Summary
激光扫描与波长多光子荧光显微镜的先进光学技术组合的实施是为了捕获高分辨率的、 三维的、 实时成像中甘油三酯 (sox10:EGFP) 和甘油三酯 (foxd3:GFP) 斑马鱼胚胎神经嵴迁移。
Abstract
先天性眼和颅颌面畸形反映神经嵴，流动人口的洄游的干细胞，导致整个身体的许多细胞类型的中断。了解神经嵴的生物学已经有限，反映出缺乏可以研究体内的转基因听话模型和实时。斑马鱼是特别重要的发展模式，为研究洄游的细胞群，如神经嵴。若要检查神经嵴迁移到眼睛发育，实施的结合激光扫描显微镜与长波长多光子荧光激发的先进光学技术是拍摄高分辨率的、 三维的、 实时的转基因斑马鱼胚胎，即甘油三酯 (sox10:EGFP) 和甘油三酯 (foxd3:GFP)，在眼睛发育如sox10和foxd3已经在众多的动物模型，以调节早期神经嵴分化，他们可能代表神经嵴细胞的标记所示。多光子延时成像用来辨别的行为和早期眼发展作出贡献的两个神经嵴细胞群的迁徙模式。本议定书提供关于作为一个例子，斑马鱼神经嵴在迁移期间，生成的视频信息，并可进一步用于可视化斑马鱼和其他模式生物的很多建筑的早期发展。
Introduction
先天性眼疾导致儿童失明，往往是由于异常的颅神经嵴。神经嵴细胞是瞬态的干细胞，起身从神经管形成许多机体全身。1,2,3,4,5前脑的两侧和中脑，神经嵴细胞，引起的骨和软骨的中部和额叶区和虹膜、 角膜、 小梁网和前段眼睛的巩膜。4,6,7,8神经嵴细胞从蛤蚧形式咽弓、 下巴和心脏流出道。1,3,4,9,10研究强调了贡献于眼部神经嵴和眼周发展，强调这些细胞在脊椎动物眼睛发育的重要性。事实上，中断的神经嵴细胞迁移和分化导致颅面部、 眼部异常如在阿克森费尔德丽格综合征和彼得斯加综合征。11,12,13,14,15,16,17因此，全面了解迁移、 增殖和分化的这些神经嵴细胞将提供洞察潜在先天性眼疾的复杂性。
斑马鱼是强大的模式生物研究眼发展，斑马鱼眼的结构类似于哺乳动物同行，以及许多基因进化保守斑马鱼和哺乳动物之间。18,19,20此外，斑马鱼胚胎是透明和卵生，促进眼发育的实时可视化。
扩大以前发表的作品，6，，720神经嵴细胞的迁移模式描述了使用多光子荧光延时成像上带有 SRY （性别决定区 Y） 的转录控制下的绿色荧光蛋白 (GFP) 的转基因斑马鱼线-框 10 (sox10) 或叉头框 D3 (foxd3) 基因调控区域。21,22,23,24.多光子荧光延时成像是一项强大的技术，结合先进的光学技术的激光扫描显微镜与长波长多光子荧光激发来捕获的标本，用荧光标记的高分辨率的三维图像。25,26,27多光子激光的使用已经超过标准的共焦显微镜，包括增加的组织的渗透和减少的荧光漂白明显的优势。
使用此方法，两个不同种群的神经嵴细胞迁移和洄游通道的时间变了可区分，即 foxd3 阳性神经嵴细胞在眼周间质和眼睛发育和颅面间质 sox10 阳性神经嵴细胞。使用此方法，介绍了可视化的斑马鱼的眼部和面部神经嵴迁移迁移方法，使其易于观察发展过程中实时调节的神经嵴迁移。
此协议提供信息以便在早期眼发育的甘油三酯 (sox10:EGFP) 和甘油三酯 (foxd3:GFP) 转基因斑马鱼作为示例生成定时视频。此协议可进一步用于任何来自神经嵴细胞在斑马鱼的眼部和面部结构的早期发展的高分辨率的、 三维的、 实时可视化。此外，这种方法进一步可以用于发展的其它组织和器官在斑马鱼和其他动物的模型可视化。
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Representative Results
多光子荧光延时成像产生一系列的视频显示斑马鱼线到眼前段中的甘油三酯 (sox10:EGFP) 和甘油三酯 (foxd3:GFP) 与颅面结构引起的颅神经嵴细胞的迁移模式。作为一个例子， sox10-12 和 30 hpf 之间的积极的神经嵴细胞迁移从神经管的边缘到颅面地区 (视频 1， 图 2)。来自前脑的两侧和中脑细胞迁移的背、 腹面的发展中国家的眼睛来填充眼周间质。此外，这些sox10阳性细胞形成鼻过程。蛤蚧神经嵴细胞迁移腹侧和引起咽拱门。延时成像的foxd3-30-60 之间的积极的神经嵴细胞 hpf 表明这些细胞迁移视杯和表面外胚层之间，通过眼裂（视频 2、图 3）。 Foxd3这些-阳性细胞围绕镜头，形成虹膜基质。
图 1.安装程序。A.每个组件的安装装置，包括开放的沐浴室，快速交换平台和舞台适配器的胚胎。B.大会的开放洗澡室。C.另外 2%琼脂糖溶液 (60-70 ° C) 打开浴分庭。D.放置的胚胎在打开浴室在荧光显微镜下。E.胚胎 (24 hpf) 横向定位在聚合琼脂糖溶液在打开浴室中心。F.添加的媒体聚合的琼脂溶液的表面以完全覆盖胚胎在开放洗澡室。G.开放沐浴室放在快速交流平台，并定位在阶段适配器。H.的胚胎多光子显微镜台上安装设备的位置。一、激光安全框。推拉门 （1 和 2） 的加气开放分庭表示。请点击这里查看此图的大版本。
图 2.代表展开和最大投射图像从多光子延时成像对甘油三酯 (sox10:EGFP) 斑马鱼胚胎从 12 到 30 hpf。Sox10-阳性细胞迁移前脑的两侧 (P) 和中脑 (M) 来填充的眼周间质 （虚线的圈表示眼睛） 和鼻过程 （开放箭头）。从蛤蚧 (R) Sox10-阳性细胞迁移腹侧形成咽弓 （闭合箭头）。图像在时间框架中获得每 20 分钟一班，缝在一起，创建视频 1。请点击这里查看此图的大版本。
图 3.代表展开和最大投射图像从多光子延时成像的 Tg(foxd3:GFP) 斑马鱼胚胎从 24 到 48 hpf。Foxd3-阳性细胞进入眼的前房 （星号表示透镜） 之间的表面外胚层和视杯，与更多的细胞定位于背侧 ("D")-后 ("P") 象限相比前 ("A") 和腹侧 ("V") 象限。此外， foxd3阳性细胞迁移毗邻并通过眼裂。图像在时间框架中获得每 20 分钟一班，缝在一起，创建视频 2。请点击这里查看此图的大版本。
图 4.代表展开和最大投射图像从多光子延时成像的 Tg(foxd3:GFP) 从 30 至 60 岁的斑马鱼胚胎 hpf。Foxd3-阳性细胞进入眼的前房 （外的虚线的圆表示眼的外围边缘，虚线的圈表示透镜） 之间的表面外胚层和视杯，与更多的细胞定位于背侧 ("d")-后 ("p") 象限相比前 ("a") 和腹 ("v") 象限。此外， foxd3阳性细胞迁移毗邻并通过眼裂 （白色箭头表示迁移神经嵴，红色虚线划定眼裂）。在 60 hpf， foxd3-阳性细胞完全包围透镜 （闭合箭头），指示的裂缝闭合。此外，在 60 hpf， foxd3光感受器 （开放箭头），有人也表示这并不与此转录因子在神经嵴细胞中的表达。图像在时间框架中获得每 20 分钟一班，缝在一起，创建视频 3。请点击这里查看此图的大版本。
视频 1。Tg 的延时视频 (sox10:EGFP) 斑马鱼胚胎从 12 到 30 hpf。的星号表示眼睛。请点击这里下载这个视频。
视频 2。Tg 的延时视频 (foxd3:GFP) 斑马鱼胚胎从 24 到 48 hpf。的星号表示镜头。星号表示眼裂。d，背;v，腹;p 后, 唇瓣;a、 前。请点击这里下载这个视频。
视频 3。Tg 的延时视频 (foxd3:GFP) 从 30 至 60 岁的斑马鱼胚胎 hpf。星号表示镜头。箭头表示眼裂。d，背;v，腹;p 后, 唇瓣;a、 前。请点击这里下载这个视频。
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Discussion
多光子延时成像使体内追踪的瞬态和洄游的细胞群体。这个强大的技术可用于研究胚胎过程在真正的时间，并在本研究中，这种方法的结果加强的神经嵴细胞迁移和发展的当前知识。以前的延时成像研究通常利用共聚焦激光扫描显微镜。29,30,31,32在这里，我们目前使用的多光子技术，相比传统的共焦显微镜有着许多优点。多光子显微镜的基础是两个较长的红外波长的光子用于激发荧光。因此，有较少的散射和因而降低的背景下，启用更深层次的组织渗透，实现成像深度超过 1 毫米更有效率比共聚焦显微镜检测生物组织中。这些属性也会减小光毒性的检测，是重要的考虑因素与重复和频繁的图像采集。25,26,27从这些属性，双光子显微镜可以图像整体器官筹备和组织小动物模型中的 (如小鼠、 斑马鱼胚胎在 12 hpf-本研究是一例)。此外，这些小动物模型使基因编码荧光蛋白，可以本地化感兴趣的组织中使用。因此，多光子显微镜的使用可以大大提高图像采集的延时实验。
有很多的步骤，在此协议中，这取决于正在使用的多光子激光检测系统的类型。大多数问题本议定书与激光设置和基于使用的检测系统的图像采集。个别系统和获得技术支持的工作知识是至关重要的。此外，以往的经验，激光共聚焦扫描显微镜是用于进行故障排除。此外，初始系统设置可能会耗费时间。然而，完成系统设置后，只有小小的调整时，通常需要使用相同的转基因株系。
在本研究中，斑马鱼胚胎之间 12 和 60 hpf 用于这些实验。在这个年龄段，胚胎很小，很容易嵌入在琼脂糖，容易麻醉与 tricaine。然而，胚胎可以成为增长和不同长度的实验发展迟缓。因此，必须注意确保胚胎适当地上演在实验结束。
多光子延时成像产生细胞迁移，这不仅增强了能力，研究体内斑马鱼胚胎发育中，但是也可以应用于许多其他系统的高分辨率的、 三维的、 实时的可视化。虽然概述的议定书的重点斑马鱼神经嵴细胞迁移，这种技术很容易被改编为其他成像的目的。
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Disclosures
这项工作提供了通过视觉研究的核心 (P30 EY007003) 与美国国立卫生研究院 (K08EY022912-01) 国家眼科研究所的赠款资助。
Acknowledgments
作者感谢托马斯 · 席林请送礼的甘油三酯 (sox10:eGFP) 鱼和玛丽哈洛伦的慈祥礼物甘油三酯(foxd3:GFP)鱼。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Breeding Tanks with Dividers | Aquaneering | ZHCT100 | Crossing Tank Set (1.0-liter) Clear Polycarbonate with Lid and Insert |
| M205 FA Combi-Scope | Leica Microsystems CMS GmbH | Stereofluorescence Microscope - FusionOptics and TripleBeam | |
| Sodium Chloride | Millipore (EMD) | 7760-5KG | Double PE sack. CAS No. 7647-14-5, EC Number 231-598-3 |
| Potassium Chloride | Millipore (EMD) | 1049380500 | Potassium chloride 99.999 Suprapur. CAS No. 7447-40-7, EC Number 231-211-8. |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | Poly bottle; 500 g. CAS No. 10035-04-8 |
| Magnesium Sulfate (Anhydrous) | Millipore (EMD) | MX0075-1 | Poly bottle; 500 g. CAS No. 7487-88-9, EC Number 231-298-2 |
| Methylene Blue | Millipore (EMD) | 284-12 | Glass bottle; 25 g. Powder, Certified Biological Stain |
| Sodium Bicarbonate | Millipore (EMD) | SX0320-1 | Poly bottle; 500 g. Powder, GR ACS. CAS No. 144-55-8, EC Number 205-633-8 |
| N-Phenylthiourea | Sigma | P7629-25G | >98%. CAS Number 103-85-5, EC Number 203-151-2 |
| Dimethylsulfoxide | Sigma | D8418-500ML | Molecular Biology grade. CAS Number 67-68-5, EC Number 200-664-3 |
| Tricaine Methanesulfonate | Western Chemical Inc. | MS222 | Tricaine-S |
| Low-Melt Agarose | ISC Bioexpress | E-3112-25 | GeneMate Sieve GQA Low Melt Agarose, 25 g |
| Open Bath Chamber | Warner Instruments | RC-40HP | High Profile |
| Glass Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-102 | Circle cover glass. 25 mm diameter |
| High Vacuum Grease | Fisher Scientific | 14-635-5C | 2.0-lb. tube. DOW CORNING CORPORATION 1658832 |
| Quick Exchange Platform | Warner Instruments | QE-1 | 35 mm |
| Stage Adapter | Warner Instruments | SA-20LZ-AL | 16.5 x 10 cm |
| TC SP5 MP multi-photon microscope | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Mai Tai DeepSee Ti-Sapphire Laser | SpectraPhysics | ||
| Laser Safety Box | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Leica Application Suite X (LAS X) Software | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Photoshop CS 6 Version 13.0 x64 Software | Adobe | ||
| iMovie Version 10.1.4 Software | Apple |
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