Summary
長い波長多光子蛍光励起顕微鏡レーザーの高度な光学技術の組み合わせは、Tg (sox10:EGFP) および Tg (foxd3:GFP) ゼブラフィッシュ胚の神経堤移行の高解像度、リアルタイム三次元画像をキャプチャする実装されました。
Abstract
先天性の目と頭蓋顔面の異常、神経の頂上、全身に様々 な細胞タイプに上昇を与える渡り鳥の幹細胞の一時的な人口の混乱を反映します。神経の頂上の生物学を理解することは、制限、リアルタイムで生体内で調査することができます遺伝的扱いモデルの不足を反映してされています。ゼブラフィッシュは、渡り鳥細胞群、神経堤などを勉強するため特に重要な発達モデルです。Sox10とfoxd3初期神経分化と神経堤細胞のマーカーを表す可能性があります多数の動物モデルで示されている、発展途上の目に神経の頂上の移行を検討するには、長波長多光子蛍光励起顕微鏡レーザーの高度な光学技術の組み合わせはトランスジェニックゼブラフィッシュ胚で、Tg (sox10:EGFP) と Tg (foxd3:GFP)、すなわち開発の目の高解像度、立体化、リアルタイムのビデオをキャプチャする実装されました。多光子タイムラプス イメージングは、動作や目の早期開発に貢献する 2 つの神経堤細胞集団の移住性パターンを識別する使用されました。このプロトコルは、例としてゼブラフィッシュ神経堤移行中に時間経過のビデオを生成するための情報を提供し、ゼブラフィッシュと他のモデル有機体の多くの構造の初期の開発を視覚化するさらに適用することができます。
Introduction
先天性眼疾患小児失明を引き起こすことができるおよび頭蓋神経堤の異常によることが多い。神経堤細胞は神経管から発生し、全身の多くの組織を形成する非定常の幹細胞です。1,2,3,4,5前と、中脳由来神経堤細胞は、骨と軟骨の顔面と前頭葉、虹彩、角膜、小柱網と目の眼の強膜に上昇を与えます。4,6,7,8神経堤細胞、咽頭アーチ菱フォーム、あご及び心臓流出路から。1,3,4,9,10研究を強調しますしている眼に神経の頂上の貢献や眼周囲の開発、脊椎動物の目の開発のこれらのセルの重要性を強調します。確かに、神経堤細胞の移動と分化の混乱は、Axenfeld リーガー症候群および Peters プラス症候群における顎顔面と眼球の異常に します。11,12,13,14,15,16,17したがって、これら神経堤細胞の分化、増殖、移行の包括的な理解は、先天性眼疾患の基になる複雑さに洞察を提供します。
ゼブラフィッシュはゼブラフィッシュ眼の構造は、哺乳類に類似し、多くの遺伝子は、ゼブラフィッシュと哺乳類の間保存された眼の開発を研究するため強力なモデル生物です。18,19,20また、zebrafish の胚が透明で、卵生、目におけるリアルタイムの可視化を促進します。
以前に発行された仕事で拡大して、6、7,20神経堤細胞の移動パターン多光子蛍光タイムラプス イメージング (性決定領域 Y) sry 遺伝子の転写制御の下で緑色蛍光タンパク質 (GFP) の付いたトランスジェニックゼブラフィッシュ線を使用して記述された-ボックス 10 (sox10) またはフォーク ヘッド ボックス D3 (foxd3) 遺伝子の規定する領域。21,22,23,24. 多光子蛍光タイムラプス イメージングはレーザ走査型顕微鏡標本 fluorophores が付いているタグの立体化、高解像度の画像をキャプチャする長い波長多光子蛍光励起の高度な光学技術を組み合わせた強力な手法です。25,26,27多光子レーザーの使用増加組織浸透と減少蛍光漂白などを含む標準の共焦点顕微鏡上の明確な利点があります。
このメソッドを使用すると、移行と渡り鳥の経路のタイミングでさまざまな神経堤細胞の 2 つの異なる集団が眼周囲間充織と発展途上の目で判別、すなわち foxd3 陽性の神経堤細胞と顔面の間充織で sox10 陽性神経堤細胞。この方法では、開発中にリアルタイムで規制の神経堤の移行を観察しやすくゼブラフィッシュ眼と顔面神経の頂上の移行の移行を可視化へのアプローチは導入されました。
このプロトコルは、Tg (sox10:EGFP) の例として、Tg (foxd3:GFP) 遺伝子導入ゼブラフィッシュ初期の目の開発の間に時間経過のビデオを生成するための情報を提供します。このプロトコルは、ゼブラフィッシュ神経堤細胞由来眼と顔面の構造体の早い開発の高解像度、リアルタイム 3次元可視化のためさらに適用できます。また、このメソッドは、他の組織や臓器ゼブラフィッシュと他の動物モデルの開発の可視化のためさらに適用できます。
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Representative Results
多光子蛍光タイムラプス イメージングは、ゼブラフィッシュ行 craniofacial 構造と Tg (sox10:EGFP) と Tg (foxd3:GFP) の眼の前眼部に上昇を与える頭部神経堤細胞の移行パターンを明らかにしたビデオのシリーズを生成されます。例としてsox1012 と 30 の hpf の間肯定的な神経堤細胞は神経管の端から顎顔面領域 (ビデオ 1 図 2) に移行します。前、中脳から細胞移行眼周囲間充織を作成する開発の目に腹側および背側。さらに、これらsox10 -陽性細胞は成人のプロセスを形成します。菱から神経堤細胞は、腹側に移行し、咽頭のアーチを生じさせる。タイムラプス イメージングfoxd3-30 と 60 の間肯定的な神経堤細胞 hpf と眼裂眼杯と表面の外胚葉間にこれらの細胞が移行されたことを示した(ビデオ 2図 3)。これらのfoxd3-陽性細胞結合形成、虹彩、レンズの周り。
図 1.セットアップ。A.露天風呂商工会議所、迅速な交換プラットフォームとステージ アダプターを含む装置を取り付け胚の各コンポーネント。露天風呂の部屋のB.アセンブリ。C.添加 2% アガロース溶液 (60-70 ° C) 露天風呂の部屋。D.蛍光顕微鏡下で露天風呂室で胚の配置。E.胚 (24 で hpf) 露天風呂の部屋で重合アガロース溶液の中央に横方向に配置。露天風呂室で胚を完全にカバーするため重合のアガロース溶液の表面にメディアのF.追加。G.露天風呂室クイック交換プラットフォームに配置され、ステージ アダプターに配置。多光子顕微鏡のステージ上の装置を取り付け胚のH.配置。I.レーザ安全ボックス。開いた区域の補充の引き戸 (1 および 2) が示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2.代表の逆算と Tg の多光子タイムラプス イメージングから最大投影画像 (sox10:EGFP) 12 から 30 にゼブラフィッシュ胚 hpf 。Sox10 -陽性細胞は眼周囲間充織 (点線の円は、目を表す) と成人プロセス (開矢印) を設定する前 (P) と中脳 (M) から移行。菱 (R) からSox10 -陽性細胞移行腹 (矢印) の咽頭のアーチを形成します。画像は、時間枠の間に 20 分毎を得られ、ビデオ 1 を作成する一緒に縫われます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3.逆算代表と Tg の多光子タイムラプス イメージングから最大投影画像(foxd3:GFP) 24 から 48 のゼブラフィッシュ胚 hpf 。Foxd3-肯定的な細胞の目の前房に入った (アスタリスク レンズ) 表面の外胚葉と背側 ("D") にローカライズされてより多くの細胞、眼杯の間-前方 ("A") と腹側 ("V") 象限と比較して後部 ("P") 象限。さらに、 foxd3 -陽性細胞移行して眼裂を隣接します。画像は、時間枠の間に 20 分毎を得られ、ビデオ 2 を作成する一緒に縫われます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4.逆算代表と Tg の多光子タイムラプス イメージングから最大投影画像(foxd3:GFP) 30 から 60 にゼブラフィッシュ胚 hpf。Foxd3-肯定的な細胞の目の前房に入った (点線の外側の円は、目の周辺のエッジを示し、内側の点線の円表しますレンズ) 表面の外胚葉と背側 ("d") にローカライズされてより多くの細胞、眼杯の間-前方と後方 ("p") 象限比較 ("a") と腹側 ("v") 作業領域。さらに、 foxd3 -陽性細胞移行して眼裂を隣接する (白い矢印が移行する神経堤を示し、赤い破線は眼裂を設定)。60 で hpf foxd3-陽性細胞は完全に裂の閉鎖を示すレンズ (閉じた矢印) を包囲します。さらに、60 で hpf foxd3もに表現された光受容体 (白抜きの矢印)、神経堤細胞のこの転写因子の発現に関連付けられてではなかった。画像は、時間枠の間に 20 分毎を得られ、ビデオ 3 を作成する一緒に縫われます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
ビデオ 1。Tg のタイムラプス ビデオ (sox10:EGFP) 12 から 30 にゼブラフィッシュ胚 hpf。目をアスタリスクします。このビデオをダウンロードするにはここをクリックしてください。
ビデオ 2。Tg のタイムラプス ビデオ (foxd3:GFP) 24 から 48 のゼブラフィッシュ胚 hpf。レンズをアスタリスクします。アスタリスクは、眼裂を表します。d、背;v、腹側;p、後部;前方。このビデオをダウンロードするにはここをクリックしてください。
動画 3.Tg のタイムラプス ビデオ (foxd3:GFP) 30 から 60 にゼブラフィッシュ胚 hpf。アスタリスクは、レンズを表します。矢印は、眼裂を示します。d、背;v、腹側;p、後部;前方。このビデオをダウンロードするにはここをクリックしてください。
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Discussion
多光子タイムラプス イメージングが一過性と渡り鳥の細胞集団の生体内で追跡を可能にします。リアルタイムで萌芽期のプロセスを研究するこの強力な技術を使用ことができます、現在の研究では、このメソッドの結果は神経堤細胞の移動と開発の現在の知識を強化します。以前のタイムラプス イメージング研究は、通常、共焦点レーザ走査型顕微鏡を利用します。29,30,31,32ここで、従来の共焦点顕微鏡に比べて多くの利点を持っている多光子技術の使用を紹介します。多光子顕微鏡の基礎より長い赤外線波長の 2 つの光子を使用して蛍光体を刺激することです。その結果より少ない散乱そしてこうして減少の背景、深い組織浸透を有効にする、生体共焦点顕微鏡よりもより効率的な検出と 1 mm を超える画像の深さを達成するあります。これらのプロパティは、光毒性は、繰り返し、頻繁に画像の取得で重要な考慮事項を小さくもできます。25,26,27これらのプロパティから 2 光子顕微鏡することができます画像全体臓器製剤と小動物モデルにおける組織 (例えばマウス、ゼブラフィッシュ胚 12 で hpf - 本研究の場合のように)。さらに、これらの小さな動物モデルは興味のティッシュでローカライズできる遺伝的コード化の蛍光タンパク質の使用を有効にします。したがって、多光子顕微鏡を使用は、タイムラプスの実験のためのイメージ取得を大きく向上できます。
このプロトコルで使用されている多光子レーザーや検出システムの種類に依存する数多くのステップがあります。このプロトコルでほとんどの問題は、レーザーの設定と使用の検出システムに基づく画像の取得で発生します。個々 のシステムとテクニカル ・ サポートへのアクセスについての知識が不可欠です。さらに、共焦点レーザ走査型顕微鏡との経験がトラブルシューティングに役立ちます。また、初期のシステム設定は、時間がかかる可能性があります。ただし、システムのセットアップが完了すると、小さな調整だけは、同じ形質転換線を使用して、通常必要です。
本研究では 12 と 60 の hpf のゼブラフィッシュ胚はこれらの実験のため使用されました。この年齢の範囲の中に胚が小さく、アガロースで簡単に埋め込み、tricaine と容易に麻酔です。しかし、胚の成長になることが、実験の長さに応じて発達が遅れています。したがって、胚は実験の終わりに適切に上演するように注意が必要があります。
多光子タイムラプス イメージングは、ゼブラフィッシュ胚体内を研究する能力を高めるだけでなく、多くの他のシステムにも適用することができます、セルの移行の高解像度、リアルタイム 3次元可視化を生成します。輪郭を描かれたプロトコルはゼブラフィッシュ神経堤細胞の移動に焦点を当て、このテクニック簡単に適応できます他のイメージング用。
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Disclosures
この仕事は健康の国民の協会 (K08EY022912-01) とビジョン研究コア (P30 EY007003) の国立眼研究所からの助成金によって財政上支えられます。
Acknowledgments
著者は、トーマス ・ シリングが親切贈与 Tg (sox10:eGFP) 魚とメアリー halloran さん親切贈与 Tg(foxd3:GFP)魚をありがちましょう。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Breeding Tanks with Dividers | Aquaneering | ZHCT100 | Crossing Tank Set (1.0-liter) Clear Polycarbonate with Lid and Insert |
| M205 FA Combi-Scope | Leica Microsystems CMS GmbH | Stereofluorescence Microscope - FusionOptics and TripleBeam | |
| Sodium Chloride | Millipore (EMD) | 7760-5KG | Double PE sack. CAS No. 7647-14-5, EC Number 231-598-3 |
| Potassium Chloride | Millipore (EMD) | 1049380500 | Potassium chloride 99.999 Suprapur. CAS No. 7447-40-7, EC Number 231-211-8. |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | Poly bottle; 500 g. CAS No. 10035-04-8 |
| Magnesium Sulfate (Anhydrous) | Millipore (EMD) | MX0075-1 | Poly bottle; 500 g. CAS No. 7487-88-9, EC Number 231-298-2 |
| Methylene Blue | Millipore (EMD) | 284-12 | Glass bottle; 25 g. Powder, Certified Biological Stain |
| Sodium Bicarbonate | Millipore (EMD) | SX0320-1 | Poly bottle; 500 g. Powder, GR ACS. CAS No. 144-55-8, EC Number 205-633-8 |
| N-Phenylthiourea | Sigma | P7629-25G | >98%. CAS Number 103-85-5, EC Number 203-151-2 |
| Dimethylsulfoxide | Sigma | D8418-500ML | Molecular Biology grade. CAS Number 67-68-5, EC Number 200-664-3 |
| Tricaine Methanesulfonate | Western Chemical Inc. | MS222 | Tricaine-S |
| Low-Melt Agarose | ISC Bioexpress | E-3112-25 | GeneMate Sieve GQA Low Melt Agarose, 25 g |
| Open Bath Chamber | Warner Instruments | RC-40HP | High Profile |
| Glass Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-102 | Circle cover glass. 25 mm diameter |
| High Vacuum Grease | Fisher Scientific | 14-635-5C | 2.0-lb. tube. DOW CORNING CORPORATION 1658832 |
| Quick Exchange Platform | Warner Instruments | QE-1 | 35 mm |
| Stage Adapter | Warner Instruments | SA-20LZ-AL | 16.5 x 10 cm |
| TC SP5 MP multi-photon microscope | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Mai Tai DeepSee Ti-Sapphire Laser | SpectraPhysics | ||
| Laser Safety Box | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Leica Application Suite X (LAS X) Software | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Photoshop CS 6 Version 13.0 x64 Software | Adobe | ||
| iMovie Version 10.1.4 Software | Apple |
References
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