Summary
Een combinatie van de geavanceerde optische technieken van laser scanning microscopie met lange golflengte fluorescentie multi foton excitatie werd uitgevoerd om vast te leggen van real-time, hoge resolutie, driedimensionale beeldvorming van neurale crest migratie in GS (sox10:EGFP) en GS (foxd3:GFP) zebrafish embryo's.
Abstract
Aangeboren oog- en craniofaciale afwijkingen weerspiegelen verstoringen in de neurale crest, een voorbijgaande bevolking van trekkende stamcellen die aanleiding tot talrijke celtypes in het lichaam geven. Inzicht in de biologie van de neurale crest is beperkt, als gevolg van een gebrek aan genetisch hanteerbare modellen die bestudeerd in vivo worden kunnen en in real-time. Zebravis is een bijzonder belangrijk developmental model voor het bestuderen van de trekkende cel populaties, zoals de neurale crest. Onderzoek naar neurale crest migratie naar het derde oog, werd een combinatie van de geavanceerde optische technieken van laser scanning microscopie met lange golflengte fluorescentie multi foton excitatie uitgevoerd om vast te leggen met een hoge resolutie, drie-dimensionale, real-time video's van het derde oog in transgene zebrafish embryo's, namelijk GS (sox10:EGFP) en GS (foxd3:GFP), zoals sox10 en foxd3 zijn aangetoond in talloze dierlijke modellen om te reguleren van vroege crest van de neurale differentiatie en waarschijnlijk vertegenwoordigen markers voor neurale kamcellen. Multi foton time-lapse imaging werd gebruikt om te onderscheiden van het gedrag en de migratiepatronen van twee neurale crest cel populaties bij te dragen tot de vroege ontwikkeling van het oog. Dit protocol biedt informatie voor het genereren van time-lapse video's tijdens de zebravis neurale crest migratie als een voorbeeld, en verder kan worden toegepast om te visualiseren van de vroege ontwikkeling van vele structuren in de zebravis en andere modelorganismen.
Introduction
Erfelijke oogziekten jeugd blindheid kunnen veroorzaken en zijn vaak te wijten aan afwijkingen van de craniale neurale crest. Neurale kamcellen zijn voorbijgaande stamcellen die voortvloeien uit de neurale buis en vormen van talrijke weefsels in het lichaam. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 neurale kamcellen, afgeleid van het prosencephalon en mesencephalon, aanleiding geven tot de botten en het kraakbeen van de midface en frontale regio's, en de iris, hoornvlies trabecular gevlochten en sclera in het anterieure segment van het oog. 4 , 6 , 7 , 8 neurale kamcellen uit de rhombencephalon vorm die de faryngaal bogen, kaak en cardiale uitstroom tractus. 1 , 3 , 4 , 9 , 10 studies hebben gewezen op de bijdrage van de neurale crest aan oogbeschadigingen en/of en periocular ontwikkelen, wijzend op het belang van deze cellen in gewervelde oog ontwikkeling. Immers, verstoring van neurale crest cel migratie en differentiatie leiden tot craniofaciale en oogbeschadigingen en/of afwijkingen zoals waargenomen in Axenfeld-Rieger syndroom en Peters Plus syndroom. 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 zo een grondig inzicht in de migratie, de proliferatie en differentiatie van deze neurale kamcellen geven inzicht in de complexiteit ten grondslag liggen aan erfelijke oogziekten.
De zebravis is een krachtige modelorganisme voor het bestuderen van oogbeschadigingen en/of ontwikkeling, zoals de structuren van de zebravis oog vergelijkbaar met hun tegenhangers van zoogdieren zijn, en vele genen zijn evolutionair bewaard tussen zebravis en zoogdieren. 18 , 19 , 20 voorts zebrafish embryo's zijn transparant en een zoutwatervis, vergemakkelijkt de visualisatie van oog ontwikkeling in real-time.
Uitbreiding op de eerder gepubliceerde werk,6,7,20 de trekkende patroon van neurale kamcellen werd beschreven met behulp van meerdere foton fluorescentie time-lapse imaging op transgene zebrafish lijnen gemarkeerd met groen fluorescente proteïne (GFP) onder de Transcriptionele controle van het SRY (seks-bepalen regio Y)-vak 10 (sox10) of Forkhead vak D3 (foxd3) gen regelgevende regio's. 21 , 22 , 23 , 24. multi photon fluorescentie time-lapse imaging is een krachtige techniek die combineert de geavanceerde optische technieken van laser scanning microscopie met lange golflengte fluorescentie multi foton excitatie om hoge resolutie, drie-dimensionale beelden van specimens gelabeld met fluorophores te vangen. 25 , 26 , 27 het gebruik van de multi photon laser heeft duidelijke voordelen boven standaard confocale microscopie, waaronder verhoogde weefsel penetratie en verminderde fluorophore bleken.
Met behulp van deze methode, waren twee verschillende populaties van neurale kamcellen variërend in timing van de migratie en migratiestromen trajecten gediscrimineerde, namelijk foxd3-positieve neurale kamcellen in de periocular mesenchym en het derde oog- en sox10-positieve neurale kamcellen in de craniofaciale mesenchym. Met deze methode wordt een benadering van de migratie van oculaire en craniofaciale neurale crest migratie in zebrafish visualiseren ingevoerd, waardoor het gemakkelijk is om te observeren gereglementeerde neurale crest migratie in real-time tijdens de ontwikkeling.
Dit protocol biedt informatie voor het genereren van time-lapse video's tijdens de vroege ontwikkeling van de oog in GS (sox10:EGFP) en de transgene zebrafish GS (foxd3:GFP), als voorbeeld. Dit protocol kan verder worden toegepast voor de hoge resolutie, drie-dimensionale, real-time visualisatie van de vroege ontwikkeling van een structuur van het oogbeschadigingen en/of en craniofaciale afgeleid van neurale kamcellen in zebrafish. Bovendien kan deze methode verder worden toegepast voor de visualisatie van de ontwikkeling van andere weefsels en organen in de zebravis en andere diermodellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Multi foton fluorescentie time-lapse imaging gegenereerd een aantal video's dat geopenbaard de migratiepatronen van craniale neurale kamcellen die aanleiding tot de craniofaciale structuren en anterieure segment van het oog in de GS (sox10:EGFP) en GS (foxd3:GFP) zebrafish lijnen geven. Als voorbeeld migreren sox10 -positieve neurale kamcellen tussen 12 en 30 hpf vanaf de rand van de neurale buis in de craniofaciale regio (Video 1, Figuur 2). De cellen uit het prosencephalon en mesencephalon migreren dorsale en ventrale voor het derde oog om te vullen de periocular mesenchym. Bovendien, vormen deze sox10 -positieve cellen het frontonasal proces. Neurale kamcellen uit de rhombencephalon ventrally migreren en aanleiding geven tot de faryngaal bogen. Time-lapse imaging van foxd3-positieve neurale kamcellen tussen 30 en 60 hpf bleek dat deze cellen gemigreerd tussen de optic cup en oppervlakte ectoderm en via de oogbeschadigingen en/of horizontalis (Video 2, Figuur 3). Deze foxd3-positieve cellen samensmolten rond de lens, vormen de iris stroma.
Figuur 1 . Setup. A. elk onderdeel van het embryo montage apparaat, met inbegrip van de open bad kamer, de snelle uitwisseling platform en fase adapter. B. vergadering van de kamer open bad. C. toevoeging van 2% agarose-oplossing (60-70 ° C) aan de open bad kamer. D. plaatsing van het embryo in de open bad kamer onder een fluorescente microscoop. E. Embryo (bij 24 hpf) lateraal gepositioneerd in het midden van de gepolymeriseerde agarose oplossing in de zaal open bad. F. toevoeging van media op het oppervlak van de gepolymeriseerde agarose oplossing volledig voor het embryo in de zaal open bad. G. Open bad kamer in het snelle uitwisselingsplatform geplaatst en gepositioneerd in de fase-adapter. H. plaatsing van het embryo montage van apparatuur op het podium van de multi foton microscoop. I. Laser Kluisje. De schuifdeuren (1 en 2) voor het bijvullen van de open kamer worden aangeduid. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 . Vertegenwoordiger deconvolved en max-geprojecteerd beelden van multi foton time-lapse beeldvorming voor een Tg (sox10:EGFP) zebrafish embryo van 12 tot en met 30 hpf. De sox10 -positieve cellen migreerden vanuit het prosencephalon (P) en het mesencephalon (M) voor het vullen van de periocular mesenchym (de gestippelde cirkel duidt op het oog) en frontonasal proces (open pijl). Sox10 -positieve cellen uit de rhombencephalon (R) gemigreerd ventrally vormen de faryngaal bogen (gesloten pijl). Beelden werden verkregen iedere 20 minuten tijdens het tijdsbestek en aan elkaar genaaid om te creëren Video 1. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 . Vertegenwoordiger deconvolved en max-geprojecteerd beelden van multi foton time-lapse beeldvorming voor een Tg(foxd3:GFP) zebrafish embryo van 24 tot en met 48 hpf. Foxd3 -positieve cellen aangegaan de voorste kamer van het oog (het sterretje duidt lens) tussen de oppervlakte ectoderm en optic cup, met meer cellen gelokaliseerd op de dorsale ("D")-posterieure ("P") Kwadrant in vergelijking met de anterior ('A') en het ventrale ("V") kwadranten. Foxd3 -positieve cellen gemigreerd bovendien naast en door middel van de oogbeschadigingen en/of horizontalis. Beelden werden verkregen iedere 20 minuten tijdens het tijdsbestek en aan elkaar genaaid om te creëren Video 2. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 . Vertegenwoordiger deconvolved en max-geprojecteerd beelden van multi foton time-lapse beeldvorming voor een Tg(foxd3:GFP) zebrafish embryo van 30 tot 60 hpf. Foxd3 -positieve cellen aangegaan de voorste kamer van het oog (buitenste gestippelde cirkel duidt perifere randen van het oog, innerlijke gestippelde cirkel duidt lens) tussen de oppervlakte ectoderm en optic cup, met meer cellen gelokaliseerd op de dorsale ("d")-posterieure ("p") Kwadrant in vergelijking met de anterior ('a') en ventrale ("v") kwadranten. Bovendien, de foxd3 -positieve cellen naast en door middel van de oogbeschadigingen en/of horizontalis gemigreerd (witte pijlpunt geeft migrerende neurale crest, rode stippellijn afbakent oogbeschadigingen en/of horizontalis). Op 60 hpf, foxd3-positieve cellen volledig omringd de lens (gesloten pijlen), met vermelding van de sluiting van de spleet. Bovendien, op 60 hpf, foxd3 kwam ook tot uitdrukking in researchdieren (open pijlpunt), hetgeen niet geassocieerd met de uitdrukking van deze transcriptiefactor in neurale kamcellen was. Beelden werden verkregen iedere 20 minuten tijdens het tijdsbestek en aan elkaar genaaid om te creëren Video 3. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Video 1. Time-lapse-video van een GS (sox10:EGFP) zebrafish embryo van 12 tot en met 30 hpf. Het sterretje duidt het oog. Klik hier om deze video te downloaden.
Video 2. Time-lapse-video van een GS (foxd3:GFP) zebrafish embryo van 24 tot en met 48 hpf. Het sterretje duidt de lens. Het sterretje duidt de oogbeschadigingen en/of horizontalis. d, dorsal; v, buikvinnen; p, posterieure; a, anterior. Klik hier om deze video te downloaden.
Video 3. Time-lapse-video van een GS (foxd3:GFP) zebrafish embryo van 30 tot 60 hpf. Het sterretje duidt de lens. De pijl geeft de oogbeschadigingen en/of horizontalis. d, dorsal; v, buikvinnen; p, posterieure; a, anterior. Klik hier om deze video te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Multi foton time-lapse imaging kunt het volgen in vivo van voorbijgaande aard en trekvogels cel populaties. Deze krachtige techniek kan worden gebruikt om embryonale processen in real-time te bestuderen, en in de huidige studie, de resultaten van deze methode de huidige kennis van neurale crest cel migratie en ontwikkeling verbeterd. Eerdere time-lapse imaging studies gebruiken meestal confocale laser scanning microscopie. 29 , 30 , 31 , 32 hier, presenteren we het gebruik van een multi foton-techniek, die veel voordelen ten opzichte van traditionele confocale microscopie heeft. De basis van multi foton microscopie is dat twee fotonen van langere infrarode golflengten worden gebruikt om op te wekken van de fluorophore. Daardoor is er minder verstrooiing en dus verminderde achtergrond, inschakelen van diepere weefsels penetratie, bereiken van imaging diepten van meer dan 1 mm in biologische weefsels met meer efficiënte detectie dan confocale microscopie. Deze eigenschappen worden ook fototoxiciteit, die ook een belangrijke overweging met herhaalde en frequente Beeldacquisitie afnemen. 25 , 26 , 27 van deze eigenschappen, twee-foton microscopie kan beeld geheel-orgel preparaten en weefsel in kleine-dierlijke modellen, (bijvoorbeeld muizen, zebravis embryo's op 12 hpf - zoals in het geval van de huidige studie). Verder, deze kleine dierlijke modellen gebruik van genetisch gecodeerde fluorescente proteïnen, die kan worden gelokaliseerd in het weefsel van belang inschakelen. Dus, het gebruik van meerdere foton microscopie kan sterk verbeteren Beeldacquisitie voor time-lapse experimenten.
Er zijn talrijke stappen in dit protocol, die afhankelijk van het type multi photon laser en detectie systeem wordt gebruikt. De meeste problemen met dit protocol voordoen met de instellingen van de laser en de verwerving van afbeeldingen op basis van het detectiesysteem gebruikt. Een praktische kennis van het individuele systeem en de toegang tot technische support staan kritisch tegenover. Eerdere ervaring met confocale laser scanning microscopie is bovendien nuttig voor het oplossen van problemen. Bovendien, het eerste systeem opgezet kan worden tijdrovend. Zodra het systeem opgezet is voltooid, zijn alleen kleine aanpassingen echter meestal vereist bij het gebruik van transgene dezelfde lijnen.
In de huidige studie, werden zebravis embryo's tussen 12 en 60 hpf gebruikt voor deze experimenten. Tijdens deze leeftijdsgroep zijn de embryo's klein, gemakkelijk ingesloten in agarose en gemakkelijk narcose met tricaïne. Echter, de embryo's kunnen worden groei en ontwikkelingsachterstand vertraagd afhankelijk van de lengte van het experiment. Daarom moet worden gezorgd om ervoor te zorgen dat het embryo op passende wijze aan het einde van het experiment wordt opgevoerd.
Multi foton time-lapse imaging levert hoge resolutie, drie-dimensionale, real-time visualisatie van cel migratie, die niet alleen de mogelijkheid om te studeren in vivo embryogenese van zebravis verbetert, maar kan ook worden toegepast op vele andere systemen. Hoewel het overzicht protocol zich op de zebravis neurale crest cel migratie richt, kan deze techniek gemakkelijk worden aangepast voor andere grafische doeleinden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dit werk werd financieel ondersteund door middel van subsidies uit het nationale Instituut van het oog van het National Institutes of Health (K08EY022912-01) en de visie onderzoek kern (P30 EY007003).
Acknowledgments
De auteurs bedanken Thomas Schilling voor het vriendelijk gifting de GS (sox10:eGFP)-fish and Mary Halloran voor het vriendelijk gifting de vis GS(foxd3:GFP) .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Breeding Tanks with Dividers | Aquaneering | ZHCT100 | Crossing Tank Set (1.0-liter) Clear Polycarbonate with Lid and Insert |
| M205 FA Combi-Scope | Leica Microsystems CMS GmbH | Stereofluorescence Microscope - FusionOptics and TripleBeam | |
| Sodium Chloride | Millipore (EMD) | 7760-5KG | Double PE sack. CAS No. 7647-14-5, EC Number 231-598-3 |
| Potassium Chloride | Millipore (EMD) | 1049380500 | Potassium chloride 99.999 Suprapur. CAS No. 7447-40-7, EC Number 231-211-8. |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | Poly bottle; 500 g. CAS No. 10035-04-8 |
| Magnesium Sulfate (Anhydrous) | Millipore (EMD) | MX0075-1 | Poly bottle; 500 g. CAS No. 7487-88-9, EC Number 231-298-2 |
| Methylene Blue | Millipore (EMD) | 284-12 | Glass bottle; 25 g. Powder, Certified Biological Stain |
| Sodium Bicarbonate | Millipore (EMD) | SX0320-1 | Poly bottle; 500 g. Powder, GR ACS. CAS No. 144-55-8, EC Number 205-633-8 |
| N-Phenylthiourea | Sigma | P7629-25G | >98%. CAS Number 103-85-5, EC Number 203-151-2 |
| Dimethylsulfoxide | Sigma | D8418-500ML | Molecular Biology grade. CAS Number 67-68-5, EC Number 200-664-3 |
| Tricaine Methanesulfonate | Western Chemical Inc. | MS222 | Tricaine-S |
| Low-Melt Agarose | ISC Bioexpress | E-3112-25 | GeneMate Sieve GQA Low Melt Agarose, 25 g |
| Open Bath Chamber | Warner Instruments | RC-40HP | High Profile |
| Glass Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-102 | Circle cover glass. 25 mm diameter |
| High Vacuum Grease | Fisher Scientific | 14-635-5C | 2.0-lb. tube. DOW CORNING CORPORATION 1658832 |
| Quick Exchange Platform | Warner Instruments | QE-1 | 35 mm |
| Stage Adapter | Warner Instruments | SA-20LZ-AL | 16.5 x 10 cm |
| TC SP5 MP multi-photon microscope | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Mai Tai DeepSee Ti-Sapphire Laser | SpectraPhysics | ||
| Laser Safety Box | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Leica Application Suite X (LAS X) Software | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Photoshop CS 6 Version 13.0 x64 Software | Adobe | ||
| iMovie Version 10.1.4 Software | Apple |
References
- Barembaum, M., Bronner-Fraser, M. Early steps in neural crest specification. Sem Cell Dev Biol. 16, 642-646 (2005).
- Gage, P. J., Rhoades, W., Prucka, S. K., Hjalt, T. Fate maps of neural crest and mesoderm in the mammalian eye. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (11), 4200-4208 (2005).
- Minoux, M., Rijli, F. M. Molecular mechanisms of cranial neural crest cell migration and patterning in craniofacial development. Development. 137, 2605-2621 (2010).
- Trainor, P. A. Specification of neural crest cell formation and migration in mouse embryos. Sem Cell Dev Biol. 16, 683-693 (2005).
- Johnston, M. C., Noden, D. M., Hazelton, R. D., Coulombre, J. L., Coulombre, A. Origins of avian ocular and periocular tissues. Exp Eye Res. 29, 27-43 (1979).
- Bohnsack, B. L., Kahana, A. Thyroid hormone and retinoic acid interact to regulate zebrafish craniofacial neural crest development. Dev Biol. 373, 300-309 (2013).
- Chawla, B., Schley, E., Williams, A. L., Bohnsack, B. L. Retinoic acid and pitx2 regulate early neural crest survival and migration in craniofacial and ocular development. Birth Defects Res B Dev Reprod Toxicol. , (2016).
- Trainor, P. A., Tam, P. P. L. Cranial paraxial mesoderm and neural crest cells of the mouse embryo-codistribution in the craniofacial mesenchyme but distinct segregation in branchial arches. Development. 121 (8), 2569-2582 (1995).
- Hong, C. S., Saint-Jeannet, J. P. Sox proteins and neural crest development. Sem Cell Dev Biol. 16, 694-703 (2005).
- Steventon, B., Carona-Fontaine, C., Mayor, R. Genetic network during neural crest induction: from cell specification to cell survival. Sem Cell Dev Biol. 16, 647-654 (2005).
- Dressler, S., et al. Dental and craniofacial anomalies associated wth Axenfeld-Rieger syndrome with PITX2 mutation. Case Report Med. , 621984 (2010).
- Ozeki, H., Shirai, S., Ikeda, K., Ogura, Y. Anomalies associated with Axenfeld-Rieger syndrome. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 237 (9), 730-734 (1999).
- Strungaru, M. H., Dinu, I., Walter, M. A. Genotype-phenotype correlations in Axenfeld-Rieger malformation and glaucoma patients with FOXC1 and PITX2 mutations. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48, 228-237 (2007).
- Tumer, Z., Bach-Holm, D. Axenfeld-Rieger syndrome and spectrum of Pitx2 and Foxc1 mutations. Eur J Hum Genet. 17, 1527-1539 (2009).
- Schoner, K., et al. Hydrocephalus, agenesis of the corpus callosum, and cleft lip/palate represent frequent associations in fetuses with Peters plus syndrome and B3GALTL mutations. Fetal PPS phenotypes, expanded by Dandy Walker cyst and encephalocele. Prenat Diagn. 33 (1), 75-80 (2013).
- Aliferis, K., et al. A novel nonsense B3GALTL mutation confirms Peters plus syndrome in a patient with multiple malformations and Peters anomaly. Ophthalmic Genet. 31 (4), 205-208 (2010).
- Lesnik Oberstein,, S, A., et al. Peters Plus syndrome is caused by mutations in B3GALTL, a putative glycosyltransferase. Am J Hum Genet. 79 (3), 562-566 (2006).
- Brittijn, S. A., et al. Zebrafish development and regeneration: new tools for biomedical research. Int J Dev Biol. 53, 835-850 (2009).
- Bohnsack, B. L., Kasprick, D., Kish, P. E., Goldman, D., Kahana, A. A zebrafish model of Axenfeld-Rieger Syndrome reveals that pitx2 regulation by retinoic acid is essential for ocular and craniofacial development. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (1), 7-22 (2012).
- Williams, A. L., Eason, J., Chawla, B., Bohnsack, B. L. Cyp1b1 regulates ocular fissure closure through a retinoic acid-independent pathway. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (2), 1084-1097 (2017).
- Curran, K., Raible, D. W., Lister, J. A. Foxd3 controls melanophore specification in the zebrafish neual crest by regulation of Mitf. Dev Biol. 332 (2), 408-417 (2009).
- Dutton, K., Dutton, J. R., Pauliny, A., Kelsh, R. N. A morpholino phenocopy of the colourless mutant. Genesis. 30 (3), 188-189 (2001).
- Dutton, K. A., et al. Zebrafish colourless encodes sox10 and specifies non-ectomesenchymal neural crest fates. Development. 128 (21), 4113-4125 (2001).
- Kucenas, S., Takada, N., Park, H. C., Woodruff, E., Broadie, K., Appel, B. CNS-derived glia ensheath peripheral nerves and mediate motor root development. Nat Neurosci. 11, 143-151 (2008).
- Denk, W., Strickler, J., Webb, W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Denk, W., Delaney, K. Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy. J Neurosci Methods. 54 (2), 151-162 (1994).
- Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle developmnt to changes in retinoic acid and insulin-like growth factor signaling. PLoS ONE. 6, e22991 (2011).
- Gfrerer, L., Dougherty, M., Laio, E. C. Visualization of craniofacial development in the sox10:kaede transgenic zebrafish line using time-lapse confocal microscopy. J Vis Exp. (79), e50525 (2013).
- Lopez, A. L. R., Garcai, M. D., Dickinson, M. E., Larina, I. V. Live confocal microscopy of the developing mouse embryonic yolk sac vasculature. Methods Mol Biol. 1214, 163-172 (2015).
- McGurk, P. D., Lovely, C. B., Eberhart, J. K. Analyzing craniofacial morphogenesis in zebrafish using 4D confocal microscopy. J Vis Exp. (83), e51190 (2014).
- Nowotschin, S., Ferrer-Vaquer, A., Hadjantonakis, A. K. Imaging mouse development with confocal time-lapse microscopy. Methods Enzymol. 476, 351-377 (2010).
