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Biochemistry

Eine Hefe 2-Hybrid Bildschirm im Batch Proteininteraktionen vergleichen

Published: June 6, 2018 doi: 10.3791/57801
Automatic Translation
1, 1, 1
1Molecular Physiology and Biophysics, University of Iowa

Summary

Batch-Verarbeitung von Hefe-2-Hybrid-Bildschirme ermöglicht direkten Vergleich der Interaktion profile mehrere Köder Proteine mit einem hoch komplexen Satz von Fusionsproteinen Beute. Hier beschreiben wir verfeinerten Methoden, neue Reagenzien und ihre Verwendung für solche Bildschirme zu implementieren.

Abstract

Screening für Protein-Protein-Interaktionen mit der Hefe-2-Hybrid-Assay ist seit langem ein wirksames Instrument, aber seine Verwendung wurde weitgehend auf die Entdeckung der hohen Affinität Interaktoren, die in der Bibliothek der interagierenden Kandidaten hochangereichertes sind begrenzt. In einem traditionellen Format kann Hefe 2-Hybrid Assay zu viele Kolonien zu analysieren, wenn bei niedrigen Stringenz durchgeführt ergeben, wo geringe Affinität Interaktoren gefunden werden könnte. Darüber hinaus kann nicht ohne eine umfassende und vollständige Befragung derselben Bibliothek gegen verschiedene Köder Plasmide, eine vergleichende Analyse erreicht werden. Obwohl einige dieser Probleme behoben werden kann, angeordneten Beute Bibliotheken verwenden, können die Kosten und die erforderliche Infrastruktur für solche Bildschirme betreiben unerschwinglich sein. Als Alternative haben wir die Hefe 2-Hybrid Assay um gleichzeitig entdecken Sie Dutzende von Transienten angepasst und statische Protein-Interaktionen in einem einzigen Bildschirm mit Hilfe einer Strategie bezeichnet DEEPN (dynamische Bereicherung für Evaluation of Protein Networks), die enthält Hochdurchsatz-DNA-Sequenzierung und Berechnung, mit der die Entwicklung einer Population von Plasmiden folgen, die Interaktionspartnern zu kodieren. Hier beschreiben wir maßgeschneiderte Reagenzien und Protokolle, die einen DEEPN Bildschirm einfach und kostengünstig ausgeführt werden können.

Introduction

Ein vollständiges Verständnis der biologischen Zellprozesse stützt sich auf die Suche nach der Protein-Interaktion-Netzwerke, die ihre molekularen Mechanismen zugrunde liegen. Ein Ansatz zur Protein-Interaktionen zu identifizieren ist die Hefe 2-Hybrid (Y2H) Assay, die Arbeiten durch einen funktionierenden Chimären Transkriptionsfaktor zusammenfügen, sobald zwei Protein Domänen von Interesse an einander1binden. Ein typische Y2H-Bildschirm erfolgt durch die Schaffung einer Bevölkerung von Hefe, die beide eine Bibliothek von Plasmiden Codierung interagierenden Proteine verschmolzen zu einem transcriptional Aktivator beherbergt (zB., "Beute" Schmelzverfahren Protein) und ein bestimmtes "Köder" Plasmid bestehend aus dem Protein von Interesse verschmolzen zu einem DNA-bindende Domäne (z.B. die Gal4 DNA-bindende Domäne, die an die Gal4-upstream aktivierende Sequenz bindet). Einer der Hauptvorteile des Y2H-Ansatzes ist, dass es relativ einfach ist und kostengünstig durchzuführen in einem typischen Labor für Routinearbeiten molekularen biologischen2 ausgestattet. Jedoch wenn traditionell durchgeführt, Proben ein Benutzer einzelne Kolonien, die bei der Auswahl für eine positive Y2H-Interaktion entstehen. Dies schränkt die Anzahl der Bibliothek "Beute"-Klone, die befragt werden können. Dieses Problem wird verstärkt, wenn die Fülle an eine bestimmte interagierenden Beute sehr hoch im Vergleich zu anderen, verringern die Chance Interaktion von niedrigen Fülle Beute Plasmide zu erkennen ist.

Eine Lösung für die Verwendung der Y2H-Prinzip in umfassende Abdeckung des Proteoms ist die Verwendung eines Matrix-formatierte Ansatzes, wobei ein Array mit bekannten individuelle Beute Plasmide Digital abgefragt werden kann. Ein solches Vorgehen erfordert jedoch eine Infrastruktur, die nicht ohne weiteres zugänglich oder kostengünstig an die einzelnen Ermittler ist, die bei der Festlegung der Interaktom einer kleinen Anzahl von Proteinen oder Domänen3interessiert sind. Darüber hinaus würde sehr komplexe Beute-Bibliotheken, die mehrere Fragmente von interagierenden Proteine kodieren können solche Matrix Arrays zu unpraktisch Größen vergrößern. Eine Alternative ist Assays mit komplexen Bibliotheken in Chargen und das Vorhandensein von interagierenden Klone mit massiv parallelen Hochdurchsatz-Sequenzierung4zu bewerten. Dies kann angewendet werden, um das Vorhandensein von Beute Plasmide assay, die in mehrere Kolonien mit einem typischen entstehen Y2H formatiert Ansatz in der Hefe Zellen Gehäuse interagierenden Pair von Fusionsproteinen dürfen auf einer Platte5,6wachsen. Diese allgemeine Idee kann akzentuiert werden, zur Steigerung der Abfrage der beiden mehrere Köder und Komponenten in der gleichen Zeit7,8zum Opfer.

Dennoch, viele Untersuchungen erfordern, dass ein einfacher noch mehr Aufwand auf nur wenige Protein "Köder" konzentriert und profitieren mehr von einer erschöpfenden und semi-quantitativen Abfrage einer einzigen komplexen Beute-Bibliothek. Wir haben entwickelt und validiert ein Konzept für die breit angelegte Protein Wechselwirkungsstudien mit einem Y2H-Prinzip in Batch Format4durchführen. Dies nutzt das Wachstumstempo von einem bestimmten Beute Plasmid als Proxy für die relative Stärke der Y2H Interaktion9. Tiefe Sequenzierung aller Plasmide innerhalb einer Population normales Wachstum ausgesetzt oder selektive Wachstumsbedingungen produziert eine vollständige Karte der Klone, die starke und schwache Y2H Interaktionen ergeben. Das Repertoire der interagierenden werden erhalten und direkt über mehrere Köder Plasmide verglichen. Die resultierende Workflow bezeichnet DEEPN (dynamische Bereicherung für Evaluation of Protein Networks) kann so zum differenziellen Interactomes aus den gleichen Beute Bibliotheken, Proteine, Vergleich zwischen ein Protein vs. anderen zu identifizieren identifizieren.

Hier zeigen wir DEEPN und Verbesserungen in die Labormethoden, die seine Verwendung zu erleichtern, die in Abbildung 1aufgeführt sind. Signifikante Verbesserungen umfassen:

Generation der Beute Hefe Bevölkerung. Eine der wichtigsten Voraussetzungen der DEEPN erzeugt Populationen von Hefe mit verschiedenen Köder Plasmide, die die gleiche Verteilung der Plasmid-Beute-Bibliotheken haben. Gleichwertige Grundlinie Populationen der Beute Plasmid Bibliothek sind essentiell für genaue Vergleiche zwischen den Interactomes von unterschiedlichen Ködern. Dies geschieht am besten, wenn ein Bibliothek-Plasmid sich bereits in einer Population von haploiden Hefe befindet und Umzug eines bestimmten Köder-Plasmid in dieser Population erreicht wird, indem die Paarung um einen diploiden zu produzieren. Hier bieten wir einen klaren Leitfaden wie man solche Populationen mit kommerziellen Bibliotheken in haploiden Hefe untergebracht. Obwohl wir Methoden, die eine hohe Anzahl von diploiden zu erzeugen gefunden, war die Paarung Gesamteffizienz des diese kommerzielle Bibliothek-haltigen Hefestämme gering. Daher haben wir eine neue Sorte, die Beute Bibliotheken aufnehmen kann, die weit mehr diploiden pro Paarung Reaktion ergibt.

New set Köder Plasmide. Viele aktuelle Plasmide, die "Köder" Schmelzverfahren Proteine enthalten des Proteins des Interesses und eine DNA-bindende Domäne Ausdrücken basieren auf 2µ, so dass sie ihre Kopienzahl verstärken. Diese Kopienzahl kann sehr variabel in der Bevölkerung und führen zu Schwankungen in der Y2H transcriptional Antwort. Dies könnte wiederum die Fähigkeit zu beurteilen, die Stärke einer bestimmten Protein Interaktion anhand der Antwort Wachstum von Zellen unter Auswahl verzerren. Dies kann teilweise Adresse sein, mit einem niedrigen Kopie Plasmid, von denen einige wie die im Handel erhältlichen pDEST3210zuvor beschrieben wurden. Wir konstruierten eine neue Köder-Plasmid (pTEF-GBD), das produziert Gal4 DNA-bindende Domäne Fusionsproteine innerhalb einer TRP1 Zentromer-basierte niedrigen Kopie Plasmid trägt die Kanr-Resistenz-Gen, die auch ermöglicht, Klonen von Köder Fragmente sowohl stromaufwärts und unterhalb des Gal4 DNA-bindende Domäne.

Neue High-Density Y2H fragmentbibliothek. Wir ein neues Plasmid, Haus Y2H Beute Bibliotheken gebaut und benutzte es, um eine hochkomplexe Y2H-Bibliothek nach dem Zufallsprinzip geschert Bruchstücke von genomischer DNA aus Saccharomyces Cerevisiaegemacht zu bauen. Sequenzanalyse zeigte, dass diese Bibliothek mehr als 1 Million verschiedene Elemente, die weitaus komplexer als die zuvor beschriebenen Hefe genomische Y2H Plasmid Bibliotheken11. Mit dieser neuen Bibliothek konnten wir zeigen, dass der DEEPN-Workflow robust genug ist, um komplexe Bibliotheken mit vielen unterschiedlichen Plasmide in einer Art und Weise aufzunehmen, die zuverlässig und reproduzierbar ist.

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Protocol

1. Vorbereitung von Medien und Platten

Hinweis: Alle Platten minimal 2 Tage vor Beginn des Protokolls vorgenommen werden müssen. Die Medien können jederzeit vorgenommen werden. Die gepufferten Hefe Extrakt Pepton Traubenzucker Adenin (bYPDA) muss jedoch am Tag gemacht werden, von dem es verwendet wird. Einige Medien erfolgt über eine Ergänzung-Mischung mit einem Niveau von Adenin, das größer als das, was in der Regel gewohnt ist. Die meisten minimal Medien Ergänzungen geben Sie 10 mg/L Adenin. Nahrungsergänzungsmittel mit der Bezeichnung "+ 40Ade" geben Sie eine Gesamtmenge von 40 mg/L Adenin.

  1. Bereiten Sie Glukose-Lösung (50 % w/V). Für 1 L, 500 g D-(+) auflösen-Glukose in 800 mL destilliertem Wasser in einer 1.000-mL-Becherglas. Stellen Sie die Lautstärke auf 1.000 mL mit einem Messzylinder und Filter durch einen 0,2 µm Sterilfilter in eine sterile 1.000 mL-Medien-Vorratsflasche.
  2. Bereiten Sie Hefeextrakt Pepton Traubenzucker (YPD) Platten. Für 1 L, 20 g Pepton und 10 g Hefeextrakt in 800 mL destilliertem Wasser in einer 1.000-mL-Becherglas auflösen. Gießen Sie in einen Messzylinder, füllen Sie bis zu 960 mL mit destilliertem Wasser auf. Gießen Sie in ein 2.000 mL Erlenmeyerkolben und fügen Sie 15 g Agar-Agar hinzu. Autoklaven und Cool in 37 ° C Wasserbad bis Bad Wassertemperatur auf ca. 42-50 ° c abgekühlt ist Verwenden Sie eine Pipette, 40 mL 50 % Glukose hinzuzufügen. Auch durch Umschwenken mischen.
    1. Gießen Sie eine Reihe von 100 mm Platten mit 20 mL Medien mit Pipette.
  3. Bereiten Sie komplette synthetische minimalste Medien (CSM)-Trp-Platten. Für 1 L, 6,7 g Hefe Stickstoff Basis ohne Aminosäuren in 800 mL destilliertem Wasser in einer 1.000-mL-Becherglas auflösen. Gießen Sie in einen Messzylinder, füllen Sie bis zu 960 mL mit destilliertem Wasser auf. Gießen Sie in ein 2.000 mL Erlenmeyerkolben und fügen Sie 0,7 g - Trp-Dropout-Mix, 20 mg Methionin und 15 g Agar getroffen. Autoklaven und Cool in 37 ° C Wasserbad bis Bad Wassertemperatur auf ca. 42-50 ° c abgekühlt ist Verwenden Sie eine Pipette, 40 mL 50 % Glukose hinzuzufügen. Auch durch Umschwenken mischen.
    1. Gießen Sie eine Reihe von 100 mm Platten mit 20 mL Medien mit Pipette.
  4. CSM-Leu-Met Platten vorbereiten. Für 1 L10,05 g Hefe Stickstoff Basis ohne Aminosäuren in 800 mL destilliertem Wasser in einer 1.000-mL-Becherglas auflösen. Gießen Sie in einen Messzylinder und füllen Sie bis zu 940 mL mit destilliertem Wasser auf. Gießen Sie in ein 2.000 mL Erlenmeyerkolben und fügen 1,005 g - Leu-ausfallende Mischung und 15 g des Nährbodens getroffen. Autoklaven und Cool in 37 ° C Wasserbad bis Bad Wassertemperatur auf ca. 42-50 ° c abgekühlt ist Verwenden Sie eine Pipette, 60 mL 50 % Glukose hinzuzufügen. Auch durch Umschwenken mischen.
    1. Gießen Sie eine Reihe von 100 mm Platten mit 20 mL Medien mit Pipette.
  5. CSM-Leu-Trp Platten vorbereiten. Für 1 L10,05 g Hefe Stickstoff Basis ohne Aminosäuren in 800 mL destilliertem Wasser in einer 1.000-mL-Becherglas auflösen. Gießen Sie in einen Messzylinder, füllen Sie bis zu 940 mL mit destilliertem Wasser auf. Gießen Sie in ein 2.000 mL Erlenmeyerkolben und fügen 1,005 g - Trp-Leu + 40Ade ausfallende Mix, 240 mg von Adenin und 15 g Agar. Autoklaven und Cool in 37 ° C Wasserbad bis Bad Wassertemperatur auf ca. 42-50 ° c abgekühlt ist Verwenden Sie eine Pipette, 60 mL 50 % Glukose hinzuzufügen. Auch durch Umschwenken mischen.
    1. Gießen Sie eine Reihe von 100 mm Platten mit 20 mL Medien mit Pipette.
  6. CSM-Leu-Trp-seine Platten vorbereiten. Für 1 L10,05 g Hefe Stickstoff Basis ohne Aminosäuren in 800 mL destilliertem Wasser in einer 1.000-mL-Becherglas auflösen. Gießen Sie in einen Messzylinder, füllen Sie bis zu 940 mL mit destilliertem Wasser auf. Gießen Sie in ein 2.000 mL Erlenmeyerkolben und fügen 0,975 g - Trp-Leu-seine + 40Ade ausfallende Mix, 240 mg von Adenin und 15 g Agar. Autoklaven und Cool in 37 ° C Wasserbad bis Bad Wassertemperatur auf ca. 42-50 ° c abgekühlt ist Verwenden Sie eine Pipette, 60 mL 50 % Glukose hinzuzufügen. Auch durch Umschwenken mischen.
    1. Gießen Sie eine Reihe von 100 mm Platten mit 20 mL Medien mit Pipette.
  7. CSM-Leu-Trp-His-3AT Platten vorbereiten. Für 1 L10,05 g Hefe Stickstoff Basis ohne Aminosäuren in 800 mL destilliertem Wasser in einer 1.000-mL-Becherglas auflösen. Gießen Sie in einen Messzylinder, füllen Sie bis zu 940 mL mit destilliertem Wasser auf. Gießen Sie in ein 2.000 mL Erlenmeyerkolben und fügen 0,975 g - Trp-Leu-seine + 40Ade ausfallende Mix, 240 mg von Adenin und 15 g Agar. Autoklaven und Cool in 37 ° C Wasserbad bis Bad Wassertemperatur auf ca. 42-50 ° c abgekühlt ist Verwenden Sie eine Pipette, 60 mL 50 % Glukose hinzuzufügen. In 100 µL einer 1 M steril Aktie des 3-amino-1,2,4-Triazol (3AT) durch Umschwenken mischen.
    1. Gießen Sie eine Reihe von 100 mm Platten mit 20 mL Medien mit Pipette.
  8. LB-Kanr Platten vorbereiten. Für 1 L, 10 g Tryptone, 5 g Hefe auflösen extrahieren und 10 g NaCl in 800 mL destilliertem Wasser in einer 1.000-mL-Becherglas. Gießen Sie in einen Messzylinder, füllen Sie bis zu 1.000 mL mit destilliertem Wasser auf. Gießen Sie in ein 2.000 mL Erlenmeyerkolben und fügen Sie 15 g Agar-Agar hinzu. Autoklaven und Cool in 37 ° C Wasserbad bis Bad Wassertemperatur auf ca. 42-50 ° c abgekühlt ist Fügen Sie 50 mg Kanamycin und durch Umschwenken mischen.
    1. Gießen Sie eine Reihe von 100 mm Platten mit 20 mL Medien mit Pipette.
  9. YPD, CSM-Leu-Met, CSM-Trp, CSM-Leu-Trp und CSM-Leu-Trp-HSI Medien vorbereiten. Verwenden Sie das Verfahren oben für außer statt in einen Erlenmeyerkolben gießen, Gießen Sie in ein Medien-Vorratsflasche und der Agar weglassen-Platten.
  10. BYPDA (gepufferte YPDA) vorzubereiten. Nehmen Sie sterile YPD Medien und fügen Sie 200 mg/L Adenin in sterilem destilliertem Wasser hinzu. PH bis 3.7 mit HCl. Filter durch einen 0,2 µm Sterilfilter in eine sterile Flasche einstellen.
  11. Bereiten Sie Transformation Puffer: 2 M Sorbit, 1 M Lithium Acetat Dihydrat, 10 mM Tris pH 7.6, 0,5 mM EDTA, 0,2 mM-Kalzium-Chlorid in destilliertem Wasser. In eine sterile Flasche durch einen Sterilfilter 0.2 µm filtern.
  12. Bereiten Sie PEG-Lösung: 70 % w/V Polyethylenglykol 3350 in destilliertem Wasser. Von Autoklaven sterilisieren.
  13. Bereiten Sie Wirbeln: 8 M Harnstoff, 4 % w/V SDS, 50 mM Tris, pH 6,8, 10 % V/V Glycerin, destilliert 0,02 % w/V Bromophenol blue in sterilen Wasser.
  14. STE (starke TE) vorbereiten: 50 mM Tris, 20 mM EDTA, pH 8.0 in destilliertem Wasser. In eine sterile Flasche durch einen Sterilfilter 0.2 µm filtern.
  15. Vorbereitung Zymolase-Stammlösung: 10 mg/mL Zymolase 100 t 50 mM Kalium Phosphat Diabas-pH 7,5, 50 % V/V Glycerin Puffer in sterilem destilliertem Wasser (bei-20 ° C gelagert).

2. Klonen und die Überprüfung der Köder Plasmide

Hinweis: Bau des Gal4-DNA-bindende Domäne Plasmide. Derzeit gibt es eine Vielzahl von im Handel erhältlichen und akademisch verfügbare Y2H-Systeme. DEEPN kann viele davon aufnehmen, vorausgesetzt, dass der Köder Plasmid mit dem Ausdruck des Proteins des Interesses verschmolzen zu einem DNA-bindende Domäne in einem TRP1-Plasmid enthalten. Andere nachgeschaltete Anforderungen sind, die die Sequenz sofort stromaufwärts der Beute Bibliothek einfügen bekannt ist und, die eine positive Y2H-Interaktion kann erzielt werden, durch die Produktion von His3 ermöglichen in Medien fehlt Histidin zur Auswahl. Hier beschreiben wir Gebrauch von einer neuen Y2H Köder Plasmid (pTEF-GBD, Abbildung 2), jedoch können andere Y2H-Köder-Plasmide einschließlich pGBKT7 sowie verwendet werden. Für Konstruktion und Evaluation von Köder Plasmide beschreiben wir Verwendung von pTEF-GBD. Generell empfehlen wir Gensynthese, einen offenen Leserahmen zu produzieren, die hält sich an die Hefe Codon Vorspannung zu guter Ausdruck und Leichtigkeit mit dem Klonen zu gewährleisten. Sicherstellen Sie, dass das Klonen Schema den Köder ermöglicht zu sein in-Frame mit dem Gal4 DNA-bindende Domäne und beim Klonen in der 3'-Website ein Stopcodon die Köder-kodierende Region folgt.

  1. Vorbereiten des Plasmid-Vektors. Plasmid pTEF-GBD ermöglicht das Klonen ein Fragment, die Codierung des Proteins des Interesses entweder 5' oder 3' der Region Codierung die Gal4 DNA-bindende Domäne mit einer schnellen Montage-Methode. Für Einfügung an der 5' Website, 3 µg pTEF-GBD NarI mit EcoRI zu verdauen oder für Einfügung an der 3'-Website, zu verdauen, mit BamHI und XhoI für 2-4 h Elektrophorese Probe in 1 % DNA Agarose-gel mit 0,2 - 0,5 µg/mL Interkalation Bromid (EtBr) bei 100 V. Verbrauchsteuern Schnitt 5.630 bp TEF-GBD und reinigen mit den DNA-Gel Extraction Kit in Übereinstimmung mit den Anweisungen des Herstellers und quantifizieren DNA durch Absorption bei 260 nm durch Spektralphotometer12.
    Hinweis: Generation der Köder-Codierung Einsätze. DNA-Fragmenten codieren Proteine oder PROTEINFRAGMENTE von Interesse können mit Gensynthese erhältlich und als uncloned Fragmente. Es wird empfohlen, dass Codons für Ausdruck in Saccharomyces Cerevisiae optimiert sind und online-Tools zur Optimierung der Codon sind in der Liste der Materialien enthalten.
  2. Für 5' Insertion, flankieren das DNA-Fragment Kodierung ein ATG-Start-Codon durch 5'-TTAAGAAAAACAAACTGTAACGAATTC-3 "und 5'-GCGCCTATGTGTGAACAAAAGCTTATT-3", beziehungsweise. Für 3' Insertion im Rahmen mit den Gal4 DNA-bindende Domäne, flankieren die Codierung Fragment von 5'-Ctgcatatggccatggaggccgaa-3 'und 5'-Tagtaactagcataaccccttggggcc-3'.
  3. Verwenden Sie für Plasmid Bau die schnelle Montage-Methode gemäß Anweisungen des Herstellers für Klonen Fragmente in geschnittenen pTEF-GBD.
    1. Teller alle E. Coli auf LB-Kanr Teller umgewandelt und 16-20 h bei 37 ° c inkubieren Kolonien Gehäuse pTEF-GBD mit dem gewünschten Einsatz können durch PCR-Amplifikation mit der Oligonukleotide identifiziert werden: 5'-CGGTCTTCAATTTCTCAAGTTTCAG-3 ' und 5'-GAGTAACGACATTCCCAGTTGTTC-3' 5' Einfügen und 5'-CACCGTATTTCTGCCACCTCTTCC-3 "und 5'-GCAACCGCACTATTTGGAGCGCTG-3 "für 3' einfügen. Diese Oligonukleotide können auch als Primer für die Sequenzierung des Einsatzes dienen.
    2. Zur Vorbereitung planen > 10 µg jedes pTEF-GBD-Derivat und pTEF-GBD allein um Material für die Sequenzierung und Hefe Transformationen.
    3. Verwenden Sie die folgenden PCR-Bedingungen: 3 min bei 98 ° C, gefolgt von 25 Zyklen von 30 s bei 98 ° C, 30 s bei 55 ° C und 2 min bei 72 ° C, gefolgt von 5 min bei 72 ° C mit einem Puffer mit 2,5 mM MgCl2 , U/100 0,5 µL DNA Polymerase und proprietäre Buffer.

(3) Ausdruck von Fusionsproteinen Gal4-DNA-bindende Domäne

  1. Zuständigen Hefe zu machen.
    1. Streifen aus PJ69-4A Hefe auf einen YPD-Teller mit einem sterilen hölzerne Applikator, Schaben 1 mm3 -80 ° c eingefroren Lager und rieb es sanft über die YPD-Platte. Die Platte verschieben Sie den hölzernen Applikator so dass jedem Durchgang in einen unberührten Teil der Medienoberfläche geht. Inkubieren Sie die YPD-Platte bei 30 ° C, 2 Tage lang oder bis die einzelnen Kolonien sichtbar werden. Machen Sie den gefrorenen Bestand an PJ69-4A Hefe durch Aussetzung Hefe in Wasser oder Wachstum Medien, Ergänzung mit DMSO auf 7 % und bei-80 ° c Lagern
    2. Eine einzige Kolonie in 5 mL Kultur der YPD in einem 20 x 150 mm-Kultur-Rohr mit einer sterilen hölzernen Applikator zu impfen und wachsen über Nacht bei 30 ° C in einem schütteln Inkubator bei 200 u/min.
    3. 50 mL YPD in einem 250 mL sterile Erlenmeyerkolben mit 4 mL der Nacht Kultur der PJ69-4A Hefestamm zu impfen. Wachsen Sie in einem schütteln Inkubator bei 30 ° C, 200 u/min zu einer optischen Dichte (OD600) von ca. 1,2 durch Spektralphotometrie mit einer standard 1 cm Schichtdicke bestimmt. Wachstum braucht in der Regel 5-7 h.
    4. Isolieren Sie Hefe durch Sedimentation in einer 50 mL konische Rohr 4.696 x g für 5 min bei Raumtemperatur in einer Benchtop-Zentrifuge. Entsorgen Sie überstand von dumping in flüssigem Abfall. Mit einer Pipette, Aufschwemmen Sie das Pellet in 5 mL Transformation Puffer und Transfer zum 15 mL konische Rohr. Resediment überstand verwerfen, und die Hefe in 1 mL der letzte Band der Transformation Puffer mit einer 1000 µL Pipette aufzuwirbeln.
    5. Hefezellen für 60 min. bei 30 ° C unter Schütteln bei 200 u/min inkubieren und dann für 30-90 min auf Eis legen.
  2. Hefe-Plasmid-Transformation.
    1. Fügen Sie in 1,5 mL sterile Microcentrifuge Schlauch 1 µg Plasmid pTEF-GBD-basierte und 5 µL 10 mg/mL Lachs Spermien Träger DNA-Lösung. Auch ein Röhrchen mit nur Lachs Spermien Träger DNA negative Veränderung zur Kontrolle. Jedes Rohr 100 µL Zellsuspension eiskalte Hefe mit Pipette hinzufügen. Hinzufügen von 100 µL 70 % PEG-Lösung mit 1000 µL Pipette und Mischung sanft durch Streichen der Röhre 5 - 10 mal (nicht Wirbel zu tun).
    2. Bei 30 ° C in einem schütteln Inkubator bei 200 u/min für 45 min inkubieren.
    3. Hitzeschock bei 42 ° C für 15 Minuten.
    4. Sediment in einem Microcentrifuge 845 X g für 3 min bei Raumtemperatur, pipette aus überstand verwerfen, Aufschwemmen Pellet in 150 µL steriles Wasser von oben und unten pipettieren und über die Oberfläche eines CSM-Trp-Platte verteilt.
    5. Legen Sie Platten rechts oben in 30 ° C Brutschrank und inkubieren Sie für 2-3 Tage, bis die Kolonien sichtbar sind. Platten können umgedreht werden zur Vermeidung von Kondensation auf der Plattenoberfläche nach der Inkubation bei 30 ° C für 6 bis 12 h.
    6. Nehmen Sie 2-3 Kolonien pro Transformation und Streifen als Patch auf einem CSM-Trp-Teller mit einem sterilen Zahnstocher. Für 24 h bei 30 ° c wachsen lassen
  3. Lysates für Protein-Expression zu machen.
    1. 3 mL CSM-Trp flüssiger Medien mit einer Spiel-Kopf-Größe von Hefe aus dem Patch zu impfen und wachsen über Nacht bei 30 ° C in einem 20 x 150 mm-Kultur-Rohr unter Schütteln bei 200 u/min. Machen Sie zwei Übernachtungen Kulturen pro Köder und leeren pTEF-GBD Vektor.
    2. 1 mL der YPD zu je 3 mL der CSM-Trp über Nacht Kultur hinzufügen. Für 1 h bei 30 ° C unter Schütteln bei 200 u/min wachsen. Überprüfen Sie OD der Zellen durch Spektralfotometer.
    3. Sediment eine entsprechende Anzahl von Zellen, Normalisierung nach der OD. Verwenden Sie sterile 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen mit eine 5 min Spritztour auf 2.348 x g bei Raumtemperatur in einem Microcentrifuge. Verwenden Sie eine Pipette, um überstand verwerfen. Der Endbestand entspricht mindestens 2,1 OD.
      Hinweis: Bei der Berechnung der entsprechende Anzahl von Zellen kann es vorkommen, dass unterschiedliche Volumina aus jede Nacht Kultur, die minimale 2.1 OD zu erreichen erforderlich ist.
    4. Aufschwemmen Sie das Pellet in 450 µL 0,2 M NaOH durch pipettieren rauf und runter. 5 min bei Raumtemperatur inkubieren. Wiederausschleudern Sie Zellen für 2 min bei 2.348 x g bei Zimmertemperatur, und entsorgen Sie des Überstands mit Pipette.
    5. Aufschwemmen der Pellet mit 50 µL TWIRL Puffer durch pipettieren oben und unten vorsichtig Luftblasen nicht zu machen. Hitze-Probe für 5 min bei 70 ° C.
  4. Suchen Sie nach Proteinexpression durch SDS-PAGE.
    1. Verwenden Sie eine gradient Gel von 4-20 % auf eine Vielzahl von Molekulargewichten sorgen gelöst werden kann. Last Gegenwert (gleiche OD) der Proben in einem SDS-PAGE gel und achten Sie darauf, mindestens eine Probe mit der unveränderten pTEF-GBD Vektor13,14,15gehören.
    2. Übertragen Sie nach der elektrophoretischen Trennung Gel auf Nitrozellulose und Immunoblot mit monoklonalen oder polyklonalen Antikörper Anti-Myc und ECL Angriffsermittlungslösung (Abbildung 3).

4. selbst Aktivierung Test

  1. Streifen aus der MATalpha Hefe aus dem-80 ° C entspricht der Belastung die Beute-Bibliothek von Interesse auf einen Teller YPD durch eine sterile hölzernen Applikator, Schaben eine kleine Menge der Hefe aus der Flasche und Streifen sie über die YPD-Platte Gehäuse. Inkubieren Sie die YPD-Platte bei 30 ° C, 2 Tage lang oder bis die einzelnen Kolonien sichtbar werden. Ein Paare einzelne Kolonien auf einen Teller YPD Patch und Inkubation über Nacht bei 30 ° C.
    Hinweis: Die neue Sorte entwickelte sich hier zu Haus Beute Bibliothek ist PLY5725, während einige kompatibel im Handel erhältlichen Y2H-Bibliotheken in Y187 untergebracht sind.
  2. Folgen Sie die Anweisungen unter 3.3.1 - 3.3.4, PLY5725 mit LEU2zu verwandeln-basierte Plasmid verwendet, um die gewünschte Beute Bibliothek Haus. Für Bibliotheken entwickelte sich hier die entsprechenden Plasmid ist pGal4AD (pPL6343). Platte auf CSM-Leu-Met Teller Hefe transformanten wiederherstellen. Entstehen Sie nach Kolonien, Streifen als Flecken auf einen Teller CSM-Leu-Met und 24 h bei 30 ° c inkubieren
  3. Befolgen Sie das Protokoll in 3.4 Ausdruck pPL6343 leerer Vektor mit anti-bestätigen-HA monoklonalen oder polyklonalen Antikörper und ECL-Erkennung-Lösung.
  4. Streifen, die jeweils die transformierte PJ69-4A-Hefe in einem Kreuzmuster mit PLY5725 baut auf eine YPD-Platte, die bestätigt wurde, um Protein in Protokoll Abschnitt 3.4 und 4.3 express und über Nacht bei 30 ° C inkubieren. Nehmen Sie 1 mm3 Zellen, wo die beiden Stämme sind zusammengewachsen und patch auf, separate CSM-Leu-Met, CSM-Trp und CSM-Trp-Leu-Platten und 24 h zu wachsen.
    Hinweis: Gewünschte diploiden wachsen auf den CSM-Trp-Leu-Platten. Wachstum auf CSM-Leu-Met und CSM-Trp-Platten dienen als Positivkontrolle für Hefe Wachstum.
  5. Wachsen Sie lassen in 1 mL der CSM-Trp-Leu Medien über Nacht bei 30 ° C. Sediment 500 µL Zellen in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch 2.348 x g, 3 min bei Raumtemperatur in einem Microcentrifuge. Überstand mit Pipette zu verwerfen. Die Zellen in 1 mL sterilem Wasser aufschwemmen und Sedimentation und Wiederfreisetzung zu wiederholen. Überprüfen Sie die OD600 Zellen.
  6. Machen Sie eine Reihe von 01:10 serielle Verdünnungen von jedem Zellsuspension mit sterilem Wasser mit dem Ausgangspunkt die meisten konzentrierten Lösung von jeweils eine OD von 0,5. Spot 5 µL jeder Verdünnung auf einem CSM-Leu-Trp-Teller, CSM-Leu-Trp-seine Platte und ein CSM-Leu-Trp-seine + 3AT Platte. Bei 30 ° C inkubieren und untersuchen auf Wachstum täglich über 3 Tage (Abbildung 4).
    Hinweis: für die 01:10 serielle Verdünnung, pipette 10 µL des Rohres mit einem OD 0,5 in 90 µL Wasser und Mischen von pipettieren rauf und runter. Weiterhin 01:10 serielle Verdünnungen bis insgesamt sechs verschiedenen Konzentrationen zu erkennen gibt.

5. Erstellen Sie Hefe Populationen mit Köder und Beute-Bibliothek

Hinweis: Die Y187 Belastung, die kommerzielle Beute Bibliothek Plasmide Häuser nicht gut Paaren. Somit sind folgenden optimierte Bedingungen verpflichtet, Komplexität der Bibliothek zu wahren. Die PLY5725 belasten enthaltenden Y2H Beute Bibliotheken Kumpels besser und der gleichen Paarung Verfahren kann verwendet werden, bei dieser Sorte (Abbildung 5).

  1. 3 mL der Kulturen aller der PJ69-4A transformanten tragen die verschiedenen TRP1zu impfen-mit pTEF-GBD Köder Plasmid in CSM-Trp-Medien in einem Kultur-Rohr. Gehören Sie zwei getrennte Kulturen mit pTEF-GBD Vector Plasmid allein, als verfahrenskontrollen dienen. Inkubieren Sie Kulturen bei 30 ° C, 200 u/min für 6 h und dann in ein 25 mL der Kultur in einem sterilen Erlenmeyer-Kolben für Übernachtung Wachstum verdünnen.
  2. Tauen Sie ein Fläschchen gefroren (-80 ° C) die MATalpha Zellen, enthalten die LEU2-Ausführung "Beute" Bibliothek bei Raumtemperatur. 125 mL der CSM-Leu-Met Medien in eine sterile Erlenmeyerkolben mit der gesamten aufgetauten Durchstechflasche zu impfen. Alle Kulturen über Nacht bei 30 ° C mit schütteln bei 200 u/min zu wachsen.
    Hinweis: Die OD600 der Nacht Kulturen muss zwischen 1,0 bis 1,5 bevor Sie zu den nächsten Schritten fortfahren.
  3. Zentrifugieren Sie 21 OD Entsprechungen der einzelnen PJ69-4A-Transformant-Kulturen mit einem 5 min Spin bei 4.696 x g bei Raumtemperatur. Für jede 10 Paarung Reaktionen auf Wunsch Pellet 39 OD600 Entsprechungen der MATalpha Belastung tragen die Bibliothek Plasmide in separaten 50 mL konische Röhrchen.
    1. Zellen in 10 mL sterilem Wasser und neu pellet in neuen 50 mL konische Rohr 4.696 x g 5 min bei Raumtemperatur in einer Zentrifuge Benchtop aufzuwirbeln. Mit einer Pipette, Sie vorsichtig, den überstand ohne Unterbrechung die gebeizte Zellen zu entfernen.
    2. Aufschwemmen Sie Pellets PJ69-4A in 4 mL und PLY5725 Zellen in 10 mL bYPDA (pH 3,7).
  4. Set-up fügen Paarung Reaktionen, Sie 1 mL PJ69-4A Zellen, 1 mL der MATalpha Bibliothek-haltigen Zellen und 1 mL bYPDA pH 3,7 bis neue 50 mL konische Rohr verwandelt. Bei 30 ° C mit sanften orbital Agitation (100-130 u/min) für 90 min inkubieren.
    1. Zentrifugieren Sie Zellen für 5 min bei 4.696 x g, bei Raumtemperatur in einer Benchtop-Zentrifuge. Überstand mit Pipette entfernen und erneut das Pellet in 2 mL 1:1 bYPDA:YPD. Platte auf einen 100 mm YPD Teller alle 2 mL mit Pipette und inkubieren Sie bei 30 ° C für ca. 20 h.
  5. Ernte-Zellen von den YPD-Platten mit einer Zelle Schaber, um die Zellen in 2-3 mL der CSM-Leu-Trp Medien zu verdrängen. Pipette verdrängt Zellen in ein 50 mL konische Rohr. Spülen Sie die Platten 4-5 Mal mit 2-3 mL CSM-Leu-Trp Medien von oben, die die Medien mit einer 1000 µL pipette pipettieren und sanft Auswerfen der Medien über die Plattenoberfläche YPD.
    1. Zentrifugieren Sie Zellen für 5 min bei 4.696 x g bei Raumtemperatur in einer Benchtop-Zentrifuge. Überstand mit Pipette zu verwerfen und Aufschwemmen der Zellen in 40 mL der CSM-Leu-Trp Medien durch pipettieren rauf und runter (Do nicht Wirbel).
  6. Zur Schätzung der Anzahl der diploiden Zellen gebildet, verdünnen Sie 4 µL der diploiden Mischung in 200 µL und 2000 µL CSM-Trp-Leu Medien. Platte 200 µL jeder Verdünnung auf einen Teller CSM-Leu-Trp.
    Hinweis: Die beiden Platten stellen eine 1: 10.000 und 1: 100.000 fache Verdünnung des Bestandes an diploiden geerntet und nachgiebig einem erwarteten ~ 9.000-27.000 Kolonien auf der Verdünnung 1: 10.000 nach Inkubation bei 30 ° C für 36-40 h Check Platten nach Schritt 5.7. Eine Mindestanzahl von 200 Kolonien auf der Verdünnung 1: 10.000 ist erforderlich, um zum Schritt 5.8
  7. Sofort nehmen Sie den Rest von je 40 mL der Zelle Wiederfreisetzung und impfen Sie eine 1.000 mL Erlenmeyerkolben, 500 mL von CSM-Leu-Trp Medien enthält. Nehmen Sie eine anfängliche OD600. Inkubieren Sie diese Flaschen bei 30 ° C mit schütteln bei 180 u/min bis zum Erreichen der Sättigung (~2.0 OD/mL). Dies dauert in der Regel ca. 36-40 h. Monitor Wachstum um 24 Uhr dann wieder bei 36 h OD600.
  8. Mit einer Pipette 20 mL Aliquote aller gesättigten 500 mL von Kulturen und Innoculate 2.000 mL Erlenmeyerkolben, ein mit 750 mL von CSM-Leu-Trp-Medien und die zweite mit 750 mL CSM-Leu-Trp-sein mit der niedrigsten 3AT entfernen, Hintergrund (vorher bestimmt in Abschnitt 4.5) beseitigt. Mischen Sie die neuen Kulturen (770 mL) gut durch Umschwenken und nehmen Sie eine erste OD600.
  9. Inkubieren Sie Kulturen bei 30 ° C unter Schütteln bei 180 u/min bis zum Erreichen der Sättigung, die in der Regel tritt innerhalb von 24 h für die nicht ausgewählten CSM-Leu-Trp-Kultur und kann über 70 h für Kulturen unter Auswahl für Y2H-Interaktionen.
  10. Wenn Kulturen Sättigung (OD ~ 2.0) erreicht haben, entfernen Sie die Zellen mit einem 5 min Spin bei 4.696 x g bei Raumtemperatur 11 mL Pipette, Sediment zu, verwerfen Sie überstand, Pipette, und bei-20 ° C frieren Sie ein oder fahren Sie auf die DNA-Extraktion. Die ausgewählten und nicht ausgewählten Proben werden sowohl für die Tiefe Sequenzierung verwendet werden.

(6) Probenvorbereitung für DEEPN Deep Sequencing

  1. DNA-Extraktion.
    1. Verwenden Sie eine Pipette, um Zelle Pellets aus Protokoll Abschnitt 5.7 in 500 µL Puffer sTE und Transfer zu einer 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch aufzuwirbeln. Fügen Sie 3 µL Betamercaptoethanol und 10 µL des Zymolase bestand. Gut mischen und im Inkubator für 24-36 h 37 ° C inkubieren.
    2. Extrahieren Sie die Probe zwei Mal mit 500 µL Phenol/Chloroform/Isoamyl Alkohol während der Verwendung ein Dunstabzugshaube16.
    3. Fügen Sie 7 µL 4 M NaCl, 900 µL eiskalt 100 % Ethanol (ETOH), Mix durch Umkehrung und entweder frieren-20 ° C oder Sediment DNA durch Spinnen 21.130 x g für 10 min bei Raumtemperatur in einem Microcentrifuge weiter.
    4. Überstand mit Pipette zu verwerfen. Waschen Sie die Pellets dreimal mit 900 µL 70 % ETOH.
    5. Sediment pellet 21.130 x g für 2 min und Rest ETOH-Waschanlagen mit Pipette zu entfernen. Trockene Pellets für 7 min bei 42 ° C.
    6. Aufschwemmen Pellet in 120 µL 0.1 x sTE im Wasserbad 37 ° C für 90 min, flick die Röhren alle 30 min. zu mischen.
    7. Pipette 60 µL der extrahierten DNA in eine sterile 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch. Fügen Sie 120 µL sTE, 3,5 µL RNase A Lager, Flick zu mischen und Inkubation bei 37 ° C für 1 h.
    8. Ethanol-Niederschlag wie bereits in Abschnitt 6.1.3 - 6.1.5, getan, sondern verwenden 7 µL 5 M Ammoniumacetat statt 4 M NaCl.
    9. Aufschwemmen RNase A-behandelte DNA in 55 µL 0.1 x sTE im Wasserbad 37 ° C für 90 min, flick die Rohre zu mischen alle 30 min. Quantify DNA durch Absorption bei 260 nm auf einem Spektrophotometer.
  2. Fügt ein PCR cDNA.
    1. Führen Sie zwei, 50 µL PCR-Reaktionen pro DNA-Probe. Jede Reaktion enthält 25 Pmol jedes vorwärts und rückwärts Grundierung passend die Beute-Bibliothek-Plasmid (siehe Material). Reaktionen auch enthalten 25 µL der High-Fidelity-2 X PCR Master Mix, 5 µg DNA-Probe, und Wasser bis zu 50 µL. Amplify Reaktionen für 25 Zyklen mit Verlängerung von 3 min bei 72 ° C, einer Temperung Temperatur von 55 ° C für 30 s und bei 98 ° C für 10 S. vorauszugehen Denaturierung Radfahren durch eine 30 s Denaturierung bei 98 ° C und folgen mit einer 5 min Inkubation bei 72 ° C.
    2. Analysieren Sie 4 µL jeder PCR-Reaktion von 1 % DNA-Agarose-Gelelektrophorese mit DNA-Agarose-gel mit 0,2 - 0,5 µg/mL EtBr17. Visualisieren Sie DNA-Probe durch UV durchleuchtbaren. Beispiele zeigen, dass ein Abstrich der DNA etwa 1-3 kb, wo bandenmuster für Proben gefunden werden kann, wo war eine Y2H-Interaktion (Abbildung 6) ausgewählt.
    3. Doppelte PCR Proben zu kombinieren und mit dem PCR-Reinigung-Kit in Übereinstimmung mit den Anweisungen des Herstellers zu reinigen und zu quantifizieren DNA durch Absorption bei 260 nm auf einem Spektrophotometer.

(7) deep sequencing

Hinweis: Probenvorbereitung und Sequenzierung auf eine Tiefe Sequenzierung-Plattform ist in der Regel in kommerziellen und akademischen DNA-Sequenzierung Kern Einrichtungen erhältlich.

  1. Scher 600 ng PCR-Produktes mit einem Hochleistungs-Ultra-sonikator, die Fragmente von einer durchschnittlichen Länge von ~ 300 bp.
  2. Generieren Sie indizierte Sequenzierung Bibliotheken mit ein vorbereitungssatz für tiefe Sequenzierung, die Linker Codierung Barcodes, Websites, Grundieren hinzufügt und erfassen Sie Sequenzen asymmetrisch an den Enden der DNA-Fragmente zu.
  3. Durchführen Sie Bibliothek-Zubereitung nach Herstellerangaben. Pool indiziert Bibliotheken und Sequenz als lange gepaart Ende liest auf einer tiefen Sequenzierung Plattform (z. B. 2 x 150 bp PE gelesen). Die gewünschte Anzahl der Lesevorgänge für jede Probe gezielt liegt zwischen 10 und 40 Millionen, mit mehr liest, für den nicht ausgewählten Populationen, die in der Regel komplexer sind gewünscht. Es wird empfohlen, mindestens 20 Millionen oder mehr liest für die nicht ausgewählten Populationen.

8. Bioinformatic Verarbeitung und Prüfung

  1. Prozess DNA Sequenzierung Daten in Form von Fastq mit einer Reihe von Stand-Alone-Software, die Programme gebaut, um die Karte (1) Reihenfolge gelesen, dass Dateien in einem universellen SAM-Format () (2) quantifizieren gen Bereicherung zwischen Datensätzen () (3) führen Sie statistische Analyse der Daten in Auftrag, welcher Kandidat Gene Rang sind positiv für Y2H Interaktion () 4) bieten Informationen, was positive Y2H Region(en) und welche translationale Rahmen der Beute cDNA pro gen-Fragmente ergeben Wechselwirkungen bestehen, und (5) Werkzeuge, nicht nur die 5' sondern auch die 3'-Ende der interagierenden Fragmente ermöglicht ihren Wiederaufbau und Überprüfung in einem traditionellen Y2H-Format zu rekonstruieren. Betrieb dieser Programme ist in der begleitenden Studie detailliert.

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Representative Results

Die Y2H-Assay ist weit verbreitet für die Suche nach Protein: Protein-Interaktionen und mehrere Anpassungen und Systeme entwickelt worden. Zum größten Teil sind die gleichen Überlegungen, die helfen, Erfolg mit diesen früheren Ansätzen für DEEPN wichtig. Beispiele für wichtige Benchmarks: Ausdruck der DNA-bindende Domäne Fusionsproteine, gewährleisten einem niedrigen Hintergrund der unechten seine + Wachstum in der diploiden, enthält den Köder mit einer leeren Beute Plasmid, eine hohe Effizienz der Paarung des Köders zu gewährleisten hefehaltigen MATA mit der Bibliothek-haltigen MATalpha Hefe, und schließlich auch diejenigen Low-strenge Bedingungen, mit denen die Bevölkerung weiter unter Bedingungen, die für viele positive Y2H Reaktionen, auswählen, dass produzieren niedrige Niveaus der His3 Aktivität und eine schwache Y2H transcriptional Antwort.

Kritische Aspekte der DEEPN gehört, reproduzierbar die Y2H-Bibliothek in Stämme einzuführen, die verschiedene Köder Plasmide enthalten und zuverlässig jene Bevölkerungen für diese Bibliothek Plasmide auszuwählen, die positive Y2H-Interaktionen zu erstellen. Dies wird schwieriger, wenn die Komplexität der Y2H Bibliothek erhöht, da es schwieriger ist, angemessene Übertragung der gesamten Bibliothek in verschiedenen ursprünglichen Populationen zu gewährleisten. Darüber hinaus müssen die Größe der Bevölkerung gewählt, die unter Selektionsbedingungen und Tiefe der Sequenzierung wachsen groß genug, um reproduzierbare Veränderungen im Y2H Plasmid zuverlässig identifizieren wahre positive Y2H-Interaktionen zu beobachten sein. In früheren Studien haben wir im Handel erhältliche Y2H-cDNA-Bibliotheken verwendet. Wir fanden die Variabilität in der Y2H Bibliothek Verteilung zwischen getrennten Populationen tragen die gleichen Köder Plasmide ist gering, mit einer Overdispersion zwischen den beiden ursprünglichen Populationen vor Auswahl der < 0,01 in der Regel und 0,35 - 0,55 für die getrennte Bevölkerung nach Auswahl4. Die Komplexität von einigen dieser im Handel erhältlichen Y2H-Bibliotheken ist jedoch relativ gering (Abbildung 7). Darüber hinaus bestehen viele Klone darin (~ 60 %) vollständig aus cDNA-Fragmente, die 3' von der kodierenden Region weiter ihre Nützlichkeit begrenzt sind. Um zu zeigen, dass die oben genannten Methoden waren imstande, komplexere Y2H-Bibliotheken, wir erschaffen eine neue Y2H-Bibliothek im stromlinienförmigen "Beute" Plasmid Vektor Fragmente (pGal4AD), enthält von genomischer DNA aus Saccaromyces Cerevisiae (Dehnung PLY5725). Genomischer DNA wurde durch Scheren, Größe ausgewählt für Reichweiten von 600-1500 bp, modifiziert mit Adaptern und in pGal4AD zum Erstellen der SacCer_TAB Y2H-Bibliothek (Abbildung 8) fragmentiert. Die Bibliothek wurde PLY5725, verwandelt sich in eine Bevölkerung von Hefe, die dann gedeckt war produziert, um Proben von PJ69-4A MATA tragen das pTEF-GBD Plasmid allein zu trennen. Doppelte diploide Populationen wurden nicht-selektiven und selektiven Bedingungen angebaut. Die Y2H-Plasmid-Bibliothek-Einsätze wurden durch tiefe Sequenzierung analysiert. Wenn zugeordnet genomischer DNA umfasst 100 bp vor- und nachgelagerten jedes Proteins Codierung Region (84 % des gesamten Genoms), fanden wir > 1,1 Millionen verschiedene Plasmide in der Bibliothek für eine geschätzte Gesamtgröße der Bibliothek in der Hefe von ~1.35 Millionen verschiedene Plasmide. Zum Vergleich: wir auch verwandelt eine zuvor beschriebenen Hefe genomische Y2H Bibliothek11 (PJ_C1, C2, C3 Y2H-Bibliothek) in MATalpha Hefe und die gleiche Analyse wie oben ausgesetzt. Wir fanden, dass die Komplexität unserer zufälligen Fragment Hefe Y2H Bibliothek weit höher war und hatte viel mehr Plasmide Codierung im Rahmen Fragmente von jedem gen als die bisher veröffentlichten Bibliothek (Abbildung 9). Wichtig ist, die Generation der ursprünglichen Bibliothek mit diploiden Populationen war sehr reproduzierbar mit einer Overdispersion von < 0,01 (Abbildung 10). Darüber hinaus produzieren die Reproduzierbarkeit des Habens der beiden separaten Hefe Populationen ähnliche Umverteilungen von Plasmiden, nachdem Auswahl für positive Y2H Interaktionen war sehr gut, mit einem Overdispersion von 0,3. So beherbergen die Methoden hier größere Y2H-Bibliotheken höhere Komplexität als die zuvor verwendeten.

Im Hinblick auf die Erhöhung der Benutzerfreundlichkeit DEEPN, bevorzugen wir, dass mit Gensynthese machen fügt Codierung für die Köder-Protein des Interesses. Dies ermöglicht die Codierung Regionen für Protein Domains, Chimären und Mutanten Y2H Köder Plasmide leicht integriert werden, sondern ermöglicht auch die Codons für Ausdruck in S. Cerevisiaeoptimiert werden. Ausdruck von zwei verschiedenen Gal4 DNA-bindende Domäne Fusionsproteinen wird in Abbildung 3gezeigt. Zwei verschiedene Hefe transformanten auszudrücken entweder zwei Köder Fusionsproteine wurden vorbereitet und SDS-PAGE und Immunoblotting mit Anti-Myc Antikörper ausgesetzt. Beachten Sie Ausdruck Niveaus der Köder Proteine im Verhältnis zu den Gal4 DNA-bindende Domäne allein aus dem leeren Vektor. Wir fanden, dass es ist wichtig, nicht nur um den Ausdruck des Fusionsproteins Köder zu überprüfen, sondern auch Ausdruck in der genauen MATA Hefe Transformant Kolonie zu überprüfen, die zum Erweitern und Paaren, die Beute Bibliothek-haltiger Hefe verwendet wird. Nachdem eine Transformant identifiziert wurde, ist es möglich, fixieren Sie sie nach unten und zur späteren Verwendung speichern.

Abbildung 4 zeigt einen Test für selbständige Aktivierung wo eine serielle Verdünnung der diploiden Zellen sind vernickelt auf CSM-Leu-Trp (+ seine), CSM-Trp-Leu-HSI (-seine), und CSM-Trp-Leu-seine + 3AT (-seine + 3AT) Platten und bei 30 ° C für 3 Tage wachsen durfte. Das gewünschte Ergebnis, Wachstum zu beobachten ist in der Gegenwart aber nicht Abwesenheit von Histidin unabhängig davon, ob es gibt 3AT. Dies ermöglicht die Verwendung von CSM-Trp-Leu-HSI für Hefe mit einem positiven Hefe-2-Hybrid-Interaktion auswählen. Ist Wachstum auf CSM-Leu-Trp-seine Platten, dann eine Y2H-Auswahl noch erhalten Sie mit der niedrigsten Konzentration von 3AT das Wachstum verhindert. Wir finden, dass Wachstum im CSM-Trp-Leu-HSI + 0,1 mM 3AT blockiert werden kann, dann DEEPN Assay gehen Sie können über diese Bedingung um für Y2H Interaktionen zu wählen. Wenn jedoch höhere Konzentrationen von 3AT Hemmung des Wachstums von diploiden, pGal4AD oder anderen leeren Beute Plasmid und pTEF-GBD-Köder Fusion Plasmid enthält erfordert, beeinträchtigt es die Leistung des DEEPN Verfahrens und eine verschiedene Köder plasmid sollte angestrebt werden. Beachten Sie, dass seine + Wachstum die einzige Auswahl für eine positive Y2H-Interaktion ist. Wir haben festgestellt, dass dies ausreicht, um für Y2H Interaktionen im Batch zu bereichern.

Eines der wichtigsten Verfahren im DEEPN Workflow soll erzielen hohe Effizienz Paarung der MATA Hefe tragen die Köder Plasmid mit der MATalpha Hefe Y2H Beute Bibliothek tragen. Wir festgestellt, dass einige Stämme (z. B. Y187)18, Gehäuse handelsüblichen cDNA-Bibliotheken, haben eine relativ schlechte Paarung Effizienz. Aus diesem Grund haben wir eine Sorte Y2H Bibliotheken tragen entwickelt. Diese Sorte basiert auf BY4742, ein Derivat des S288c. Diese Sorte fehlt GAL4, GAL80, TRP1, LEU2und HIS3. Es enthält kein Reporter, die auf ein Hybrid-Gal4-Protein noch ein anderes Hybrid (z. B. LexA-VP16) reagieren. Stattdessen befindet sich die Quelle der Y2H-induzierte His3 Produktion innerhalb der MATA-Belastung, die das jeweilige Köder Plasmid tragen würde. Dies vereinfacht das System und ermöglicht größere Flexibilität, dass man die gleichen Bibliothek-haltigen MATalpha Zellen verwenden kann, um mit einem Stamm mit dem Ausdruck ein Fusionsprotein LexA-Köder und ein LexA(UAS) -HIS3 -Reporter oder ein Schmelzverfahren Protein Gal4-DBD-Köder und eine Gal4 Paaren (FH)-HIS3 Reporter.

Nachdem die diploiden Populationen tragen ein Köder-Plasmid und die Bibliothek generiert wurden, sind sie verdünnt und unter Bedingungen, die wählen Sie einfach für beide Plasmide (z. B. CSM-Trp-Leu) oder für Plasmide und eine positive Interaktion Y2H wachsen durfte, Produktion von His3-Laufwerke (z. B. CSM-Leu-Trp-HSI). Es ist wichtig zu eine große Menge an Start Bevölkerung zur Vermeidung einer evolutionären "Engpass, die" die Bevölkerung neigen kann, die nach der Auswahl für eine positive Y2H Interaktion führt. So gibt unser Verfahren mit 20 mL aus 500 mL der diploiden Bevölkerung Kultur in 750 mL frische CSM-Leu-Trp-HSI Medien zur Vermeidung dieses Problems angebaut werden. Mit pTEF-GBD als Köder Plasmid fanden wir, dass eine einzelne Runde der Verdünnung und Wachstum ausreicht, um eine informative Bevölkerung zu entwickeln. Verwenden verschiedene Köder Plasmide zuvor, wir nutzten zwei Runden von Verdünnung und Wachstum, eine anfängliche 20 mL in 750 mL und dann 2 mL davon gesättigte Kultur in 75 mL verdünnt. Abbildung 6 zeigt die Ergebnisse von PCR Verstärkung über die Bibliothek-Einsätze für die diploiden Bevölkerung gewachsen unter nicht-selektiven Bedingungen sowie einen ersten und zweiten Folgerunde der Verdünnung und Wachstum in einem selektiven Zustand für zwei verschiedene Köder Plasmide. Beachten Sie, dass keine Auswahl, es gibt ein generalisierter Abstrich der PCR-Produkte bezeichnend für eine komplexe und relativ gut normalisierte Mischung aus Fragmenten. Nach der Auswahl ändert sich dieses Muster mit einigen Arten stark bereichert, so dass einzelne Bänder auszumachen sind. Ein gewisses Maß an Streifenbildung ist typisch für die erfolgreiche Experimente bisher noch eine Abstrich Muster zusätzlich zu oder anstelle einer bandenmuster ist bezeichnend für ein komplexes Gemisch von Beute Einsätze und ist wünschenswert, wenn man die Zahl der Bewerber zu maximieren will die DEEPN erkennt. Sehr starke bandenmuster, wo findet man die meisten das PCR-Produkt in 1-3 Bands, zeigt, dass die meisten Sequenzierungsdaten durch nur 1-3 Beute Einsätze geprägt sein werden. Dafür kann man kompensieren, teils durch mehr liest aus diesem Beispiel zu widmen. Man sieht, dass wenn die Bevölkerung wird verdünnt und weiter gewachsen, (siehe "ausgewählten d2' in Abbildung 5), das bandenmuster prominenter ist, darauf hinweist, dass Beute Plasmide, die Übertragung der schwacher, aber authentischen Y2H-Interaktionen sind vermindert wird, während wenige Auserwählte Beute Plasmide sind ihre Häufigkeit steigt. Aufeinanderfolgenden Verdünnung und Wachstum, dieses hohe Niveau gilt als kontraproduktiv für das Ziel die größte Zahl der potentiellen Kandidaten und damit mit dem Protokoll hier zu fangen, empfehlen wir eine Runde der Verdünnung und Wachstum verwendet werden.

Figure 1
Abbildung 1: Schematische DEEPN Workflow. Die Grundzüge der Laborverfahren zeigt auf der linken Seite zusammen mit den ungefähren Zeitpunkt des entsprechenden Vorgangs erforderlich. Auf der rechten Seite ist der Bioinformatik-Workflow mithilfe der Softwarepakete DEEPN und Stat_Maker. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Schematische von pTEF-GBD. TRP1-mit niedrigen Kopie Gal4 DNA-bindende Domäne Fusion Protein Ausdruck Plasmid wird angezeigt. Freuen Sie sich auf eine konstitutive TEF1 Promotor, Myc Epitop Tag, Gal4 DNA-bindende Domäne folgte eine T7-RNA-Polymerase-Bindungsstelle, Polylinker und PRM9 Terminator innerhalb einer Zentromer (CEN)-Plasmid basierte. Dieses Plasmid trägt auch Kanamycin-Resistenz und die ColE1 bakteriellen Ursprungs der Replikation. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Ausdruck von Gal4-Köder-Fusionsproteinen. Lysaten aus Hefe, die mit dem Ausdruck verschiedene Köder Proteine verschmolzen, die Gal4 DNA-bindende Domäne in pTEF-GBD ausgedrückt wurden SDS-PAGE und Immunoblotting mit Anti-Myc Antikörper ausgesetzt. pTEF-GBD drückt nur die Gal4-DNA-Bindng Domain allein; pTEF-GBD-bait1 drückt die Gal4-DNA-Bindng-Domain verschmolzen zu einer RhoA fehlt Standort C-terminalen Prenylation und Gehäuse eine Mutation in eine GTP-gebundenen Konformation Sperren; pTEF-GBD-bait2 drückt die Gal4-DNA-Bindng-Domain verschmolzen zu einer RhoA fehlt Standort C-terminalen Prenylation und Gehäuse eine Mutation in eine BIP-gebundenen Konformation sperren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: selbstständige Aktivierung Test Diploiden aus PJ69-4A mit den angegebenen Köder Plasmiden und PLY5725 Zellen tragen die angegebenen Beute Plasmid hergestellt wurden seriell verdünnt und entdeckt auf CSM-Leu-Trp-Platten, CSM-Leu-Trp-seine Platten und CSM-Leu-Trp-seine + 3AT Platten und für 3 Tage am gewachsen 30 ° C. Die PJ69-4A transformanten verwendet für die Paarung waren die ersten jedes Paares in Abbildung 3dargestellt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5: Paarung Effizienz der Y187 vs. PLY5725. Die Paarung Reaktion zwischen PJ69-4A, enthält ein TRP1-mit Köder Vektor- und Y187 oder PLY5725 tragen Beute Plasmid wurde durchgeführt. Verdünnungen von 1: 10.000 wurden auf CSM-Trp-Leu für diploiden auswählen überzogen. Die PLY5725 Belastung zeigt einen höheren Paarung Wirkungsgrad als der Y187 Stamm mit ~ 10 Falte mehr Kolonien produziert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6: PCR Beute Bibliothek Einsätze. DNA wurde isoliert aus diploiden Hefe mit einer Beute-Bibliothek, die unter nicht-selektiven Bedingungen (CSM-Leu-Trp Medien) angebaut wurde oder die Voraussetzungen für eine positive Y2H-Interaktion (CSM-Leu-Trp-HSI Medien) auswählen. PCR in der Bibliothek fügt zeigt Unterschiede im Repertoire der Einsätze ausgewählt. Zwei Runden der selektives Wachstum dienten. Eine erste Runde des Wachstums durch Verdünnung 20 mL 500 mL der diploiden Kultur in 750 mL nichtselektive CSM-Leu-Trp-Medien und eine weitere 20 mL in 750 mL CSM-Leu-Trp-HSI Medien für eine erste Runde von selektives Wachstum (d1) gemacht. Es folgte eine weitere Runde des Wachstums (d2) gemacht, indem man 2 mL der d1-Kultur und Verdünnung in 75 mL selektivmedien CSM-Leu-Trp-HSI. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 7
Abbildung 7: Komplexität der Y2H cDNA Bibliothek. Analyse des Inhalts der eine handelsübliche Maus cDNA Y2H Beute Bibliotheken: eine Bibliothek von cDNA des Gehirn der Maus und einer aus mehreren Maus Gewebe. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 8
Abbildung 8: Generation Y2H-Hefe-genomische Fragment-Bibliothek. A. schematische Beschreibung Montage von der Hefe-genomische Fragment-Bibliothek in pGal4AD. Genomischer DNA aus Stamm PLY5725 war nach dem Zufallsprinzip geschert, mit den angegebenen Y-Adapter ligiert und ligiert in SfiI geschnittene pGal4AD. Grundsätzlich wurden in Bakterien zu Ertrag 2,2 x 106 unabhängigen Kolonien verwandelt, die wurden kombiniert und vor Isolation von ihrer Plasmid DNA SacCer_TAB Y2H-Bibliothek umfasst gewachsen. B. die LEU2-mit Plasmid (pGal4AD) Gehäuse die Gal4 transkriptionelle Aktivierungsdomäne wird angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 9
Abbildung 9: Komplexität der Y2H Hefe genomic Bibliothek. Die SacCer_TAB genomische Bibliothek verwandelte sich in der PLY5725 MATalpha-Stamm und PJ_C1, C2, C3 Υ187 ΜΑΤalpha Sorte Hefe genomic Bibliothek umgewandelt wurde. Diploiden dieser Populationen wurden durch Paarung der PJY69-4A-Dehnung. Populationen wurden seit zehn Generationen angebaut und Beute-Fragmente, die PCR verstärkt wurden Hochdurchsatz-Sequenzierung und Analyse unterzogen. A. zeigt die Rangfolge der Lesevorgänge pro jedes Gen in den Y2H-Bibliotheken geteilt durch die Lesevorgänge pro gen durch Sequenzierung des Hefegenoms gefunden. Angesichts gleichwertige Fülle von jedem gen, hätte jedes Gen einen Wert von 1. B. Histogramm zeigt die Anzahl der einzigartigen Plasmide pro gen, die ein Fragment zu kodieren, die in das Protein kodieren Region (ORF) und in der richtigen translationale Leseraster ist. C. Vergleich der Anzahl der unterschiedlichen Plasmide in jede Bibliothek, die Hefe Gene kodieren und der Anteil von diesen, die sind nicht in der richtigen translationale Leseraster oder rückwärts eingefügt werden. D. Grundstücke zeigen Positionen und Fülle der Knotenpunkte, die Beispiel-Gene (VPS8 und VPS16) fand für die Plasmide in jeder Bibliothek zugeordnet. Plasmide mit Gen-Fusionen, die in der richtigen translationale Leseraster sind blau gekennzeichnet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 10
Abbildung 10: Reproduzierbarkeit der DEEPN mit komplexen Y2H Hefe genomic Bibliothek. A. vier verschiedene Hefe diploiden Populationen entstanden durch die Paarung mit der SacCer_TAB Y2H-Bibliothek befindet sich in PLY5725, nicht-selektiven Bedingungen angebaut und sequenziert. Die Lesevorgänge pro gen für jede Bevölkerung wird individuell in Abhängigkeit von der durchschnittlichen Rangfolge Wert in allen Bevölkerungsgruppen geplottet. B. zeigt die Lesevorgänge pro gen zwischen zwei Proben nach Wahl für positive Y2H-Interaktionen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Hier bieten wir Ihnen eine Anleitung für Y2H-Assays im Batch mit optimierten Methoden durchführen. Es gibt ein paar wichtige Schritte im Verfahren um sicherzustellen, dass die Bevölkerung von Hefe, die Auswahl unterstellt würde Vertreter der Start-Bibliothek ist, genug der Ausgangspunkt Hefe Bevölkerung dient zur Auswahl um Variabilität zu begrenzen zu unterziehen . Diese Benchmarks sind relativ leicht zu erreichen, neben der Anpassung der Methoden und Materialien für einen traditionellen Y2H-Assay, wodurch dieser Ansatz für die meisten Labors ausgestattet für standard Molekularbiologie zugänglich. DEEPN erlaubt die Auswahl aus der gleichen Beute Bibliothek Bevölkerung während der Verwendung verschiedener Köder Plasmide. Daher kann der Satz der interagierenden Kandidaten, die eine Y2H Interaktion mit einem Köder vs. andere produzieren direkt verglichen werden. Da Tiefe Sequenzierung verwendet wird, kann die Start Bibliothek Komposition für jeden Köder-spezifische Hefe Bevölkerung zu überprüfen und folgen die Bereicherung jeder Kandidat Beute Gens in der Bibliothek unabhängig. Batch-Verarbeitung ermöglicht Abfragen derselben Bibliothek gegen verschiedene Köder in einer semi-quantitative Weise, die dann erlaubt, eine statistische Rang4zu berechnen.

Es gibt mehrere Schritte in diesem Protokoll, die entscheidend für den Erfolg sind. Ist, dass eine große Anzahl von diploiden eingeholt werden muss, um sicherzustellen, dass angemessene Vertretung der Y2H Beute Bibliothek mit jeder Köder Plasmid von Interesse gemischt wird. Die Paarung hier beschriebene Vorgehensweise wurde durch Variation verschiedener Parameter optimiert. Wir fanden, dass einige Stämme, die Haus kommerzielle Y2H Bibliotheken aber schlecht im allgemeinen Paaren, die Paarung hier beschriebene Vorgehensweise 2 x 106- 2 x 107 diploiden als folgte, generieren kann angemessene und reproduzierbare Übertragung der der Y2H ermöglichen Bibliothek in der Bevölkerung. Ein weiterer kritischer Aspekt des Verfahrens soll sicherstellen, dass die Köder-Plasmid des Interesses keine positive Y2H-Interaktion auf eigene schaffen oder mit leeren Gal4-Aktivierungsdomäne Plasmid Beute. Die Methode zur Auswahl einer Y2H-Interaktion ist Wachstum in Ermangelung von Histidin, wobei eine positive Interaktion Y2H Transkription von HIS3 induziert damit Zellen werden, anspruchsvoll sein +. Während routinemäßig die traditionellen Y2H-Assays kompetitiver Inhibitor 3AT hinzufügen können, um Hintergrund Wachstum verringern oder verwenden andere Reporter3 , das Verfahren funktioniert am besten, wenn Zellen mit schwachen Y2H Interaktionen wachsen können und wodurch sich die Stringenz für Wachstum und die Auswahl nur für Zellen mit starken Y2H Interaktionen Grenzen des Repertoires der Beute Plasmide, die identifiziert werden kann. Ein weiterer wichtiger Aspekt ist es, sicherzustellen, dass eine große Menge an Start diploiden Bevölkerung verwendet, selektive und nicht-selektiven Bedingungen, evolutionäre Engpässe von sampling Error4 zu vermeiden zu wachsen. Im Anschluss an die Kultur Volumen und Zelle hilft hier die angegebenen Nummern Reproduzierbarkeit zu gewährleisten und Lärm zu vermindern.

Einer der Gründe ist der DEEPN Ansatz mächtig ist, dass es umfassend alle Plasmide in einer bestimmten Beute-Bibliothek für ihre Fähigkeit zur Interaktion mit den Köder von Interesse folgen kann. So ist eine Einschränkung des DEEPN die Komplexität der Bibliothek verwendet. Für einige der kommerziellen Bibliotheken wie wir hier, wir fanden, dass die Anzahl der Plasmide, die bona-fide Fragmente von cDNA kodieren ORF, die in der gleichen Leseraster des Gal4 Aktivierungsdomäne zwischen 3 und 6 x 10 ist4 mit Darstellung der ~ 6.000 - 8,00 0 verschiedene Gene. Wir fanden, dass fast 75 % der diese Bibliotheken enthaltenen Fragmente cDNA-Regionen, die 3' die kodierenden DNA-Sequenz (CDS/ORF) wurden ausschließlich entspricht. Darüber hinaus hatte fast ein Drittel der Gene die Fragmente in der Bibliothek hatte keine, die Regionen im ORF oder oberhalb des ORF entsprach.

Wir haben drei andere Änderungen der DEEPN-Methode. Ein neuer MATalpha-Stamm, der tragen kann "Beute" Bibliotheken in ein Plasmid TRP1 und die Kumpels weit besser als manche handelsüblichen Bibliothek-haltige Stämme wie Y187 untergebracht ist. Dadurch wird gewährleistet vollständige Übertragung der Bibliothek Bevölkerung für jeden Köder von Interesse. Wir haben auch eine neue "Köder" Ausdruck Plasmid, das unterscheidet sich von der zuvor beschriebenen Plasmide, die eine Variable Kopie 2µ-basierten Backbone10verwenden. Hier beschreiben wir eine Low-Kopie CEN Plasmid (pTEF-GBD) und finden, die eine einzelne Runde selektives Wachstum ist ausreichend für interagierenden Beute Plasmide zu bereichern. Zu guter Letzt wir bauen einen stromlinienförmigen "Beute" Bibliothek Vektor und zur Herstellung einer High-Density-random-Fragment genomic Y2H Bibliothek für Saccharomces Cerevisiae, was in der Zukunft für die Entdeckung und Charakterisierung von Interaktionen Amonst hilfreich sein sollte Hefe-Proteinen. Insgesamt machen die Verbesserungen bei Materialien und Bioinformatik (beschrieben in der begleitenden Arbeit) die DEEPN eine zugänglich, praktikable und effiziente Möglichkeit für die Durchführung umfassender und vergleichende Y2H-Bildschirme zu nähern.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben

Acknowledgments

Wir danken dem Mitarbeiter im Institut für Humangenetik für NGS Bibliothek Vorbereitung und Sequenzierung. Wir danken für ihre Expertise bei der Vorbereitung genomische Bibliothek Fragmente für die Y2H-Plasmid-Bibliothek hier Einat Snir. Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health unterstützt: NIH R21 EB021870-01A1 und durch NSF Research Project Grant: 1517110.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Illumina HiSeq 4000 Illumina deep sequencing platform
Monoclonal anti-HA antibodies Biolegend 901514 Primary Antibody to detect expression of HA in pGal4AD constructs
Polyclonal anti-myc antibodies QED Biosciences Inc 18826 Primary Antibody to detect expression of MYC in pTEF-GBD constructs
NarI New England BioLabs R0191S
EcoRI-HF New England BioLabs R3101S
BamHI-HF New England BioLabs R3236S
XhoI New England BioLabs R0146S
Polyethylene Glycol 3350, powder J.T. Baker U2211-08
Salmon Sperm DNA Trevigen, Inc sold by Fisher Scientific 50-948-286 carrier DNA for yeast transformation section 3.2.1.
Kanamycin Monosulfate Research Products International K22000
LE Agarose GeneMate E-3120-500 used for making DNA agarose gels
Sodium Chloride Research Products International S23025
Tryptone Research Products International T60060
D-Sorbitol Research Products International S23080
Lithium Acetate Dihydrate MP Biomedicals 155256
Calcium Chloride ThermoFisher C79
EDTA Sodium Salt Research Products International E57020
Yeast Extract Powder Research Products International Y20020
Yeast Nitrogen Base (ammonium sulfate) w/o amino acids Research Products International Y20040
CSM-Trp-Leu+40ADE Formedium DCS0789
CSM-Trp-Leu-His+40ADE Formedium DCS1169
CSM-Leu-Met Formedium DCS0549
CSM-Trp-Met Bio 101, Inc 4520-922
L-Methionine Formedium DOC0168
Adenine Research Products International A11500
D-(+)-Glucose Research Products International G32045
Bacto Agar BD 214010 used for making media plates in section 1
Peptone Research Products International P20240
3-amino-1,2,4 Triazole Sigma A8056
2-Mercaptoehanol (BME) Sigma-Aldrich M6250
Zymolyase 100T USBiological Z1004
Potassium phosphate dibasic Sigma P8281
Phenol:Chloroform:IAA Ambion AM9732
Ammonium Acetate Sigma-Aldrich 238074
Ethanol Decon Laboratories, INC 2716
RNAse A ThermoFisher EN0531
Urea Research Products International U20200
SDS Research Products International L22010
glycerol Sigma Aldrich G5516
Tris-HCl Gibco 15506-017
bromophenol blue Amresco 449
Gibson Assembly Cloning Kit New England Biolabs E5510S Rapid assembly method for cloning of plasmids in section 2
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix New England Biolabs M0541S Used for amplification of products for Gibson Assembly in Section 2.3 as well assample preparation for DEEPN deep sequencing in section 6.2.1
Ethidium Bromide Amresco 0492-5G
QIAquick PCR purification kit Qiagen 28104 Used for purification of pcr products in section 6.2.3
Qiaquick DNA Gel Extraction Kit Qiagen 28704 Used for purification of digested pTEF-GBD in section 2.1
KAPA Hyper Prep kit KAPA Biosystems KK8500 preparation kit for deep sequencing
Codon optimization http://www.jcat.de
Codon optimization https://www.idtdna.com/CodonOpt
gBlocks Integrated DNA Technologies DNA fragments used for cloning in Section 2.2
Strings Thermofisher DNA fragments used for cloning in Section 2.2
GenCatch Plasmid DNA mini-prep Kit EPOCH Life Sciences Used to prepare quantities of DNA in Section 2.3
Covaris E220 Covaris high performance ultra-sonicator in section 7
oligo nucelotide 5’- CGGTCTT
CAATTTCTCAAGTTTCAG -3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher used for pcr amplification and sequencing 5' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-GAGTAACG
ACATTCCCAGTTGTTC-3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher used for pcr amplification and sequencing 5' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-CACCGTAT
TTCTGCCACCTCTTCC-3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher used for pcr amplification and sequencing 3' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-GCAACCGC
ACTATTTGGAGCGCTG-3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher used for pcr amplification and sequencing 3' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligonucleotide 5’-GTTCCGATG
CCTCTGCGAGTG-3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher 5' Pimer used for insert amplification of pGAL4AD
oligonucelotide 5’-GCACATGCT
AGCGTCAAATACC-3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher 3' Pimer used for insert amplification of pGAL4AD
oligonucelotide 5’-ACCCAAGCA
GTGGTATCAACG-3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher 5' Pimer used for insert amplification of pGADT7
oligonucelotide 5’- TATTTAGA
AGTGTCAACAACGTA -3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher 3' Pimer used for insert amplification of pGADT7
PJ69-4A MatA yeast strain http://depts.washington.edu/yeastrc/ James P, Halladay J, Craig EA: Genomic Libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast. GENETICS 1996 144:1425-1436 MATA leu2-3,112 ura3-52 trp1-901 his3-200 gal4D, gal80D, GAL-ADE2 lys2::GAL1-HIS3 met2::GAL7
pTEF-GBD Dr. Robert Piper Lab Gal4-DNA binding doimain expression plasmid
pGal4AD (pPL6343) Dr. Robert Piper Lab Gal4-activation domain expression plasmid
100 mm petri dishes Kord-Vallmark sold by VWR 2900
125 mL PYREX Erlenmeyer flask Fisher Scientific S63270
250 mL PYREX Erlenmeyer flask Fisher Scientific S63271
1,000 mL PYREX Erlenmeyer flask Fisher Scientific S63274
2,000 mL PYREX Erlenmeyer flask Fisher Scientific S63275
20 X 150 mm Disposable Culture Tube Thermofisher 14-961-33
pipet-aid Drummond 4-000-100
5 mL Serological Pipette Denville P7127
10 mL Serological Pipette Denville P7128
25 mL Serological Pipette Denville P7129
1,000 mL PYREX Griffin Beaker Fisher Scientific 02-540P
1,000 mL PYREX Reuasable Media Storage Bottle Fisher Scientific 06-414-1D
1,000 mL graduated cylinder Fisher Scientific 08-572-6G
SpectraMax 190 Molecular Devices used to measure the Optical Density of cells
NanoDrop 2000 Thermo Scientific ND-2000 Spectrophotometer used to quantify amount of DNA
Electronic UV transilluminator Ultra Lum MEB 20 used to visualize DNA in an Ethidium Bromide agarose gel
P1000 Gilson PIPETMAN Fisher Scientific F123602G
P200 Gilson PIPETMAN Fisher Scientific F123601G
P20 Gilson PIPETMAN Fisher Scientific F123600G
P10 Gilson PIPETMAN Fisher Scientific F144802G
1250 µL Low Retention Pipette Tips GeneMate P-1236-1250
200 µLLow Retention Pipette Tips VWR 10017-044
10 µL XL Low Retention Pipette Tips VWR 10017-042
50 mL conical tube VWR 490001-627
15 mL conical tube VWR 490001-621
cell scraper Denville Scientific TC9310
1.5 mL Microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5500
HCl Fluka Analytical 318949-1L
NaOH J.T. Baker 5674-02
Wooden applicators Solon Care 55900
Eppendorf microcentrifuge 5424 Fisher Scientific 05-400-005 microcentrifuge
Sorvall ST16R Thermo Fisher Scientific 75004381 benchtop centrifuge
Amersham ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey) GE Healthcare NA934-1ML Secondary Antibody
Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep) GE Healthcare NA931-1ML Secondary Antibody
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate Thermo Fisher Scientific 34080 ECL detection solution
Isotemp Incubator Thermo Fisher Scientific Incubator
Mutitron 2 INFORS HT Shaking incubator
Isotemp Digital-Control Water Bath Model 205 Fisher Scientific water bath
Y2H mouse cDNA library in Y187 (pan tissue) Clontech 630482 commercially available cDNA Library
Y2H mouse cDNA library in Y187 (mouse brain) Clontech 630488 commercially available cDNA Library
pGADT7 AD Vector Clontech 630442 commercially available AD Vector housing many cDNA libraries
pGBKT7 DNA-BD Vector Clontech 630443 commercially available DNA-BD Vector
Biolase DNA Polymerase Bioline BIO-21042 DNA polymerase used for section 2.4
GeneMate GCL-60 Thermal Cycler BioExpress P-6050-60 pcr machine
TempAssure 0.5 mL PCR tubes USA Scientific 1405-8100

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References

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Biochemie Ausgabe 136 Protein-Interaktion nächste Generation Sequenzierung DNA-Sequenzanalyse Hefe-2-Hybrid
Eine Hefe 2-Hybrid Bildschirm im Batch Proteininteraktionen vergleichen
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Peterson, T. A., Stamnes, M. A.,… More

Peterson, T. A., Stamnes, M. A., Piper, R. C. A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions. J. Vis. Exp. (136), e57801, doi:10.3791/57801 (2018).

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