigeno lo scavenging sistemi, come glucosio ossidasi/catalasi) è raccomandata. Dopo i singoli fili sono stati mescolati nelle condizioni giuste buffer, una rampa di temperatura viene applicata per ibridare le strutture (Figura 2A). Questo modello di temperatura segue la temperatura di ibridazione critici determinati in precedenza, dove il DNA doppio modulo di eliche. Diversi metodi sono stati sviluppati per analizzare la cinetica di ibridazione del DNA (cioè, nativo di assorbanza UV del DNA31, calorimetria32o tinture fluorescenti33). In quest'ultimo metodo, coloranti intercalano in doppie eliche di DNA, formando complessi altamente fluorescente più luminoso di tinture non associati. Si legano parzialmente a doppio filamento, ma non a single-stranded DNA34. Di conseguenza, questi coloranti sono stati applicati per monitorare nanostrutture di DNA auto-assemblaggio nel sistema35 e possono essere utilizzati per identificare condizioni di montaggio ideale.
Inizialmente, qualsiasi DNA double-stranded all'interno del campione, quali duplex predefiniti e imprevedibili, sono denaturate ad alta temperatura (90 ° C) per evitare di appaiamento non intenzionale. Una successiva graduale diminuzione della temperatura (simile alla Figura 2A) riduce il movimento termico di filamenti di DNA, attivazione eventi base pairing. Dovuto la minimizzazione dell'energia libera, filamenti di DNA si ibridano preferenzialmente alle loro sequenze complementari. Quando viene applicato un colorante intercalante specifico dsDNA, la luminosità aumenta con la formazione di complessi altamente fluorescente, che a sua volta è una misura quantitativa per neonata double-stranded DNA34. La variazione relativa del segnale di fluorescenza per la formazione di 4HTs e 8HTs è rappresentato graficamente nella Figura 2B. Questa variazione relativa viene calcolata una media dell'intensità di fluorescenza per ogni temperatura e successivamente sottraendo il valore medio della temperatura precedente. Con la diminuzione della temperatura, un'elevata fluorescenza può essere rilevato (Figura 2B), e il picco di questa curva evidenzia la temperatura dove si verificano gli eventi massiccia ibridazione. Il calo delle curve si riferisce a valori di intensità raggiungendo un plateau. A seconda del costrutto di DNA e la sua complessità (ad esempio, un insieme di piccolo o grande di DNA strands), il picco può essere sharp (Figura 2B, curva blu) o broad (Figura 2B, curva verde). Quando possibile, questo deve essere testato per ogni struttura di nuova concezione garantire che la la rampa di temperatura gradualmente decrescente contiene la gamma dove è in corso la formazione di tubi attraverso la formazione di segmenti di dsDNA ibridati. Dopo la temperatura appropriata regime è determinato, nanostrutture possono essere assemblati con successo in intervalli di temperatura molto stretta (Figura 2B, curva blu), o anche isothermally35. Si noti che l'ibridazione del DNA più trefoli in reticoli periodici induce cooperativa ricottura effetti35,36, che supportano ulteriore DNA ricottura. Dovrebbe essere considerato che i coloranti intercalante tratto eliche del DNA di là di loro standard 10,5 coppie di base per configurazione elicoidale Disabilita, alterando così la geometria complessiva dei tubi. Di conseguenza, non si consiglia di aumentare la concentrazione di tintura sopra una molecola a 900 paia di basi di DNA35. Inoltre, il picco di temperatura di montaggio può deviare dalla temperatura di ricottura ottima effettiva. Per ottenere alta precisione e per determinare le migliori condizioni per la formazione del tubo, l'ibridazione del DNA dovrebbe essere studiato durante molti passaggi di temperatura lentamente cambiando, che dovrebbero essere ricontrollati con elettroforesi su gel di agarosio. Per il caso di nanotubi di DNA, abbiamo stabilito un protocollo di tre fasi. In primo luogo, il campione viene riscaldato a 90 ° C per denaturare il DNA nei singoli fili. Successivamente, un ampio intervallo di temperature (intorno alla vetta di assemblaggio del segnale di fluorescenza) è coperto. Nel nostro caso, una gamma di 10 ° C è coperto, che vanno da 65 ° C a 55 ° C, con un passo di-0,50 ° C ogni 30 min. Nel passaggio finale, la temperatura dovrebbe scendere rapidamente a temperatura ambiente - o, come nel nostro caso, - 20 ° C per evitare eventuali interazioni sfavorevoli a temperature intermedie (Figura 2A). Di solito, thermocyclers riscaldare i campioni da temperature più fredde. Pertanto, è importante regolare di conseguenza la temperatura del coperchio per limitare l'evaporazione del liquido del campione durante il montaggio, che aumenta la concentrazione del campione finale.
Se nHTs sono formate in modo appropriato, essi organizzare nelle reti puramente entangled (Figura 3), senza interazioni causando effetti di reticolazione tra tubi distinti. Legami incrociati presumibilmente deriverebbero da spaiato segmenti di DNA che si estende da difetti lungo un tubo o alle estremità appiccicosa, che sarebbero stati liberi di coppia con segmenti di singolo filamento complementari sui tubi vicini. Questi effetti potrebbero indurre proprietà non lineari, ad esempio incrudimento (aumentando G' per i più grandi ceppi), ma sono assenti in impigliato reti (Figura 4). Il γ-spazza visualizzata rivela anche i regimi di deformazione lineare appropriato per misure reologiche in generale. Sopra una certa soglia, la rete si rompe o perde il contatto con le piastre del reometro, che danneggia irreversibilmente il sistema. Dovrebbero pertanto applicate ceppi in regime lineare per ottenere dati affidabili. In genere, un ceppo di 5% è sufficiente per produrre dati ben di sopra del regime di rumore. Ceppi più alti possono essere applicati; Tuttavia, si avvicina facilmente la soglia di rottura, e i risultati possono essere falsified a causa di misurazione in regime non lineare.
Misure reologiche richiedono una preparazione attenta e coerenza del campione e attentamente considerati protocolli di misura per ottenere risultati riproducibili e interpretabile. Il punto centrale è di stabilire una rete completamente casuale, isotropica tra le piastre reometro poiché queste reti sono per lo più la struttura solo riproducibile. Così, tempi di equilibrazione piuttosto lungo (in genere circa 2 h, talvolta anche di più) sono necessari per disperdere eventuali effetti d'ordine che si verificano a causa di allineamento indotta da taglio durante il pipettaggio del campione. Esperimenti di pre-test sono raccomandati per l'evoluzione nel tempo (sweep tempo) del sistema di registrazione durante equilibrazione al fine di determinare l'intervallo di tempo necessario. Una volta che i segnali raggiungono altopiani senza ulteriori cambiamenti, il sistema è equilibrato. Una volta equilibrazione sono state determinate condizioni, i test desiderati, ad esempio un ceppo f - o γ-sweep, o rampa può essere eseguito. Prova un ampio spettro di ceppi in ultima analisi, può distruggere la rete o la connessione alle piastre. Tuttavia, se i test sono limitati a ceppi sotto la soglia di rottura, ceppo rampe e spazza in modo iterativo ripetibile per indagare i potenziali effetti di invecchiamento o isteresi. Nel caso di f-spazza, misura i tempi possono variare sostanzialmente. Test basse frequenze drammaticamente prolunga gli esperimenti, poiché una oscillazione potrebbe richiedere alcuni minuti. Si noti che, nel caso di nHTs, f-spazza rivela che il modulo elastico G' supera il modulo viscoso G' di circa un ordine di grandezza, che illustra la risposta elastica predominante di questi sistemi ( Figura 5). In generale, i diversi tipi di esperimenti possono essere accompagnati da breve f-spazza prima e dopo l'esperimento principale per verificare che il sistema è rimasto indisturbato dalla misura stessa. Tuttavia, alcune macchine hanno cambiare la modalità di motore sottostante per i diversi tipi di misure, soprattutto quando si passa da esperimenti dinamici (ad esempio, le oscillazioni della f-spazza) ad una rampa di tensione statica. Questo cambiamento è spesso accompagnato da spontanee grandi stiramenti distruggendo la rete e tempera le misurazioni successive. Pertanto, è consigliabile verificare le specifiche del reometro utilizzato.
Esperimenti di reologia su sistemi basati su actina rivelano un effetto drammatico di denaturazione proteica che si verificano all'interfaccia aria-acqua del sistema. Proteine denaturate aderiscano non specifico a vicenda, formando un gel denso che può altamente dominano le proprietà meccaniche dell'intero sistema. Per evitare il contatto diretto del campione con l'aria circostante, tecniche di passivazione che anche sopprimono l'evaporazione del contenuto idrico del campione possono essere utilizzati. Tre metodi potenziali sono: (i) che circonda la camera del campione con lo stesso buffer come nell'esempio; (ii) utilizzando tensioattivi per coprire l'interfaccia a causa loro domini idrofobi e idrofili (cura deve essere presa, dato che alcuni tensioattivi interferiscano con conformazioni di polimero); o (iii) che impiegano i lipidi più biologicamente compatibili, con effetti simili come tensioattivi. Si noti che nHTs non sono stati trovati per essere conforme agli effetti di denaturazione all'interfaccia e risultati sono indipendenti del metodo passivazione (Figura 6), che elimina i principali potenziali fonti di errore. In generale, la camera del campione sempre dovrebbe essere sigillata con un tappo, che può essere equipaggiato con spugne umide per aumentare l'umidità nella camera, sopprimendo l'evaporazione.
Come brevemente descritto in precedenza, una potenziale fonte di errore nei sistemi basati su DNA è unhybridized DNA, come DNA single-stranded spaiato sovrasta a difetti o alle estremità dei nanotubi, che potrebbero causare effetti aggiuntivi di reticolazione. Per studiare e/o eliminare questa possibilità, filamenti corti complementari possono essere utilizzati per ricoprire queste estremità appiccicosa. Tuttavia, le nostre indagini hanno indicato che l'aggiunta di fili di coperchiamento ha avuto alcun effetto sull'introdotto nHTs e il comportamento delle reti entangled è rimasto invariato (Figura 7). Tuttavia, la tappatura estremità appiccicosa con sequenze complementari può essere utile per altri sistemi basati sul DNA (e più complesse) sopprimere interazioni indesiderate. Inoltre, campioni di HTs ndovrebbero essere attentamente pipettati (ad es., per passaggi di diluizione e preparazione del campione) per evitare qualsiasi rottura o altri danni ai tubi. Se la soluzione è dispensata troppo approssimativamente, i tubi di rompono in maniera incontrollata, esponendo un numero elevato di estremità adesive in difetto punti, portando a indesiderati di interazioni tra i tubi e la reticolazione potenziale nel sistema. Questo interferisce con il segnale e conduce a effetti di irrigidimento, così come agli effetti non lineari quali incrudimento, che diventa visibile nelle γ-sweep (Figura 8). Così, la soluzione entangled dovrebbe essere fatto soltanto lentamente il pipettaggio e mediante Puntali per pipette con diametro piuttosto grande (alla fine di un puntale di taglio è consigliabile) per ridurre il taglio forze sui tubi.
In conclusione, DNA nHTs sono un sistema di modello adatto e adattabile per studiare i polimeri semiflessibili e reti formate da questi filamenti, che rappresenta una nuova classe di idrogeli meccanicamente sintonizzabile in massa. Se i tubi sono preparati con cura, può essere utilizzati per verificare l'impatto della lp dei filamenti in vari casi. La misurazione della massa reologiche di impigliato reti, per esempio, rivela che le dipendenze teoricamente previste del modulo elastico con concentrazione e lp sono incoerenti con il ridimensionamento sperimentalmente derivata Leggi (Figura 9)9. Questo studio dà risalto a che l'elasticità di una rete può essere aumentata aumentando la rigidità dei polimeri sottostante. Tradizionalmente, aumentando la rigidità di un idrogel è stato realizzato aggiungendo ulteriori polimeri alla soluzione o inducendo legami crociati (fisiche o chimiche) tra vicini polimeri37,38. Tuttavia, un più alto contenuto molecolare inoltre è associato con una dimensione di maglia ridotta, che può limitare le applicazioni come coltura cellulare 3D. Legami incrociati, d'altra parte, possono indurre cambiamenti morfologici complessi all'interno dell'architettura di rete sottostante, che complica ulteriormente la sintonizzazione precisa di proprietà meccaniche39. Tuttavia, utilizzando reti di nHTs, consente un disaccoppiamento completo di questi parametri, per cui gli effetti di irrigidimento possono essere indotta modificando unicamente la rigidità dei filamenti sottostante, lasciando la dimensione delle maglie invariata. Inoltre, le architetture di tubo possono essere specificamente modificate per integrare in modo selettivo gli effetti supplementari come la reticolazione, che, allo stesso modo nelle reti entangled, crea ulteriori possibilità per testare sperimentalmente predizioni teoriche per parametri comel p o crosslink dimensioni e potenza per reti. In generale, l'architettura programmabile amplia l'ambito delle applicazioni, consentendo per lo studio di lp-effetti dipendenti non solo all'ingrosso, ma anche a livello di singola molecola. Provette possono essere incorporati nella rete per studiare, per esempio, la dipendenza di lp sul moto unidimensionale di un filamento in tubo-come confinamento, comunemente denominato reptation (Figura 10)9. Se questo movimento diffusivo è visibile, inoltre, verifica la natura entangled della rete, dal momento che verrebbero soppressi dagli effetti di reticolazione. Analizzare la dinamica sottostante rivela anche la dimensione delle maglie della rete. Inoltre, questi tubi possono essere utilizzati per studiare la dipendenza della rigidezza e chiralità dei tubi sottostanti sulla formazione di fasci40,41,42,43, 44 , strutture di 45 o di ordine superiore, come stella-come Aster46,47,48,49,50, che può essere indotta dagli effetti di reticolazione o via ambienti affollati molecolarmente27.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Riconosciamo che il finanziamento da DFG (1116/17-1) e la scuola di Lipsia di scienze naturali "BuildMoNa" (GSC 185). Questo lavoro è stato sostenuto attraverso il progetto di Fraunhofer Attract 601 683. T. H. riconosce finanziamenti del Fondo sociale europeo (FSE-100077106).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AFM cantilever ACTA | AppNano | ||
| AFM - NanoWizard 3 | JPK Instruments | ||
| CCD camera | Andor | iXon DV887 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DNA oligonucleotides | Biomers.net | For sequences see Table 1 | |
| DNA Cy3-labeled oligonucleotides | Biomers.net | For sequence see Table 1 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E-9884 | |
| Epi-fluorescence micro-scope | Leica | DM-IRB | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M-8266 | |
| Mica "V1", 12 mm round | Plano GmbH | 50-12 | |
| MicroAmp® Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4346907 | |
| MicroAmp® Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4306311 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| 100x objective | Leica5 | 506168 | |
| Purified water | Merk Millipore - Milli-Q & Elix | ||
| Sapphire PCR tubes | Greiner Bio-One | 683271 | |
| TProfessional Standard PCR Thermocycler | Core Life Sciences Inc. | 070- Standard | |
| 7900HT Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4351405 | |
| Rheometer | TA Instruments | ARES | |
| SYBR® Green I nucleic acid gel stain | Thermo Fisher Scientific Inc. | S7567 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T4661 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich Co. | X-100 | Suppresses evaporation of sample at air-water interface |
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