Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Een gist 2-Hybrid scherm in Batch om te vergelijken eiwitinteractie

Published: June 6, 2018 doi: 10.3791/57801
Automatic Translation
1, 1, 1
1Molecular Physiology and Biophysics, University of Iowa

Summary

Batch-verwerking van gist 2-hybrid schermen zorgt voor directe vergelijking van de profielen van de interactie van meerdere aas eiwitten met een zeer complexe verzameling prooi fusion eiwitten. We beschrijven hier, verfijnde methoden, nieuwe reagentia en het implementeren van het gebruik ervan voor dergelijke schermen.

Abstract

Screening voor eiwit-eiwitinteractie met behulp van de gist 2-hybrid test is al lang een effectief instrument, maar het gebruik ervan grotendeels beperkt gebleven tot de ontdekking van hoge-affiniteit interactors die in de bibliotheek van interagerende kandidaten zijn hoogverrijkt. In een traditionele indeling, kan de gist 2-hybrid assay opleveren teveel kolonies om te analyseren wanneer uitgevoerd bij lage striktheid waar lage affiniteit interactors kunnen worden gevonden. Bovendien, zonder een uitgebreide en volledige ondervraging van dezelfde bibliotheek tegen verschillende aas plasmiden, een vergelijkende analyse niet worden bereikt. Hoewel sommige van deze problemen kunnen worden opgelost met behulp van gekleed prooi Bibliotheken, kunnen de kosten en de infrastructuur die nodig is om dergelijke schermen onbetaalbaar. Als alternatief hebben we aangepast de gist 2-hybrid bepaling om tegelijkertijd tientallen van voorbijgaande aard bloot te leggen en statische eiwitinteractie binnen één scherm met behulp van een strategie genoemd DEEPN (dynamische verrijking voor evaluatie van de netwerken van de proteïne), die omvat high-throughput DNA sequencing en berekening de ontwikkeling van een populatie van plasmiden, die coderen van interagerende partners te volgen. Hier beschrijven we aangepaste reagentia en protocollen waarmee een DEEPN scherm op eenvoudige en lonende wijze worden uitgevoerd.

Introduction

Een volledig inzicht in biologische processen van de cel is afhankelijk van het vinden van de Eiwit-interactienetwerken die ten grondslag liggen aan hun moleculaire mechanismen. Een benadering te identificeren eiwitinteractie is de gist 2-hybrid assay (Y2H), die werkt door het monteren van een goed functionerende chimeer transcriptiefactor zodra twee domeinen van de proteïne van belang aan elkaar1 binden. Een typische Y2H scherm wordt uitgevoerd door het creëren van een bevolking van gist dat huizen van beide een bibliotheek van plasmiden, interacterende eiwitten, gesmolten tot een transcriptionele activator codering (bv., 'prooi' fusieproteïne) en een bepaalde 'lokaas' plasmide bestaat uit het eiwit gesmolten tot een DNA-bindende-domein (bijvoorbeeld, de Gal4 DNA-bindend domein dat zich aan de Gal4-upstream activerend volgorde bindt) van belang. Een van de belangrijkste voordelen van de Y2H-aanpak is dat het is relatief eenvoudig en goedkoop uit te voeren in een typische laboratorium voor moleculaire biologische routinewerk2 uitgerust. Echter als traditioneel uitgevoerd, monsters een gebruiker afzonderlijke kolonies die zich bij de selectie voor een positieve interactie met de Y2H voordoen. Dit beperkt ernstig het aantal bibliotheek 'prooi' klonen die kunnen worden onderzocht. Dit probleem wordt nog verergerd wanneer de overvloed aan een bepaalde interactie prooi zeer hoog ten opzichte van de anderen is, het afnemen van de kans op interactie van lage overvloed prooi plasmiden opsporen.

Een oplossing voor het gebruik van het Y2H-beginsel in de uitgebreide dekking van de Proteoom is het gebruik van een matrix-indeling aanpak waarin een array met daarin bekende individuele prooi plasmiden digitaal kan worden ondervraagd. Een dergelijke benadering vereist echter een infrastructuur die niet gemakkelijk toegankelijk te laten of kosteneffectieve aan individuele onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het definiëren van de interactome van een klein aantal proteïnen of domeinen3. Bovendien zou zeer complexe prooi bibliotheken die meerdere fragmenten van interacterende eiwitten kunnen coderen de grootte van deze matrix arrays uitbreiden naar onpraktisch maten. Een alternatief is het uitvoeren van testen met complexe bibliotheken in batches en beoordelen van de aanwezigheid van interagerende klonen met massale parallelle high-throughput sequencing4. Dit kan worden toegepast om de test op de aanwezigheid van plasmiden met prooi, die zich voordoen in meerdere kolonies met behulp van een typische Y2H opgemaakt aanpak in welke gist cellen huisvesting een interactie paar fusion eiwitten zijn toegestaan om te groeien op een plaat5,6. Dit algemene idee kan worden geaccentueerd ter vergroting van de query van beide meerdere aas en prooi onderdelen op de dezelfde tijd7,8.

Toch veel onderzoeken vereisen dat een gemakkelijker nog meer gericht inspanning op slechts een paar eiwit 'lokaas' en meer kunnen profiteren door een uitputtende en semi-kwantitatieve-query van een enkele complexe prooi-bibliotheek. Wij hebben ontwikkeld en gevalideerd van een aanpak voor het uitvoeren van grootschalige eiwit interactie studies gebruik te maken van een Y2H principe in batch formaat4. Deze maakt gebruik van het tempo van de expansie van een specifieke prooi plasmide als een proxy voor de relatieve sterkte van Y2H interactie9. Diepe sequentiebepaling van alle plasmiden binnen een populatie onderworpen aan normale groei of selectieve groei omstandigheden produceert een volledige kaart van klonen dat de opbrengst van de sterke en zwakke Y2H interacties. Het repertoire van interactors kan worden verkregen en rechtstreeks met elkaar vergeleken in meerdere aas plasmiden. De resulterende workflow genoemd DEEPN (dynamische verrijking voor evaluatie van de netwerken van de eiwitten) kan dus worden gebruikt om te identificeren van differentiële interactomes uit de dezelfde prooi bibliotheken te identificeren van eiwitten, waardoor vergelijking tussen één eiwit vs. andere.

Hier tonen we DEEPN en verbeteringen in de laboratoriumtechnieken die vergemakkelijken het gebruik ervan, die worden beschreven in Figuur 1. Belangrijke verbeteringen zijn onder andere:

Generatie van prooi gist bevolking. Een van de belangrijkste vereisten van DEEPN is het genereren van populaties van gist met verschillende aas plasmiden die de dezelfde verdeling van de plasmide prooi bibliotheken hebben. Gelijkwaardige basislijn populaties van de prooi plasmide bibliotheek zijn essentieel voor hetgeen een exacte vergelijking tussen de interactomes van verschillende lokaas. Dit gebeurt best bij een plasmide bibliotheek al is gehuisvest in een haploïde gist bevolking en een bepaalde aas plasmide betreden die bevolking wordt bereikt door de paring voor de productie van een diploïde. Wij bieden hier een duidelijke handleiding in hoe te maken van dergelijke populaties commerciële bibliotheken gehuisvest in haploïde gist gebruiken. Hoewel we vonden de methoden die het genereren van een groot aantal ze, was de paring totaalrendement van deze commerciële bibliotheek-bevattende giststammen laag. Dus we hebben gebouwd een nieuwe spanning die kan huis prooi bibliotheken die veel meer ze per paring reactie oplevert.

New set van aas plasmiden. Veel huidige plasmiden die uitdrukking geven aan 'lokaas' fusion eiwitten bestaat van de proteïne van belang en een DNA-bindende domein zijn 2µ gebaseerde, waardoor ze hun exemplaaraantal versterken. Deze exemplaaraantal kan heel variabel in de bevolking en leiden tot variabiliteit in het Y2H transcriptionele antwoord. Dit kan op zijn beurt de mogelijkheid om te meten de sterkte van een bepaald eiwit interactie op basis van de reactie van de groei van cellen onder selectie scheeftrekken. Dit kan gedeeltelijk adres met behulp van een laag kopie plasmide, waarvan sommige eerder zoals de verkrijgbare pDEST3210 beschreven zijn. We hebben een nieuwe aas plasmide (pTEF-GBD) die produceert Gal4-DNA-bindende domein fusion eiwitten binnen een TRP1 laag kopie centromeer gebaseerde plasmide uitvoering van het Kanr-resistentie gen waarmee ook klonen van aas fragmenten, zowel stroomopwaarts gebouwd en stroomafwaarts van het domein van Gal4 DNA-bindende.

Nieuwe High-Density Y2H fragment library. We gebouwd een nieuwe plasmide naar huis Y2H prooi bibliotheken en gebruikt het om te bouwen van een uiterst complexe Y2H bibliotheek gemaakt van willekeurig sheared fragmenten van genomic DNA van Saccharomyces cerevisiae. Sequentieanalyse toonde aan dat deze bibliotheek had meer dan 1 miljoen verschillende elementen, veel complexer dan hierboven beschreven gist genomische Y2H plasmide bibliotheken11. Met deze nieuwe bibliotheek waren we kunnen laten zien dat het DEEPN werkstroom robuust genoeg is voor complexe bibliotheken met vele verschillende plasmiden op een wijze die betrouwbaar en reproduceerbaar is.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. voorbereiding van de Media en platen

Opmerking: Alle platen moeten minimaal 2 dagen voor het begin van het protocol worden gemaakt. De media kan worden gemaakt op elk gewenst moment. De gebufferde gist extract pepton dextrose adenine (bYPDA) moet echter geschieden op de dag die zal worden gebruikt. Sommige media wordt gemaakt met behulp van een supplement mix, met een level van adenine dat groter is dan wat wordt meestal gebruikt. Meeste minimale media supplementen geven 10 mg/L adenine. Supplementen met het label '+ 40Ade' opgeven van een totaal van 40 mg/L adenine.

  1. Voorbereiden van de Glucose-oplossing (50% g/v). Voor 1 L, los 500 g D-(+)-Glucose in 800 mL gedestilleerd water in een bekerglas van 1000 mL. Draai volume om 1000 mL met behulp van een gegradueerde cilinder en filter door een 0,2 µm steriele filter in een steriele 1000 mL fles voor de opslag van de media.
  2. Bereiden gistextract pepton dextrose (YPD) platen. Voor 1 L, los 20 g en pepton 10 g gistextract in 800 mL gedestilleerd water in een bekerglas van 1000 mL. Giet in een gegradueerde cilinder, vul tot 960 mL met gedestilleerd water. Giet in een 2.000 mL conische kolf en voeg 15 g agar. Autoclaaf en koel in waterbad 37 ° C tot water bad temperatuur heeft gekoeld tot ongeveer 42-50 ° C. Gebruik een pipet toe 40 mL 50% glucose. Meng goed door zwenken.
    1. Giet een reeks van 100 mm platen met 20 mL media Pipetteer.
  3. Bereiden van Complete synthetische minimale media (CSM)-Trp platen. Voor 1 L, los van 6,7 g gist stikstof Base zonder aminozuren in 800 mL gedestilleerd water in een bekerglas van 1000 mL. Giet in een gegradueerde cilinder, vullen tot 960 mL met gedestilleerd water. Giet in een conische kolf van 2.000 mL en Voeg 0.7 g - Trp-ontmoette dropout mix, 20 mg van methionine en 15 g agar. Autoclaaf en koel in waterbad 37 ° C tot water bad temperatuur heeft gekoeld tot ongeveer 42-50 ° C. Gebruik een pipet toe 40 mL 50% glucose. Meng goed door zwenken.
    1. Giet een reeks van 100 mm platen met 20 mL media Pipetteer.
  4. CSM-Leu-ontmoette platen voor te bereiden. Voor 1 L, Los 10.05 g gist stikstof Base zonder aminozuren in 800 mL gedestilleerd water in een bekerglas van 1000 mL. Giet in een gegradueerde cilinder en vul tot 940 mL met gedestilleerd water. Giet in een conische kolf van 2.000 mL en voeg 1.005 g - Leu-dropout mix en 15 g agar ontmoet. Autoclaaf en koel in waterbad 37 ° C tot water bad temperatuur heeft gekoeld tot ongeveer 42-50 ° C. Gebruik een pipet toe te voegen 60 mL 50% glucose. Meng goed door zwenken.
    1. Giet een reeks van 100 mm platen met 20 mL media Pipetteer.
  5. CSM-Leu-Trp platen voor te bereiden. Voor 1 L, Los 10.05 g gist stikstof Base zonder aminozuren in 800 mL gedestilleerd water in een bekerglas van 1000 mL. Giet in een gegradueerde cilinder, vul dan maximaal 940 mL met gedestilleerd water. Giet in een conische kolf van 2.000 mL en voeg 1.005 g - Trp-Leu + 40Ade dropout mix, 240 mg van adenine en 15 g agar. Autoclaaf en koel in waterbad 37 ° C tot water bad temperatuur heeft gekoeld tot ongeveer 42-50 ° C. Gebruik een pipet toe te voegen 60 mL 50% glucose. Meng goed door zwenken.
    1. Giet een reeks van 100 mm platen met 20 mL media Pipetteer.
  6. CSM-Leu-Trp-zijn platen voor te bereiden. Voor 1 L, Los 10.05 g gist stikstof Base zonder aminozuren in 800 mL gedestilleerd water in een bekerglas van 1000 mL. Giet in een gegradueerde cilinder, vul dan maximaal 940 mL met gedestilleerd water. Giet in een conische kolf van 2.000 mL en Voeg 0.975 g - Trp-Leu-zijn + 40Ade dropout mix, 240 mg van adenine en 15 g agar. Autoclaaf en koel in waterbad 37 ° C tot water bad temperatuur heeft gekoeld tot ongeveer 42-50 ° C. Gebruik een pipet toe te voegen 60 mL 50% glucose. Meng goed door zwenken.
    1. Giet een reeks van 100 mm platen met 20 mL media Pipetteer.
  7. CSM-Leu-Trp-zijne-3AT platen voor te bereiden. Voor 1 L, Los 10.05 g gist stikstof Base zonder aminozuren in 800 mL gedestilleerd water in een bekerglas van 1000 mL. Giet in een gegradueerde cilinder, vul dan maximaal 940 mL met gedestilleerd water. Giet in een conische kolf van 2.000 mL en Voeg 0.975 g - Trp-Leu-zijn + 40Ade dropout mix, 240 mg van adenine en 15 g agar. Autoclaaf en koel in waterbad 37 ° C tot water bad temperatuur heeft gekoeld tot ongeveer 42-50 ° C. Gebruik een pipet toe te voegen 60 mL 50% glucose. Meng in 100 µL van een steriele voorraad van 1 M van 3-amino-1,2,4 triazool (3AT) door zwenken.
    1. Giet een reeks van 100 mm platen met 20 mL media Pipetteer.
  8. LB-Kanr platen voor te bereiden. Voor 1 L, Los 10 g trypton, 5 g gist extract en 10 g NaCl in 800 mL gedestilleerd water in een bekerglas van 1000 mL. Giet in een gegradueerde cilinder, vul tot 1000 mL met gedestilleerd water. Giet in een conische kolf van 2.000 mL en voeg 15 g agar. Autoclaaf en koel in waterbad 37 ° C tot water bad temperatuur heeft gekoeld tot ongeveer 42-50 ° C. Voeg 50 mg kanamycine en meng door het zwenken.
    1. Giet een reeks van 100 mm platen met 20 mL media Pipetteer.
  9. YPD, CSM-Leu-voldaan, CSM-Trp, CSM-Leu-Trp en CSM-Leu-Trp-Hsi media voor te bereiden. Gebruik de bovenstaande procedure voor platen behalve in plaats van het gieten in een erlenmeyer, in een fles van de opslag media giet en het weglaten van de agar.
  10. BYPDA (gebufferde YPDA) voor te bereiden. Steriele YPD media nemen en voeg 200 mg/L adenine in steriel gedistilleerd water. Breng pH op 3.7 met HCl. Filter door een 0,2 µm steriele filter in een steriele fles.
  11. Bereiden transformatie Buffer: 2 M sorbitol, 1 M lithium acetaat (dihydraat) p.a., 10 mM Tris pH 7,6, 0.5 mM EDTA, 0,2 mM calciumchloride in gedestilleerd water. Filtreer door een 0,2 µm steriele filter in een steriele fles.
  12. Bereiden van PEG oplossing: 70% w/v polyethyleenglycol 3350 in gedestilleerd water. Steriliseren in autoclaaf.
  13. Twirl bereiden: 8 M ureum, 4% w/v SDS, 50 mM Tris pH 6.8, 10% v/v glycerol, 0,02% w/v bromophenol blauw in steriel gedistilleerd water.
  14. STE (TE sterke) bereiden: 50 mM Tris, 20 mM EDTA, pH 8,0 in gedestilleerd water. Filtreer door een 0,2 µm steriele filter in een steriele fles.
  15. Bereiden van Zymolase stockoplossing: 10 mg/mL Zymolase 100T in 50 mM kalium fosfaat dibasische pH 7.5, 50% v/v glycerol buffer in steriel gedistilleerd water (opgeslagen bij-20 ° C).

2. klonen en verificatie van aas plasmiden

Opmerking: De bouw van Gal4-DNA-bindende domein plasmiden. Momenteel zijn er een scala aan verkrijgbare en academisch beschikbaar Y2H systemen. DEEPN is geschikt voor veel van deze voorwaarde dat het aas plasmide uitdrukken van de proteïne van belang gesmolten tot een DNA-bindende domein in een TRP1 is-met plasmide. Andere stroomafwaartse eisen zijn die de volgorde onmiddellijk stroomopwaarts van de prooi-bibliotheek invoegen is bekend en dat een positieve interactie van de Y2H kan worden gescoord door de productie van His3 voor selectie in media ontbreekt histidine. Hier beschrijven we gebruik van een nieuwe Y2H aas plasmide (pTEF-GBD, Figuur 2), echter andere Y2H aas plasmiden met inbegrip van de pGBKT7 ook kunnen worden gebruikt. Voor bouw en evaluatie van aas plasmiden beschrijven we gebruik van pTEF-GBD. Als een algemene nota adviseren wij gene synthese te produceren van een open-leesraam die aan de gist codon bias voldoet om goede expressie en gemak met klonen te garanderen. Zorg ervoor dat de klonen regeling voorziet in het aas in-frame met het domein van Gal4 DNA-bindende en dat, wanneer het klonen in de 3'-site, een stop codon de regio aas-codering volgt.

  1. Bereiden de plasmide-vector. Plasmide pTEF-GBD zorgt voor het klonen van een fragment codering van de proteïne van belang 5' of 3' van de regio codering van het domein van de Gal4 DNA-bindende methode van een Assemblaggio rapido. Voor opneming op de 5' site, verteren 3 µg pTEF-GBD met NarI en EcoRI of voor plaatsing op de site 3', verteren met BamHI en XhoI voor 2-4 h. Electrophorese monster in 1% DNA agarose gel met 0,2 - 0,5 µg/mL ethidiumbromide (EtBr) bij 100 V. accijnzen de bp gesneden 5,630 TEF-GBD en zuiveren met behulp van een DNA-gel extractie-kit in overeenstemming met de instructies van de fabrikant en kwantificeren van DNA door absorptie bij 260 nm door spectrofotometer12.
    Opmerking: Generatie van aas-encoding tussenvoegsels. DNA fragmenten coderen proteïnen of eiwit fragmenten van belang kunnen worden gemaakt met behulp van gen synthese en beschikbaar als uncloned fragmenten. Het wordt aangeraden dat codonen zijn geoptimaliseerd voor expressie in Saccharomyces cerevisiae en online tools voor het codon optimalisatie zijn opgenomen in de lijst met materialen.
  2. Voor 5' inbrengen, flank van het fragment van DNA coderen een ATG start codon 5'-TTAAGAAAAACAAACTGTAACGAATTC-3 'en 5'-GCGCCTATGTGTGAACAAAAGCTTATT-3', respectievelijk. Voor 3' inbrengen in het frame met het domein van de bindende Gal4 DNA, het coderen fragment flankeren door 5'-ctgcatatggccatggaggccgaa-3 'en 5'-tagtaactagcataaccccttggggcc-3'.
  3. Voor de bouw van de plasmide, gebruik de methode Assemblaggio rapido zoalsgespecificeerd in de aanwijzingen van de fabrikant voor klonen fragmenten in gesneden pTEF-GBD.
    1. Plaat alle getransformeerd van E. coli op LB-Kanr platen en incubeer gedurende 16-20 uur bij 37 ° C. Kolonies huisvesting pTEF-GBD met de gewenste invoegen kunnen worden geïdentificeerd door PCR versterking met behulp van de oligonucleotides: 5'-CGGTCTTCAATTTCTCAAGTTTCAG-3 ' en 5'-GAGTAACGACATTCCCAGTTGTTC-3' 5' invoegen en 5'-CACCGTATTTCTGCCACCTCTTCC-3' en 5'-GCAACCGCACTATTTGGAGCGCTG-3' voor 3' invoegen. Deze oligonucleotides kunnen ook dienen als inleidingen voor de rangschikking van de invoegen.
    2. Plannen over de voorbereiding van > 10 µg van elk pTEF-GBD afgeleide en pTEF-GBD alleen om materiaal voor Sequencen en gist transformaties.
    3. Gebruik de volgende PCR voorwaarden: 3 min bij 98 ° C, gevolgd door 25 cycli van 30 bij 98 ° C, 30 s s bij 55 ° C, en 2 minuten bij 72 ° C, gevolgd door 5 minuten bij 72 ° C met behulp van een buffer met 2.5 mM MgCl2 , U/100 0,5 µL DNA-polymerase, en merkgebonden buffer.

3. weergave van de Gal4-DNA-bindende domein Fusion eiwitten

  1. Bevoegde gist maken
    1. Streak uit PJ69-4A gist op een bord van YPD door middel van een steriel houten applicator, 1 mm,3 van een-80 ° C schrapen bevroren voorraad en wrijven zachtjes over de YPD plaat. De houten applicator omlaag verplaatsen de plaat zodat elke keer over een ongerepte deel van het oppervlak van de media gaat Incubeer de YPD plaat bij 30 ° C gedurende 2 dagen of totdat één kolonies zichtbaar zijn. Maken van de bevroren voorraad van PJ69-4A gist door schorsing van gist in water of groei media, aan te vullen met DMSO tot 7% en opslaan bij-80 ° C.
    2. Inoculeer een één kolonie in 5 mL van de cultuur van de YPD in een 20 x 150 mm cultuur buis met behulp van een steriele houten applicator en 's nachts groeien bij 30 ° C in een schudden incubator bij 200 omwentelingen per minuut.
    3. Inoculeer 50 mL YPD in een 250 mL steriele kolf met 4 mL van de overnachting cultuur van PJ69-4A giststam. Groeien in een schudden incubator bij 30 ° C, 200 tpm tot een optische dichtheid (OD600) van ongeveer 1.2, zoals bepaald door spectrofotometrie met een standaard 1 cm licht weg. Groei duurt meestal 5-7 h.
    4. Isoleren gist door sedimentatie in een 50 mL conische buis bij 4,696 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur in een benchtop centrifuge. Verwijder het supernatant door dumping in vloeibaar afval. Met behulp van een precisiepipet, resuspendeer de pellet in 5 mL transformatie buffer en transfer naar 15 mL conische buis. Resediment naar Verwijder supernatant en resuspendeer de gist in 1 mL eindvolume van transformatie buffer met een 1000 µL pipet.
    5. Incubeer gistcellen voor 60 min bij 30 ° C terwijl het schudden bij 200 t/min en plaats dan op ijs gedurende 30-90 minuten.
  2. Gist plasmide transformatie.
    1. In 1,5 mL steriele microcentrifuge buis, voeg 1 microgram van pTEF GBD-gebaseerde plasmide en 5 µL van 10 mg/mL zalm sperma vervoerder DNA oplossing. Ook een buis met alleen zalm sperma vervoerder DNA als een transformatie van de negatieve controle. Pipetteer 100 µL celsuspensie van de ijskoude gist aan elke buis toevoegen. Voeg 100 µL van 70% PEG oplossing met een 1000 µL pipet en meng zachtjes door flicking de buis 5 - 10 keer (doen niet vortex).
    2. Incubeer bij 30 ° C, in een schudden incubator bij 200 omwentelingen per minuut gedurende 45 minuten.
    3. Warmte schok bij 42 ° C gedurende 15 minuten.
    4. Sediment in een microcentrifuge bij 845 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur, Pipetteer af en weggeworpen, resuspendeer de pellet in 150 µL van steriel water door pipetteren op en neer en verspreid over het oppervlak van een plaat van CSM-Trp.
    5. Plaats van platen rechts boven in de 30 ° C incubator en incubeer gedurende 2-3 dagen totdat kolonies zichtbaar zijn. Platen mogelijk ondersteboven worden uitgeschakeld om te voorkomen dat condens op het oppervlak van de plaat na incubatie bij 30 ° C gedurende 6-12 uur.
    6. Neem 2-3 kolonies per transformatie en streep als een patch op een bord van de CSM-Trp met behulp van een steriel tandenstoker. Staat u toe te groeien voor 24 h bij 30 ° C.
  3. Lysates voor eiwit expressie maken
    1. Enten van 3 mL van CSM-Trp vloeibare media met een wedstrijd-hoofd-grootte van de gist van de patch en 's nachts groeien bij 30 ° C in een 20 x 150 mm cultuur buis, terwijl schudden bij 200 omwentelingen per minuut. Maak twee overnachting culturen per aas en lege pTEF-GBD vector.
    2. Voeg 1 mL YPD tot elke 3 mL van CSM-Trp overnachting cultuur. Groeien voor 1 h bij 30 ° C, terwijl het schudden bij 200 omwentelingen per minuut. Controleer de OD van cellen door spectrofotometer.
    3. Sediment een equivalent aantal cellen, normaliseren volgens de OD. Gebruik van steriele 1,5 mL van microcentrifuge buizen met een spin 5 min bij 2348 x g bij kamertemperatuur in een microcentrifuge. Gebruik een pipet om weggeworpen. De laatste voorraad komt overeen met een minimum van 2.1 OD.
      Opmerking: Bij de berekening van equivalent aantal cellen, kan het voorkomen dat verschillende volumes vereist van elke overnachting cultuur worden kunnen om de minimale 2.1 OD.
    4. Resuspendeer de pellet in 450 µL van 0,2 M NaOH door pipetteren omhoog en omlaag. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Recentrifuge cellen voor 2 min bij 2348 x g bij kamertemperatuur, en verwijder het supernatant Pipetteer.
    5. Resuspendeer de pellet met 50 µL van TWIRL buffer door pipetteren omhoog en omlaag zorgvuldig dat niet bellen. Warmte monster gedurende 5 minuten bij 70 ° C.
  4. Selectievakje voor eiwit expressie door SDS-PAGE.
    1. Gebruik een kleurovergang gel van 4-20% om een grote reeks molecuulgewichten kan worden opgelost. Belasting equivalente hoeveelheid (dezelfde OD) monsters in een SDS-pagina gel en zorg ervoor dat u ten minste één monster met de ongewijzigde pTEF-GBD vector13,14,15.
    2. Overdracht na elektroforetische scheiding, gel nitrocellulose en immunoblot gebruik van anti-myc monoclonal of polyclonal antilichamen en ECL detectie oplossing (Figuur 3).

4. zelf activering Test

  1. Streak uit de MATalpha gist uit de voorraad van de-80 ° C overeenkomt met de huisvesting van de bibliotheek van de prooi van belang op een bord YPD door een steriele houten applicator, schrapen van een kleine hoeveelheid gist uit de flacon en het strepen over de plaat YPD stam. Incubeer de YPD plaat bij 30 ° C gedurende 2 dagen of totdat één kolonies zichtbaar zijn. Patch een paar enkele kolonies op het bord van een YPD en na een nacht bebroeden bij 30 ° C.
    Opmerking: De nieuwe stam ontwikkeld hier aan huis prooi bibliotheek is PLY5725, terwijl sommige compatibel verkrijgbare Y2H bibliotheken zijn ondergebracht in Y187.
  2. Voer de procedures in 3.3.1 - 3.3.4 te transformeren van PLY5725 met de LEU2-op basis van de plasmide gebruikt naar het huis van de gewenste prooi-bibliotheek. Voor bibliotheken hier ontwikkeld, de bijbehorende plasmide is pGal4AD (pPL6343). Te vorderen gist transformants, plaat op borden CSM-Leu-voldaan. Na kolonies ontstaan, streep als patches op een bord van CSM-Leu-voldaan en incubeer gedurende 24 h bij 30 ° C.
  3. Volg het protocol in 3.4 te bevestigen van expressie van het pPL6343 gebruik van de lege vector anti-HA monoclonal of polyclonal antilichamen en ECL detectie oplossing.
  4. Streak die elk van de getransformeerde PJ69-4A gist in een kruis patroon met PLY5725 bouwt op een YPD plaat die te uiten van eiwit in sectie 3.4 en 4.3 protocol en na een nacht bebroeden bij 30 ° C werd bevestigd. Neem 1 mm3 van de cellen waar de twee stammen samen hebben gegroeid en patch op aparte CSM-Leu-voldaan, CSM-Trp en CSM-Trp-Leu platen en groeien van de 24 h.
    Opmerking: Gewenste ze zal groeien op de platen van de CSM-Trp-Leu. Groei op de CSM-Leu-voldaan en CSM-Trp platen dienen als een positieve controle voor gist groei.
  5. Groeien ze in 1 mL van CSM-Trp-Leu media's nachts bij 30 ° C. Sediment 500 µL cellen in een 1,5 mL microcentrifuge tube 2348 x g 3 min bij kamertemperatuur in een microcentrifuge. Pipetteer wordt weggeworpen. Resuspendeer de cellen in 1 mL steriel water en herhaal sedimentatie en resuspensie. Controleer de OD600 van cellen.
  6. Maak een reeks van 1:10 seriële verdunningen van elke celsuspensie steriel water met het starten van de meeste geconcentreerde oplossing van elk op een OD van 0,5. Ter plaatse 5 µL van elke verdunning op een plaat van CSM-Leu-Trp, een CSM-Leu-Trp-Hsi plaat en een CSM-Leu-Trp-zijn + 3AT plaat. Incubeer bij 30 ° C en te inspecteren op groei dagelijks meer dan 3 dagen (Figuur 4).
    Opmerking: voor de 1:10 seriële verdunning, Pipetteer 10 µL van de buis met een OD 0,5 in 90 µL van water en meng door pipetteren omhoog en omlaag. Blijven maken van 1:10 seriële verdunningen, totdat er een totaal van zes verschillende concentraties te herkennen.

5. Maak de gist bevolking met aas en prooi bibliotheek

Opmerking: De Y187-stam dat huizen van commerciële prooi bibliotheek plasmiden doet niet goed stuurman. Dus de volgende geoptimaliseerde voorwaarden moet worden voldaan om de complexiteit van de bibliotheek. De PLY5725 stam met Y2H prooi bibliotheken stuurlieden beter en dezelfde paring procedure kan worden gebruikt met deze stam (Figuur 5).

  1. Enten van een 3 mL van culturen van elk van de PJ69-4A transformants uitvoering van de verschillende TRP1-met pTEF-GBD aas plasmide in CSM-Trp media in een cultuur-buis. Twee afzonderlijke culturen met het pTEF-GBD vector plasmide alleen om te dienen als de procedurele besturingselementen bevatten. Incubeer culturen bij 30 ° C, 200 rpm voor 6 h en vervolgens verdund in een 25 mL van de cultuur in een steriele kolf voor overnachting groei.
  2. Ontdooi een flesje bevroren (-80 ° C) van de cellen van de MATalpha met de LEU2-uitvoering "prooi" bibliotheek bij kamertemperatuur. Inoculeer een 125 mL van CSM-Leu-ontmoet media in een steriele kolf met de hele ontdooide flacon. Groeien alle culturen 's nachts bij 30 ° C met schudden bij 200 omwentelingen per minuut.
    Opmerking: De OD600 van de overnachting culturen moet variëren tussen 1,0 tot 1,5 voordat u verdergaat met volgende stappen.
  3. Centrifugeer 21 OD equivalenten van elk van de PJ69-4A transformant culturen met een spin 5 min op 4,696 x g bij kamertemperatuur. Voor elke 10 paring reacties gewenst, pellet 39 OD600 equivalenten van de stam van de MATalpha uitvoering van de bibliotheek plasmiden in aparte 50 mL conische buizen.
    1. Resuspendeer de cellen in 10 mL steriel water- and -pellet opnieuw in nieuwe 50 mL van conische buis 4,696 x g 5 minuten bij kamertemperatuur in een benchtop centrifuge. Met behulp van een precisiepipet, zachtjes Verwijder de bovendrijvende vloeistof zonder het verstoren van de Ingehuld cellen.
    2. Resuspendeer de pellets van PJ69-4A cellen in 4 mL en PLY5725 cellen in 10 mL bYPDA (pH 3.7).
  4. Aan opstelling Voeg paring reacties, 1 mL PJ69-4A getransformeerd cellen, MATalpha bibliotheek-bevattende cellen 1 mL en 1 mL van bYPDA pH 3.7 aan nieuwe 50 mL conische buis. Incubeer bij 30 ° C met zachte orbitale agitatie (100-130 rpm) voor 90 min.
    1. Centrifugeer cellen voor 5 min 4,696 x g bij kamertemperatuur in een benchtop centrifuge. Pipetteer bovendrijvende vloeistof verwijderen en resuspendeer de pellet in 1:1 bYPDA:YPD 2 mL. Alle 2 mL op een plaat van de YPD 100 mm plaat Pipetteer en Incubeer bij 30 ° C gedurende ongeveer 20 uur.
  5. Oogsten van cellen uit de platen van de YPD met behulp van een cel schraper te verjagen van de cellen in 2-3 mL van CSM-Leu-Trp media. Pipetteer verdreven cellen in een 50 mL van conische buis. Spoel de platen 4 - 5 keer met 2-3 mL van CSM-Leu-Trp media door tot de media met behulp van een 1000 µL Pipetteer pipetteren en zachtjes de media uitwerpen over het oppervlak van de plaat YPD.
    1. Centrifugeer cellen gedurende 5 minuten bij 4,696 x g bij kamertemperatuur in een benchtop centrifuge. Pipetteer wordt weggeworpen en resuspendeer de cellen in 40 mL van CSM-Leu-Trp media door pipetteren op en neer (do niet vortex).
  6. Als u wilt schatten het aantal diploïde cellen gevormd, Verdun 4 µL van het diploïde mengsel in 200 µL en 2000 µL CSM-Trp-Leu media. Plaat 200 µL van elke verdunning op een bord van CSM-Leu-Trp.
    Opmerking: De twee platen vertegenwoordigen een 1:10,000 en 1:100,000 vouwen verdunning van de voorraad van ze geoogst en opbrengst van een verwachte ~ 9000-27.000 kolonies op de plaat van de verdunning 1:10,000 na incubatie bij 30 ° C voor 36-40 h. Check platen na stap 5.7. Een minimum aantal 200 kolonies op de plaat van de verdunning 1:10,000 is vereist om door te gaan naar stap 5.8
  7. Onmiddellijk neem de rest van elk 40 mL cel resuspensie en een conische kolf van 500 mL van CSM-Leu-Trp media met 1000 mL beënten. Neem een eerste OD600. Incubeer deze kolven bij 30 ° C met schudden bij 180 t/min, totdat ze bij verzadiging (~2.0 OD/mL). Dit duurt meestal ongeveer 36-40 h. Monitor groei op 24u dan weer bij 36 h door OD600.
  8. Met behulp van een precisiepipet, 20 mL aliquots verwijderen uit elk van de verzadigde 500 mL van culturen en innoculate 2.000 mL van conische kolven, één met 750 mL CSM-Leu-Trp media en de tweede met 750 mL CSM-Leu-Trp-zijn met het laagste niveau van 3AT die elimineert achtergrond (eerder bepaald in punt 4.5). Meng de nieuwe culturen (770 mL) goed door zwenken en nemen een eerste OD600.
  9. Incubeer culturen bij 30 ° C terwijl het schudden bij 180 t/min tot het bereiken van verzadiging, die meestal optreedt binnen 24u voor de niet-geselecteerde CSM-Leu-Trp-cultuur en meer dan 70 h voor culturen onder selectie voor Y2H interacties kunt nemen.
  10. Zodra culturen hebben bereikt verzadiging (OD ~ 2.0), verwijder 11 mL Pipetteer, sediment de cellen met een spin 5 min op 4,696 x g bij kamertemperatuur, weggeworpen Pipetteer, en bevriezen bij-20 ° C of blijven op DNA-extractie. De geselecteerde en niet-geselecteerde monsters worden beide gebruikt voor het diepe rangschikken.

6. monstervoorbereiding voor DEEPN diepe Sequencing

  1. DNA-extractie.
    1. Gebruik een pipet om resuspendeer cel pellets van protocol sectie 5.7 in 500 µL van sTE buffer en overdracht aan een 1,5 mL microcentrifuge buis. Voeg 3 µL van betamercaptoethanol en 10 µL van Zymolase voorraad. Meng goed en laat inwerken in de 37 ° C incubator voor 24-36 h.
    2. Pak het monster twee keer met 500 µL fenol/chloroform/Isoamylalcohol tijdens het gebruik van een fume hood16.
    3. Voeg 7 µL van 4 M NaCl, 900 µL van ijskoud 100% ethanol (ETOH), Meng door inversie en beide freeze-20 ° C of blijven sediment DNA door spinnen bij 21,130 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in een microcentrifuge.
    4. Pipetteer wordt weggeworpen. Wassen van de pellet driemaal met 900 µL van 70% ETOH.
    5. Sediment pellet 21,130 x g gedurende 2 minuten en verwijder residuele ETOH wassen Pipetteer. Droge pellet gedurende 7 minuten bij 42 ° C.
    6. Resuspendeer de pellet in 120 µL van 0.1 x sTE in een waterbad 37 ° C gedurende 90 minuten, flick de buizen te mengen elke 30 min.
    7. Pipetteer 60 µL van geëxtraheerde DNA in een steriele 1,5 mL van microcentrifuge buis. Voeg 120 µL van sTE, 3,5 µL van RNase A materieel, flick om te mengen en Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur.
    8. 7 µL van 5 M ammoniumacetaat ethanol neerslag zoals eerder gedaan in punt 6.1.3 - 6.1.5, maar gebruik in plaats van 4 M NaCl.
    9. Resuspendeer RNase A-verwerkt DNA in 55 µL van 0.1 x sTE in een waterbad 37 ° C gedurende 90 minuten, flick de buizen te mengen elke 30 min. Quantify DNA door absorptie bij 260 nm in een spectrofotometer.
  2. PCR cDNA wordt ingevoegd.
    1. Twee, 50 µL PCR reacties per DNA-monster uit te voeren. Elke reactie bevat 25 pmol elke voorwaartse en omgekeerde primer die overeenkomen met de plasmide prooi-bibliotheek (Zie materiaal). Reacties ook bevatten 25 µL van High-Fidelity 2 x PCR Master Mix, 5 µg DNA-monster, en water maximaal 50 µL. Amplify reacties voor 25 cycli met extensie tijden van 3 min bij 72 ° C, een anneal temperatuur van 55 ° C gedurende 30 s en denaturering bij 98 ° C gedurende 10 s. Precede fietsen door een 30 s denaturatie bij 98 ° C en volgen met een incubatieperiode van 5 min bij 72 ° C.
    2. Analyseren van 4 µL van elke PCR reactie door 1% de Elektroforese van het gel van de agarose van het DNA met de DNA-agarose gel met 0,2 - 0,5 µg/mL EtBr17. Visualiseer DNA-monster door UV-transillumination. Monsters zal tonen een uitstrijkje van DNA ongeveer 1-3 kb, waar de banding patroon kan worden gevonden voor monsters waar een Y2H interactie was geselecteerd (Figuur 6).
    3. Combineer dubbele PCR monsters en zuiveren met behulp van de PCR zuivering kit in overeenstemming met de instructies van de fabrikant en kwantificeren van DNA door absorptie bij 260 nm in een spectrofotometer.

7. diepe sequencing

Opmerking: Monstervoorbereiding en rangschikken op een diepe sequencing platform is meestal beschikbaar in commerciële en academische DNA sequencing kern faciliteiten.

  1. Schuintrekken 600 ng van PCR product met behulp van een krachtige ultra-ultrasoonapparaat te geven van fragmenten van een gemiddelde lengte van ~ 300 bp.
  2. Bibliotheken van de geïndexeerde volgorde met behulp van een voorbereiding kit voor het diepe rangschikken dat linkers encoding van barcodes voegt, priming sites, genereren en vastleggen van sequenties asymmetrisch op de uiteinden van de DNA-fragmenten.
  3. Voorbereiding van de bibliotheek volgens de instructies van de fabrikant uit te voeren. Zwembad geïndexeerd bibliotheken en volgorde als lang gekoppeld-end leest op een diepe sequencing platform (bijvoorbeeld 2 x 150 bp PE leest). Het gewenste aantal leesbewerkingen gericht voor elk monster is tussen 10 en 40 miljoen, met meer leest gewenst voor de ongeselecteerde populaties die meestal complexer zijn. Het is raadzaam ten minste 20 miljoen of meer leest voor de ongeselecteerde populaties.

8. Bioinformatic verwerking en controle

  1. Proces DNA sequencing van gegevens in de vorm van fastq met een set van zelfstandige software programma's die zijn gebouwd om (1) kaart volgorde lezen bestanden in een universele indeling voor SAM (2) kwantificeren gene verrijking tussen datasets () 3) uit te voeren statistische analyse van gegevens in volgorde te rangschikken van welke kandidaat-genen zijn positief voor interactie met de Y2H () 4) levert informatie over wat regio('s) en welke translationeel frame, elk van de prooi cDNA per gene fragmenten die opbrengst positieve Y2H interacties bestaan, en (5) hulpmiddelen om te reconstrueren, niet alleen de 5' maar ook het 3' eind van de interactie fragmenten waardoor hun wederopbouw en verificatie in een traditionele Y2H formaat. Werking van deze programma's wordt gedetailleerd beschreven in de bijbehorende studie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De Y2H bepaling is wijd verbeid gebruikt voor het vinden van eiwit: eiwitinteractie en diverse aanpassingen en systemen zijn ontwikkeld. Voor het grootste deel, zijn dezelfde overwegingen die helpen zorgen voor succes met deze vorige benaderingen belangrijk voor DEEPN. Enkele van de belangrijke ijkpunten zijn: zorgen voor expressie van DNA-bindende domein fusie-eiwitten, zorgen voor een lage achtergrond van vals zijn + groei in de ze met het aas van belang met een lege prooi plasmide, een paring hoogrenderende van het aas met MATA gist met de bibliotheek-bevattende MATalpha gist, en ten slotte laag-striktheid voorwaarden waarmee de bevolking groeien onder voorwaarden die voor veel positieve reacties van de Y2H selecteert, zelfs degenen die produceren lage niveaus van activiteit van de His3 en een zwak Y2H transcriptionele reactie.

Een van de kritieke aspecten van DEEPN is om reproducibly de Y2H-bibliotheek in stammen die verschillende aas plasmiden bevatten en betrouwbaar selecteren die populaties voor die bibliotheek plasmiden die positieve Y2H interacties maken. Dit wordt moeilijker wanneer de complexiteit van de Y2H-bibliotheek stijgt sinds het is moeilijker om te zorgen voor adequate overdracht van de volledige bibliotheek in verschillende eerste populaties. Bovendien hebben de grootte van de populaties die zijn gekozen om te groeien onder selectie voorwaarden en diepte van sequencing groot genoeg is om te observeren reproduceerbare veranderingen in de samenstelling van de plasmide Y2H betrouwbaar identificeren waar positieve interacties van de Y2H. In eerdere studies gebruikten we verkrijgbare Y2H cDNA bibliotheken. We vonden de variabiliteit in de Y2H bibliotheek verdeling tussen afzonderlijke bevolkingsgroepen dragen de dezelfde aas plasmiden is laag, met een overdispersion tussen de twee oorspronkelijke bevolking vóór selectie van < 0.01 meestal en 0.35 - 0,55 om aparte populaties na selectie4. De complexiteit van sommige van deze verkrijgbare Y2H bibliotheken is echter vrij laag (Figuur 7). Daarnaast zijn veel van de klonen binnen het (~ 60%) gemaakt volledig van cDNA fragmenten die zijn 3' van de codering regio, waardoor hun nut verder wordt beperkt. Om aan te tonen dat de bovengenoemde methoden aankonden voor meer complexe Y2H Bibliotheken, wij een nieuwe Y2H-bibliotheek in de gestroomlijnde 'prooi' plasmide vector gemaakt (pGal4AD) waarin fragmenten van genomic DNA van Saccaromycs cerevisiae (stam PLY5725). Genomic DNA werd versnipperd door schuintrekken, grootte geselecteerd voor poortbereiken 600-1500 bp, bewerkt met adapters en pGal4AD ingevoegd om te maken van de bibliotheek van SacCer_TAB Y2H (Figuur 8). De bibliotheek werd omgevormd tot PLY5725, die een gist bevolking die vervolgens afzonderlijke monsters van PJ69-4A MATA uitvoering van het pTEF-GBD plasmide alleen werd gekruist. Dubbele diploïde populaties werden gekweekt onder niet-selectieve en selectieve omstandigheden. De Y2H plasmide bibliotheek inserts zijn geanalyseerd door diepe sequentiebepaling. Wanneer ze worden toegewezen aan de genomic DNA omvat 100 bp upstream- en downstream van elke proteïne codering regio (84% van het gehele genoom), vonden we > 1,1 miljoen verschillende plasmiden in de bibliotheek voor een geschatte totale grootte van de bibliotheek in gist van ~1.35 miljoen verschillende plasmiden. Ter vergelijking, wij ook omgevormd van een eerder beschreven gist genomische Y2H bibliotheek11 (PJ_C1, C2, C3 Y2H bibliotheek) in MATalpha gist en onderworpen aan dezelfde analyse als hierboven. We vonden dat de complexiteit van onze willekeurige fragment gist Y2H bibliotheek veel hoger was en had veel meer plasmiden codering in-frame fragmenten van elk gen dan de eerder gepubliceerde bibliotheek (Figuur 9). Nog belangrijker is, de generatie van eerste bibliotheek met diploïde bevolking was zeer reproduceerbaar met een overdispersion van < 0,01 (Figuur 10). Bovendien produceren de reproduceerbaarheid van het hebben van de twee aparte gist bevolking gelijkaardige verspreiding van plasmiden na selecteren voor positieve interacties van de Y2H was zeer goed, een overdispersion van 0,3 oplevert. Dus, de methoden hier geschikt voor grotere Y2H bibliotheken van hogere complexiteit dan vroeger.

In termen van verhoging van het gemak van DEEPN, wij bij voorkeur met behulp van gen synthese te maken voegt codering voor de aas proteïne van belang. Dit kunt codering van regio's voor eiwit domeinen, chimaera en mutanten gemakkelijk in Y2H aas plasmiden worden opgenomen, maar ook hun codonen worden geoptimaliseerd voor expressie in S. cerevisiaestaat. Expressie van twee verschillende Gal4-DNA-bindende domein fusion eiwitten wordt geïllustreerd in Figuur 3. Twee verschillende gist transformants uiting geven aan een van de twee aas fusion eiwitten werden voorbereid en onderworpen aan de SDS-pagina en immunoblotting met anti-myc antilichamen. Opmerking expressie niveaus van aas proteïnen ten opzichte van het alleen uit de lege vector Gal4 DNA-bindende-domein. We vonden dat het is belangrijk niet alleen om te controleren of de expressie van de fusieproteïne aas, maar ook om te controleren of de expressie in de exacte MATA gist transformant kolonie die uit te breiden en stuurman aan de prooi bibliotheek-bevattende gist zal worden gebruikt. Zodra een transformant is geconstateerd, is het mogelijk om te bevriezen het neer en opslaan voor later gebruik.

Figuur 4 toont een test voor zelfstandige activering waar een seriële verdunning diploïde cellen zijn verzinkt op CSM-Leu-Trp (+ zijn), CSM-Trp-Leu-Hsi (-zijn), en CSM-Trp-Leu-zijn + 3AT (-zijn + 3AT) platen en toegestaan om te groeien bij 30 ° C gedurende 3 dagen. Het gewenste resultaat is te observeren van de groei in de aanwezigheid, maar niet de afwezigheid van histidine ongeacht of er is 3AT. Hierdoor zal het gebruik van CSM-Trp-Leu-zijn te selecteren voor de gist met een positieve gist 2-hybrid interactie. Als er groei op CSM-Leu-Trp-zijn platen, kan vervolgens de selectie van een Y2H nog steeds worden verkregen met behulp van de laagste concentratie van 3AT waardoor groei. Wij vinden dat als groei kan worden geblokkeerd in CSM-Trp-Leu-Hsi + 0,1 mM 3AT, vervolgens de DEEPN assay doorgaan met met behulp van deze voorwaarde installeren kunt te selecteren voor Y2H interacties. Als, echter, vereist de remming van de groei van ze met pGal4AD of andere lege prooi plasmide en de pTEF-GBD-aas fusion plasmide hogere concentraties van 3AT, zal op de prestaties van de DEEPN procedure en een plasmide verschillende aas vergelijk moet worden gezocht. Let erop dat zijn + groei de enige keuze voor een positieve interactie van de Y2H is. Wij hebben gevonden dat dit volstaat om te verrijken voor Y2H interacties in batch.

Een van de meest kritische procedures in de workflow van de DEEPN is te bereiken hoog rendement paring van de gist van de MATA de plasmide aas met de gist van de MATalpha uitvoering van de bibliotheek van de prooi Y2H aan boord. We vonden dat sommige stammen (bijvoorbeeld Y187)18, huisvesting verkrijgbare cDNA bibliotheken hebben relatief arme paring efficiëntie. Om die reden ontworpen we een stam te voeren Y2H bibliotheken. Deze soort is gebaseerd op BY4742, een afgeleide van S288c. Deze spanning ontbreekt GAL4, GAL80, TRP1, LEU2en HIS3. Het bevat geen verslaggevers die inspelen op een hybride Gal4 eiwit, noch een verschillende hybride (bijvoorbeeld LexA-VP16). In plaats daarvan, de bron van productie van de Y2H-geïnduceerde His3 is gehuisvest binnen de MATA-stam dat de bijzondere aas plasmide zou dragen. Dit vereenvoudigt het systeem en laat meer flexibiliteit in die ene dezelfde bibliotheek-bevattende MATalpha cellen kunt gebruiken om te paren met een stam die uiting geven aan een fusieproteïne LexA-aas en een verslaggever van de LexA(UAS) -HIS3 of een Gal4-DBD-aas fusieproteïne en een Gal4 (UAS)-verslaggever van deHIS3 .

Zodra de diploïde populaties die zowel een plasmide aas en de bibliotheek worden gegenereerd, zij zijn verdund en toegestaan om te groeien onder voorwaarden die net selecteert voor beide plasmiden (bijvoorbeeld CSM-Trp-Leu) of voor zowel plasmiden en een positieve interactie van de Y2H die productie van His3-stations (bijvoorbeeld CSM-Leu-Trp-Hsi). Het is belangrijk om te beginnen met een grote hoeveelheid de startende bevolking om te voorkomen dat een evolutionaire 'knelpunt' die de bevolking die het resultaat is na selectie voor een positieve interactie met de Y2H kan scheeftrekken. Dus onze procedure geeft u met behulp van 20 mL uit de 500 mL diploïde bevolking cultuur te worden gekweekt in 750 mL verse CSM-Leu-Trp-Hsi media om dit probleem te vermijden. Met de pTEF-GBD als het aas plasmide vonden we dat een ronde van verdunnings- en groei volstond om te evolueren van een informatieve bevolking. Met behulp van verschillende aas plasmiden eerder, we gebruikten twee rondes van de verdunnings- en groei, een eerste 20 mL tot 750 mL, en vervolgens 2 mL van die cultuur in 75 mL verdunde verzadigd. Figuur 6 toont de resultaten van PCR versterking in de bibliotheek inserts voor de diploïde bevolking gekweekt onder niet-selectieve voorwaarden, evenals een eerste en tweede opeenvolgende ronde verdunnings-en groei in selectieve voorwaarde voor twee verschillende aas plasmiden. Merk op dat met geen selectie heeft plaatsgevonden, is er een veralgemeende uitstrijkje van PCR producten indicatieve uit een complex en betrekkelijk goed genormaliseerde mengsel van fragmenten. Selectie, bij verandert dat patroon, met enkele soorten die sterk verrijken zodat individuele banden kunnen worden onderkend. Een zekere mate van "banding" is een typisch voorbeeld van de succesvolle experimenten tot nu toe, maar een uitstrijkje patroon in aanvulling op, of in plaats van een banding patroon, is een indicatie van een complex mengsel van prooi inzetstukken en is wenselijk als men wil maximaliseren van het aantal kandidaten dat DEEPN detecteert. Zeer sterke verbanden patroon, waar de meeste van het PCR-product in 1-3-bands wordt gevonden, geeft aan dat allermeest sequencing gegevens zal worden gedomineerd door slechts 1-3 prooi inserts. Men kan dit deels door het wijden van meer leest uit dit voorbeeld compenseren. Men ziet dat als de bevolking is verdund en verder gegroeid (Zie 'geselecteerde d2' in Figuur 5), de banding patroon belangrijker is, die aangeeft dat prooi plasmiden overdracht van zwak maar authentiek Y2H interacties zijn wordt verminderd, terwijl een select groepje prooi plasmiden zijn het verhogen van hun overvloed. Opeenvolgende verdunnings- en groei tot dit buitensporige niveau wordt geacht contraproductief zijn om het doel van het vangen van het grootste aantal potentiële kandidaten en dus met het protocol hier, is het raadzaam een ronde van de verdunnings- en groei worden gebruikt.

Figure 1
Figuur 1: schematische van workflow DEEPN. De algemene schets van de laboratorium-procedures wordt weergegeven aan de linkerkant samen met de geschatte tijd die nodig is om de desbetreffende taak te voltooien. Aan de rechterkant is de workflow van de bio-informatica met behulp van de softwarepakketten DEEPN en Stat_Maker. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: schematische van pTEF-GBD. De TRP1-bevattende laag kopie Gal4 DNA-bindende domein fusion eiwit expressie plasmide wordt weergegeven. Het beschikt over een constitutief TEF1 promotor, myc epitoop tag, de Gal4 DNA bindend domein gevolgd een T7 RNA polymerase bindende site, polylinker en PRM9 terminator binnen een centromeer (CEN)-plasmide gebaseerd. Deze plasmide draagt ook kanamycine weerstand en de ColE1 van bacteriële oorsprong van replicatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: expressie van Gal4-aas fusion eiwitten. Lysates uit gist uiting van verschillende aas eiwitten gesmolten tot het domein van de Gal4 DNA-bindende uitgedrukt in pTEF-GBD werden onderworpen aan SDS-pagina en immunoblotting met anti-myc antilichamen. pTEF-GBD spreekt gewoon het Gal4-DNA-bindng domein alleen; pTEF-GBD-bait1 spreekt het domein van de Gal4-DNA-bindng gesmolten tot een RhoA ontbreekt van haar C-terminal prenylation site en huisvesting van een mutatie locken in een conformatie GTP-gebonden; pTEF-GBD-bait2 spreekt het domein van de Gal4-DNA-bindng aan een RhoA ontbreekt van haar C-terminal prenylation site en huisvesting van een mutatie in een BBP-gebonden conformatie locken gesmolten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: zelfstandig activering test Ze maakte van PJ69-4A cellen die de aangegeven aas plasmiden en PLY5725 cellen dragen het plasmide aangegeven prooi waren serieel verdund en bevlekt op CSM-Leu-Trp platen, CSM-Leu-Trp-zijn platen en CSM-Leu-Trp-3AT platen zijn + en gegroeid gedurende 3 dagen bij 30 ° C. De transformants van de PJ69-4A gebruikt voor de paring waren de eerste van elk paar afgebeeld in Figuur 3. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5: paring van efficiëntie van Y187 vs. PLY5725. De paring reactie tussen PJ69-4A met een TRP1-met aas vector en Y187 of PLY5725 uitvoering prooi plasmide werd uitgevoerd. 1:10,000 verdunningen waren verguld op CSM-Trp-Leu om voor ze te selecteren. De stam van de PLY5725 toont een hogere paring efficiëntie dan de Y187-stam met ~ 10-voudige meer koloniën geproduceerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6: PCR van prooi bibliotheek tussenvoegsels. DNA werd geïsoleerd uit diploïde gist met een prooi-bibliotheek die werd gekweekt onder niet-selectieve omstandigheden (CSM-Leu-Trp media) of voorwaarden voor een positieve interactie met de Y2H (CSM-Leu-Trp-Hsi media) selecteren. PCR in de bibliotheek wordt ingevoegd onthult verschillen in het repertoire van inzetstukken geselecteerd. Twee rondes van selectieve groei werden gebruikt. Een eerste ronde van groei gemaakt door verder verdunnen van 20 mL diploïde cultuur 500 ml tot 750 mL van niet-selectieve CSM-Leu-Trp media, en een ander 20 mL tot 750 mL van CSM-Leu-Trp-Hsi media voor een eerste ronde van selectieve groei (d1). Dit werd gevolgd door een extra ronde voor groei (d2) gemaakt door het nemen van 2 mL van de cultuur van de d1 en verdunnen in 75 mL van selectieve media CSM-Leu-Trp-zijn. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 7
Figuur 7: complexiteit van Y2H cDNA Bibliotheek. Analyse van de inhoud van een commercieel beschikbare muis cDNA Y2H prooi bibliotheken: een bibliotheek van cDNA van muis hersenen en een uit meerdere weefsels van de muis. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 8
Figuur 8: generatie van Y2H gist genomic fragment bibliotheek. A. schematische beschrijven vergadering van de gist genomic fragment bibliotheek in pGal4AD. Genomic DNA van stam PLY5725 was willekeurig geschoren, afgebonden met de aangegeven Y-adapters en afgebonden in SfiI gesneden pGal4AD. Ligations werden omgevormd tot bacteriën aan opbrengst 2.2 x 106 onafhankelijke kolonies die werden gecombineerd en gegroeid voorafgaand aan de isolatie van hun plasmide DNA omvat de Y2H van de SacCer_TAB-bibliotheek. B. de LEU2-met plasmide (pGal4AD) wonen de Gal4 transcriptionele activering domein wordt weergegeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 9
Figuur 9: complexiteit van Y2H gist genomic bibliotheek. De genomic bibliotheek van SacCer_TAB werd omgevormd tot de stam van de PLY5725 MATalpha en de PJ_C1, C2, C3 gist genomic bibliotheek werd omgevormd tot de stam van de ΜΑΤalpha Υ187. Ze van deze populaties werden gemaakt door de paring op de PJY69-4A-stam. Bevolking waren volwassen voor 10 generaties en prooi fragmenten die PCR versterkt werden onderworpen aan high-throughput Sequencen en analyse. A. toont de rangorde van luidt per elk gen in de bibliotheken van de Y2H gedeeld door de leest per gen dat wordt gevonden door rangschikkend het genoom van de gist. Gezien gelijkwaardig overvloed van elk gen, zou elk gen hebben een waarde van 1. B. Histogram weergegeven: het aantal unieke plasmiden per gen dat een fragment dat is zowel in het eiwit codering regio (ORF) en in de juiste translationeel leesraam coderen. C. vergelijking van het aantal verschillende plasmiden in elke bibliotheek die gist genen coderen en het aandeel van deze die zijn en niet in de juiste translationeel leesraam of achteruit worden ingevoegd. D. Percelen weergegeven: posities en abundantie van de knooppunten die zijn toegewezen aan voorbeeld genen (VPS8 en VPS16) gevonden voor de plasmiden in elke bibliotheek. Plasmiden met gene fusies die in de juiste translationeel leesraam zijn aangewezen blauw. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 10
Figuur 10: reproduceerbaarheid van DEEPN met complexe Y2H gist genomic bibliotheek. A. vier verschillende gist diploïde populaties werden gemaakt door de paring met de Y2H van de SacCer_TAB bibliotheek ondergebracht in PLY5725, gekweekt onder niet-selectieve omstandigheden en sequenced. Het luidt per gen voor elk volk individueel wordt uitgezet als functie van de waarde van de gemiddelde rangorde over alle populaties. B. toont de leest per gen tussen de twee monsters na selectie voor positieve Y2H interacties. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hier bieden we een gids voor het uitvoeren van de Y2H tests in batch met behulp van geoptimaliseerde methoden. Er zijn een paar kritische stappen in de procedure om ervoor te zorgen dat de bevolking van gist die zou worden geplaatst onder selectie representatief voor de startende bibliotheek is en dat genoeg van de startende gist bevolking wordt gebruikt voor het ondergaan van de selectie te beperken variabiliteit . Nog belangrijker is, is deze benchmarks zijn relatief gemakkelijk te bereiken naast de aanpassing van de methoden en materialen voor een traditionele Y2H assay, waardoor deze aanpak toegankelijk is voor de meeste laboratoria die toegerust zijn voor standaard moleculaire biologie. DEEPN kunt de selectie uit dezelfde prooi bibliotheek populatie tijdens het gebruik van verschillende aas plasmiden. De set van interagerende kandidaten die een Y2H interactie met een aas vs. andere produceren kan dus direct worden vergeleken. Omdat diepe sequencing wordt gebruikt, kan een controleren de startende bibliotheek samenstelling voor elke aas-specifieke gist bevolking en de verrijking van elke kandidaat-prooi-gen in de bibliotheek onafhankelijk van elkaar volgen. Batch-verwerking kunt opvragen van dezelfde bibliotheek tegen verschillende lokazen in een semi-kwantitatieve wijze waarmee men voor het berekenen van een statistische ranking4dan.

Er zijn verschillende stappen in dit protocol, die cruciaal voor succes zijn. Een is dat een groot aantal ze moet worden verkregen om te zorgen voor adequate vertegenwoordiging van de bibliotheek Y2H prooi wordt gemengd met elke aas plasmide van belang. De paring procedure die hier beschreven is geoptimaliseerd door het variëren van de verschillende parameters. We vonden dat sommige spanningen die huis commerciële Y2H bibliotheken stuurman slecht in het algemeen, echter, de paring hier beschreven procedure 2 x 106- 2 x 107 ze genereren kan toen volgde, zodat adequate en reproduceerbare overdracht van de Y2H bibliotheek in de bevolking. Een ander cruciaal aspect van de procedure is om ervoor te zorgen dat het aas plasmide van belang niet een positieve interactie van de Y2H op eigen maken of met het lege Gal4 activering domein prooi plasmide. De methode voor het selecteren van een Y2H interactie is groei in de afwezigheid van Histidine waarin een positieve interactie Y2H transcriptie van HIS3 induceert om cellen te veeleisend zijn +. Terwijl routinematig de traditionele Y2H testen aan de concurrerende remmer 3AT toevoegen kunnen verminderen achtergrond groei of gebruik andere verslaggevers3 , deze procedure werkt het beste als cellen met zwakke Y2H interacties kunnen groeien en waardoor de striktheid voor groei en selecteren alleen voor cellen met sterke Y2H interacties beperkt het repertoire van plasmiden met prooi, die kunnen worden geïdentificeerd. Een ander cruciaal aspect is om ervoor te zorgen dat een groot deel van de startende diploïde bevolking gebruikt om te groeien onder te vermijden van evolutionaire knelpunten van bemonstering van fout4 selectieve en niet-selectieve omstandigheden. Naar aanleiding van de volumes van de cultuur en de cel nummers die u hier opgeeft zal helpen zorgen voor reproduceerbaarheid en lawaai te verminderen.

Een van de redenen dat de DEEPN aanpak krachtig is is dat het alle plasmiden in de bibliotheek van een bepaalde prooi voor hun vermogen tot interactie met het aas van belang uitvoerig kan volgen. Een van de beperkingen van DEEPN is dus de complexiteit van de bibliotheek gebruikt. Voor een aantal van de commerciële bibliotheken zoals die we hier gebruikt, vonden we dat het aantal plasmiden die coderen bonafide fragmenten van cDNA ORF die in het zelfde leesraam van Gal4 activering domein tussen 3-6 x 10 is4 met vertegenwoordiging van ~ 6.000 - 8,00 0 verschillende genen. We vonden dat bijna 75% van deze bibliotheken bevatten fragmenten uitsluitend correspondeert cDNA-regio's die 3' voor de coding DNA sequence (cd's / ORF waren). Bovendien had bijna een derde van de genen die fragmenten in de bibliotheek had geen die overeenkwam met regio's in de ORF of stroomopwaarts van de ORF.

We drie andere wijzigingen aangebracht in de DEEPN-methode. Een is een nieuwe MATalpha stam die meenemen mogen 'prooi' bibliotheken gehuisvest in een plasmide TRP1 en dat veel beter dan sommige verkrijgbare bibliotheek-bevattende soorten zoals Y187 stuurlieden. Dit waarborgt een volledige overdracht van de bevolking van de bibliotheek voor elke aas van belang. We hebben ook een nieuwe 'aas' expressie plasmide, die verschilt van de eerder beschreven plasmiden die gebruikmaken van een kopie van de variabele 2µ gebaseerde ruggengraat10. Hier beschrijven we een laag-kopie CEN plasmide (pTEF-GBD) en vinden dat één ronde van selectieve groei is voldoende om te verrijken voor interactie prooi plasmiden. Tot slot, we bouwen een gestroomlijnde 'prooi' bibliotheek-vector en gebruikt voor de productie van een high-density willekeurige-fragment genomische Y2H bibliotheek voor Saccharomces cerevisiae, die moet nuttig zijn in de toekomst voor het ontdekken en karakteriseren van interacties amonst gist eiwitten. Over het geheel genomen maken de verbeteringen in materialen en bioinformatica tools (beschreven in de bijbehorende werk) de DEEPN aanpak een toegankelijk, haalbaar en efficiënte manier van het uitvoeren van uitgebreide en vergelijkende Y2H schermen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen

Acknowledgments

Wij danken het personeel binnen het Instituut voor menselijke genetica voor NGS bibliotheek voorbereiding en sequencing. Wij danken Einat Snir voor haar expertise bij de voorbereiding van genomic bibliotheek fragmenten van de Y2H plasmide bibliotheek gemaakt hier. Dit werk werd gesteund door de National Institutes of Health: NIH R21 EB021870-01A1 en door NSF onderzoek projectsubsidie: 1517110.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Illumina HiSeq 4000 Illumina deep sequencing platform
Monoclonal anti-HA antibodies Biolegend 901514 Primary Antibody to detect expression of HA in pGal4AD constructs
Polyclonal anti-myc antibodies QED Biosciences Inc 18826 Primary Antibody to detect expression of MYC in pTEF-GBD constructs
NarI New England BioLabs R0191S
EcoRI-HF New England BioLabs R3101S
BamHI-HF New England BioLabs R3236S
XhoI New England BioLabs R0146S
Polyethylene Glycol 3350, powder J.T. Baker U2211-08
Salmon Sperm DNA Trevigen, Inc sold by Fisher Scientific 50-948-286 carrier DNA for yeast transformation section 3.2.1.
Kanamycin Monosulfate Research Products International K22000
LE Agarose GeneMate E-3120-500 used for making DNA agarose gels
Sodium Chloride Research Products International S23025
Tryptone Research Products International T60060
D-Sorbitol Research Products International S23080
Lithium Acetate Dihydrate MP Biomedicals 155256
Calcium Chloride ThermoFisher C79
EDTA Sodium Salt Research Products International E57020
Yeast Extract Powder Research Products International Y20020
Yeast Nitrogen Base (ammonium sulfate) w/o amino acids Research Products International Y20040
CSM-Trp-Leu+40ADE Formedium DCS0789
CSM-Trp-Leu-His+40ADE Formedium DCS1169
CSM-Leu-Met Formedium DCS0549
CSM-Trp-Met Bio 101, Inc 4520-922
L-Methionine Formedium DOC0168
Adenine Research Products International A11500
D-(+)-Glucose Research Products International G32045
Bacto Agar BD 214010 used for making media plates in section 1
Peptone Research Products International P20240
3-amino-1,2,4 Triazole Sigma A8056
2-Mercaptoehanol (BME) Sigma-Aldrich M6250
Zymolyase 100T USBiological Z1004
Potassium phosphate dibasic Sigma P8281
Phenol:Chloroform:IAA Ambion AM9732
Ammonium Acetate Sigma-Aldrich 238074
Ethanol Decon Laboratories, INC 2716
RNAse A ThermoFisher EN0531
Urea Research Products International U20200
SDS Research Products International L22010
glycerol Sigma Aldrich G5516
Tris-HCl Gibco 15506-017
bromophenol blue Amresco 449
Gibson Assembly Cloning Kit New England Biolabs E5510S Rapid assembly method for cloning of plasmids in section 2
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix New England Biolabs M0541S Used for amplification of products for Gibson Assembly in Section 2.3 as well assample preparation for DEEPN deep sequencing in section 6.2.1
Ethidium Bromide Amresco 0492-5G
QIAquick PCR purification kit Qiagen 28104 Used for purification of pcr products in section 6.2.3
Qiaquick DNA Gel Extraction Kit Qiagen 28704 Used for purification of digested pTEF-GBD in section 2.1
KAPA Hyper Prep kit KAPA Biosystems KK8500 preparation kit for deep sequencing
Codon optimization http://www.jcat.de
Codon optimization https://www.idtdna.com/CodonOpt
gBlocks Integrated DNA Technologies DNA fragments used for cloning in Section 2.2
Strings Thermofisher DNA fragments used for cloning in Section 2.2
GenCatch Plasmid DNA mini-prep Kit EPOCH Life Sciences Used to prepare quantities of DNA in Section 2.3
Covaris E220 Covaris high performance ultra-sonicator in section 7
oligo nucelotide 5’- CGGTCTT
CAATTTCTCAAGTTTCAG -3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher used for pcr amplification and sequencing 5' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-GAGTAACG
ACATTCCCAGTTGTTC-3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher used for pcr amplification and sequencing 5' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-CACCGTAT
TTCTGCCACCTCTTCC-3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher used for pcr amplification and sequencing 3' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-GCAACCGC
ACTATTTGGAGCGCTG-3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher used for pcr amplification and sequencing 3' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligonucleotide 5’-GTTCCGATG
CCTCTGCGAGTG-3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher 5' Pimer used for insert amplification of pGAL4AD
oligonucelotide 5’-GCACATGCT
AGCGTCAAATACC-3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher 3' Pimer used for insert amplification of pGAL4AD
oligonucelotide 5’-ACCCAAGCA
GTGGTATCAACG-3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher 5' Pimer used for insert amplification of pGADT7
oligonucelotide 5’- TATTTAGA
AGTGTCAACAACGTA -3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher 3' Pimer used for insert amplification of pGADT7
PJ69-4A MatA yeast strain http://depts.washington.edu/yeastrc/ James P, Halladay J, Craig EA: Genomic Libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast. GENETICS 1996 144:1425-1436 MATA leu2-3,112 ura3-52 trp1-901 his3-200 gal4D, gal80D, GAL-ADE2 lys2::GAL1-HIS3 met2::GAL7
pTEF-GBD Dr. Robert Piper Lab Gal4-DNA binding doimain expression plasmid
pGal4AD (pPL6343) Dr. Robert Piper Lab Gal4-activation domain expression plasmid
100 mm petri dishes Kord-Vallmark sold by VWR 2900
125 mL PYREX Erlenmeyer flask Fisher Scientific S63270
250 mL PYREX Erlenmeyer flask Fisher Scientific S63271
1,000 mL PYREX Erlenmeyer flask Fisher Scientific S63274
2,000 mL PYREX Erlenmeyer flask Fisher Scientific S63275
20 X 150 mm Disposable Culture Tube Thermofisher 14-961-33
pipet-aid Drummond 4-000-100
5 mL Serological Pipette Denville P7127
10 mL Serological Pipette Denville P7128
25 mL Serological Pipette Denville P7129
1,000 mL PYREX Griffin Beaker Fisher Scientific 02-540P
1,000 mL PYREX Reuasable Media Storage Bottle Fisher Scientific 06-414-1D
1,000 mL graduated cylinder Fisher Scientific 08-572-6G
SpectraMax 190 Molecular Devices used to measure the Optical Density of cells
NanoDrop 2000 Thermo Scientific ND-2000 Spectrophotometer used to quantify amount of DNA
Electronic UV transilluminator Ultra Lum MEB 20 used to visualize DNA in an Ethidium Bromide agarose gel
P1000 Gilson PIPETMAN Fisher Scientific F123602G
P200 Gilson PIPETMAN Fisher Scientific F123601G
P20 Gilson PIPETMAN Fisher Scientific F123600G
P10 Gilson PIPETMAN Fisher Scientific F144802G
1250 µL Low Retention Pipette Tips GeneMate P-1236-1250
200 µLLow Retention Pipette Tips VWR 10017-044
10 µL XL Low Retention Pipette Tips VWR 10017-042
50 mL conical tube VWR 490001-627
15 mL conical tube VWR 490001-621
cell scraper Denville Scientific TC9310
1.5 mL Microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5500
HCl Fluka Analytical 318949-1L
NaOH J.T. Baker 5674-02
Wooden applicators Solon Care 55900
Eppendorf microcentrifuge 5424 Fisher Scientific 05-400-005 microcentrifuge
Sorvall ST16R Thermo Fisher Scientific 75004381 benchtop centrifuge
Amersham ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey) GE Healthcare NA934-1ML Secondary Antibody
Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep) GE Healthcare NA931-1ML Secondary Antibody
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate Thermo Fisher Scientific 34080 ECL detection solution
Isotemp Incubator Thermo Fisher Scientific Incubator
Mutitron 2 INFORS HT Shaking incubator
Isotemp Digital-Control Water Bath Model 205 Fisher Scientific water bath
Y2H mouse cDNA library in Y187 (pan tissue) Clontech 630482 commercially available cDNA Library
Y2H mouse cDNA library in Y187 (mouse brain) Clontech 630488 commercially available cDNA Library
pGADT7 AD Vector Clontech 630442 commercially available AD Vector housing many cDNA libraries
pGBKT7 DNA-BD Vector Clontech 630443 commercially available DNA-BD Vector
Biolase DNA Polymerase Bioline BIO-21042 DNA polymerase used for section 2.4
GeneMate GCL-60 Thermal Cycler BioExpress P-6050-60 pcr machine
TempAssure 0.5 mL PCR tubes USA Scientific 1405-8100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
  2. Bruckner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology. International Journal of Molecular Sciences. 10 (6), 2763-2788 (2009).
  3. Vidal, M., Fields, S. The yeast two-hybrid assay: still finding connections after 25 years. Nature Methods. 11 (12), 1203-1206 (2014).
  4. Pashkova, N., et al. DEEPN as an Approach for Batch Processing of Yeast 2-Hybrid Interactions. Cell Reports. 17 (1), 303-315 (2016).
  5. Rajagopala, S. V. Mapping the Protein-Protein Interactome Networks Using Yeast Two-Hybrid Screens. Advances in Experimental Medicine and Biology. 883, 187-214 (2015).
  6. Weimann, M., et al. A Y2H-seq approach defines the human protein methyltransferase interactome. Nature Methods. 10 (4), 339-342 (2013).
  7. Yachie, N., et al. Pooled-matrix protein interaction screens using Barcode Fusion Genetics. Molecular Systems Biology. 12 (4), 863 (2016).
  8. Trigg, S. A., et al. CrY2H-seq: a massively multiplexed assay for deep-coverage interactome mapping. Nature Methods. , (2017).
  9. Estojak, J., Brent, R., Golemis, E. A. Correlation of two-hybrid affinity data with in vitro measurements. Molecular and Cellular Biology. 15 (10), 5820-5829 (1995).
  10. Rajagopala, S. V., Hughes, K. T., Uetz, P. Benchmarking yeast two-hybrid systems using the interactions of bacterial motility proteins. Proteomics. 9 (23), 5296-5302 (2009).
  11. James, P., Halladay, J., Craig, E. A. Genomic libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast. Genetics. 144 (4), 1425-1436 (1996).
  12. Barbas, C. F. 3rd, Burton, D. R., Scott, J. K., Silverman, G. J. Quantitation of DNA and RNA. CSH Protoc. 2007, pdb ip47 (2007).
  13. Sambrook, J., Russell, D. W. SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (4), (2006).
  14. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  15. Alegria-Schaffer, A. Western blotting using chemiluminescent substrates. Methods in Enzymology. 541, 251-259 (2014).
  16. Plank, J. Practical application of Phenol/Chloroform extraction. , Available from: http://bitesizebio.com/3651/practical-application-of-phenolchloroform-extraction/ (2018).
  17. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), (2012).
  18. Harper, J. W., Adami, G. R., Wei, N., Keyomarsi, K., Elledge, S. J. The p21 Cdk-interacting protein Cip1 is a potent inhibitor of G1 cyclin-dependent kinases. Cell. 75 (4), 805-816 (1993).

Tags

Biochemie kwestie 136 eiwit interactie Next Generation Sequencing DNA sequentieanalyse gist 2-Hybrid
Een gist 2-Hybrid scherm in Batch om te vergelijken eiwitinteractie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Peterson, T. A., Stamnes, M. A.,… More

Peterson, T. A., Stamnes, M. A., Piper, R. C. A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions. J. Vis. Exp. (136), e57801, doi:10.3791/57801 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter