Uma tela de 2-híbrido de levedura em lote para comparar as interações da proteína

Summary

Processamento em lote de telas 2-híbrido de levedura permite a comparação direta dos perfis de interação de várias proteínas de isca com um conjunto altamente complexo de proteínas da fusão de rapina. Aqui, descrevemos como implementar sua utilização para tais telas, novos reagentes e métodos refinados.

Abstract

Triagem para interações da proteína-proteína usando o ensaio de 2-híbrido de levedura tem sido uma ferramenta eficaz, mas seu uso foi em grande parte limitado à descoberta de interactianos de alta afinidade que são altamente enriquecido na biblioteca dos candidatos interagindo. Em um formato tradicional, o ensaio 2-híbrido de levedura pode render muitas colônias para analisar quando conduzido no rigor baixa onde os interactianos de baixa afinidade podem ser encontrados. Além disso, sem uma interrogação abrangente e completa da mesma biblioteca contra diferentes isca plasmídeos, uma análise comparativa não pode ser alcançada. Embora alguns destes problemas podem ser abordados usando bibliotecas de matriz presa, o custo e a infra-estrutura necessária para operar essas telas podem ser proibitivos. Como alternativa, adaptámos o ensaio 2-híbrido de levedura para descobrir simultaneamente dezenas de transiente e interações proteína estático dentro de uma única tela utilizando uma estratégia denominado DEEPN (enriquecimento dinâmico para avaliação de redes de proteínas), que incorpora o sequenciamento de DNA do elevado-throughput e computação para acompanhar a evolução de uma população de plasmídeos que codificam parceiros interagindo. Aqui, descrevemos reagentes personalizados e protocolos que permitem que uma tela DEEPN a ser executado de modo fácil e econômico.

Introduction

Um entendimento completo dos processos biológicos de célula depende de encontrar as redes de interação de proteínas que fundamentam seus mecanismos moleculares. Uma abordagem para identificar as interações da proteína é ensaio fermento 2-híbrido (Y2H), que trabalha pela montagem de um fator de transcrição quimérico funcionamento uma vez que os dois domínios da proteína de interesse ligam para um outro¹. Uma tela típica de Y2H é realizada através da criação de uma população de levedura que abriga tanto uma biblioteca de plasmídeos codificação interação proteínas fundidas a um ativador transcricional (ex., 'presas' a proteína de fusão) e um determinado 'isca' plasmídeo composto da proteína de interesse fundido a um domínio de ligação do DNA (por exemplo, o domínio de Gal4 DNA-ligando que vincula-se à sequência de ativação Gal4-upstream). Uma das principais vantagens da abordagem Y2H é que é relativamente fácil e barata para realizar em um laboratório típico equipada para trabalho rotineiro de biológica molecular². No entanto, quando tradicionalmente realizada, um usuário amostras colônias individuais que surgem em seleção para uma interação positiva de Y2H. Isto limita severamente o número de clones 'presas' biblioteca que podem ser pesquisados. Este problema é agravado quando a abundância de uma particular interação presa é muito elevada em relação às outras, diminuindo a chance de detecção de interação de plasmídeos de rapina baixa abundância.

Uma solução para usando o princípio de Y2H em uma cobertura abrangente da proteoma é o uso de uma abordagem de matriz formatada no qual uma matriz contendo plasmídeos conhecido presas individuais pode ser interrogada digitalmente. No entanto, essa abordagem exige uma infra-estrutura que não é prontamente acessível ou rentável para os investigadores que estão interessados em definir a interactome de um pequeno número de proteínas ou domínios³. Além disso, bibliotecas de rapina muito complexo que podem codificar vários fragmentos de interação de proteínas que expandir o tamanho do como matrizes matriz para tamanhos impraticáveis. Uma alternativa é realizar ensaios com bibliotecas complexas em lotes e avaliar a presença de interação clones usando sequenciamento de elevado-throughput maciço paralelo⁴. Isto pode ser aplicado para ensaiar a presença de plasmídeos de rapina que surgem em várias colônias usando um típico Y2H formatado abordagem em qual fermento habitação um par de interação de proteínas da fusão de células podem crescer em uma placa de^5,6. Esta ideia geral pode ser acentuada para aumentar a consulta de ambos várias iscas e presas componentes ao mesmo tempo^7,8.

Ainda assim, muitas investigações exigem que um mais fácil ainda mais focado esforço em apenas algumas proteínas 'iscas' e podem se beneficiar mais de uma consulta exaustiva e semi-quantitativa de uma biblioteca de rapina complexo único. Temos desenvolvido e validado uma abordagem para realizar estudos de interação de proteínas em larga escala usando um princípio de Y2H em formato de lote⁴. Isto usa a taxa de expansão de um plasmídeo presa particular como um proxy para a força relativa da interação de Y2H⁹. Sequenciamento profundo de todos os plasmídeos dentro de uma população submetida ao crescimento normal ou condições de crescimento seletivo produz um mapa completo de clones que geram interações de Y2H forte e fracas. O repertório de interactianos pode ser obtido e comparado diretamente através de múltiplos isca plasmídeos. O fluxo de trabalho resultante denominado DEEPN (enriquecimento dinâmico para avaliação de redes de proteínas), portanto, pode ser usado para identificar interactomes diferencial das bibliotecas de rapina mesmo para identificar proteínas, permitindo a comparação entre uma proteína vs outro.

Aqui, demonstramos DEEPN e introduzir melhorias nos métodos laboratoriais que facilitam a sua utilização, que são descritos na Figura 1. Melhorias significativas incluem:

Geração de populações de presas fermento. Um dos principais requisitos de DEEPN está gerando populações de levedura com diferentes isca plasmídeos que têm a mesma distribuição das bibliotecas de rapina do plasmídeo. Populações de equivalente de linha de base da biblioteca do plasmídeo presa são essenciais para fazer comparações precisas entre o interactomes de iscas diferentes. Isto é melhor alcançado quando um plasmídeo de biblioteca já está alojado em uma população de levedura haploide e entrando um plasmídeo isco dado que a população é alcançado pelo acasalamento para produzir um diploides. Aqui, nós fornecemos um guia claro em como fazer tais populações usando bibliotecas comerciais alojadas em leveduras haploides. Embora não tenhamos encontrado métodos que geram um número elevado de diploides, a eficiência global de acasalamento destas cepas de leveduras contendo biblioteca comercial foi baixa. Portanto, nós construímos uma nova tensão que pode abrigar presas bibliotecas que rende muito mais diploides por reação de acasalamento.

Novo conjunto de isca plasmídeos. Muitos plasmídeos atuais que expressam proteínas da fusão 'isca' compostas da proteína de interesse e um domínio de ligação a DNA são baseados em 2µ, permitindo-lhes ampliar seu número de cópia. Este número de cópia pode ser bastante variável na população e levar a variabilidade na resposta transcricional de Y2H. Isto por sua vez poderia inclinar a capacidade de medir a força de uma interação de proteína dada baseada a resposta de crescimento das células de seleção. Isto pode ser parcialmente endereço usando um plasmídeo cópia baixa, alguns dos quais têm sido descritos anteriormente como o comercialmente disponível pDEST32¹⁰. Nós construímos um nova isca do plasmídeo (pTEF-GBD) que produz proteínas da fusão Gal4-DNA-ligando domínio dentro de um plasmídeo de cópia baixa baseada em Centrómero TRP1 carreg o gene de resistência de Kanr que também permite a clonagem de fragmentos de isca contra a corrente e a jusante do domínio Gal4 DNA-ligando.

Biblioteca de fragmento de novo high-density Y2H. Temos construído um plasmídeo novo para bibliotecas de rapina Y2H casa e usou para construir uma biblioteca de Y2H altamente complexa feita de distorcida aleatoriamente fragmentos de DNA genômico de Saccharomyces cerevisiae. Análise de sequência mostrou que esta biblioteca tinha mais 1 milhão de elementos diferentes, muito mais complexos do que descritas anteriormente fermento Y2H genômica plasmídeo bibliotecas¹¹. Com essa nova biblioteca, fomos capazes de mostrar que o fluxo de trabalho do DEEPN é robusto o suficiente para acomodar o complexas bibliotecas com muitos plasmídeos diferentes de uma forma que é confiável e reprodutível.

Protocol

1. preparação de mídia e placas

Nota: Todas as placas precisam ser feitas, minimamente, 2 dias antes de iniciar o protocolo. Os meios de comunicação podem ser feitos em qualquer ponto. No entanto, a extrato a adenina levedura tamponado peptona dextrose (bYPDA) precisa ser feita no dia em que será usado. Alguns meios de comunicação é feito usando uma mistura de suplemento contendo um nível de adenina é maior do que o que normalmente é usado. A maioria dos suplementos de media mínimos especificam adenina de 10 mg/L. Suplementos rotulados '+ 40Ade' especificar um total de adenina de 40 mg/L.

1. Preparar a solução de glicose (50% p/v). Para 1 L, dissolver 500 g de D-(+)-glicose em 800 mL de água destilada em uma proveta de 1.000 mL. Ajuste o volume para 1.000 mL de usar um cilindro graduado e filtro através de 0,2 µm filtro estéril dentro de uma garrafa de armazenamento de mídia estéril 1.000 mL.
2. Prepare-se placas de peptona dextrose (YPD) extrato de levedura. Para 1 L, dissolver 20 g de peptona e 10 g de extrato de levedura em 800 mL de água destilada em uma proveta de 1.000 mL. Despeje em uma proveta graduada, encha até 960 mL com água destilada. Despeje em um Erlenmeyer de 2.000 mL e adicionar 15 g de ágar-ágar. Autoclave e cool em banho de água a 37 ° C até a temperatura do banho de água esfriou-se a aproximadamente 42-50 ° C. Use uma pipeta para adicionar 40 mL de glicose 50%. Misturar agitando bem.
   1. Despeje uma série de placas de 100 mm com 20 mL de mídia com uma pipeta.
3. Preparar a mídia mínima sintética completa (CSM)-placas de Trp. Para 1 L, dissolver 6,7 g de levedura Base de nitrogênio sem aminoácidos em 800 mL de água destilada em uma proveta de 1.000 mL. Despeje em um cilindro graduado, enche até 960 mL de água destilada. Despeje em um 2.000 mL de balão Erlenmeyer e adicione 0,7 g de - Trp-conheceu a mistura de abandono, 20 mg de metionina e 15 g de ágar-ágar. Autoclave e cool em banho de água a 37 ° C até a temperatura do banho de água esfriou-se a aproximadamente 42-50 ° C. Use uma pipeta para adicionar 40 mL de glicose 50%. Misturar agitando bem.
   1. Despeje uma série de placas de 100 mm com 20 mL de mídia com uma pipeta.
4. Prepare placas CSM-Leu-Met. Para 1 L, dissolver 10,05 g de levedura Base de nitrogênio sem aminoácidos em 800 mL de água destilada em uma proveta de 1.000 mL. Despeje em um cilindro graduado e enche até 940 mL de água destilada. Despeje em um 2.000 mL de balão Erlenmeyer e adicione 1,005 g de - Leu-conheceu a mistura de abandono e 15 g de ágar-ágar. Autoclave e cool em banho de água a 37 ° C até a temperatura do banho de água esfriou-se a aproximadamente 42-50 ° C. Use uma pipeta para adicionar 60 mL de glicose 50%. Misturar agitando bem.
   1. Despeje uma série de placas de 100 mm com 20 mL de mídia com uma pipeta.
5. Prepare pratos CSM-Leu-Trp. Para 1 L, dissolver 10,05 g de levedura Base de nitrogênio sem aminoácidos em 800 mL de água destilada em uma proveta de 1.000 mL. Despeje em um cilindro graduado, enche até 940 mL de água destilada. Despeje em um 2.000 mL de balão Erlenmeyer e adicione 1,005 g de - Trp-Leu + 40Ade mistura de abandono, 240 mg de adenina e 15 g de ágar-ágar. Autoclave e cool em banho de água a 37 ° C até a temperatura do banho de água esfriou-se a aproximadamente 42-50 ° C. Use uma pipeta para adicionar 60 mL de glicose 50%. Misturar agitando bem.
   1. Despeje uma série de placas de 100 mm com 20 mL de mídia com uma pipeta.
6. Prepare pratos CSM-Leu-Trp-His. Para 1 L, dissolver 10,05 g de levedura Base de nitrogênio sem aminoácidos em 800 mL de água destilada em uma proveta de 1.000 mL. Despeje em um cilindro graduado, enche até 940 mL de água destilada. Despeje em um 2.000 mL de balão Erlenmeyer e adicione 0,975 g de - Trp-Leu-a + 40Ade mistura de abandono, 240 mg de adenina e 15 g de ágar-ágar. Autoclave e cool em banho de água a 37 ° C até a temperatura do banho de água esfriou-se a aproximadamente 42-50 ° C. Use uma pipeta para adicionar 60 mL de glicose 50%. Misturar agitando bem.
   1. Despeje uma série de placas de 100 mm com 20 mL de mídia com uma pipeta.
7. Prepare pratos CSM-Leu-Trp-His-3AT. Para 1 L, dissolver 10,05 g de levedura Base de nitrogênio sem aminoácidos em 800 mL de água destilada em uma proveta de 1.000 mL. Despeje em um cilindro graduado, enche até 940 mL de água destilada. Despeje em um 2.000 mL de balão Erlenmeyer e adicione 0,975 g de - Trp-Leu-a + 40Ade mistura de abandono, 240 mg de adenina e 15 g de ágar-ágar. Autoclave e cool em banho de água a 37 ° C até a temperatura do banho de água esfriou-se a aproximadamente 42-50 ° C. Use uma pipeta para adicionar 60 mL de glicose 50%. Misture em 100 µ l de um depósito de estéril de 1 M de 3-amino-1, 2,4 triazole (3AT) agitando.
   1. Despeje uma série de placas de 100 mm com 20 mL de mídia com uma pipeta.
8. Prepare as placas LB-Kanr. Extraia o dissolver 10g de triptona, 5 g de fermento de 1 L, e 10 g de NaCl em 800 mL de água numa proveta 1.000 mL de destilado. Despeje em um cilindro graduado, enche até 1.000 mL de água destilada. Despeje em um 2.000 mL de balão Erlenmeyer e adicione 15 g de ágar-ágar. Autoclave e cool em banho de água a 37 ° C até a temperatura do banho de água esfriou-se a aproximadamente 42-50 ° C. Adicionar 50 mg de canamicina e misturar agitando.
   1. Despeje uma série de placas de 100 mm com 20 mL de mídia com uma pipeta.
9. Prepare a YPD, CSM-Leu-Met, CSM-Trp, CSM-Leu-Trp e CSM-Leu-Trp-sua mídia. Use o procedimento acima para placas, exceto que em vez de despejando um Erlenmeyer, despeje em uma garrafa de armazenamento de mídia e omitir o ágar-ágar.
10. Prepare-se bYPDA (YPDA no buffer). Levar a mídia YPD estéril e adicionar adenina de 200 mg/L em água destilada estéril. Ajuste o pH a 3.7 com HCl. filtro através de 0,2 µm filtro estéril em um frasco estéril.
11. Prepare o Buffer de transformação: 2m sorbitol, dihidrato de acetato de lítio de 1 M, 10 mM Tris pH 7,6, 0.5 mM EDTA, cloreto de cálcio 0,2 mM em água destilada. Filtrar com um filtro estéril de 0,2 µm em um frasco estéril.
12. Preparar a solução de PEG: 70% w/v polietilenoglicol 3350 em água destilada. Esterilize em autoclave.
13. Preparar Twirl: 8m ureia, 4% w/v SDS, 50 mM Tris pH 6,8, 10% v/v glicerol, 0,02% w/v bromofenol em estéril de água destilada.
14. Preparar o sTE (forte TE): 50 mM Tris, 20 mM de EDTA, pH 8,0 em água destilada. Filtrar com um filtro estéril de 0,2 µm em um frasco estéril.
15. Preparar a solução-mãe de Zymolase: 10 mg/mL Zymolase 100T em 50mm potássio Fosfato dibásico pH 7,5, buffer de glicerol 50% v/v no estéril destilada água (armazenada a-20 ° C).

2. clonagem e verificação de isca plasmídeos

Nota: A construção do domínio Gal4-DNA-ligando plasmídeos. Atualmente, há uma variedade de sistemas de Y2H disponíveis comercialmente e academicamente disponíveis. DEEPN pode acomodar muitos destes desde que a isca plasmídeo expressando a proteína de interesse fundido a um domínio de ligação a DNA está em um TRP1-contendo o plasmídeo. Outros requisitos a jusante que são a sequência imediatamente acima da biblioteca de rapina inserir é conhecido e que uma interação positiva de Y2H pode ser marcada pela produção de His3 permitindo a seleção em mídia falta histidina. Aqui descreveremos o uso de um plasmídeo de isca Y2H novo (pTEF-GBD, Figura 2), no entanto, outros plasmídeos de isca de Y2H incluindo pGBKT7 podem ser usados também. Para a construção e avaliação de isca plasmídeos, descreveremos o uso de pTEF-GBD. Como uma nota geral, recomendamos a síntese do gene para produzir um quadro de leitura aberta que adere o viés de códon de levedura para ajudar a garantir a boa expressão e facilidade com a clonagem. Certifique-se de que o esquema de clonagem permite que a isca a ser em-frame com o domínio de Gal4 DNA-ligando e que quando clonagem no local de 3', um codão stop segue a região de codificação de isca.

1. Prepare o vetor do plasmídeo. Plasmídeo pTEF-GBD permite a clonagem de um fragmento de codificação da proteína de interesse ou 5' ou 3' da região de codificação do domínio de ligação a Gal4 DNA usando um método de montagem rápida. Para inserção no 5' local, digerir 3 µ g de pTEF-GBD com NarI e EcoRI ou para inserção no site 3', digerir com BamHI e XhoI para 2-4 h. Electrophorese amostra de DNA agarose a 1% gel contendo 0,2 - brometo de etídio 0,5 µ g/mL (EtBr) em 100 V. excisar a corte 5.630 bp TEF-GBD e purificar usando um kit de extração do DNA gel de acordo com as instruções do fabricante e quantificar o DNA de absorvância a 260 nm por espectrofotômetro¹².
   Nota: Geração de inserções de codificação de isca. Codificação de proteínas de fragmentos de DNA ou fragmentos da proteína de interesse podem ser feita usando síntese de gene e disponível como fragmentos uncloned. É recomendável que os códons são otimizados para expressão em Saccharomyces cerevisiae e ferramentas on-line para otimização de códon estão incluídas na lista de materiais.
2. Para 5' inserção, flanqueiam o fragmento de DNA a codificação de um códon de início ATG por 5'-TTAAGAAAAACAAACTGTAACGAATTC-3 'e 5'-GCGCCTATGTGTGAACAAAAGCTTATT-3, respectivamente. Para 3' inserção no quadro com o domínio de ligação Gal4 DNA, flanqueiam o fragmento de codificação por 5'-ctgcatatggccatggaggccgaa-3 'e 5'-tagtaactagcataaccccttggggcc-3'.
3. Para a construção do plasmídeo, use o método de montagem rápida conforme especificado nas instruções do fabricante para clonagem de fragmentos em corte pTEF-GBD.
   1. Placa tudo transformado e. coli em placas LB-Kanr e incubar durante 16-20 h a 37 ° C. Colônias de habitação pTEF-GBD com a inserção desejada podem ser identificadas por amplificação por PCR usando os oligonucleotides: 5'-CGGTCTTCAATTTCTCAAGTTTCAG-3 ' e 5'-GAGTAACGACATTCCCAGTTGTTC-3' para 5' insert e 5'-CACCGTATTTCTGCCACCTCTTCC-3' e 5'-GCAACCGCACTATTTGGAGCGCTG-3' para 3' Inserir. Estes oligonucleotídeos também podem servir como primers para a inserção de sequenciamento.
   2. Planejo preparar > 10 µ g de cada derivado pTEF-GBD e pTEF-GBD sozinho para fornecer material para transformações de sequenciamento e levedura.
   3. Use as seguintes condições PCR: 3 min a 98 ° C, seguido de 25 ciclos de 30 s a 98 ° C, 30 s a 55 ° C e 2 min a 72 ° C, seguiram por 5 min a 72 ° C, usando um buffer contendo 2,5 mM MgCl₂ , U/100 0,5 µ l de DNA polimerase e buffer de proprietário.

3. a expressão de proteínas da fusão de domínio Gal4-DNA-ligando

1. Fazer fermento competente.
   1. Raia para fora de PJ69-4A fermento em uma placa YPD tomando um estéril aplicador de madeira, raspagem de 1 mm³ de a-80 ° C congelados estoque e esfregando-a suavemente em toda a placa YPD. Mova o aplicador de madeira abaixo da placa para cada passagem atravessa uma parte intacta da superfície da mídia. Incube a placa YPD a 30 ° C por 2 dias ou até colônias única são visíveis. Fazer o estoque congelado de levedura PJ69-4A suspendendo o fermento na água ou crescimento da mídia, completando com DMSO para 7%, e armazenando a-80 ° C.
   2. Inocular uma colônia única em 5 mL de cultura de YPD em um tubo de cultura 20 x 150 mm usando um aplicador de madeira estéril e crescer durante a noite a 30 ° C, uma incubadora de agitação a 200 rpm.
   3. Inocule 50 mL de YPD em uma 250 mL do frasco de Erlenmeyer estéril com 4 mL da cultura de levedura PJ69-4A durante a noite. Cresce em uma incubadora de agitação a 30 ° C, 200 rpm para uma densidade óptica (OD₆₀₀) de aproximadamente 1.2, conforme determinado por espectrofotometria com um caminho de luz padrão de 1 cm. Crescimento geralmente leva 5-7 h.
   4. Isole o fermento por sedimentação em um 50 mL do tubo cônico a 4.696 x g durante 5 min à temperatura ambiente em uma centrífuga de bancada. Desprezar o sobrenadante por dumping para resíduos líquidos. Utilizando uma pipeta, resuspenda o pellet em 5 mL de tampão de transformação e transferência de 15 mL de tubo cônico. Resediment para descartar o sobrenadante e ressuspender o fermento em 1 mL de volume final do buffer de transformação com uma pipeta de 1000 µ l.
   5. Incubar as células de levedura para 60 minutos a 30 ° C e agitando a 200 rpm e em seguida colocar no gelo por 30-90 min.
2. Transformação de plasmídeo de levedura.
   1. Em 1,5 mL de tubo estéril microcentrifuga, adicione 1 µ g de pTEF-GBD-baseado do plasmídeo e 5 µ l de transportadora de esperma de salmão de 10 mg/mL solução de DNA. Incluem também um tubo contendo apenas esperma de salmão transportadora DNA como um controle negativo de transformação. Adicione 100 µ l de suspensão de célula de levedura gelada a cada tubo, com uma pipeta. Adicione 100 µ l de 70% solução de PEG, com uma pipeta de 1000 µ l e misture suavemente por agredir o tubo 5 - 10 vezes (não de vórtice de fazer).
   2. Incube a 30 ° C, uma incubadora de agitação a 200 rpm por 45 min.
   3. Choque térmico a 42 ° C por 15 min.
   4. Sedimento em microcentrifuga a 845 x g, durante 3 min à temperatura ambiente, pipetar fora e descartar o sobrenadante, resuspenda o pellet em 150 µ l de água estéril pipetando para cima e para baixo e espalhe sobre a superfície de uma placa CSM-Trp.
   5. Coloque placas direita 30 ° C incubadora e incubar durante 2-3 dias até colônias são visíveis. As placas podem ser virou do avesso para evitar condensação na superfície da placa, após incubação a 30 ° C, durante 6-12 h.
   6. Tome 2 a 3 colónias por transformação e raia como um patch em um prato de CSM-Trp usando um palito estéril. Permitir a crescer durante 24 horas a 30 ° C.
3. Fazer lysates na expressão de proteínas.
   1. Inocular 3 mL de meio líquido CSM-Trp com um fósforo-cabeça-tamanho de levedura do patch e crescer durante a noite a 30 ° C, em um tubo de cultura 20 x 150 mm, agitando a 200 rpm. Fazer duas culturas durante a noite por isca e vetor vazio pTEF-GBD.
   2. Adicione 1 mL de YPD a cada 3 mL de cultura durante a noite CSM-Trp. Cresce por 1h a 30 ° C, agitando a 200 rpm. Verifique o OD de células por Espectrofotômetro.
   3. Sedimentos, um número equivalente de células, normalizando-se de acordo com o OD. Use estéril 1,5 mL de tubos microcentrifuga com um giro de 5 min a 2.348 x g, à temperatura ambiente em um microcentrifuge. Use uma pipeta para descartar o sobrenadante. O estoque final corresponde a um mínimo de OD 2.1.
      Nota: Ao calcular o número equivalente de células, pode ocorrer que diferentes volumes podem ser exigidos de cada cultura durante a noite para conseguir o mínimo OD 2.1.
   4. Resuspenda o pellet em 450 µ l de 0,2 M de NaOH pipetando para cima e para baixo. Incube durante 5 min à temperatura ambiente. Recentrifugue células por 2 min a 2.348 x g, à temperatura ambiente e descartar o sobrenadante com uma pipeta.
   5. Resuspenda o pellet com 50 µ l de tampão TWIRL pipetando acima e para baixo com cuidado para não fazer bolhas. Amostra de calor por 5 min a 70 ° C.
4. Verifique se a expressão da proteína por SDS-PAGE.
   1. Uso um gel gradiente de 4-20% para garantir uma ampla gama de pesos moleculares pode ser resolvido. Quantidade equivalente de carga (mesma OD) de amostras em um SDS-PAGE gel e certifique-se de incluir pelo menos uma amostra contendo o pTEF-GBD não modificado vector^13,14,15.
   2. Após a separação eletroforética, transferi gel para nitrocelulose e immunoblot usando anticorpos monoclonais ou policlonais de anti-myc e solução de deteção de ECL (Figura 3).

4. autoativação teste

1. Raia para fora o fermento MATalpha do estoque correspondente a estirpe de habitação a biblioteca de presas de interesse em um prato YPD tomando um aplicador de madeira esterilizado, raspando uma pequena quantidade de fermento fora do frasco e estrias-lo através da placa YPD-80 ° C. Incube a placa YPD a 30 ° C por 2 dias ou até colônias única são visíveis. Patch de algumas colônias única em um prato YPD e incubar durante uma noite a 30 ° C.
   Nota: A nova variedade desenvolvida aqui a biblioteca de casa presa é PLY5725 Considerando que algumas bibliotecas compatíveis de Y2H disponíveis comercialmente são alojadas em Y187.
2. Siga os procedimentos em 3.3.1 - 3.3.4 para transformar o PLY5725 com o LEU2-baseado do plasmídeo usado para abrigar a biblioteca desejada presa. Para bibliotecas desenvolvidas aqui, o plasmídeo correspondente é pGal4AD (pPL6343). Para recuperar o fermento transformants, placa nas chapas CSM-Leu-Met. Depois de colônias surgir, raia como patches em uma placa CSM-Leu-Met e incubar durante 24 horas a 30 ° C.
3. Siga o protocolo em 3.4 para confirmar a expressão de pPL6343 vetor vazio usando-HA anticorpos monoclonais ou policlonais e solução de deteção de ECL.
4. Raia que cada um da levedura PJ69-4A transformada em um padrão cruzado com PLY5725 constrói uma placa de YPD que foi confirmado para expressar a proteína no protocolo seção 3.4 e 4.3 e incubar a 30 ° C durante a noite. Tome 1 mm³ das células onde as duas variedades têm crescido juntos e patch para separar CSM-Leu-Met, CSM-Trp e placas CSM-Trp-Leu e crescer 24 h.
   Nota: Diploides desejados vão crescer com as placas do CSM-Trp-Leu. Crescimento em CSM-Leu-Met e CSM-Trp placas servem como um controle positivo para o crescimento de levedura.
5. Crescer diploides em 1 mL de mídia CSM-Trp-Leu durante a noite a 30 ° C. Células de 500 µ l de sedimentos em um 1,5 mL de microcentrifuga tubo a 2.348 x g, 3 min à temperatura ambiente em um microcentrifuge. Desprezar o sobrenadante com uma pipeta. Ressuspender as células em 1 mL de água estéril e repita a sedimentação e ressuspensão. Verifique o OD₆₀₀ de células.
6. Fazer uma série de 01:10 diluições de série de cada suspensão de células usando água estéril com o ponto de partida mais concentrada a solução de cada um em uma overdose de 0,5. Ponto 5 µ l de cada diluição em um prato de CSM-Leu-Trp, uma placa CSM-Leu-Trp-His e um CSM-Leu-Trp-seu + placa 3AT. Incubar a 30 ° C e inspecionar para crescimento diariamente durante 3 dias (Figura 4).
   Nota: para a 01:10 diluição serial, pipete 10 µ l do tubo contendo um OD 0.5 em 90 µ l de água e misture por pipetagem para cima e para baixo. Continuam a fazer 01:10 diluições em série, até que haja um total de seis diferentes concentrações de detectar.

5. criar populações de leveduras com isca e biblioteca de rapina

Nota: A tensão de Y187 que abriga presas comerciais plasmídeos de biblioteca não meu bem. Assim, as seguintes condições otimizadas são obrigadas a manter a complexidade da biblioteca. O PLY5725 Coe contendo companheiros de bibliotecas de rapina Y2H melhor e o mesmo procedimento de acasalamento pode ser usado com esta estirpe (Figura 5).

1. Inocular uma 3 mL de culturas de cada um do transformants de PJ69-4A carregando a vários TRP1-contendo o plasmídeo de isca pTEF-GBD na mídia CSM-Trp em um tubo de cultura. Incluem duas culturas separadas contendo o plasmídeo vetor de pTEF-GBD sozinho para servir como controles processuais. Incubar as culturas a 30 ° C, 200 rpm para 6 h e depois diluir em um 25 mL de cultura em um frasco de Erlenmeyer estéril de crescimento durante a noite.
2. Descongelar um frasco de congelados (-80 ° C) das células MATalpha contendo o LEU2-carregando «presas» biblioteca à temperatura ambiente. Inocule uma 125 mL de mídia CSM-Leu-nos conhecemos em um frasco de Erlenmeyer estéril com o frasco inteiro descongelado. Cresce todas as culturas durante a noite a 30 ° C com agitação a 200 rpm.
   Nota: O OD₆₀₀ das culturas durante a noite precisa variar entre 1.0 a 1.5 antes de prosseguir para os próximos passos.
3. Centrifugue 21 equivalentes de OD de cada uma das culturas PJ69-4A transformantes com um giro de 5 min a 4.696 x g, à temperatura ambiente. Para cada 10 reações de acasalamento desejado, pelota 39 OD₆₀₀ equivalentes da estirpe MATalpha carregando os plasmídeos de biblioteca em separado de 50 mL de tubos cónicos.
   1. Ressuspender as células em 10 mL de água estéril e re-pelota em novo 50 mL tubo cônico 4.696 x g 5 min à temperatura ambiente em uma centrífuga de bancada. Utilizando uma pipeta, retire com cuidado o sobrenadante sem interromper as células peletizadas.
   2. Resuspenda pelotas de células PJ69-4A em 4 mL de e PLY5725 células em 10 mL de bYPDA (pH 3,7).
4. Set-up reações acasalamento, adicionar 1 mL de PJ69-4A transformado células, 1 mL de MATalpha biblioteca contendo células e 1 mL de bYPDA pH 3,7 a nova 50 mL de tubo cônico. Incube a 30 ° C, com leve agitação orbital (100-130 rpm) para 90 min.
   1. Centrifugar as células por 5 min a 4.696 x g, à temperatura ambiente em uma centrífuga de bancada. Remover o sobrenadante com uma pipeta e resuspenda o pellet em 2 mL de 1:1 bYPDA:YPD. Todos os 2 mL de em uma placa YPD 100 mm da placa com uma pipeta e incubar a 30 ° C por aproximadamente 20 h.
5. Colheita de células das placas YPD usando um raspador de célula para desalojar as células em 2-3 mL de mídia CSM-Leu-Trp. Pipete células soltas para um 50ml de tubo cônico. Lave as placas de 4 - 5 vezes com 2-3 mL de CSM-Leu-Trp mídia por pipetagem até a mídia usando um 1000 µ l pipeta e suavemente como ejetar a mídia em toda a superfície da placa YPD.
   1. Centrifugar as células por 5 min a 4.696 x g, à temperatura ambiente em uma centrífuga de bancada. Descartar o sobrenadante com uma pipeta e ressuspender as células em 40 mL de mídia CSM-Leu-Trp pipetando acima e para baixo (do vórtice não).
6. Para estimar o número de células diploides formado, dilua 4 µ l da mistura diploide em 200 µ l e 2000 µ l CSM-Trp-Leu meios de comunicação. Placa de 200 µ l de cada diluição em um prato de CSM-Leu-Trp.
   Nota: As duas placas representam uma diluição de dobra de 1:10,000 e 1: 100.000 da unidade populacional de diploides colhidas e produzindo um esperado ~ 9.000-27.000 colônias na placa de diluição de 1:10,000 após incubação a 30 ° C para 36-40 h. Check placas depois passo 5.7. Um número mínimo de 200 colônias na placa de diluição de 1:10,000 é necessária para prosseguir para a etapa 5.8
7. Imediatamente tomar o restante de cada 40 mL de ressuspensão de célula e inocular um 1.000 mL do frasco de Erlenmeyer contendo 500 mL de mídia CSM-Leu-Trp. Leve uma inicial de OD₆₀₀. Incube nestes frascos a 30 ° C, com agitação a 180 rpm até atingirem a saturação (~2.0 OD/mL). Isto geralmente leva cerca de 36-40 h. crescimento de Monitor em 24h depois novamente a 36 h por OD₆₀₀.
8. Usando uma pipeta, retirar 20 mL de alíquotas de cada um da saturada 500ml de culturas e vacine 2.000 mL de Erlenmeyers, um com 750 mL de mídia CSM-Leu-Trp e o segundo contendo 750 mL do CSM-Leu-Trp-sua com o menor nível de 3AT que elimina o plano de fundo (anteriormente determinado na seção 4.5). Misturar as novas culturas (770 mL) agitando bem e tomar uma inicial de OD₆₀₀.
9. Incube as culturas a 30 ° C e agitando a 180 rpm até atingir a saturação, o que normalmente ocorre dentro de 24h para a cultura de CSM-Leu-Trp não selecionada e pode levar mais de 70 h para culturas sob seleção para interações Y2H.
10. Uma vez que culturas chegaram a saturação (OD ~ 2.0), remover 11 mL de pipeta, sedimentos as células com um giro de 5 min a 4.696 x g à temperatura ambiente, descartar o sobrenadante com uma pipeta e congelar a-20 ° C ou continue para extração de DNA. As amostras selecionadas e não selecionadas serão ambos usadas para sequenciamento profundo.

6. amostra preparaçãopara DEEPN Deep Sequencing

1. Extração de DNA.
   1. Use uma pipeta para Ressuspender pelotas de célula do protocolo seção 5.7 em 500 µ l de tampão de sTE e transferência para um 1,5 mL de tubo de microcentrifugadora. Adicione 3 µ l de betamercaptoethanol e 10 µ l de caldo de Zymolase. Misture bem e incube a incubadora de 37 ° C por 24-36 h.
   2. Extrair a amostra duas vezes com álcool de fenol/clorofórmio/isoamílico 500 µ l enquanto estiver usando um capuz de emanações¹⁶.
   3. Adicionar 7 µ l de 4 M de NaCl, 900 µ l de gelado 100% de etanol (ETOH), misturar por inversão e ou congelar a-20 ° C ou continuar a sedimentos DNA por fiação a 21.130 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente em um microcentrifuge.
   4. Desprezar o sobrenadante com uma pipeta. Lave o pellet três vezes com 900 µ l de 70% ETOH.
   5. Sedimentos da pelota 21.130 x g por 2 min e remover lavagem ETOH residual com uma pipeta. Pellet seco por 7 min a 42 ° C.
   6. Resuspenda o pellet em 120 µ l de 0.1 x sTE em banho-maria 37 ° C por 90 min, agite os tubos para misturar a cada 30 min.
   7. Pipete 60 µ l de DNA extraído para um estéril 1,5 mL de tubo de microcentrifugadora. Adicione 120 µ l de sTE, 3,5 µ l de caldo de RNase A, filme para misturar e incubar a 37 ° C, durante 1 h.
   8. Precipitado de etanol como anteriormente feito na secção 6.1.3 - 6.1.5, mas o uso de 7 µ l de acetato de amónio de 5 M em vez de 4 M de NaCl.
   9. Resuspenda RNase DNA A Tratado em µ l 55 de 0.1 x sTE em banho-maria 37 ° C por 90 min, agite os tubos para misturar a cada 30 min. Quantify DNA pela absorvância a 260 nm em um espectrofotômetro.
2. CDNA PCR insere.
   1. Execute duas, as reações de PCR de 50 µ l por amostra de DNA. Cada reação contém 25 pmol de cada primer frente e verso, combinando o plasmídeo de rapina-biblioteca (ver materiais). Reações também contêm 25 µ l de alta-fidelidade 2 x PCR Master Mix, 5 µ g de amostra de DNA e água até 50 µ l. amplificar reações para 25 ciclos com tempos de extensão de 3 min a 72 ° C, uma recozer a temperatura de 55 ° C por 30 s e desnaturando a 98 ° C, durante 10 s. Precede ciclismo por uma desnaturação de s 30 98 ° C e segue com uma incubação de 5 min a 72 ° C.
   2. Analisar 4 µ l de cada reação de PCR por eletroforese em gel de agarose 1% DNA com o DNA de agarose gel contendo 0,2 - 0,5 µ g/mL de EtBr¹⁷. Visualize a amostra de DNA por transiluminação UV. Amostras de irão mostrar um esfregaço de ADN cerca de 1-3 kb, onde o padrão de bandas pode ser encontrado para amostras onde uma interação Y2H foi selecionado (Figura 6).
   3. Combinar as amostras duplicadas de PCR e purificar usando o kit de purificação de PCR de acordo com as instruções do fabricante e quantificar o DNA de absorvância a 260 nm em um espectrofotômetro.

7. deep sequenciamento

Nota: Preparação da amostra e sequenciamento em uma plataforma de sequenciamento profunda está normalmente disponível em comerciais e acadêmicas instalações de núcleo de sequenciamento DNA.

1. Cisalhamento 600 ng do produto do PCR usando um ultrasonicador de alto desempenho para dar fragmentos de um comprimento médio de ~ 300 bp.
2. Gerar sequenciamento indexado bibliotecas usando um kit de preparação para o sequenciamento profundo que adiciona linkers codificação de códigos de barras, escorva de sites, e capturar sequências assimetricamente nas extremidades dos fragmentos do DNA.
3. Execute a preparação da biblioteca de acordo com as instruções do fabricante. Piscina indexados bibliotecas e sequência como leituras de tempo emparelhado-final em uma plataforma de sequenciamento profunda (por exemplo, 2 x 150 bp PE leituras). O número desejado de leituras orientadas para cada amostra é entre 10 e 40 milhões, com leituras mais desejadas para as populações não selecionadas que são tipicamente mais complexas. Nós recomendamos pelo menos 20 milhões ou mais leituras para as populações não selecionadas.

8. Bioinformatic processamento e verificação

1. Processo DNA sequenciamento de dados sob a forma de fastq com um conjunto de software stand-alone programas construídos para (1) mapear sequência ler arquivos em um formato universal de SAM (2) quantificar enriquecimento do gene entre conjuntos de dados (3) realizar análise estatística dos dados em a fim de que o candidato classificado em genes são positivos para interação Y2H (4) fornecem informações sobre o que região (ões) e o quadro translacional cada do cDNA presa por gene fragmentos que rendem positivo Y2H interações são compostas e (5) fornecer ferramentas para reconstruir não só os 5' mas também extremidade 3' dos fragmentos interagindo permitindo sua reconstrução e a verificação em um formato tradicional de Y2H. Operação destes programas é detalhada no estudo de acompanhamento.

Representative Results

O ensaio de Y2H tem sido amplamente utilizado para encontrar interações da proteína: proteína e várias adaptações e sistemas foram desenvolvidos. Na maior parte, as mesmas considerações que ajudam a garantir o sucesso com estas abordagens anteriores são importantes para DEEPN. Alguns dos pontos de referência importantes incluem: garantindo a expressão do domínio de ligação a DNA proteínas da fusão, garantindo um baixo fundo de espúrias + seu crescimento nos diploides que contém a isca de interesse com um plasmídeo vazio presas, uma alta eficiência de acasalamento da isca contendo levedura MATA com a biblioteca contendo levedura de MATalpha, e finalmente, baixo-rigor condições que permitem que a população de crescer sob condições que seleciona para muitas reacções positivas de Y2H, mesmo aqueles que produzem baixos níveis de atividade His3 e uma fraca Y2H resposta transcricional.

Um dos aspectos críticos do DEEPN é reproducibly introduzir a biblioteca Y2H em cepas que contêm diferentes isca plasmídeos e confiantemente selecionar essas populações para os plasmídeos de biblioteca que criar interações de Y2H positivas. Isso se torna mais difícil quando a complexidade da biblioteca de Y2H aumenta desde que é mais difícil garantir a adequada transferência de toda a biblioteca em diferentes populações iniciais. Além disso, o tamanho das populações escolhido para crescer sob condições de seleção e profundidade de sequenciamento precisa ser grande o suficiente para observar alterações pode ser reproduzidas na composição do plasmídeo Y2H confiantemente identificar verdadeiros positivos Y2H interações. Em estudos anteriores, usamos as bibliotecas de cDNA comercialmente disponíveis Y2H. Encontramos a variabilidade na distribuição da biblioteca do Y2H entre populações isoladas, carregando os mesma isca plasmídeos é baixa, com um overdispersion entre as duas populações iniciais antes da seleção de < 0,01 normalmente e 0.35 - 0,55 para separado populações após seleção⁴. No entanto, a complexidade de algumas dessas bibliotecas Y2H comercialmente disponível é bastante baixa (Figura 7). Além disso, muitos dos clones dentro dele (~ 60%) são feitos inteiramente de fragmentos de cDNA que são 3' da região de codificação, o que limita ainda mais a sua utilidade. Para demonstrar que os métodos acima foram capazes de acomodar mais complexa Y2H bibliotecas, criamos uma nova biblioteca de Y2H do vetor simplificada do plasmídeo 'presas' (pGal4AD) contendo fragmentos de DNA genômico de Saccharomyces cerevisiae (estirpe PLY5725). DNA genômico foi fragmentado por corte, tamanho selecionado para intervalos de bp-600-1500, modificado com adaptadores e inserido na pGal4AD para criar a biblioteca de SacCer_TAB Y2H (Figura 8). A biblioteca foi transformada em PLY5725, que produziu uma população de levedura que foi então acoplada para separar amostras de PJ69-4A MATA carregando o plasmídeo pTEF-GBD sozinho. Populações diploides duplicadas foram cultivadas em condições não-seletivos e seletivas. As inserções de biblioteca do plasmídeo Y2H foram analisadas por sequenciamento profundo. Quando mapeado para o DNA genômico, abrangendo 100 bp a montante e a jusante de cada proteína codificação região (84% do genoma inteiro), encontramos > 1,1 milhões plasmídeos diferentes na biblioteca para um tamanho total estimado da biblioteca em leveduras de ~1.35 milhões de diferentes plasmídeos. Como uma comparação, também transformou uma levedura descrito anteriormente genômica Y2H biblioteca¹¹ (PJ_C1, C2, C3 Y2H biblioteca) no fermento de MATalpha e é submetido à mesma análise como acima. Descobrimos que a complexidade da nossa biblioteca de Y2H de fermento aleatório fragmento foi muito maior e tinha muito mais plasmídeos codificação em-frame fragmentos de cada gene do que a biblioteca publicada anteriormente (Figura 9). Importante, a geração de biblioteca inicial contendo populações diploides era muito reprodutível com um overdispersion de < 0,01 (Figura 10). Além disso, a reprodutibilidade de ter as duas populações de levedura separada produzir semelhantes redistribuições de plasmídeos depois selecionando para interações positivas do Y2H foi muito bom, rendendo um overdispersion de 0.3. Assim, os métodos aqui acomodam maior Y2H bibliotecas de maior complexidade do que aqueles utilizados anteriormente.

Em termos de aumentar a facilidade de DEEPN, nós preferimos usar síntese de gene tornar insere que codifica para a proteína de isca de interesse. Isto permite a codificação de regiões para domínios da proteína, quimeras e mutantes para facilmente ser incorporada Y2H isca plasmídeos, mas também permite que seus códons sejam otimizados para expressão em S. cerevisiae. Expressão de dois diferentes proteínas de fusão de domínio Gal4-DNA-ligando é demonstrado na Figura 3. Dois diferentes leveduras transformants expressar qualquer uma das duas proteínas de fusão de isca foram preparados e submetidos a SDS-PAGE e immunoblotting com anticorpos anti-myc. Observe os níveis de expressão de proteínas de isca em relação ao domínio de Gal4 DNA-ligando sozinho do vetor vazio. Achamos que é importante não só para verificar a expressão da proteína de fusão a isca, mas também para verificar a expressão na exata MATA leveduras transformantes colônia que será usada para expandir e companheiro para a levedura contendo biblioteca de rapina. Uma vez um transformantes foi identificado, é possível congelá-lo para baixo e armazenar para uso posterior.

A Figura 4 mostra um teste para a auto ativação onde uma diluição serial de células diploides são banhados em CSM-Leu-Trp (+ dele), CSM-Trp-Leu-His (-dele) e CSM-Trp-Leu-3AT dele + (-dele + 3AT) placas e permitido para crescer a 30 ° C durante 3 dias. O resultado desejado é observar crescimento na presença, mas não a ausência de histidina, independentemente se há 3AT. Isto permitirá o uso do CSM-Trp-Leu-sua para selecionar para o fermento com uma interação de 2-híbrido de levedura positivas. Se houver crescimento em placas CSM-Leu-Trp-His, então uma seleção de Y2H pode ainda ser obtida usando a concentração mais baixa de 3AT que impede o crescimento. Achamos que se o crescimento pode ser bloqueado no CSM-Trp-Leu-His + 0.1 mM 3AT, então o ensaio DEEPN pode prosseguir usando esta condição para selecionar para interações Y2H. Se, no entanto, a inibição do crescimento dos diploides contendo pGal4AD ou outro presas vazio do plasmídeo e o plasmídeo pTEF-GBD-isca fusão exige concentrações mais altas de 3AT, isso irá comprometer o desempenho do procedimento DEEPN e um isca diferente do plasmídeo deve ser procurada. Observe que sua + crescimento é a única seleção para uma interação positiva de Y2H. Encontramos que isto é suficiente para enriquecer para interações Y2H em lote.

Um dos procedimentos mais importantes do fluxo de trabalho do DEEPN é conseguir a eficiência elevada de acasalamento do fermento MATA carregando o plasmídeo de isca com o fermento MATalpha carregar a biblioteca de rapina Y2H. Achamos que algumas cepas (por exemplo, Y187)¹⁸, bibliotecas de cDNA comercialmente disponível de habitação, têm eficiência de acasalamento relativamente pobre. Por esse motivo, nós produzimos uma estirpe para carregar bibliotecas de Y2H. Esta tensão é baseada no BY4742, um derivado do S288c. Esta estirpe carece de GAL4, GAL80, TRP1, LEU2e HIS3. Ele contém nenhum repórter que respondem a uma proteína de Gal4 híbrido nem um híbrido diferente (por exemplo, LexA-VP16). Em vez disso, a fonte de produção induzida por Y2H His3 está alojada a estirpe MATA que carregasse o plasmídeo isca especial. Isto simplifica o sistema e permite maior flexibilidade no que um pode usar as mesmas células que contém a biblioteca de MATalpha para acasalar com uma cepa de expressar uma proteína de fusão de LexA-isca e um repórter LexA(UAS) -HIS3 ou uma proteína de fusão Gal4-DBD-isca e um Gal4 (UAS)-HIS3 repórter.

Uma vez que as populações diploides carregando tanto um plasmídeo de isca e a biblioteca são geradas, são diluídos e permitidos crescer sob condições que basta selecionar para ambos os plasmídeos (por exemplo, CSM-Trp-Leu) ou para uma interação positiva de Y2H e plasmídeos que dirige a produção de His3 (por exemplo, CSM-Leu-Trp-His). É importante começar com uma grande quantidade da população inicial para evitar uma evolutiva 'gargalo' que pode distorcer a população que os resultados após seleção para uma interação positiva de Y2H. Assim, nosso procedimento especifica usando 20ml de fora a 500 mL de cultura população diploide para ser cultivada em 750 mL de mídia CSM-Leu-Trp-His fresca para evitar esse problema. Com a pTEF-CGD como o plasmídeo de isca, achamos que uma única rodada de diluição e crescimento era suficiente para evoluir uma população informativa. Usando diferentes isca plasmídeos anteriormente, usamos duas rodadas de diluição e de crescimento, uma inicial 20 mL de 750 ml, e em seguida 2 mL daquele saturado diluída em 75 mL de cultura. A Figura 6 mostra os resultados de amplificação por PCR do outro lado as inserções de biblioteca para a população diploide cultivadas sob condições não-seletivo, bem como um primeiro e segundo turno sucessivo de diluição e crescimento em condição seletiva para dois diferentes isca plasmídeos. Observe que com nenhuma seleção, há uma mancha generalizada de produtos do PCR indicativos de uma mistura complexa e relativamente bem normalizada de fragmentos. Após a seleção, muda esse padrão, com algumas espécies extremamente enriquecedor para que bandas individuais podem ser discernidas. Algum grau de borda é típico das experiências bem sucedidas realizadas até agora, no entanto, um padrão de esfregaço para além ou em vez de um padrão de bandas, é indicativo de uma mistura complexa de inserções de presa e é desejável se você quiser maximizar o número de candidatos que detecta DEEPN. Padrão de bandas de tempestade muito forte, onde a maioria do produto do PCR encontra-se em bandas de 1-3, indica que a maioria dos dados de sequenciamento será dominada por apenas 1-3 inserções de rapina. Um pode compensar isso em parte por dedicar mais leituras neste exemplo. Um pode ver que, se a população é diluída e cresceu ainda mais (veja 'd2 selecionados' na Figura 5), o padrão de bandas é mais proeminente, indicando que rapina plasmídeos que conferem fracas mas autênticas Y2H interações estão sendo diminuídos enquanto um seleto poucos rapina plasmídeos estão aumentando sua abundância. Diluições sucessivas e crescimento para este nível excessivo é considerado contraproducente para a meta de alcançar o maior número de candidatos em potencial e, portanto, com o protocolo aqui, recomendamos uma rodada de diluição e crescimento ser usado.

Figura 1: esquemático do fluxo de trabalho DEEPN. Em linhas gerais os procedimentos de laboratório é mostrada à esquerda, junto com o tempo aproximado necessário para completar a tarefa correspondente. À direita está o fluxo de trabalho de Bioinformática usando os pacotes de software DEEPN e Stat_Maker. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: esquemático de pTEF-GBD. O TRP1-contendo o plasmídeo de expressão do baixo cópia Gal4 DNA-ligando domínio fusão proteína é mostrado. Possui um promotor TEF1 constitutivo, marca de epítopo myc, o domínio de ligação Gal4 DNA seguido de um sítio de ligação do T7 RNA polimerase, polylinker e PRM9 terminator dentro um centrômero (CEN)-baseado do plasmídeo. Este plasmídeo também carrega a resistência de canamicina e a origem de replicação bacteriana do ColE1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: expressão de proteínas da fusão Gal4-isca. Lysates do fermento expressando proteínas diferentes isca fundidas-se ao domínio de ligação a Gal4 DNA expressado em pTEF-GBD foram submetidos a SDS-PAGE e immunoblotting com anticorpos anti-myc. pTEF-GBD expressa apenas o domínio de Gal4-DNA-bindng sozinho; pTEF-GBD-bait1 expressa o domínio de Gal4-DNA-bindng fundido a uma RhoA falta seu site Prenilação do C-terminal e habitação uma mutação, trancando-os em uma conformação de GTP-limite; pTEF-GBD-bait2 expressa o domínio de Gal4-DNA-bindng fundido a uma RhoA falta seu site Prenilação do C-terminal e uma mutação, trancando-os em uma conformação de PIB-limite de habitação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: teste de auto ativação Diploides, feitas a partir de células de PJ69-4A, carregando os indicado isca plasmídeos e células PLY5725, carregando o plasmídeo presa indicada em série foram diluídos e manchadas em placas, placas CSM-Leu-Trp-His e CSM CSM-Leu-Trp-Leu-Trp-seu + 3AT placas e crescido durante 3 dias a 30 ° C. Os PJ69-4A transformants usados para acasalamento foram os primeiros de cada par, mostrado na Figura 3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: acasalamento eficiência de Y187 vs. PLY5725. A reação de acasalamento entre PJ69-4A contendo um TRP1-contendo isca vetor e Y187 ou PLY5725 escriturado plasmídeo de rapina foi realizada. 1:10,000 diluições foram banhadas no CSM-Trp-Leu para selecionar para diploides. A tensão de PLY5725 mostra uma acasalamento uma eficiência mais elevada do que a tensão de Y187 com ~ 10 vezes mais colônias produzidas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: PCR de rapina biblioteca inserções. DNA foi isolado de levedura diploide que contém uma biblioteca de rapina que foi cultivada em condições não-seletivo (CSM-Leu-Trp mídia) ou as condições de seleção para uma interação positiva Y2H (CSM-Leu-Trp-sua mídia). PCR em toda a biblioteca insere revela diferenças no repertório de inserções selecionado. Foram utilizadas duas rodadas de crescimento seletivo. Uma rodada inicial de crescimento feita diluindo 20 mL a 500 ml de cultura diploide em 750 mL de mídia não-seletivo do CSM-Leu-Trp e outro 20 mL de 750 ml de CSM-Leu-Trp-sua mídia para uma rodada inicial de crescimento seletivo (d1). Este foi seguido por uma rodada adicional de crescimento (d2) feita por tomar 2 mL da cultura d1 e diluir em 75 mL de meios selectivos CSM-Leu-Trp-His. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: complexidade da biblioteca de cDNA de Y2H. Análise do conteúdo de um bibliotecas de presas de cDNA Y2H rato comercialmente disponíveis: uma biblioteca de cDNA de cérebro de rato e um dos vários tecidos de rato. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8: geração de biblioteca de fragmento genômico de fermento Y2H. R. montagem descrevendo esquemática da biblioteca genômica fragmento fermento em pGal4AD. DNA genômico de estirpe PLY5725 aleatoriamente foi cortado, ligado com os Y-adaptadores indicados e ligado em pGal4AD de SfiI-corte. Ligadura foram transformadas em bactérias de rendimento 2.2 x 10⁶ colônias independentes que foram combinadas e crescidas antes do isolamento de seu plasmídeo que compõem a biblioteca de SacCer_TAB Y2H. B. O LEU2-contendo o plasmídeo (pGal4AD), abrigando a Gal4 domínio de ativação transcricional é mostrado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 9: complexidade da biblioteca genômica de fermento Y2H. A biblioteca genômica SacCer_TAB foi transformada a estirpe de PLY5725 MATalpha e o PJ_C1, C2, C3 biblioteca genômica de levedura transformou-se a tensão de ΜΑΤalpha de Υ187. Diploides dessas populações foram feitas por acasalamento para a tensão de PJY69-4A. As populações foram cultivadas por 10 gerações e fragmentos de rapina que PCR amplificado foram submetidos a análise e sequenciamento de alta produtividade. R. mostra o ordem de classificação de leituras por cada gene nas bibliotecas Y2H divididas pelas leituras por gene encontrado pelo sequenciamento do genoma da levedura. Dada a abundância equivalente de cada gene, cada gene teria um valor de 1. B. histograma mostrando o número de plasmídeos exclusivos por genes que codificam um fragmento que seja da proteína codificação região (ORF) e no quadro de leitura translacional. C. comparação do número de plasmídeos diferentes em cada biblioteca que codificam genes da levedura e a proporção destes que são e não estão no quadro de leitura correta translacional ou são inseridos para trás. D. Parcelas mostrando as posições e a abundância dos cruzamentos que mapeiam para genes de exemplo (VPS8 e VPS16) encontrados para o plasmídeo em cada biblioteca. Plasmídeos com fusões de gene que estão no quadro de leitura correta de translação são designados azul. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 10: reprodutibilidade de DEEPN com complexo Y2H fermento genomic da biblioteca. R. quatro populações diploides de levedura diferentes foram criadas pelo acasalamento com a biblioteca SacCer_TAB Y2H alojado em PLY5725, cultivadas sob condições não-seletivo e sequenciados. As leituras por gene para cada população individualmente é plotado como uma função do valor médio ordem de classificação em todas as populações. B. mostra as leituras por gene entre duas amostras após seleção para interações de Y2H positivas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Aqui nós fornecemos um guia de como realizar ensaios Y2H em lote usando métodos otimizados. Existem alguns passos críticos no procedimento para ajudar a garantir que a população de levedura que devem ser colocada sob seleção é representante da biblioteca de partida e que suficiente da população inicial de fermento é usado para se submeter a seleção para limitar a variabilidade . Importante, estes parâmetros são relativamente fáceis de alcançar ao lado de adaptar os métodos e materiais para um ensaio de Y2H tradicional, tornando essa abordagem acessível para a maioria dos laboratórios equipados para padrão de biologia molecular. DEEPN permite a seleção da população de biblioteca mesmo presa enquanto estiver usando diferentes isca plasmídeos. Portanto, o conjunto de candidatos interação que produzem uma interação Y2H com uma isca vs outro pode ser directamente comparado. Porque o sequenciamento profundo é usado, pode verificar a composição inicial de biblioteca para cada população de leveduras específicas de isca e siga o enriquecimento de cada gene de rapina candidato na biblioteca de forma independente. Processamento em lote permite consultar a biblioteca mesma contra diferentes iscas de forma semi-quantitativa que então permite calcular uma classificação estatística⁴.

Existem várias etapas neste protocolo que são críticas para o sucesso. Uma é que um grande número de diploides deve ser obtido para assegurar uma representação adequada da biblioteca Y2H de rapina é misturada com cada isca plasmídeo de interesse. O acasalamento procedimento descrito aqui foi otimizado, variando de vários parâmetros. Achamos que algumas estirpes bibliotecas comerciais de Y2H casa mal acasalam em geral, no entanto, o processo de acasalamento descrito aqui pode gerar 2 x 10⁶- 2 x 10⁷ diploides quando seguido, permitindo transferência adequada e reprodutível da Y2H biblioteca para a população. Outro aspecto crítico do procedimento é para garantir que o plasmídeo isca de interesse não criar uma interação positiva de Y2H por conta própria ou com o domínio de ativação Gal4 vazio presa do plasmídeo. O método para a seleção de uma interação de Y2H exige crescimento na ausência de histidina, onde uma interação positiva de Y2H induz a transcrição de HIS3 para permitir que as células ser sua +. Enquanto rotineiramente os tradicionais ensaios de Y2H podem adicionar o inibidor competitivo 3AT para diminuir o crescimento de fundo ou usar outros repórteres³ , este procedimento funciona melhor quando as células com fraco Y2H interações podem crescer e aumentando assim o rigor para o crescimento e selecionando somente para as células com fortes interações Y2H limita o repertório de plasmídeos de rapina que podem ser identificados. Outro aspecto fundamental é ter certeza de que uma grande quantidade da população diploide inicial usado para crescer sob condições não-seletivos e seletivas para evitar gargalos evolutivos de amostragem erro⁴ . Após a cultura volumes e célula números especificados aqui ajudará a garantir a reprodutibilidade e diminuir o ruído.

Uma das razões que a abordagem DEEPN é poderosa é que exaustivamente pode seguir todo o plasmídeo em uma biblioteca de rapina determinado por sua capacidade de interagir com a isca de interesse. Assim, uma das limitações do DEEPN é a complexidade da biblioteca usada. Para algumas das bibliotecas comerciais como as que usamos aqui, descobrimos que o número de plasmídeos que codificam bona fide fragmentos de cDNA ORF que estão no mesmo quadro de leitura do domínio de ativação Gal4 é entre 3-6 x 10⁴ com representação de ~ 6000 - 8,00 0 genes diferentes. Nós achamos que quase 75% dessas bibliotecas continha fragmentos correspondendo unicamente às regiões de cDNA que eram 3' da sequência de DNA de codificação (CDS/ORF). Além disso, quase um terço dos genes que tinham fragmentos na biblioteca não teve nenhum que correspondia às regiões no ORF ou montante da ORF.

Fizemos três outras alterações para o método DEEPN. Um é uma nova estirpe de MATalpha que pode transportar 'presas' bibliotecas alojadas no interior de um plasmídeo TRP1 e mates that distante melhor do que algumas cepas de biblioteca contendo comercialmente disponíveis como Y187. Isso ajuda a garantir a transferência completa da população de biblioteca para cada isca de interesse. Nós também fizemos um novo 'isca' do plasmídeo de expressão, que diferem das descritas anteriormente plasmídeos que usam uma cópia variável espinha dorsal baseada em 2µ¹⁰. Aqui descrevemos um plasmídeo CEN de baixo-cópia (pTEF-GBD) e descobrir que uma única rodada de crescimento seletivo é suficiente para enriquecer para interação presa de plasmídeos. Por último, podemos construir um vetor de biblioteca simplificada 'presas' e usado para produzir uma alta densidade aleatório-fragmento genomic Y2H da biblioteca para Saccharomces cerevisiae, que deve ser útil no futuro para descobrir e caracterizar as interações amonst proteínas de levedura. Em geral, as melhorias nos materiais e ferramentas de Bioinformática (descritas na obra de acompanhamento) faz o DEEPN abordar de uma forma acessível, viável e eficiente de executar telas de Y2H abrangentes e comparativas.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Illumina HiSeq 4000	Illumina		deep sequencing platform
Monoclonal anti-HA antibodies	Biolegend	901514	Primary Antibody to detect expression of HA in pGal4AD constructs
Polyclonal anti-myc antibodies	QED Biosciences Inc	18826	Primary Antibody to detect expression of MYC in pTEF-GBD constructs
NarI	New England BioLabs	R0191S
EcoRI-HF	New England BioLabs	R3101S
BamHI-HF	New England BioLabs	R3236S
XhoI	New England BioLabs	R0146S
Polyethylene Glycol 3350, powder	J.T. Baker	U2211-08
Salmon Sperm DNA	Trevigen, Inc sold by Fisher Scientific	50-948-286	carrier DNA for yeast transformation section 3.2.1.
Kanamycin Monosulfate	Research Products International	K22000
LE Agarose	GeneMate	E-3120-500	used for making DNA agarose gels
Sodium Chloride	Research Products International	S23025
Tryptone	Research Products International	T60060
D-Sorbitol	Research Products International	S23080
Lithium Acetate Dihydrate	MP Biomedicals	155256
Calcium Chloride	ThermoFisher	C79
EDTA Sodium Salt	Research Products International	E57020
Yeast Extract Powder	Research Products International	Y20020
Yeast Nitrogen Base (ammonium sulfate) w/o amino acids	Research Products International	Y20040
CSM-Trp-Leu+40ADE	Formedium	DCS0789
CSM-Trp-Leu-His+40ADE	Formedium	DCS1169
CSM-Leu-Met	Formedium	DCS0549
CSM-Trp-Met	Bio 101, Inc	4520-922
L-Methionine	Formedium	DOC0168
Adenine	Research Products International	A11500
D-(+)-Glucose	Research Products International	G32045
Bacto Agar	BD	214010	used for making media plates in section 1
Peptone	Research Products International	P20240
3-amino-1,2,4 Triazole	Sigma	A8056
2-Mercaptoehanol (BME)	Sigma-Aldrich	M6250
Zymolyase 100T	USBiological	Z1004
Potassium phosphate dibasic	Sigma	P8281
Phenol:Chloroform:IAA	Ambion	AM9732
Ammonium Acetate	Sigma-Aldrich	238074
Ethanol	Decon Laboratories, INC	2716
RNAse A	ThermoFisher	EN0531
Urea	Research Products International	U20200
SDS	Research Products International	L22010
glycerol	Sigma Aldrich	G5516
Tris-HCl	Gibco	15506-017
bromophenol blue	Amresco	449
Gibson Assembly Cloning Kit	New England Biolabs	E5510S	Rapid assembly method for cloning of plasmids in section 2
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix	New England Biolabs	M0541S	Used for amplification of products for Gibson Assembly in Section 2.3 as well assample preparation for DEEPN deep sequencing in section 6.2.1
Ethidium Bromide	Amresco	0492-5G
QIAquick PCR purification kit	Qiagen	28104	Used for purification of pcr products in section 6.2.3
Qiaquick DNA Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	Used for purification of digested pTEF-GBD in section 2.1
KAPA Hyper Prep kit	KAPA Biosystems	KK8500	preparation kit for deep sequencing
Codon optimization	http://www.jcat.de
Codon optimization	https://www.idtdna.com/CodonOpt
gBlocks	Integrated DNA Technologies		DNA fragments used for cloning in Section 2.2
Strings	Thermofisher		DNA fragments used for cloning in Section 2.2
GenCatch Plasmid DNA mini-prep Kit	EPOCH Life Sciences		Used to prepare quantities of DNA in Section 2.3
Covaris E220	Covaris		high performance ultra-sonicator in section 7
oligo nucelotide 5’- CGGTCTT CAATTTCTCAAGTTTCAG -3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		used for pcr amplification and sequencing 5' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-GAGTAACG ACATTCCCAGTTGTTC-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		used for pcr amplification and sequencing 5' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-CACCGTAT TTCTGCCACCTCTTCC-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		used for pcr amplification and sequencing 3' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-GCAACCGC ACTATTTGGAGCGCTG-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		used for pcr amplification and sequencing 3' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligonucleotide 5’-GTTCCGATG CCTCTGCGAGTG-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		5' Pimer used for insert amplification of pGAL4AD
oligonucelotide 5’-GCACATGCT AGCGTCAAATACC-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		3' Pimer used for insert amplification of pGAL4AD
oligonucelotide 5’-ACCCAAGCA GTGGTATCAACG-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		5' Pimer used for insert amplification of pGADT7
oligonucelotide 5’- TATTTAGA AGTGTCAACAACGTA -3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		3' Pimer used for insert amplification of pGADT7
PJ69-4A MatA yeast strain	http://depts.washington.edu/yeastrc/ James P, Halladay J, Craig EA: Genomic Libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast. GENETICS 1996 144:1425-1436		MATA leu2-3,112 ura3-52 trp1-901 his3-200 gal4D, gal80D, GAL-ADE2 lys2::GAL1-HIS3 met2::GAL7
pTEF-GBD	Dr. Robert Piper Lab		Gal4-DNA binding doimain expression plasmid
pGal4AD (pPL6343)	Dr. Robert Piper Lab		Gal4-activation domain expression plasmid
100 mm petri dishes	Kord-Vallmark sold by VWR	2900
125 mL PYREX Erlenmeyer flask	Fisher Scientific	S63270
250 mL PYREX Erlenmeyer flask	Fisher Scientific	S63271
1,000 mL PYREX Erlenmeyer flask	Fisher Scientific	S63274
2,000 mL PYREX Erlenmeyer flask	Fisher Scientific	S63275
20 X 150 mm Disposable Culture Tube	Thermofisher	14-961-33
pipet-aid	Drummond	4-000-100
5 mL Serological Pipette	Denville	P7127
10 mL Serological Pipette	Denville	P7128
25 mL Serological Pipette	Denville	P7129
1,000 mL PYREX Griffin Beaker	Fisher Scientific	02-540P
1,000 mL PYREX Reuasable Media Storage Bottle	Fisher Scientific	06-414-1D
1,000 mL graduated cylinder	Fisher Scientific	08-572-6G
SpectraMax 190	Molecular Devices		used to measure the Optical Density of cells
NanoDrop 2000	Thermo Scientific	ND-2000	Spectrophotometer used to quantify amount of DNA
Electronic UV transilluminator	Ultra Lum	MEB 20	used to visualize DNA in an Ethidium Bromide agarose gel
P1000 Gilson PIPETMAN	Fisher Scientific	F123602G
P200 Gilson PIPETMAN	Fisher Scientific	F123601G
P20 Gilson PIPETMAN	Fisher Scientific	F123600G
P10 Gilson PIPETMAN	Fisher Scientific	F144802G
1250 µL Low Retention Pipette Tips	GeneMate	P-1236-1250
200 µLLow Retention Pipette Tips	VWR	10017-044
10 µL XL Low Retention Pipette Tips	VWR	10017-042
50 mL conical tube	VWR	490001-627
15 mL conical tube	VWR	490001-621
cell scraper	Denville Scientific	TC9310
1.5 mL Microcentrifuge tubes	USA Scientific	1615-5500
HCl	Fluka Analytical	318949-1L
NaOH	J.T. Baker	5674-02
Wooden applicators	Solon Care	55900
Eppendorf microcentrifuge 5424	Fisher Scientific	05-400-005	microcentrifuge
Sorvall ST16R	Thermo Fisher Scientific	75004381	benchtop centrifuge
Amersham ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey)	GE Healthcare	NA934-1ML	Secondary Antibody
Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep)	GE Healthcare	NA931-1ML	Secondary Antibody
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate	Thermo Fisher Scientific	34080	ECL detection solution
Isotemp Incubator	Thermo Fisher Scientific		Incubator
Mutitron 2	INFORS HT		Shaking incubator
Isotemp Digital-Control Water Bath Model 205	Fisher Scientific		water bath
Y2H mouse cDNA library in Y187 (pan tissue)	Clontech	630482	commercially available cDNA Library
Y2H mouse cDNA library in Y187 (mouse brain)	Clontech	630488	commercially available cDNA Library
pGADT7 AD Vector	Clontech	630442	commercially available AD Vector housing many cDNA libraries
pGBKT7 DNA-BD Vector	Clontech	630443	commercially available DNA-BD Vector
Biolase DNA Polymerase	Bioline	BIO-21042	DNA polymerase used for section 2.4
GeneMate GCL-60 Thermal Cycler	BioExpress	P-6050-60	pcr machine
TempAssure 0.5 mL PCR tubes	USA Scientific	1405-8100