Évaluation de la densité de la Synapse dans des tranches de cerveau de rongeurs hippocampe

Le cerveau humain est composé d’environ 10¹⁴ synapses. Nombre de Synapse est étroitement contrôlée pendant le développement et la maturation du système nerveux central (CNS). Au cours du développement, nombre de synapse est modulée par la synaptogénèse et l’élagage pour former des réseaux de neurones fonctionnels. Apprentissage et la mémoire sont pris en charge par le règlement du nombre de synapses et la force, un processus appelé potentialisation synaptique et dépression¹. Ce qui est important, la stabilisation des synapses matures est essentielle au maintien des connexions réseau neuronal. En outre, les déficits en densité de synapse ont été signalés aux premiers stades des maladies neurodégénératives comme la maladie d’Alzheimer (ma)². La capacité de précisément identifier et évaluer le nombre de synapses est donc fondamentale pour l’évaluation de la pathologie et la physiologie du cerveau.

L’extrême densité et la nature compacte de synapses font qu’il est difficile d’estimer leur nombre précis dans certaines zones du cerveau intact. Synapses chimiques dans le système nerveux central sont constitués de deux neurones en apposition étroite, séparés par une fente synaptique³. Le terminal présynaptique, ou bouton synaptique, émerge d’un axone et se compose de vésicules accumulés, qui contiennent des neurotransmetteurs qui définissent la spécificité d’une synapse — à savoir, glutamate et acide gamma - aminobutyrique (GABA) pour excitateurs et inhibiteur de synapses, respectivement. Les membranes des vésicules contiennent des transporteurs vésiculaires spécifiques à chaque neurotransmetteur : transporteur vésiculaire glutamate (vGlut) de glutamate et transporteur vésiculaire de GABA (vGAT) de GABA. Le terminal post-synaptique est une structure très dense composée de plusieurs protéines, y compris des récepteurs, molécules d’adhésion et les protéines de l’échafaudage. Dans les synapses excitatrices, post-synaptiques densité-95 protein (PSD-95) est le plus abondant échafaud protéines⁴, modulation excitatrice N-methyl-D-aspartate(NMDA-) et le récepteur de l’acide α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic (AMPA) fonction, tandis que gephyrin les chevilles des récepteurs inhibiteurs de l’inhibiteur postsynaptique borne⁵. Dans l’ensemble, la spécificité des protéines aux compartiments préalables- et post-synaptiques de l’aide dans la différenciation et l’identification des sous-types de la synapse.

L’évaluation du nombre de synapses peut être effectuée avec différentes techniques. Le plus commun est l’utilisation de la microscopie électronique (EM), qui permet l’analyse de la synapse dans les zones cérébrales intactes et compact avec fort grossissement et la résolution. Cependant, cette technique est très coûteuse, nécessite la préparation des échantillons complexes et est très chronophage. Autres techniques incluent l’utilisation de tableau tomographie⁶, qui a un inconvénient majeur car il nécessite un équipement spécialisé et coûteux pour effectuer l’analyse. En outre, des lignées transgéniques exprimant des marqueurs spécifiques de synaptiques sont utiles à l’évaluation de synapse numéro⁷, mais la génération de nouvelles lignes peut être restrictives et coûteuses, et la surexpression de protéines peut entraîner indésirable hors cible phénotypes.

En raison de ces limitations et par souci de simplicité, de nombreux chercheurs évaluent nombre de synapses en examinant les concentrations en protéines synaptiques total. Cependant, perte synapse peut être observée avant des changements importants en protéines, comme des résultats de remodelage synaptiques structurelles dans la dispersion de l’apposition de pré- et post-synaptiques, avec aucune dégradation de protéines synaptiques. En outre, AD, des niveaux de protéines synaptiques sont réduits suivant synapse dégénérescence ou mort neuronale^8,9. La quantification des niveaux totaux ne permet pas cette distinction. Ainsi, il est nécessaire d’élaborer une méthode précise, accessible et fiable pour l’évaluation du nombre de synapses dans le cerveau.

Dans cet article, nous décrivons comment bien identifier et déterminer le nombre de synapses en utilisant la microscopie par immunofluorescence dans des tranches de cerveau de rongeurs hippocampe. Les synapses sont définies par la co-localisation de pré- et post-synaptiques des marqueurs qui apparaissent dans une distribution ponctuée. Nous avons démontré la validité de cette technique à travers l’étude de Wnt signaling dans le cerveau. WNTs sont importants pour la formation, élimination et l’entretien des synapses de protéines sécrétées. L’induction in vivo d’un antagoniste sécrétée de la cascade de signalisation Wnt, Dickkopf-1 (Dkk1), entraîne une perte synaptique excitatrice tout en préservant des synapses inhibitrices dans le hippocampe¹⁰. Nous illustrons l’identification et le comptage des synapses excitatrices et inhibitrices dans des tranches d’hippocampe d’une souris adulte exprimant Dkk1 et mettez en surbrillance la transférabilité de cette technique à d’autres types de préparations de cultures tissulaires.

toutes les expériences à l’aide de la souris et les rats ont été approuvés et réalisée à l’aide de procédures de l’annexe 1 couvertes en vertu de la Loi de 1986 sur les animaux particuliers (procédures scientifiques). La recette du liquide céphalo-rachidien artificiel (FSCA) se trouvent dans le tableau 1.

1. préparation de tranches Hippocampal aiguë

1. enlever le cerveau de souris aussi rapidement que possible, à l’aide d’une spatule et tranchants des ciseaux pour couper le crâne et placez-le dans glacee, oxygénés (95 % O ₂, 5 % de CO ₂), haute-saccharose ACSF (~ 100 mL).
2. Placer le cerveau de la souris sur une boîte de Pétri et enlever le cervelet et une petite partie du cortex frontal avec un scalpel devant hemisecting vers le bas de la ligne médiane du cerveau.
3. Placer les deux hémisphères sur le côté qui était juste couper et coller chaque hémisphère sur la scène d’un vibratome.
4. Coupes 200-300 µm d’épaisseur de la région complète d’intérêt. Dans le cas de l’hippocampe, environ 3-4 tranches par hémisphère devraient provenir.
5. à l’aide d’une pipette Pasteur en plastique, transférer les tranches dans une chambre immergée dans oxygéné (95 % O ₂, 5 % de CO ₂) fsca. Maintenir à 34 ° C pendant 30 min.
   Remarque : Le traitement des tranches d’agents pharmacologiques actives, telles que des protéines recombinantes Dkk1, peut être effectué à ce stade en ajoutant les agents à la chambre tranche.
6. Retirer les tranches de la chambre à l’aide d’un pinceau, placez-les dans un plat de 24 puits et Difficulté pendant 20 min à 1 h de paraformaldéhyde à 4 % (saccharose PFA)/4% à température ambiante (RT).
   ATTENTION : PFA est toxique, portez une protection appropriée.
7. Laver les tranches trois fois dans du PBS de X 1 (10 min chacun).
   Remarque : Le protocole peut être suspendu ici pendant 1 à 2 jours, tant que les tranches sont conservés à 4 ° C en solution 1 PBS X.

2. Immunofluorescence pour marqueurs synaptiques

Remarque : les recettes de tous les tampons utilisés peuvent être trouvées dans le tableau 2.

1. Remplacer les PBS avec tampon de blocage/perméabiliser (tableau 2) dans les tranche des puits et incuber à RT pour 4-6 h.
2. Diluer l’anticorps polyclonal cobaye contre vGlut1 à une dilution de 1:2,000 dans un tampon bloquant/perméabilisation.
   Remarque : vGlut1 est un marqueur pour pré synaptique excitateur visualisation terminal. Pour l’identification des synapses excitatrices post-synaptiques, utiliser un anticorps polyclonal contre PSD-95 et dilué 1/500 dans la même solution. Utiliser un volume minimal de 300 µL à chaque puits. Pour identifier la localisation anatomique de l’hippocampe, utilisez un anticorps qui peut également identifier la structure neuronale, comme MAP2 ou tubuline. Fonctionne sur les concentrations correctes de tous les anticorps primaires pour les marqueurs synaptiques de choix (pré- et post-synaptiques) et dilué dans un tampon bloquant/perméabiliser fraîche.
3. Incuber les tranches dans la solution d’anticorps primaire pendant la nuit (ou pendant 1 à 2 jours) à 4 ° C. Utilisez une plate-forme vibrante avec mouvement vigoureux.
4. Laver les tranches trois fois dans du PBS (10 min chacun).
5. Diluer au 1/500 Anticorps secondaires appropriés dans un tampon bloquant. Par exemple, lorsque vous utilisez l’anticorps de cobaye vGlut1, appliquer un anticorps secondaire qui identifie le composant de cobaye (p. ex., âne anti-Guinée-cochon) conjugué à un fluorophore spécifique. Lors de l’utilisation de l’anticorps de lapin de PSD-95, appliquer un anticorps secondaire qui identifie le composant de lapin (p. ex., âne anti-lapin) conjugué à un fluorophore spécifique différent.
6. Incuber les tranches dans cette solution pendant 2-3 h à RT. veiller à ce que les tranches soient protégés de la lumière, comme les anticorps secondaires sont sensibles à la lumière.
7. Laver les tranches trois fois dans du PBS (10 min chacun).
8. Retirez délicatement les tranches de la plaque 24 puits à l’aide d’un pinceau et placez-les uniformément sur lames de verre préalablement marqués. Ajouter une goutte de milieu de montage sur le dessus de chaque tranche et puis placer délicatement une lamelle de verre sur le dessus les tranches. Éviter la formation de bulles d’air. Prendre soin d’utiliser assez milieu de montage (300-400 µL), car une quantité insuffisante peut conduire à sécher les tranches.
9. Laisser sécher pendant au moins 1-2 jours à ta et conserver les lames à l’abri de la lumière.
10. Stocker les lames à 4 ° C à court terme, mais pour le stockage à long terme, maintenez-les à -20 ° C.

3. Confocal Acquisition d’images et analyse

1. d’imagerie utilisant confocal laser scanning microscopy.
   1. Identifier la zone de l’hippocampe à être photographiée (p. ex., le cornu ammonis 1 et 3 (CA1, CA3) ou le gyrus denté (DG)) au moyen d’un 10 x ou 20 x objectif.
   Objectif du
   2. changement à un x 40 ou 63 x-immersion dans l’huile pour s’assurer que l’anatomie de la tranche est intact en identifiant les neurites continu et organisé la structure. Utilisez un marqueur neuronal, comme MAP2, comme référence ( Figure 1 a).
   3. Par la suite, passer à un 60 x objectif immersion dans l’huile (NA = ~1.3 - 1,4) et ajuster les réglages pour chaque canal pour obtenir le signal optimal et le contraste. Régler l’intensité de chaque laser afin d’éviter la saturation de tous les pixels à l’aide d’une option de haute / faible contraste.
      Remarque : Ce paramètre va dépendre le microscope utilisé, mais se référer à la Table des matières pour les paramètres de puissance de laser utilisé dans la Figure 2, Figure 3, et Figure 4. Pour de meilleurs résultats, utilisez une résolution de 1024 x 1024 pixels. Les paramètres doivent rester constantes tout au long des conditions différentes de la même expérience. Zoom supplémentaire peut être appliquée si nécessaire.
   4. Évaluer la profondeur où la coloration est même et acquérir des piles d’image d’au moins 8 équidistantes (250 nm) avions. Puis prendre 3 piles d’images représentatives adjacents de la même région d’intérêt par tranche.
      NOTE : La profondeur peut varier d’une tranche à une autre mais doit toujours être environ 2 à 5 µm de la surface de la tranche.
   5. Répéter l’acquisition en au moins 3 tranches par condition et d’animaux de 6 à 8 par groupe de traitement.
2. Analyse d’image.
   Remarque : Utiliser un logiciel d’analyse automatique d’image (voir la Table des matières). Notez que certains systèmes nécessitent une licence, alors que d’autres sont libres, comme ImageJ. Le logiciel utilisé doit analyser les images en 3D en prenant en compte tous les avions de la pile imagés. Se référer à la Table des matières pour les détails du logiciel utilisé pour l’analyse de l’image ( Figure 1).
   1. Utiliser un protocole de seuil d’intensité axée sur la coutume d’identifier tous les examen synaptique et marqueurs neurones qui sont manuellement optimisés et sélectionnés au sein du logiciel [voir Table des matières pour le logiciel spécifique utilisé dans cette Protocol].
      Remarque : Le logiciel identifie une intensité minimale et maximale pour chaque fluorophore et associe un pourcentage d’intensité pour chaque objet reconnu. Notez que le pourcentage de l’intensité variera selon le fluorophore utilisé et les anticorps contre le marqueur synaptique.
   2. Pour les marqueurs synaptiques, s’assurer que les filtres de taille (> 0.1µm ³ et < 0.8µm ³) sont choisis au sein du logiciel et appliqué à l’image. Ajustez les paramètres pour s’assurer que les objets sélectionnés sont chevauchent pas. Exclure n’importe quel objet qui sont trop grande ou trop petite à considérer punctums synaptique (voir la Figure 2 b).
      Remarque : Une fois optimisées, les mêmes valeurs de seuil sont ensuite appliqués à toutes les images dans une expérience donnée.
   3. Quantifier le nombre moyen, intensité et volume de chaque examen synaptique (pré- et post-synaptiques) utilisant les protocoles optimisés seuil sélectionnés au sein du logiciel. Normaliser le nombre d’examen pour le volume du champ image (environ 16 928 µm ³ dans le système utilisé ici). Normaliser l’intensité punctums synaptique à l’intensité du marqueur neuronal référence.
      Remarque : Les Synapses sont définis comme la co-localisation entre les marqueurs de pré- et post-synaptiques. Une fois les protocoles de seuil pour examen pré- et post-synaptiques hAve été établie, le logiciel doit identifier la co-localisation d’examen synaptique comme le chevauchement de 1 pixel, ou plus dans un seul plan.
      Remarque : Pour l’analyse statistique, confirmer que toutes les séries d’échantillons suivent la normalité et homogénéité de variance, tel que déterminé par les Lilliefords et les tests χ2, respectivement. Montrant une distribution normale et homogénéité de variance des échantillons devraient être analysés avec tests paramétriques, tel que décrit ci-dessous. Par exemple, les punctums synaptiques excitateurs analyse doit être effectuée à l’aide d’une ANOVA à avec blocage et la réplication. Chaque expérience individuelle doit être considérée comme un bloc ; en général, il y a trois expériences indépendantes, chacune avec 1-3 souris de chaque condition.

figure 1 : analyse des punctums synaptique en utilisant l’analyse d’image logiciel. (A) capture d’écran de la personnalisation de protocole intensité seuil. L’exemple donné est pour PSD-95, dans lequel l’examen sélectionné ont une taille de > 0,1 µm ³ et < 0,8 µm ³ et les objets qui se chevauchent réduites présents. Notez que l’image affichée est un avion confocal permettre la visualisation plus facile de synaptique examen et sélection des paramètres précis. (B) capture d’écran de l’analyse de sortie du logiciel (suite à la sélection du protocole optimisé). Un exemple d’examen synaptique brut numéros mesures basées sur le volume. Ces valeurs sont ensuite exportés vers un logiciel de feuille de calcul. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

figure 2 : contrôle de la qualité des arrangements de tranche et de paramètre pour examen synaptique. (A) représentant images confocales (objectif 40) de la région d’intérêt : la CA1 stratum radiatum (sr) et le stratum oriens (donc) d’une tranche de hippocampe sont identifiés par MAP2 coloration. Echelle = 2 µm. (B) images confocales (60 x objectif et une supplémentaire 1,3 X grossissement sur le logiciel d’acquisition) de CA1 stratum radiatum, avec excitateur marqueurs-vGlut1 (vert) et le PSD-95 (rouge)-de tranches d’hippocampe. Notez l’identification des punctums claire pré- et post-synaptiques. Punctums supérieure à 0,8 µm ³ sont exclus de la quantification (flèches blanches). Echelle = 2 µm (C) Confocal images (60 x objectif et une supplémentaire 1,3 X grossissement sur le logiciel d’acquisition) de CA1 stratum radiatum, avec excitateur marqueurs-vGlut1 (vert)-du cryostat-coupe des sections hippocampiques du cerveau entier fixe du PFA. Noter la présence de grands trous et une coloration irrégulière, contagieuse vGlut1. Echelle = 2 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Perte de Synapse survient tôt dans les maladies neurodégénératives comme AD et la maladie de Parkinson2,11,12. Cependant, les mécanismes moléculaires qui sous-tendent ces déficits restent mal compris. Lacunes dans la signalisation Wnt ont été associés à AD13,14,15,16,17. WNTs sont des glycoprotéines sécrétées et jouent un rôle essentiel dans la formation des synapses et la modulation de la transmission synaptique18,19,20,21. Récemment, nous avons identifié Wnts comme régulateurs clés de maintenance synaptique dans le système nerveux mature10,22. Etudier avec précision l’impact de la signalisation Wnt sur les synapses dans l’hippocampe de souris génétiquement modifiées, nous avons profité d’une préparation de tranches de cerveau et de la microscopie confocale à évaluer les changements dans le nombre de synapses. Nous avons identifié des tranches en bonne santé dont la structure a été bien conservé (Figure 2 a). En outre, la sélection des punctums synaptique a été soigneusement définie, à l’exclusion des grands objets colorés représentant probablement les protéines agrégées (Figure 2 b). Ce critère a été appliqué à toutes les images, avec les mêmes paramètres d’analyse rigoureux.

Nous avons utilisé un système de modèle transgénique qui induit l’expression de l’antagoniste de Wnt Dkk1 sécrétée chez les adultes (voir la Table des matières)10,22de contrôle de souris (iDkk1) de la tétracycline. Nous avons démontré que le blocus de signalisation Wnt dans l’hippocampe adulte déclenche perte synapse excitatrice spécifiquement dans la région CA1 de radiatum strate (Figure 3). Figure 3 illustre représentant images confocales de marqueurs de pré- et post-synaptiques excitateurs (vGlut1 et PSD-95, respectivement) acquis auprès des tranches d’hippocampe d’iDkk1 de souris exprimant Dkk1 pour deux semaines, ainsi que leurs contrôles respectifs. Nous avons analysé ces images à l’aide du logiciel Volocity et a démontré une réduction significative du nombre de synapses excitatrices, quantifiée par la co-localisation d’examen vGlut1 et PSD-95-marquée dans la région CA1 de l’hippocampe de souris iDkk1 après la induction de Dkk1 pendant deux semaines (Figure 3 b, * p < 0,05 ; Test de Kruskal-Wallis ; 6 souris par génotype). Dans la région CA1 stratum radiatum, le nombre de punctums de synapse excitatrice par 1 000 µm3 a été ramené de 500 chez les souris témoins à 300 chez les souris iDkk1. En revanche, expression de Dkk1 induite n’a pas affecté le nombre de synapses inhibitrices (identifié par la co-localisation entre les pré- et post-synaptiques marqueurs vGAT et gephyrin, respectivement), comme illustré à la Figure 4 a-B (p > 0,05 ; Test de Kruskal-Wallis ; 3 souris par génotype).

Ce qui est important, nous avons effectué une analyse de puissance statistique pour estimer le nombre de tranches et animaux requis pour générer ces résultats robustes. À l’aide de R, nous avons calculé qu’il fallait environ 35 tranches par condition (animaux de tranches x 6 3 images x 3 = 36) pour détecter une taille d’effet important (f = 0,4) avec 80 % de certitude (puissance = 0,8) à une ANOVA à avec blocage et la réplication, comme décrit dans l’étape 3.2.6.

Figure 3 : perte des synapses excitatrices dans des tranches d’hippocampe de souris iDkk1. (A) images confocales représentatifs des CA1 stratum radiatum Voir la synapses excitatrices, identifiés par la co-localisation entre vGlut1 et PSD-95 (flèches blanches). Le panneau inférieur représente un grossissement supérieur du rectangle en surbrillance. Barreaux de l’échelle = 2 µm. (B) le pourcentage de synapses excitatrices entre contrôle et iDkk1 a été quantifié à l’aide des logiciels mentionnés dans la Table des matières (* p < 0,05 ; Test de Kruskal-Wallis ; 6 souris par génotype). Les données sont représentées ± SEM Ce chiffre a été modifié par référence10. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : synapses inhibitrices sont inchangés dans des tranches d’hippocampe de souris iDkk1. (A) images confocales représentatif du stratum radiatum CA1 des synapses inhibitrices, identifié par la co-localisation entre vGAT et gephyrin (flèches blanches). Le panneau inférieur représente un grossissement supérieur du rectangle en surbrillance. Barreaux de l’échelle = 2 µm. (B) pourcentage des synapses inhibitrices entre souris contrôle et iDkk1, tel que quantifié à l’aide du logiciel Volocity (p > 0,05 ; Test de Kruskal-Wallis ; 3 souris par génotype). Les données sont représentées ± SEM Ce chiffre a été modifié par référence10. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Composition de fsca.

Tableau 2 : Tampons utilisés pour la coloration par immunofluorescence.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.