Summary
Se implementó una combinación de las técnicas de microscopía con largo excitación de fluorescencia de varios fotones de longitud de onda del láser ópticas avanzadas para capturar imágenes de alta resolución, tridimensionales en tiempo real de la migración de la cresta neural en Tg (sox10:EGFP) y los embriones de pez cebra de Tg (foxd3:GFP).
Abstract
Ojo congénita y anomalías craneofaciales reflejan alteraciones en los nervios de la cresta, una población transitoria de células migratorias que dan lugar a numerosos tipos de células en todo el cuerpo. Entender la biología de la cresta neural ha sido limitada, lo que refleja una falta de modelos genéticamente manejables que pueden ser estudiado en vivo y en tiempo real. Pez cebra es un modelo de desarrollo particularmente importante para el estudio de las poblaciones de células migratorias, como la cresta neural. Para examinar la migración de la cresta neural en el ojo en desarrollo, se implementó una combinación de las técnicas ópticas avanzadas de láser, microscopía de excitación de fluorescencia de varios fotones de onda larga para capturar videos de alta resolución, tridimensionales en tiempo real del ojo en desarrollo en embriones de pez cebra transgénico, es decir, Tg (sox10:EGFP) y Tg (foxd3:GFP), como sox10 y foxd3 han demostrado en numerosos modelos animales para regular la diferenciación temprana de la cresta neural y probablemente representan los marcadores para células de la cresta neural. La proyección de imagen multi-photon Time-lapse fue utilizada para discernir el comportamiento y los patrones migratorios de dos poblaciones de células de cresta neural que contribuye al desarrollo temprano del ojo. Este protocolo proporciona información para la generación de vídeos Time-lapse durante la migración de la cresta neural del pez cebra, como un ejemplo y puede aplicarse más para visualizar el desarrollo temprano de muchas estructuras en el pez cebra y otros organismos modelo.
Introduction
Enfermedades congénitas oculares pueden causar ceguera de la infancia y a menudo debido a las anormalidades de la cresta neural craneal. Las células de la cresta neural son células transitorias que surgen a partir del tubo neural y forman numerosos tejidos en todo el cuerpo. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 las células de la cresta Neural, derivadas del prosencéfalo y mesencéfalo, dan lugar a los huesos y el cartílago de la cara y regiones frontales, iris, córnea, red trabecular y esclera en el segmento anterior del ojo. 4 , 6 , 7 , 8 células de la cresta Neural desde el rhombencephalon forma que arcos de la faringe, mandíbula y tracto de salida cardíaco. 1 , 3 , 4 , 9 , 10 estudios han puesto de relieve las aportaciones de la cresta neural para ocular y periocular desarrollo, haciendo hincapié en la importancia de estas células en el desarrollo del ojo vertebrado. De hecho, alteración de la diferenciación y migración de células de cresta neural conducen a anomalías craneofaciales y oculares como se observa en el síndrome de Axenfeld-Rieger y síndrome de Peters Plus. 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 por lo tanto, una comprensión global de la migración, proliferación y diferenciación de estas células de la cresta neural se proporciona la penetración en la complejidad subyacente a enfermedades oculares congénitas.
El pez cebra es un organismo modelo de gran alcance para estudiar desarrollo ocular, como las estructuras del ojo de pez cebra son similares a sus contrapartes mamíferas, y muchos genes son conservados evolutivamente entre pez cebra y mamíferos. 18 , 19 , 20 además, embriones de pez cebra son transparentes y ovípara, facilitando la visualización del desarrollo del ojo en tiempo real.
Ampliando el trabajo previamente publicado,6,7,20 el patrón migratorio de las células de la cresta neural fue descrito usando múltiples fotones fluorescencia Time-lapse de imagen en líneas de pez cebra transgénico con proteína verde fluorescente (GFP) bajo el control transcripcional de SRY (sex-determining región Y)-caja de 10 (sox10) o caja del Forkhead D3 regiones reguladoras del gen de (foxd3). 21 , 22 , 23 , 24. proyección de imagen de múltiples fotones fluorescencia Time-lapse es una técnica poderosa que combina las técnicas ópticas avanzadas de láser microscopía con larga excitación de fluorescencia de varios fotones de longitud de onda para capturar imágenes de alta resolución, tridimensionales de las muestras etiquetadas con fluoróforos. 25 , 26 , 27 el uso del multi-photon laser tiene distintas ventajas sobre el estándar microscopia confocal, incluyendo penetración creciente del tejido y disminución fluoróforo blanqueo.
Usando este método, dos poblaciones distintas de las células de la cresta neural varía en el momento de la migración y vías migratorias fueron las células de la cresta neural es decir positivo de foxd3, discriminados en el mesenchyme periocular y el ojo en desarrollo y sox10-positivo de la cresta neural células de mesénquima craneofacial. Con este método, se introduce un enfoque para visualizar la migración de migración de la cresta de los nervios oculares y craneofacial en el pez cebra, lo que es fácil observar la migración de la cresta neural regulado en tiempo real durante el desarrollo.
Este protocolo proporciona información para la generación de vídeos Time-lapse durante el desarrollo temprano del ojo en Tg (sox10:EGFP) y Tg (foxd3:GFP) de pez cebra transgénico, por ejemplo. Este protocolo se puede aplicar aún más para la visualización de alta resolución, tridimensional en tiempo real del desarrollo temprano de cualquier estructura ocular y craneofacial derivado de las células de la cresta neural en el pez cebra. Además, este método puede ser aplicado además para la visualización del desarrollo de otros tejidos y órganos en el pez cebra y otros modelos animales.
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Representative Results
Imágenes de Time-lapse de fluorescencia de varios fotones generan una serie de videos que revelaron los patrones de migración de las células de la cresta de los nervios craneales que dan lugar a las estructuras craneofaciales y segmento anterior del ojo en la Tg (sox10:EGFP) y Tg (foxd3:GFP) líneas de pez cebra. Por ejemplo, sox10 -células cresta neural positiva entre 12 y 30 hpf migran desde el borde del tubo neural en la región craneofacial (Video 1, figura 2). Migración de las células del prosencéfalo y mesencéfalo dorsal y ventral al ojo en desarrollo para rellenar el mesenchyme periocular. Además, estas células positivas sox10 -forman el proceso frontonasal. Las células de la cresta neural desde el rhombencephalon migran ventralmente y dan lugar a los arcos faríngeos. Time-lapse de imágenes de foxd3-células de la cresta neural positivo entre 30 y 60 hpf demostró que estas células migran entre la Copa óptica y el ectodermo superficial y a través de la fisura ocular (Video 2, figura 3). Estas foxd3-células positivas Unido alrededor de la lente, formando el estroma del iris.
Figura 1 . Programa de instalación. A. cada componente del embrión montaje aparatos, incluyendo la sala de baño abierta, plataforma y escenario adaptador de cambio rápido. B. montaje de la sala de baño abierta. C. adición de solución de agarosa al 2% (60-70 ° C) a la sala de baño abierta. D. colocación del embrión en la sala de baño abierta debajo de un microscopio de fluorescencia. E. embrión (a las 24 hpf) colocado lateralmente en el centro de la solución de agarosa polimerizada en la sala de baño abierta. F. además de los medios de comunicación a la superficie de la solución de agarosa polimerizada para cubrir completamente el embrión en la sala de baño abierta. G. cámara de baño abierto colocado en la plataforma de intercambio rápido y colocado en el adaptador de la etapa. H. colocación del embrión aparato de montaje en el escenario del multi-photon microscopio. I. caja de seguridad de Laser. Las puertas correderas (1 y 2) para rellenar el compartimiento abierto se indican. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 . Representante de deconvolución y max proyecta imágenes de multi-photon imaging Time-lapse de un Tg (sox10:EGFP) embrión de pez cebra de 12 a 30 hpf. Las células positivas sox10 -migraron desde el prosencéfalo (P) y mesencéfalo (M) para rellenar el mesenchyme periocular (círculo punteado indica el ojo) y el proceso frontonasal (flecha abierta). Sox10-las células positivas del rhombencephalon (R) migran ventralmente para formar los arcos faríngeos (flecha cerrado). Imágenes obtenidas cada 20 min durante el período de tiempo y cosidos juntos para crear el Video 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 . Representante de deconvolución y max proyecta imágenes de multi-photon imaging Time-lapse de un Tg(foxd3:GFP) embrión de pez cebra de 24 a 48 hpf. Células positivas de Foxd3 -entradas en la cámara anterior del ojo (asterisco denota lente) entre el ectodermo superficial y la Copa óptica, con más células localizada en el dorsal ("D")-cuadrante posterior de ("P") en comparación con el anterior ("A") y cuadrantes ("V") ventrales. Además, las células positivas de foxd3 -emigraron adyacente y a través de la fisura ocular. Imágenes obtenidas cada 20 min durante el período de tiempo y cosidos juntos para crear el Video 2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 . Representante de deconvolución y max proyecta imágenes de multi-photon imaging Time-lapse de un Tg(foxd3:GFP) embrión de pez cebra de 30 a 60 hpf. Foxd3-las células positivas entradas en la cámara anterior del ojo (círculo punteado exterior denota bordes periféricos del ojo, círculo interior punteado denota lente) entre el ectodermo superficial y la Copa óptica, con más células localizada en el dorsal ("d")-posterior cuadrante ("p") en comparación con el anterior ("a") y ventral ("v") cuadrantes. Además, las células positivas de foxd3 -migran adyacente y a través de la fisura ocular (punta de flecha blanca indica migración de la cresta neural, línea roja punteada delimita la fisura ocular). A los 60 años hpf, foxd3-células positivas rodeado completamente la lente (Flechas cerradas), que indica el cierre de la fisura. Además, en 60 hpf, foxd3 también se expresó en los fotorreceptores (flecha abierta), que no estaba asociada con la expresión de este factor de transcripción en las células de la cresta neural. Imágenes obtenidas cada 20 min durante el período de tiempo y cosidos juntos para crear Video 3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Video de 1. Video Time-lapse de un Tg (sox10:EGFP) embrión de pez cebra de 12 a 30 hpf. El asterisco denota el ojo. Haga clic aquí para descargar este video.
Video 2. Video Time-lapse de un Tg (foxd3:GFP) embrión de pez cebra de 24 a 48 hpf. El asterisco denota la lente. El asterisco denota la fisura ocular. d, dorsal; v, ventral; p, posterior; a, anterior. Haga clic aquí para descargar este video.
Video 3. Video Time-lapse de un Tg (foxd3:GFP) embrión de pez cebra de 30 a 60 hpf. El asterisco denota la lente. La flecha indica la fisura ocular. d, dorsal; v, ventral; p, posterior; a, anterior. Haga clic aquí para descargar este video.
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Discussion
La proyección de imagen multi-photon Time-lapse permite el seguimiento en vivo de poblaciones celulares transitorias y migratorias. Esta poderosa técnica se puede utilizar para el estudio de los procesos embrionarios en tiempo real, y en el presente estudio, los resultados de este método mejorado el conocimiento actual de la migración de células de cresta neural y el desarrollo. Anteriores estudios Time-lapse de imágenes típicamente utilizan la microscopía de láser confocal. 29 , 30 , 31 , 32 , presentamos el uso de una técnica del multi-photon, que tiene muchas ventajas sobre el tradicional microscopia confocal. La base de la microscopia del multi-photon es que dos fotones de longitudes infrarrojos se utilizan para excitar el fluoróforo. Como resultado, hay menos dispersión y menor fondo, permitiendo una penetración más profunda del tejido, logrando imágenes profundidades superiores a 1 mm de tejido biológico con detección más eficiente que la microscopia confocal. Estas propiedades también disminuyen la fototoxicidad, que es una consideración importante con la adquisición de imágenes repetidas y frecuentes. 25 , 26 , 27 de estas propiedades, microscopia de dos fotones puede obtener imágenes de preparaciones de todo órgano y tejido en modelos de pequeños animales, (por ejemplo ratones, embriones de pez cebra en 12 hpf - como en el caso del presente estudio). Además, estos pequeños modelos animales permiten uso de proteínas fluorescentes genéticamente codificadas, que puede localizarse en el tejido de interés. Así, el uso de múltiples fotones microscopía puede realzar grandemente la adquisición de imágenes para los experimentos de Time-lapse.
Hay numerosos pasos de este protocolo, que dependen del tipo de sistema de láser y detección de fotones múltiples se utiliza. Mayoría de los problemas con este protocolo se presenta con la configuración de láser y adquisición de imágenes basado en el sistema de detección usado. Conocimientos del sistema individual y acceso a soporte técnico son esenciales. Además, es útil para solucionar problemas de experiencia previa con láser confocal de la microscopia de barrido. Por otra parte, el sistema inicial puede ser desperdiciador de tiempo. Sin embargo, una vez terminado el sistema, sólo pequeños ajustes deben normalmente al utilizar las mismas líneas transgénicas.
En el presente estudio, se utilizaron embriones de pez cebra entre 12 y 60 hpf para estos experimentos. En este rango de edad, los embriones son pequeños, fácilmente incorporado en agarosa y fácilmente anestesiados con Metanosulfonato. Sin embargo, los embriones pueden convertirse en crecimiento y retraso dependiendo de la duración del experimento. Por lo tanto, se debe tener cuidado para asegurarse de que el embrión adecuadamente es puesta en escena en el final del experimento.
La proyección de imagen multi-photon Time-lapse produce visualización de alta resolución, tridimensional en tiempo real de la migración de la célula, que no sólo mejora la capacidad para estudiar en vivo la embriogénesis pez cebra, pero también se puede aplicar a muchos otros sistemas. Aunque el protocolo delineado se centra en la migración de células de cresta neural de pez cebra, esta técnica fácilmente adaptables para otros fines de proyección de imagen.
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Disclosures
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la National Eye Institute de los National Institutes of Health (K08EY022912-01) y visión investigación núcleo (P30 EY007003).
Acknowledgments
Los autores agradecen a Thomas Schilling para amablemente regalar el pescado Tg (sox10:eGFP) y Mary Halloran para amablemente regalar pescado Tg(foxd3:GFP) .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Breeding Tanks with Dividers | Aquaneering | ZHCT100 | Crossing Tank Set (1.0-liter) Clear Polycarbonate with Lid and Insert |
| M205 FA Combi-Scope | Leica Microsystems CMS GmbH | Stereofluorescence Microscope - FusionOptics and TripleBeam | |
| Sodium Chloride | Millipore (EMD) | 7760-5KG | Double PE sack. CAS No. 7647-14-5, EC Number 231-598-3 |
| Potassium Chloride | Millipore (EMD) | 1049380500 | Potassium chloride 99.999 Suprapur. CAS No. 7447-40-7, EC Number 231-211-8. |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | Poly bottle; 500 g. CAS No. 10035-04-8 |
| Magnesium Sulfate (Anhydrous) | Millipore (EMD) | MX0075-1 | Poly bottle; 500 g. CAS No. 7487-88-9, EC Number 231-298-2 |
| Methylene Blue | Millipore (EMD) | 284-12 | Glass bottle; 25 g. Powder, Certified Biological Stain |
| Sodium Bicarbonate | Millipore (EMD) | SX0320-1 | Poly bottle; 500 g. Powder, GR ACS. CAS No. 144-55-8, EC Number 205-633-8 |
| N-Phenylthiourea | Sigma | P7629-25G | >98%. CAS Number 103-85-5, EC Number 203-151-2 |
| Dimethylsulfoxide | Sigma | D8418-500ML | Molecular Biology grade. CAS Number 67-68-5, EC Number 200-664-3 |
| Tricaine Methanesulfonate | Western Chemical Inc. | MS222 | Tricaine-S |
| Low-Melt Agarose | ISC Bioexpress | E-3112-25 | GeneMate Sieve GQA Low Melt Agarose, 25 g |
| Open Bath Chamber | Warner Instruments | RC-40HP | High Profile |
| Glass Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-102 | Circle cover glass. 25 mm diameter |
| High Vacuum Grease | Fisher Scientific | 14-635-5C | 2.0-lb. tube. DOW CORNING CORPORATION 1658832 |
| Quick Exchange Platform | Warner Instruments | QE-1 | 35 mm |
| Stage Adapter | Warner Instruments | SA-20LZ-AL | 16.5 x 10 cm |
| TC SP5 MP multi-photon microscope | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Mai Tai DeepSee Ti-Sapphire Laser | SpectraPhysics | ||
| Laser Safety Box | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Leica Application Suite X (LAS X) Software | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Photoshop CS 6 Version 13.0 x64 Software | Adobe | ||
| iMovie Version 10.1.4 Software | Apple |
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