Summary
En kombination av avancerade optiska tekniker för laserscanning mikroskopi med lång våglängd flera photon fluorescens excitation implementerades för att fånga högupplösta, tredimensionella, realtid avbildning av neural crest migration i Tg (sox10:EGFP) och Tg (foxd3:GFP) zebrafiskar embryon.
Abstract
Medfödd öga och kraniofaciala anomalier återspeglar störningar i den neural crest, en övergående befolkning av flyttande stamceller som ger upphov till många typer av celler i hela kroppen. Förstå biologin av den neural crest har begränsats, vilket återspeglar bristande genetiskt eftertraktansvärda modeller som kan studeras i vivo och i realtid. Zebrafisk är en särskilt viktig utvecklingsmässiga modell för att studera flyttande cellpopulationer, såsom den neural crest. För att undersöka neural crest migration in i tredje ögat, implementerades en kombination av avancerade optiska tekniker för laserscanning mikroskopi med lång våglängd flera photon fluorescens excitation för att fånga högupplösta, tredimensionella, realtid videor av utveckla ögat i transgena zebrafiskar embryon, nämligen Tg (sox10:EGFP) och Tg (foxd3:GFP), som sox10 och foxd3 har visats i ett flertal djurmodeller att reglera tidiga neural crest differentiering och sannolikt representerar markörer för neural crest celler. Flera photon time-lapse imaging användes för att urskilja den beteende och flyttande mönster två neural crest cellpopulationer bidrar till tidig öga utveckling. Detta protokoll ger information för att generera tidsförlopp videor under zebrafiskar neural crest migreringen, som ett exempel, och ytterligare kan användas för att visualisera den tidiga utvecklingen av många strukturer i zebrafiskar och andra modellorganismer.
Introduction
Medfödda ögonsjukdomar kan orsaka barndom blindhet och beror ofta på avvikelser i den kraniala neural crest. Neural crest celler är övergående stamceller som kan uppstå från neuralrörsdefekter och bildar många vävnader i hela kroppen. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 Neural crest celler, härrör från prosencephalon och mesencephalon, ge upphov till ben och brosk i mellanansiktet och frontala regioner, och iris, hornhinnan, trabekelverket och sklera i främre segmentet av ögat. 4 , 6 , 7 , 8 Neural crest celler från rhombencephalon form faryngeal arches, käken och hjärt utflöde tarmkanalen. 1 , 3 , 4 , 9 , 10 studier har belyst de bidrag av den neural crest till okulär och periokulära utveckling, betonar vikten av dessa celler i ryggradsdjur öga utveckling. Faktiskt, störningar av neural crest cellmigration och differentiering leda till kraniofaciala och okulär anomalier som observerats i Axenfeld-Rieger syndrom och Peters Plus syndrom. 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 således en omfattande förståelse av migration, proliferation och differentiering av dessa neural crest celler kommer att ge inblick i komplexiteten bakom medfödda ögonsjukdomar.
Zebrafiskar är en kraftfull modellorganism för att studera okulär utveckling, som strukturerar av zebrafisk ögat liknar motsvarigheterna hos däggdjur, och många gener är evolutionärt bevarade mellan zebrafiskar och däggdjur. 18 , 19 , 20 dessutom Sebrafisken embryon är transparent och ovipar, underlättar visualisering av ögat utveckling i realtid.
Expanderande på tidigare publicerade arbete,6,7,20 flyttande mönster av neural crest celler beskrevs med flera photon fluorescens time-lapse imaging på transgena zebrafiskar linjer märkt med grönt fluorescerande protein (GFP) under SRY (sex-bestämma region Y) transkriptionell kontroll-fält 10 (sox10) eller Forkhead låda D3 (foxd3) genen regulatoriska regioner. 21 , 22 , 23 , 24. flera photon fluorescens time-lapse imaging är en kraftfull teknik som kombinerar de avancerade optiska teknikerna av laserscanning mikroskopi med lång våglängd flera photon fluorescens magnetisering att fånga högupplösta, tredimensionella bilder av prov märkta med fluorophores. 25 , 26 , 27 användning av flera photon lasern har tydliga fördelar jämfört med standard konfokalmikroskopi, inklusive ökad vävnad penetration och minskad fluorophore blekning.
Två distinkta populationer av neural crest celler varierar i tidpunkten för migration och flyttande vägar med den här metoden och var diskriminerade, nämligen foxd3-positiv neural crest celler i periokulära mesenchyme och utveckla öga och sox10-positiv neural crest celler i de kraniofaciala mesenchyme. Med den här metoden introduceras en strategi att visualisera migration av okulär och kraniofaciala neural crest migration i zebrafiskar, vilket gör det lätt att observera reglerade neural crest migrering i realtid under utveckling.
Detta protokoll ger information för att generera tidsförlopp videor under tidig öga utveckling i Tg (sox10:EGFP) och Tg (foxd3:GFP) transgena zebrafiskar, som ett exempel. Detta protokoll kan tillämpas ytterligare för högupplösta, tredimensionella, realtid visualisering av den tidiga utvecklingen av någon okulär och kraniofaciala struktur som härrör från neural crest celler i zebrafiskar. Denna metod kan dessutom ytterligare tillämpas för visualisering av utvecklingen av andra vävnader och organ i zebrafiskar och andra djurmodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Flera photon fluorescens time-lapse imaging genereras en serie videoklipp som avslöjade flyttmönster av kraniala neural crest celler som ger upphov till de kraniofaciala strukturer och främre segmentet av ögat i Tg (sox10:EGFP) och Tg (foxd3:GFP) zebrafiskar linjer. Som ett exempel migrera sox10 -positiva neural crest celler mellan 12 och 30 hpf från kanten av neuralrörsdefekter i regionen kraniofaciala (Video 1, figur 2). Cellerna från prosencephalon och mesencephalon migrera dorsala och ventrala att utveckla ögat att befolka de periokulära mesenchyme. Dessutom, bildar dessa sox10 -positiva celler frontonasal processen. Neural crest celler från rhombencephalon migrera ventralt och ge upphov till faryngala valven. Time-lapse avbildning av foxd3-positiva neural crest celler mellan 30 och 60 hpf visade att dessa celler migreras mellan optic cup och ytan ektoderm och genom okulär spricka (Video 2, diagram 3). Dessa foxd3-positiva celler coalesced runt linsen, bildar iris stroma.
Figur 1 . Setup. A. varje komponent av embryot montering apparater, inklusive öppet bad avdelningen, snabbt utbyte plattform och scenen adapter. B. montering av öppet bad kammaren. C. tillägg av 2% agaros lösning (60-70 ° C) till öppen bad avdelningen. D. placering av embryot i öppet bad kammaren under en fluorescerande Mikroskop. E. Embryo (24 hpf) placerad sidled i mitten av polymeriserat agaros lösningen i öppet bad kammaren. F. tillägg av media på ytan av polymeriserat agaros lösningen att helt täcka embryot i öppet bad kammaren. G. öppet bad avdelningen placeras i snabb exchange-plattformen och placerad i scenen adaptern. H. placering av embryot Montera apparaten på scenen av mikroskopet multi fotonen. I. Laser värdeskåp. Skjutdörrar (1 och 2) för påfyllning öppna kammaren indikeras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Representant deconvolved och max-projicerade bilder från flera photon time-lapse avbildning av en Tg (sox10:EGFP) zebrafiskar embryo från 12 till 30 hpf. De sox10 -positiva cellerna migrerade från prosencephalon (P) och mesencephalon (M) att fylla de periokulära mesenchyme (den streckad cirkeln betecknar ögat) och frontonasal processen (öppen pil). Sox10 -positiva celler från rhombencephalon (R) migreras ventralt för att bilda faryngala valv (stängda pil). Bilderna var erhållits varje 20 min under tidsramen och sys ihop för att skapa Video 1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . Företrädare för deconvolved och max-projicerade bilder från flera photon time-lapse avbildning av en Tg(foxd3:GFP) zebrafiskar embryo från 24 till 48 hpf. Foxd3 -positiva celler trädde i den främre kammaren i ögat (asterisk betecknar lins) mellan ytan ektoderm och optic cup, med fler celler lokaliserad till dorsala (”D”)-bakre (”P”) Kvadranten jämfört med främre (”A”) och ventrala (”V”) kvadranter. Dessutom flyttade foxd3 -positiva celler intill och genom okulär spricka. Bilderna var erhållits varje 20 min under tidsramen och sys ihop för att skapa Video 2. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 . Företrädare för deconvolved och max-projicerade bilder från flera photon time-lapse avbildning av en Tg(foxd3:GFP) zebrafiskar embryo från 30 till 60 hpf. Foxd3 -positiva celler trädde i den främre kammaren i ögat (yttre streckad cirkel betecknar perifera kanter i ögat, inre streckad cirkel betecknar lins) mellan ytan ektoderm och optic cup, med fler celler lokaliserad till dorsala (”d”)-bakre (”p”) Kvadranten jämfört med den främre (”a”) och ventrala (”v”) kvadranter. Dessutom foxd3 -positiva celler flyttade intill och genom okulär spricka (vit pilspetsen betecknar migrerar neural crest, röd streckad linje avgränsas okulär fissur). Vid 60 hpf, foxd3-positiva celler helt omringade linsen (stängda pilar), som anger stängningen av sprickan. Dessutom på 60 hpf, foxd3 uttrycktes också i fotoreceptorer (öppen pilspets), vilket inte var associerade med uttryck för denna transkriptionsfaktor i neural crest celler. Bilderna var erhållits varje 20 min under tidsramen och sys ihop för att skapa Video 3. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Video 1. Time-lapse video av en Tg (sox10:EGFP) zebrafiskar embryo från 12 till 30 hpf. Asterisken betecknar ögat. Vänligen klicka här för att ladda ner denna video.
Video 2. Time-lapse video av en Tg (foxd3:GFP) zebrafiskar embryo från 24 till 48 hpf. Asterisken betecknar linsen. Asterisken betecknar den okulära sprickan. d, dorsala; v, ventrala; p, bakre; a, främre. Vänligen klicka här för att ladda ner denna video.
Video 3. Time-lapse video av en Tg (foxd3:GFP) zebrafiskar embryo från 30 till 60 hpf. Asterisken betecknar linsen. Pilen anger den okulära sprickan. d, dorsala; v, ventrala; p, bakre; a, främre. Vänligen klicka här för att ladda ner denna video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flera photon time-lapse imaging gör i vivo spårning av övergående och flyttande cellpopulationer. Denna kraftfulla teknik kan användas för att studera embryonala processer i realtid, och i den aktuella studien, förbättrade resultaten av denna metod den aktuella kunskapen om neural crest cellmigration och utveckling. Tidigare time-lapse imaging studier utnyttjar vanligtvis confocal microscopy för laserscanning. 29 , 30 , 31 , 32 här presenterar vi användning av en multi photon-teknik, vilket har många fördelar jämfört med traditionella konfokalmikroskopi. Grunden för flera foton mikroskopi är att två fotoner av längre infraröda våglängder används att excitera fluorophore. Som ett resultat finns det mindre spridning och därmed minskad bakgrund, möjliggör djupare vävnad penetration, uppnå imaging djup som överstiger 1 mm i biologisk vävnad med effektivare upptäckt än konfokalmikroskopi. Dessa egenskaper också minska fototoxicitet, vilket är viktigt med upprepad och täta bild förvärv. 25 , 26 , 27 från dessa egenskaper, två-foton mikroskopi kan bilden hela-orgel preparat och vävnad i små djurbaserade modeller, (t.ex. möss, zebrafiskar embryon 12 hpf - som i fallet med den aktuella studien). Ytterligare, dessa små djurmodeller aktivera användningen av genetiskt kodade fluorescerande proteiner, som kan vara lokaliserade i vävnaden av intresse. Användning av flera foton mikroskopi kan således kraftigt öka bild förvärv för time-lapse experiment.
Det finns många steg i detta protokoll, som beror på vilken typ av multi photon laser och detection system som används. De flesta problem med detta protokoll med laser inställningar och förvärvet av bilder baserat på det system för identifiering. Kunskaper om det enskilda systemet och tillgång till teknisk support är kritiska. Tidigare erfarenhet med confocal laserscanning mikroskopi är dessutom bra för felsökning. Dessutom kan det ursprungliga systemet ställa in vara tidskrävande. Men när systemet ställa in är klar, krävs bara små justeringar normalt när du använder de samma transgena linjerna.
I den aktuella studien användes zebrafiskar embryon mellan 12 och 60 hpf för dessa experiment. Under denna åldersgrupp som är embryon små, enkelt inbäddade i agaros och lätt sövda med tricaine. Dock embryon kan bli tillväxt och försenad utvecklingsmässigt beroende på längden av experimentet. Vård måste därför vidtas för att säkerställa att embryot är korrekt iscensatt i slutet av experimentet.
Flera photon time-lapse imaging ger högupplösta, tredimensionella, realtid visualisering av cellmigration, som inte bara förbättrar förmågan att studera i vivo zebrafiskar embryogenes, men kan också tillämpas på många andra system. Även om protokollet beskrivs fokuserar på zebrafiskar neural crest cellmigration, kan denna teknik enkelt anpassas för andra imaging ändamål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Detta arbete fick ekonomiskt stöd genom bidrag från National Eye Institute National Institutes of Health (K08EY022912-01) och Vision forskning Core (P30 EY007003).
Acknowledgments
Författarna vill tacka Thomas Schilling för vänligt gifting Tg (sox10:eGFP) fisk och Mary Halloran för vänligt gifting Tg(foxd3:GFP) fisken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Breeding Tanks with Dividers | Aquaneering | ZHCT100 | Crossing Tank Set (1.0-liter) Clear Polycarbonate with Lid and Insert |
| M205 FA Combi-Scope | Leica Microsystems CMS GmbH | Stereofluorescence Microscope - FusionOptics and TripleBeam | |
| Sodium Chloride | Millipore (EMD) | 7760-5KG | Double PE sack. CAS No. 7647-14-5, EC Number 231-598-3 |
| Potassium Chloride | Millipore (EMD) | 1049380500 | Potassium chloride 99.999 Suprapur. CAS No. 7447-40-7, EC Number 231-211-8. |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | Poly bottle; 500 g. CAS No. 10035-04-8 |
| Magnesium Sulfate (Anhydrous) | Millipore (EMD) | MX0075-1 | Poly bottle; 500 g. CAS No. 7487-88-9, EC Number 231-298-2 |
| Methylene Blue | Millipore (EMD) | 284-12 | Glass bottle; 25 g. Powder, Certified Biological Stain |
| Sodium Bicarbonate | Millipore (EMD) | SX0320-1 | Poly bottle; 500 g. Powder, GR ACS. CAS No. 144-55-8, EC Number 205-633-8 |
| N-Phenylthiourea | Sigma | P7629-25G | >98%. CAS Number 103-85-5, EC Number 203-151-2 |
| Dimethylsulfoxide | Sigma | D8418-500ML | Molecular Biology grade. CAS Number 67-68-5, EC Number 200-664-3 |
| Tricaine Methanesulfonate | Western Chemical Inc. | MS222 | Tricaine-S |
| Low-Melt Agarose | ISC Bioexpress | E-3112-25 | GeneMate Sieve GQA Low Melt Agarose, 25 g |
| Open Bath Chamber | Warner Instruments | RC-40HP | High Profile |
| Glass Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-102 | Circle cover glass. 25 mm diameter |
| High Vacuum Grease | Fisher Scientific | 14-635-5C | 2.0-lb. tube. DOW CORNING CORPORATION 1658832 |
| Quick Exchange Platform | Warner Instruments | QE-1 | 35 mm |
| Stage Adapter | Warner Instruments | SA-20LZ-AL | 16.5 x 10 cm |
| TC SP5 MP multi-photon microscope | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Mai Tai DeepSee Ti-Sapphire Laser | SpectraPhysics | ||
| Laser Safety Box | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Leica Application Suite X (LAS X) Software | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Photoshop CS 6 Version 13.0 x64 Software | Adobe | ||
| iMovie Version 10.1.4 Software | Apple |
References
- Barembaum, M., Bronner-Fraser, M. Early steps in neural crest specification. Sem Cell Dev Biol. 16, 642-646 (2005).
- Gage, P. J., Rhoades, W., Prucka, S. K., Hjalt, T. Fate maps of neural crest and mesoderm in the mammalian eye. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (11), 4200-4208 (2005).
- Minoux, M., Rijli, F. M. Molecular mechanisms of cranial neural crest cell migration and patterning in craniofacial development. Development. 137, 2605-2621 (2010).
- Trainor, P. A. Specification of neural crest cell formation and migration in mouse embryos. Sem Cell Dev Biol. 16, 683-693 (2005).
- Johnston, M. C., Noden, D. M., Hazelton, R. D., Coulombre, J. L., Coulombre, A. Origins of avian ocular and periocular tissues. Exp Eye Res. 29, 27-43 (1979).
- Bohnsack, B. L., Kahana, A. Thyroid hormone and retinoic acid interact to regulate zebrafish craniofacial neural crest development. Dev Biol. 373, 300-309 (2013).
- Chawla, B., Schley, E., Williams, A. L., Bohnsack, B. L. Retinoic acid and pitx2 regulate early neural crest survival and migration in craniofacial and ocular development. Birth Defects Res B Dev Reprod Toxicol. , (2016).
- Trainor, P. A., Tam, P. P. L. Cranial paraxial mesoderm and neural crest cells of the mouse embryo-codistribution in the craniofacial mesenchyme but distinct segregation in branchial arches. Development. 121 (8), 2569-2582 (1995).
- Hong, C. S., Saint-Jeannet, J. P. Sox proteins and neural crest development. Sem Cell Dev Biol. 16, 694-703 (2005).
- Steventon, B., Carona-Fontaine, C., Mayor, R. Genetic network during neural crest induction: from cell specification to cell survival. Sem Cell Dev Biol. 16, 647-654 (2005).
- Dressler, S., et al. Dental and craniofacial anomalies associated wth Axenfeld-Rieger syndrome with PITX2 mutation. Case Report Med. , 621984 (2010).
- Ozeki, H., Shirai, S., Ikeda, K., Ogura, Y. Anomalies associated with Axenfeld-Rieger syndrome. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 237 (9), 730-734 (1999).
- Strungaru, M. H., Dinu, I., Walter, M. A. Genotype-phenotype correlations in Axenfeld-Rieger malformation and glaucoma patients with FOXC1 and PITX2 mutations. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48, 228-237 (2007).
- Tumer, Z., Bach-Holm, D. Axenfeld-Rieger syndrome and spectrum of Pitx2 and Foxc1 mutations. Eur J Hum Genet. 17, 1527-1539 (2009).
- Schoner, K., et al. Hydrocephalus, agenesis of the corpus callosum, and cleft lip/palate represent frequent associations in fetuses with Peters plus syndrome and B3GALTL mutations. Fetal PPS phenotypes, expanded by Dandy Walker cyst and encephalocele. Prenat Diagn. 33 (1), 75-80 (2013).
- Aliferis, K., et al. A novel nonsense B3GALTL mutation confirms Peters plus syndrome in a patient with multiple malformations and Peters anomaly. Ophthalmic Genet. 31 (4), 205-208 (2010).
- Lesnik Oberstein,, S, A., et al. Peters Plus syndrome is caused by mutations in B3GALTL, a putative glycosyltransferase. Am J Hum Genet. 79 (3), 562-566 (2006).
- Brittijn, S. A., et al. Zebrafish development and regeneration: new tools for biomedical research. Int J Dev Biol. 53, 835-850 (2009).
- Bohnsack, B. L., Kasprick, D., Kish, P. E., Goldman, D., Kahana, A. A zebrafish model of Axenfeld-Rieger Syndrome reveals that pitx2 regulation by retinoic acid is essential for ocular and craniofacial development. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (1), 7-22 (2012).
- Williams, A. L., Eason, J., Chawla, B., Bohnsack, B. L. Cyp1b1 regulates ocular fissure closure through a retinoic acid-independent pathway. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (2), 1084-1097 (2017).
- Curran, K., Raible, D. W., Lister, J. A. Foxd3 controls melanophore specification in the zebrafish neual crest by regulation of Mitf. Dev Biol. 332 (2), 408-417 (2009).
- Dutton, K., Dutton, J. R., Pauliny, A., Kelsh, R. N. A morpholino phenocopy of the colourless mutant. Genesis. 30 (3), 188-189 (2001).
- Dutton, K. A., et al. Zebrafish colourless encodes sox10 and specifies non-ectomesenchymal neural crest fates. Development. 128 (21), 4113-4125 (2001).
- Kucenas, S., Takada, N., Park, H. C., Woodruff, E., Broadie, K., Appel, B. CNS-derived glia ensheath peripheral nerves and mediate motor root development. Nat Neurosci. 11, 143-151 (2008).
- Denk, W., Strickler, J., Webb, W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Denk, W., Delaney, K. Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy. J Neurosci Methods. 54 (2), 151-162 (1994).
- Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle developmnt to changes in retinoic acid and insulin-like growth factor signaling. PLoS ONE. 6, e22991 (2011).
- Gfrerer, L., Dougherty, M., Laio, E. C. Visualization of craniofacial development in the sox10:kaede transgenic zebrafish line using time-lapse confocal microscopy. J Vis Exp. (79), e50525 (2013).
- Lopez, A. L. R., Garcai, M. D., Dickinson, M. E., Larina, I. V. Live confocal microscopy of the developing mouse embryonic yolk sac vasculature. Methods Mol Biol. 1214, 163-172 (2015).
- McGurk, P. D., Lovely, C. B., Eberhart, J. K. Analyzing craniofacial morphogenesis in zebrafish using 4D confocal microscopy. J Vis Exp. (83), e51190 (2014).
- Nowotschin, S., Ferrer-Vaquer, A., Hadjantonakis, A. K. Imaging mouse development with confocal time-lapse microscopy. Methods Enzymol. 476, 351-377 (2010).
