Développement de dosage pour une Quantification contenue élevée de Formation globale de protéine mutante Sod1 dans les cellules vivantes

L’objectif global de cette expérience est de développer un test pour étudier l’effet de petites molécules dans la modulation de l’agrégation de protéines mal repliées d’une manière dépendante du temps et de la dose. Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés pour le développement du test cellulaire, et son utilisation est pour les techniques de criblage à haut contenu. Le principal avantage de cette technique est de fournir une méthode simple pour détecter et quantifier l’agrégation de protéines survenant dans plusieurs troubles neurodégénératifs.

L’implication de cette technique s’étend vers le traitement potentiel des maladies neurodégénératives, telles que la SLA, car elle propose une méthode simple qui permet de développer un dosage cellulaire et d’effectuer un criblage pour les modérateurs de petites molécules. Pour démarrer la production du virus, avant la transfection du plasmide, les lymphocytes T HEK-293 se séparent à 30 à 40 % de confluence dans une boîte de culture tissulaire de 10 centimètres et 10 millilitres de milieu de culture cellulaire. Incuber la plaque de culture dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant la nuit.

Le lendemain, préparez une solution de transfection d’ADN avec des plasmides d’emballage à vecteur lentiviral, 125 microlitres d’une molaire de chlorure de calcium et ajoutez de l’eau distillée pour ajuster le volume à 500 microlitres. Ajoutez délicatement 500 microlitres de tampon HEPS 0,05 molaire et incubez pendant 10 minutes à température ambiante. Après cela, remplacez le milieu de cellules T HEK-293 par 10 millilitres de milieu de culture frais préchauffé sans antibiotiques mélangé à un millilitre de solution de transfection d’ADN.

Incuber à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone dans un incubateur pendant la nuit. Remplacer le surnageant cellulaire par un milieu de culture frais le lendemain et incuber à nouveau pendant la nuit. Enfin, le lendemain, récoltez le surnageant et transférez-le dans un tube de 15 millilitres.

Pour éliminer les cellules mortes et les débris, centrifugez le tube à 500 fois g pendant cinq minutes. Pour purifier davantage le surnageant, passez-le à travers un filtre de 0,45 micromètre à l’aide d’une seringue de 60 millilitres. Ensuite, distribuez immédiatement le surnageant filtré dans des aliquotes à usage unique de 300 microlitres.

Pour préparer les cellules à la transduction, divisez-les pour être infectées à 60 % de confluence dans une plaque de culture tissulaire à six puits dans deux millilitres de DMAM complété par 10 % de FBS. Incuber les cellules dans un incubateur à 37 degrés Celsius à 5 % de dioxyde de carbone pendant la nuit. Le lendemain, décongeler une aliquote du lentivirus congelé sur de la glace pour chaque utilisation.

Pendant ce temps, réchauffez le milieu de culture cellulaire contenant le sérum compatible avec la lignée cellulaire d’intérêt. Une fois le virus complètement décongelé, diluez-le dans du DMEM dans de nouveaux tubes à micro-centrifuger de 1,5 millilitre. Ajustez ensuite le volume à un millilitre avec un sérum réduit medium.

Ensuite, ajoutez deux microlitres de polybrène à un millilitre de virus par milieu et mélangez bien par pipetage. Ajoutez un millilitre de ce mélange dans les cellules et incubez à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Après l’incubation, retirez le milieu contenant le virus et remplacez-le par du DMEM normal complété par 10 % de FBS et retournez les cellules dans l’incubateur.

Surveillez la croissance cellulaire et changez de milieu tous les deux jours Lorsque les cellules atteignent la confluence, élargissez chaque puits de la boîte à six puits en une plaque de culture tissulaire de 10 centimètres. Déplacez les plaques dans l’incubateur. Enfin, économisez 1,5 fois 10 à la 4ème cellule par puits et 50 microlitres de DMEM sur 384 plaques de dosage de puits.

Vérifiez ensuite le niveau d’expression de la protéine marquée YFP au microscope. Si l’expression indique un rapport signal/bruit égal ou supérieur à trois, préparez le stock de cellules pour la lignée cellulaire correspondante. Pour le transfert de composé, sur une plaque de polypropylène de stockage à 384 puits, ajouter des dilutions en série de composés par la série standard de une à trois dilutions.

Ensuite, à l’aide d’un manipulateur de liquide équipé d’une tête capillaire 384, répartissez 0,25 microlitre d’inhibiteurs de protéasome sur des plaques de dosage noires à 384 puits vides et à fond plat. Ensuite, ensemencez 1,5 fois 10 jusqu’à la 4ème cellule sur ces plaques. Incuber à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 24 heures.

Avant d’imager la lignée cellulaire traitée avec des inhibiteurs de protéasome, ajoutez 10 microlitres de DMEM préchauffé avec une solution de coloration et incubez à température ambiante pendant 10 minutes. Après la coloration, démarrez le logiciel d’exploitation du microscope automatisé en sélectionnant l’onglet du microscope. Tout d’abord, sélectionnez l’onglet de configuration, puis sélectionnez 20 fois objectif dans le bon type de plaque.

Pour permettre une mise au point correcte avec différents types de plaques, assurez-vous que l’appelant est réglé sur la bonne valeur sur l’objectif. Ensuite, sélectionnez l’exposition un. Réglez la hauteur de mise au point sur zéro micromètre, puis sélectionnez la mise au point.

Une fois qu’il est mis au point, exposez la première caméra. Pour optimiser le plan d’exposition, ajustez la hauteur de mise au point et cliquez sur prendre la hauteur. Modifiez les temps d’exposition et la puissance du laser pour une intensité de pixel maximale d’environ 3000 pixels et enregistrez les paramètres d’exposition.

Sélectionnez l’onglet Définition de l’expérience, créez une mise en page et une sous-mise en page. Ensuite, faites glisser et déposez l’exposition de la mise en page, l’image de référence, le fichier de recadrage oblique et la sous-mise en page appropriés. Enregistrez ensuite l’expérience.

Enfin, sélectionnez l’onglet Expérience automatique et acquérez des images. Pour les images à deux canaux, sélectionnez d’abord l’algorithme logiciel pour segmenter les objets primaires, tels que les noyaux, le cytosol et les agrégats. Tout d’abord, distribuez 0,25 microlitre d’inhibiteur de protéasome dissous dans du DMSO à 100 % ou du DMSO sur des plaques à fond plat à 384 puits.

Sur la même plaque, ensemencez manuellement 1,5 fois 10 à la 4e cellule par puits dans 50 microlitres de DMEM. Ensuite, réglez l’unité de contrôle de l’environnement du système de microscope à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Faites fonctionner le microscope en mode fluorescent grand champ et, comme paramètres logiciels, choisissez LWD 20 fois objectif non confocal, mode non confocal, quatre champs par puits et intervalle de capture d’une heure.

Ensuite, sélectionnez l’algorithme approprié pour segmenter l’objet principal, tel que le cytosol et les agrégats. Ajustez le seuil d’arrière-plan et les paramètres de contraste si nécessaire. Les lignées cellulaires testées transduites avec le type sauvage SOD-1 et le mutant SOD-1 A4V sont restées saines, ont montré des niveaux d’expression élevés et un marquage phi à long terme, quelle que soit la forme SOD.

Le traitement par l’inhibiteur du protéasome ALLN pendant 24 heures a favorisé l’accumulation d’agrégats SOD-1 A4V YFP dans les cellules HEK-293, mais pas dans les cellules SOD-1 Wild Type YFP transduites. De plus, il y avait de très faibles niveaux d’agrégation dans les lignées cellulaires U2 OS et SH-SY5Y SOD-1 A4V YFP transduites avec les mêmes vecteurs. Après l’ensemencement des cellules en présence ou en l’absence d’ALLN, elles ont été surveillées pour la formation d’agrégats pendant une période de 50 heures.

La formation globale d’ALLN a atteint un plateau après 24 heures et est restée stable au cours des 12 heures suivantes. De plus, la densité cellulaire a considérablement diminué après 28 heures en raison de l’effet cytotoxique de l’ALLN, tandis que le nombre de cellules a augmenté dans le contrôle négatif traité au DMSO. Des cellules SOD-1 A4V YFP cultivées en présence d’inhibiteurs de protéasome pendant 24 heures ont été colorées avec une solution de Hoechst.

La toxicité relative de trois inhibiteurs différents du protéasome a été quantifiée en mesurant le nombre de lignées cellulaires adhérentes restantes dans le puits étiqueté avec un colorant Hoechst. Le nombre total de cellules a diminué en réponse à l’augmentation de la dose d’inhibiteurs de la protéase. À l’inverse, le pourcentage de cellules exprimant les agrégats SOD-1 A4V augmentait avec la concentration d’inhibiteur de protéase.

Lors de ce processus, il est important de se rappeler que la qualité des cellules influencera considérablement votre résultat. Il est donc important de déterminer que les cellules sont exemptes de microplasmes et qu’elles sont saines tout au long des étapes. Suite à ce processus, une autre méthode d’imagerie peut être utilisée afin de répondre à des questions supplémentaires concernant la dégradation de la protéine ou l’interaction de la protéine avec d’autres en utilisant le transfert d’énergie de résonance.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de générer les outils nécessaires pour tester le devenir des protéines dans plusieurs cellules vivantes à l’aide d’une analyse d’image à haut contenu. Cette méthode peut donc donner un aperçu de l’agrégation des protéines telle qu’elle se produit dans des modèles cellulaires simples. Il peut également être appliqué à d’autres systèmes tels que les neurones différenciés des cellules souches pluripotentes induites spécifiques au patient.