En jäst 2-Hybrid skärm i Batch att jämföra proteininteraktioner

Summary

Batch-bearbetning av jäst 2-hybrid skärmar tillåter direkt jämförelse av interaktion profiler av flera bete proteiner med en mycket komplex uppsättning bytesdjur fusionsproteinerna. Här beskriver vi förfinade metoder, nya reagenser och implementera deras användning för sådana skärmar.

Abstract

Screening för protein-protein interaktioner med jäst 2-hybrid analys har länge varit ett effektivt verktyg, men dess användning har i stort sett begränsats till upptäckten av hög affinitet interactmedlemmar som är höganrikat i biblioteket i samverkande kandidater. I ett traditionellt format, kan jäst 2-hybrid analysen ge alltför många kolonier att analysera när bedrivs vid låga kravnivåer där låg affinitet interactmedlemmar kan hittas. Dessutom utan en omfattande och fullständig förhör av samma bibliotek mot olika bete plasmider, kan inte en jämförande analys uppnås. Även om några av dessa problem kan lösas med klädd prey bibliotek, kan kostnad och infrastruktur som krävs för att driva sådana skärmar vara oöverkomliga. Som ett alternativ, vi har anpassat jäst 2-hybrid analysen för att samtidigt avslöja dussintals övergående och statiska proteininteraktioner inom en enda skärm som använder en strategi som kallas DEEPN (dynamisk anrikning för utvärdering av Protein nätverk), som innehåller hög genomströmning DNA-sekvensering och uträkningen att följa utvecklingen av en befolkning på plasmider som kodar samverkande partner. Här beskriver vi anpassade reagenser och protokoll som tillåter en DEEPN skärm ska utföras enkelt och kostnadseffektivt sätt.

Introduction

En fullständig förståelse av biologiska processer i cellen bygger på att hitta de protein interaktion nätverk som ligger bakom deras molekylära mekanismer. En metod att identifiera proteininteraktioner är den jäst 2-hybrid (Y2H) test, som fungerar genom att samla en fungerande chimära transkriptionsfaktor när två protein domäner av intresse binder till en annan¹. En typisk Y2H skärm utförs genom att skapa en befolkning av jäst som rymmer både ett bibliotek av plasmider kodning samverkande proteiner smält till en transkriptionell aktivator (t.ex., 'offer' fusionsprotein) och en viss ”bait' plasmiden består av proteinet av intresse smält till en DNA-bindande domän (t.ex., Gal4 DNA-bindande domänen som binder till Gal4-upstream aktiverande sekvensen). En av de främsta fördelarna med metoden med Y2H är att det är relativt lätt och billig att utföra i en typisk laboratorium utrustat för molekylär biologiska rutinarbete². När traditionellt utförs, tar dock enskilda kolonier som uppstår vid urval till en positiv Y2H interaktion prov av en användare. Detta begränsar allvarligt antalet bibliotek 'offer' kloner som kan vara tillfrågade. Problemet förvärras när överflödet av en viss samverkande bytesdjur är mycket hög i förhållande till de andra, minskar chansen att upptäcka interaktion från låga överflöd prey plasmider.

En lösning för att använda Y2H principen i omfattande täckning av proteomet är användningen av en matris-formaterade strategi vari en array som innehåller kända enskilda byten plasmider kan förhöras digitalt. Men kräver en sådan strategi en infrastruktur som inte är lätt tillgängliga eller kostnadseffektiv till enskilda utredare som är intresserade av att definiera interactome av ett litet antal proteiner eller domäner³. Dessutom skulle mycket komplicerat byte bibliotek som kan koda flera fragment av samverkande proteiner expandera storleken för sådan matris matriser till opraktiskt storlekar. Ett alternativ är att utföra analyser med komplexa bibliotek i omgångar och bedöma förekomst av samverkande kloner använder massiva parallella hög genomströmning sekvensering⁴. Detta kan användas för att assay förekomsten av bytesdjur plasmider som uppstår i flera kolonier med en typisk Y2H formaterade strategi i vilken jäst celler bostäder ett samverkande par fusionsproteinerna tillåts att växa på en tallrik^5,6. Denna allmänna idé kan förstärkas för att öka fråga både flera bete och byte av komponenter på samma gång^7,8.

Fortfarande, många undersökningar kräver en lättare ännu mer fokuserad satsning på bara några protein 'beten' och kan gynnas mer genom en uttömmande och semikvantitativt fråga av ett enda komplexa prey bibliotek. Vi har utvecklats och validerats ett tillvägagångssätt för att utföra omfattande protein interaktionsstudier med en Y2H princip i batch format⁴. Detta använder expansionstakten av en viss prey plasmid som en proxy för den relativa styrkan i Y2H interaktion⁹. Djupsekvensering av alla plasmider inom en befolkning utsätts för normal tillväxt eller selektiv tillväxt villkorar ger en komplett karta över kloner som ger starka och svaga Y2H interaktioner. Repertoar av interactmedlemmar kan erhållits och jämföras direkt över flera bete plasmider. Resulterande arbetsflödet kallas DEEPN (dynamisk anrikning för utvärdering av Protein nätverk) kan således användas för att identifiera differential interactomes från samma prey biblioteken att identifiera proteiner, möjliggör jämförelse mellan en protein vs en annan.

Här visar vi DEEPN och införa förbättringar i de laboratoriemetoder som underlättar dess användning, som beskrivs i figur 1. Betydande förbättringar inkluderar:

Generation av bytesdjur jäst populationer. En av de viktigaste kraven på DEEPN genererar populationer av jäst med olika bete plasmider som har samma fördelning av Plasmiden prey bibliotek. Motsvarande originalplan populationer av bytesdjur plasmid biblioteket är avgörande för att göra korrekta jämförelser mellan interactomes av olika beten. Detta uppnås bäst när en bibliotek plasmid redan är inrymt i en haploida jäst befolkning och inflyttningen som befolkningen en viss bete plasmid erhålls genom parning för att producera en diploida. Här ger vi en tydlig guide i hur man gör sådana populationer som använder kommersiella bibliotek inrymt i haploida jäst. Även om vi hittade metoder som genererar ett stort antal diploider, var parning totaleffektiviteten i dessa kommersiella bibliotek-innehållande jäststammar låg. Därför konstruerade vi en ny stam som kan hus prey bibliotek som ger långt mer diploider per parning reaktion.

Ny uppsättning bete plasmider. Många nuvarande plasmider som express 'bete' fusionsproteinerna består av proteinet av intresse och ett DNA-bindande domän är 2µ-baserade, ger dem möjlighet att förstärka sin kopia nummer. Detta exemplar nummer kan vara ganska variabel i befolkningen och leda till variationer i Y2H transkriptionell svaret. Detta kan i sin tur skeva förmågan att mäta styrkan i en viss proteinet interaktion utifrån tillväxt respons av celler under markeringen. Detta kan vara delvis adress med hjälp av en låg kopia plasmid, som tidigare har beskrivits såsom de kommersiellt tillgängliga pDEST32¹⁰. Vi konstruerade ett nytt bete plasmid (pTEF-GBD) som producerar Gal4-DNA-bindande domänen fusionsproteiner inom en TRP1 centromer-baserade låg kopia plasmiden bär genen Kanr motstånd som också tillåter kloning av bete fragment både uppströms och nedströms Gal4 DNA-bindande domänen.

Nya High-Density Y2H fragment bibliotek. Vi konstruerade en ny plasmid till hus Y2H byte bibliotek och använde den för att bygga en mycket komplexa Y2H bibliotek gjort av slumpmässigt klippt fragment av genomisk DNA från Saccharomyces cerevisiae. Sekvensanalys visade att detta bibliotek hade över 1 miljon olika element, långt mer komplext än tidigare beskrivna jäst genomisk Y2H plasmid bibliotek¹¹. Med detta nya bibliotek kunde vi visa att DEEPN arbetsflödet är robust nog att rymma komplexa bibliotek med många olika plasmider på ett sätt som är tillförlitliga och reproducerbara.

Protocol

1. beredning av Media och plattorna

Obs: Alla plattor behöver göras minimalt 2 dagar innan du börjar protokollet. Media kan göras när som helst. Buffrade jäst extrakt pepton dextros adenin (bYPDA) måste dock göras den dag som den kommer att användas. Vissa medier görs med hjälp av en tillägg blandning som innehåller en nivå av adenin som är större än vad som vanligtvis används. De flesta minimal media kosttillskott ange 10 mg/L adenin. Kosttillskott som heter '+ 40Ade' Ange sammanlagt 40 mg/L adenin.

1. Förbereda glukoslösning (50% w/v). För 1 L, lös 500 g D-(+)-glukos i 800 mL destillerat vatten i en 1000 mL-bägare. Justera volymen till 1 000 mL med en graderad cylinder och filtrera genom ett 0,2 µm sterila filter till en steril 1000 mL media lagring flaska.
2. Förbereda jästextrakt pepton dextros (YPD) plattor. För 1 L, Lös 20 g pepton och 10 g jästextrakt i 800 mL destillerat vatten i en 1000 mL-bägare. Häll i en graderad cylinder, fyll upp till 960 mL med destillerat vatten. Häll i en 2 000 mL Erlenmeyer-kolv och tillsätt 15 g agar. Autoklav och cool i 37 ° C vattenbad tills vatten badtemperaturen har svalnat till ca 42-50 ° C. Använd en pipett för att lägga till 40 mL 50% glukos. Blanda väl genom omskakning.
   1. Häll en rad 100 mm plattor med 20 mL av media med pipett.
3. Förbereda komplett syntetiska minimal media (CSM)-Trp plåt. För 1 L, lös 6,7 g jäst kväve bas utan aminosyror till 800 mL destillerat vatten i en 1000 mL-bägare. Häll i en graderad cylinder, fyll upp till 960 mL med destillerat vatten. Och häll i en 2 000 mL Erlenmeyerkolv 0.7 g - Trp-träffade dropout mix, 20 mg metionin och 15 g agar. Autoklav och cool i 37 ° C vattenbad tills vatten badtemperaturen har svalnat till ca 42-50 ° C. Använd en pipett för att lägga till 40 mL 50% glukos. Blanda väl genom omskakning.
   1. Häll en rad 100 mm plattor med 20 mL av media med pipett.
4. Förbereda CSM-Leu-Met plattor. För 1 L, lös 10,05 g jäst kväve bas utan aminosyror till 800 mL destillerat vatten i en 1000 mL-bägare. Häll i en graderad cylinder och fyll upp till 940 mL med destillerat vatten. Och häll i en 2 000 mL Erlenmeyerkolv 1.005 g - Leu-träffade dropout mix och 15 g agar. Autoklav och cool i 37 ° C vattenbad tills vatten badtemperaturen har svalnat till ca 42-50 ° C. Använd en pipett för att lägga till 60 mL 50% glukos. Blanda väl genom omskakning.
   1. Häll en rad 100 mm plattor med 20 mL av media med pipett.
5. Förbereda CSM-Leu-Trp plåt. För 1 L, lös 10,05 g jäst kväve bas utan aminosyror till 800 mL destillerat vatten i en 1000 mL-bägare. Häll i en graderad cylinder, fyll upp till 940 mL med destillerat vatten. Och häll i en 2 000 mL Erlenmeyerkolv 1.005 g - Trp-Leu + 40Ade avhopp mix, 240 mg adenin och 15 g agar. Autoklav och cool i 37 ° C vattenbad tills vatten badtemperaturen har svalnat till ca 42-50 ° C. Använd en pipett för att lägga till 60 mL 50% glukos. Blanda väl genom omskakning.
   1. Häll en rad 100 mm plattor med 20 mL av media med pipett.
6. Förbereda CSM-Leu-Trp-hans plattor. För 1 L, lös 10,05 g jäst kväve bas utan aminosyror till 800 mL destillerat vatten i en 1000 mL-bägare. Häll i en graderad cylinder, fyll upp till 940 mL med destillerat vatten. Och häll i en 2 000 mL Erlenmeyerkolv 0.975 g - Trp-Leu-hans + 40Ade avhopp mix, 240 mg adenin och 15 g agar. Autoklav och cool i 37 ° C vattenbad tills vatten badtemperaturen har svalnat till ca 42-50 ° C. Använd en pipett för att lägga till 60 mL 50% glukos. Blanda väl genom omskakning.
   1. Häll en rad 100 mm plattor med 20 mL av media med pipett.
7. Förbereda CSM-Leu-Trp-hans-3AT plattor. För 1 L, lös 10,05 g jäst kväve bas utan aminosyror till 800 mL destillerat vatten i en 1000 mL-bägare. Häll i en graderad cylinder, fyll upp till 940 mL med destillerat vatten. Och häll i en 2 000 mL Erlenmeyerkolv 0.975 g - Trp-Leu-hans + 40Ade avhopp mix, 240 mg adenin och 15 g agar. Autoklav och cool i 37 ° C vattenbad tills vatten badtemperaturen har svalnat till ca 42-50 ° C. Använd en pipett för att lägga till 60 mL 50% glukos. Blanda i 100 µL sterilt lager 1 M 3-amino-1,2,4-triazol (3AT) genom omskakning.
   1. Häll en rad 100 mm plattor med 20 mL av media med pipett.
8. Förbereda LB-Kanr plattor. För 1 L, lös 10 g trypton, 5 g jäst extrakt och 10 g NaCl i 800 mL destillerat vatten i en 1000 mL-bägare. Häll i en graderad cylinder, fyll upp till 1 000 mL med destillerat vatten. Häll i en 2 000 mL Erlenmeyer-kolv och tillsätt 15 g agar. Autoklav och cool i 37 ° C vattenbad tills vatten badtemperaturen har svalnat till ca 42-50 ° C. Tillsätt 50 mg Kanamycin och blanda genom omskakning.
   1. Häll en rad 100 mm plattor med 20 mL av media med pipett.
9. Förbered YPD, CSM-Leu-Met, CSM-Trp, CSM-Leu-Trp och CSM-Leu-Trp-hans. Proceduren ovan för plåtar utom i stället för att hälla i en Erlenmeyerkolv, häll i en flaska för lagring av media och utelämna ägarn.
10. Förbered bYPDA (buffrat YPDA). Ta sterila YPD media och lägga till 200 mg/L adenin i sterilt destillerat vatten. Justera pH till 3,7 med HCl. Filter genom ett 0,2 µm sterila filter i en steril flaska.
11. Förbereda Transformation buffert: 2 M sorbitol, 1 M litium acetat dihydrat, 10 mM Tris pH 7,6, 0,5 mM EDTA, 0,2 mM kalciumklorid i destillerat vatten. Filtrera genom ett 0,2 µm sterila filter till en steril flaska.
12. Förbereda PEG lösning: 70% w/v polyetylenglykol 3350 i destillerat vatten. Sterilisera i autoklav.
13. Förbereda virvel: 8 M urea, 4% w/v SDS, 50 mM Tris pH 6.8, 10% v/v glycerol, 0,02% w/v bromofenolblått i sterilt destillerat vatten.
14. Förbereda sTE (starkt TE): 50 mM Tris, 20 mM EDTA, pH 8,0 i destillerat vatten. Filtrera genom ett 0,2 µm sterila filter till en steril flaska.
15. Förbereda Zymolase stamlösning: 10 mg/mL Zymolase 100T i 50 mM kalium fosfatbuffert dibasiskt pH 7.5, 50% v/v glycerol buffert i sterilt destillerat vatten (lagras vid-20 ° C).

2. kloning och verifiering av bete plasmider

Obs: Konstruktion av Gal4-DNA-bindande domän plasmider. För närvarande finns det en mängd olika kommersiellt tillgängliga och akademiskt tillgängliga Y2H system. DEEPN rymmer många av dessa under förutsättning att bete plasmiden uttrycker proteinet av intresse smält till en DNA-bindande domän i en TRP1-innehållande plasmid. Andra nedströms krav är att sekvensen omedelbart uppströms prey bibliotekets infoga är känd och som en positiv Y2H samverkan kan vara poängsätts av produktionen av His3 möjliggör urval i media saknar histidin. Här kommer vi att beskriva användningen av en ny Y2H bete plasmid (pTEF-GBD, figur 2), men andra Y2H bete plasmider inklusive pGBKT7 kan användas också. För konstruktion och utvärdering av bete plasmider, kommer vi att beskriva användningen av pTEF-GBD. Som en allmän anmärkning rekommenderar vi gen syntes att producera en öppna-läsning ram som följer jäst kodon bias för att säkerställa bra uttryck och lätthet med kloning. Säkerställa att kloning systemet tillåter för betet vara i-ram med Gal4 DNA-bindande domänen och att när kloning i 3' webbplats, ett stop-kodon följer betet-kodande regionen.

1. Förbereda plasmid vektorn. Plasmid pTEF-GBD möjliggör kloning ett fragment som kodning proteinet av intresse antingen 5' eller 3' i regionen kodning Gal4 DNA-bindande domänen med hjälp av en metod för snabb montering. För införande på 5' platsen, smälta 3 µg pTEF-GBD med NarI och mina eller för införande på webbplatsen 3', smälta med BamHI och XhoI för 2-4 h. Electrophorese prov i 1% DNA agaros gel innehållande 0,2 - 0,5 µg/mL etidiumbromid (EtBr) på 100 V. punktskatt cut 5,630 bp TEF-GBD och rena med hjälp av ett DNA gel utvinning kit i enlighet med tillverkarens anvisningar och kvantifiera DNA av absorbansen vid 260 nm med spektrofotometer¹².
   Obs: Generering av bete-encoding skär. DNA fragment kodning proteiner eller protein fragment av intresse kan vara gjord med hjälp av gen syntes och tillgänglig som uncloned fragment. Det rekommenderas att kodon är optimerade för uttryck i Saccharomyces cerevisiae och online-verktyg för kodon optimering ingår i listan över material.
2. För 5' införande, flankerar den DNA-fragment som kodning en ATG start-kodon av 5'-TTAAGAAAAACAAACTGTAACGAATTC-3 'och 5'-GCGCCTATGTGTGAACAAAAGCTTATT-3', respektive. För 3' införande i ram med Gal4 DNA bindande domän, flank kodning fragmentet av 5'-ctgcatatggccatggaggccgaa-3 'och 5'-tagtaactagcataaccccttggggcc-3'.
3. För plasmid konstruktion, använda metoden snabb montering som anges i tillverkarens anvisningar för kloning fragment i skurna pTEF-GBD.
   1. Plattan alla förvandlas E. coli på LB-Kanr plattor och inkubera i 16-20 timmar vid 37 ° C. Kolonierna bostäder pTEF-GBD med önskad skäret kan identifieras genom PCR-amplifiering med hjälp av oligonukleotider: 5'-CGGTCTTCAATTTCTCAAGTTTCAG-3 ' och 5'-GAGTAACGACATTCCCAGTTGTTC-3' 5' infoga och 5'-CACCGTATTTCTGCCACCTCTTCC-3' och 5'-GCAACCGCACTATTTGGAGCGCTG-3' för 3' infoga. Dessa oligonukleotider kan också fungera som primers för sekvensering skäret.
   2. Planerar på att förbereda > 10 µg av varje pTEF-GBD derivat och pTEF-GBD ensam för att ge material för sekvensering och jäst transformationer.
   3. Använd följande PCR villkor: 3 min vid 98 ° C, följt av 25 cykler av 30 s vid 98 ° C, 30 s vid 55 ° C, och 2 min vid 72 ° C, följt av 5 min vid 72 ° C med en buffert som innehåller 2,5 mM MgCl₂ , U/100 0,5 µL DNA-polymeras och egenutvecklade buffert.

3. redovisning av Gal4-DNA-bindande domän fusionsproteinerna

1. Gör behöriga jäst.
   1. Strimma ut PJ69-4A jäst på YPD plåt genom att ta en steril trä applikator, skrapa 1 mm³ en-80 ° c fryst lager och gnugga det försiktigt över YPD plattan. Flytta trä applikatorn ner plattan så att varje pass går över en orörd del av media ytan. Inkubera YPD plattan vid 30 ° C i 2 dagar eller tills enda kolonier är synliga. Göra fryst beståndet av PJ69-4A jäst genom att avbryta jäst i vatten eller tillväxt medier, komplettera med DMSO till 7% och lagra vid-80 ° C.
   2. Inokulera en enda koloni i 5 mL av kulturen i YPD i en 20 x 150 mm kultur tub med hjälp av en steril trä applikator och växa över natten vid 30 ° C i en skakande inkubator på 200 rpm.
   3. Inokulera YPD 50 mL i en 250 mL steril Erlenmeyerkolven med 4 mL av övernattning kulturen av PJ69-4A jäst stam. Växa i en skakande inkubator vid 30 ° C, 200 rpm till en optisk densitet (OD₆₀₀) av ungefärligt 1.2, som bestäms av spektrofotometri med en standard 1 cm ljusstrålen. Tillväxt tar oftast 5-7 h.
   4. Isolera jäst genom sedimentering i en 50 mL konisk röret vid 4.696 x g i 5 min i rumstemperatur i en bänkmonterade centrifug. Kassera supernatanten genom dumpning i flytande avfall. Med pipett återsuspendera pelleten i 5 mL transformation buffert och överföring till 15 mL koniska tube. Resediment att Kassera supernatanten och återsuspendera jästen i 1 mL av slutlig volym av omvandling buffert med 1000 µL pipett.
   5. Inkubera jästceller i 60 min vid 30 ° C under omskakning vid 200 rpm och placera sedan på is för 30-90 min.
2. Jästen plasmid omvandling.
   1. I 1,5 mL steril mikrocentrifug rör, tillsätt 1 µg av pTEF-GBD-baserade plasmid och 5 µL 10 mg/mL lax spermier carrier DNA lösning. Även en tub som innehåller endast lax spermier carrier DNA som en negativ omvandling kontroll. Tillsätt 100 µL av iskall jäst cellsuspensionen till varje rör med pipett. Tillsätt 100 µL av 70% PEG lösning med en 1000 µL pipett och blanda försiktigt genom att snärta röret 5 - 10 gånger (gör inte vortex).
   2. Inkubera vid 30 ° C, i en skakande inkubator på 200 rpm för 45 min.
   3. Värme chock vid 42 ° C i 15 min.
   4. Sediment i en mikrocentrifug på 845 x g under 3 minuter vid rumstemperatur, Pipettera och Kassera supernatanten, återsuspendera pelleten i 150 µL sterilt vatten genom pipettering upp och ner, och spred sig över ytan av en CSM-Trp-plåt.
   5. Placera plattor höger upp i 30 ° C inkubator och Inkubera under 2-3 dagar tills kolonierna är synliga. Plattorna kan vändas upp och ned för att undvika kondens på den platta ytan efter inkubation vid 30 ° C för 6-12 h.
   6. Ta 2-3 kolonier per omvandling och strimma som ett plåster på CSM-Trp plåt med hjälp av en steril tandpetare. Tillåta för att växa för 24 h vid 30 ° C.
3. Göra lysates för proteinuttryck.
   1. Inokulera 3 mL CSM-Trp flytande media med en match-huvud-storlek av jäst från plåstret och växa över natten vid 30 ° C i en 20 x 150 mm kultur tube, under omskakning vid 200 rpm. Gör två natten kulturer per bete och Tom pTEF-GBD vektor.
   2. Tillsätt 1 mL YPD till varje 3 mL CSM-Trp övernattning kultur. Växer för 1 h vid 30 ° C, under omskakning vid 200 rpm. Kontrollera OD av celler genom spektrofotometer.
   3. Sediment ett motsvarande antal celler, normalisera enligt OD. Använd sterila 1,5 mL mikrocentrifugrör med en 5 min spin vid 2,348 x g i rumstemperatur i en mikrocentrifug. Använd en pipett för att Kassera supernatanten. Det sista lagret motsvarar minst 2,1 OD.
      Obs: Vid beräkning av motsvarande antal celler, kan det uppstå att olika volymer kan krävas från varje övernattning kultur att uppnå minimal 2.1 OD.
   4. Återsuspendera pelleten i 450 µL av 0.2 M NaOH genom pipettering upp och ner. Inkubera i 5 min i rumstemperatur. Recentrifuge celler för 2 min vid 2,348 x g i rumstemperatur, och kasta bort supernatanten med pipett.
   5. Återsuspendera pelleten med 50 µL av TWIRL buffert av pipettering upp och ner noga att inte gör bubblor. Värme prov för 5 min vid 70 ° C.
4. Kontrollera om proteinuttryck med SDS-PAGE.
   1. Använda en gradient gel 4-20% att säkerställa en stor rad molekylvikter kan lösas. Belastning motsvarande belopp (samma OD) av prover i en SDS-PAGE gel och se till att inkludera minst ett prov som innehåller den omodifierade pTEF-GBD vektor^13,14,15.
   2. Efter elektroforetisk separation, överföra gel till nitrocellulosa och immunoblot använder anti myc monoklonala eller polyklonala antikroppar och ECL upptäckt lösning (figur 3).

4. själv aktiveringen Test

1. Strimma ut MATalpha jästen från-80 ° C lager motsvarande den stam som bostäder prey biblioteket av intresse på YPD plåt genom att ta en steril trä applikator, skrapa en liten mängd jäst ur injektionsflaskan och strimmor det över YPD plattan. Inkubera YPD plattan vid 30 ° C i 2 dagar eller tills enda kolonier är synliga. Lappa ett par enstaka kolonier på YPD plåt och inkubera över natten vid 30 ° C.
   Obs: Nya stammen framkallat här till husets prey bibliotek är PLY5725 medan vissa kompatibla kommersiellt tillgängliga Y2H bibliotek är inrymt i Y187.
2. Följ procedurerna i 3.3.1 - 3.3.4 att omvandla PLY5725 med den LEU2-baserat plasmiden används för att hysa önskat byte biblioteket. För biblioteken utvecklats här, motsvarande plasmiden är pGal4AD (pPL6343). Att återvinna jäst transformants, plattan på CSM-Leu-Met plattor. Efter kolonierna uppstår, strimma som fläckar på CSM-Leu-Met plåt och Inkubera under 24 timmar vid 30 ° C.
3. Följa protokollet i 3.4 bekräfta uttryck för pPL6343 tom vector använder-HA monoklonala eller polyklonala antikroppar och ECL upptäckt lösning.
4. Strimma var och en av de transformerade PJ69-4A jästen i ett kors mönster med PLY5725 konstruerar på en YPD-platta som bekräftades att uttrycka protein i protokollet avsnitt 3.4 och 4.3 och inkubera vid 30 ° C över natten. Ta 1 mm³ celler där de två stammarna har vuxit samman och lapp på separata CSM-Leu-Met, CSM-Trp och CSM-Trp-Leu plattor och växa 24 h.
   Obs: Önskad diploider kommer att växa på CSM-Trp-Leu plattorna. Tillväxt på CSM-Leu-Met och CSM-Trp plåt fungera som en positiv kontroll för jäst tillväxt.
5. Odla diploider i 1 mL av CSM-Trp-Leu media övernattning på 30 ° C. Sediment 500 µL celler i en 1,5 mL mikrocentrifug rör vid 2,348 x g, 3 min i rumstemperatur i en mikrocentrifug. Kassera supernatanten med pipett. Att resuspendera cellerna i 1 mL sterilt vatten och upprepa sedimentation och resuspension. Kontrollera den OD₆₀₀ av celler.
6. Göra en rad 1:10 seriespädningar av varje cellsuspension med sterilt vatten med start mest koncentrerad lösning av varje på en OD 0,5. Spot 5 µL av varje utspädning på en CSM-Leu-Trp-plåt, en CSM-Leu-Trp-hans platta och ett CSM-Leu-Trp-hans + 3AT plattan. Inkubera vid 30 ° C och inspektera för tillväxt dagligen under 3 dagar (figur 4).
   Obs: för 1:10 seriella utspädning, Pipettera 10 µL av röret som innehåller en OD 0,5 till 90 µL av vatten och blanda genom pipettering upp och ner. Fortsätta att göra 1:10 seriespädningar tills det finns totalt sex olika koncentrationer att upptäcka.

5. skapa jäst populationer med bete och byte bibliotek

Obs: Den Y187 stammen som inrymmer kommersiella prey bibliotek plasmider inte väl mate. Således krävs följande optimerade villkor för att upprätthålla komplexiteten i biblioteket. PLY5725 stam som innehåller Y2H byte bibliotek kompisar bättre och samma parning förfarande kan användas med denna stam (figur 5).

1. Inokulera en 3 mL av kulturer av varje av de PJ69-4A transformants bär de olika TRP1-innehållande pTEF-GBD bete plasmid i CSM-Trp media i en kultur tube. Inkludera två separata kulturer som innehåller pTEF-GBD vektor plasmiden ensam för att tjäna som processuella kontroller. Inkubera kulturer vid 30 ° C, 200 rpm för 6 h och späd sedan till en 25 mL av kulturen i en steril Erlenmeyerkolv för övernattning tillväxt.
2. Tina frysta (-80 ° C) injektionsflaska av MATalpha celler som innehåller de LEU2-transporterar ”offer” bibliotek i rumstemperatur. Inokulera en 125 mL för CSM-Leu-mötte media i en steril Erlenmeyerkolv helt tinade injektionsflaskan. Växer alla kulturer över natten vid 30 ° C under skakning på 200 rpm.
   Obs: OD₆₀₀ övernattande kulturer måste ligga mellan 1,0 till 1,5 innan du fortsätter till nästa steg.
3. Centrifugera 21 OD motsvarigheter till var och en av de PJ69-4A transformant kulturerna med en 5 min spin på 4.696 x g vid rumstemperatur. För varje 10 parning reaktioner önskas, pellet 39 OD₆₀₀ medel av den MATalpha stammen bär bibliotek plasmidsna i separata 50 mL koniska rör.
   1. Att resuspendera cellerna i 10 mL sterilt vatten och åter pellet i nya 50 mL koniska tube 4.696 x g 5 min i rumstemperatur i en bänkmonterade centrifug. Med pipett försiktigt avlägsna supernatanten utan att störa pelleterat cellerna.
   2. Återsuspendera pellets av PJ69-4A i 4 mL och PLY5725 celler i 10 mL av bYPDA (pH 3,7).
4. Set-up tillsätt parning reaktioner, 1 mL PJ69-4A omvandlas celler, 1 mL MATalpha bibliotek-innehållande celler och 1 mL bYPDA pH 3,7 till nya 50 mL koniska tube. Inkubera vid 30 ° C med mild orbital agitation (100-130 rpm) för 90 min.
   1. Centrifugera celler för 5 min på 4.696 x g, vid rumstemperatur i en bänkmonterade centrifug. Ta bort supernatanten med pipett och återsuspendera pelleten i 2 mL av 1:1 bYPDA:YPD. Tavla alla 2 mL på en 100 mm YPD tallrik med pipett och inkubera vid 30 ° C i ca 20 h.
5. Skörda celler från YPD plattorna med en cell skrapa rubba cellerna i 2-3 mL CSM-Leu-Trp media. Pipettera rubbas celler i en 50 mL konisk slang. Skölj plåtarna 4 - 5 gånger med 2-3 mL CSM-Leu-Trp media genom pipettering upp media använder en 1000 µL Pipettera och försiktigt mata ut media över YPD plattans yta.
   1. Centrifugera celler för 5 min vid 4.696 x g i rumstemperatur i en bänkmonterade centrifug. Kassera supernatanten med pipett och resuspendera cellerna i 40 mL CSM-Leu-Trp media genom pipettering upp och ner (gör inte vortex).
6. För att uppskatta antalet diploida celler bildas, späd 4 µL av diploida blandningen in 200 µL och 2000 µL CSM-Trp-Leu media. Tallrik 200 µL av varje utspädning på CSM-Leu-Trp plåt.
   Obs: De två plattorna representerar en 1:10,000 och 1:100,000 vik spädning av beståndet av frilevande skördas och ger en förväntad ~ 9000-27.000 kolonier på 1:10,000 utspädning plattan efter inkubation vid 30 ° C för 36-40 h. Kontrollera plattor efter steg 5,7. Ett minsta antal 200 kolonier på 1:10,000 utspädning plattan krävs att fortsätta till steg 5,8
7. Omedelbart ta resten av varje 40 mL cell resuspension och Inokulera en 1 000 mL Erlenmeyerkolv, innehållande 500 mL CSM-Leu-Trp media. Ta en inledande OD₆₀₀. Inkubera dessa kolvar vid 30 ° C med skakningar vid 180 rpm tills de når mättnad (~2.0 OD/mL). Det tar vanligtvis ca 36-40 h. övervaka tillväxt på 24 h sedan igen på 36 h av OD₆₀₀.
8. Med pipett, ta bort alikvoter 20 mL från var och en av de mättade 500 mL av kulturer och innoculate 2 000 mL Erlenmeyer-kolvar, en med 750 mL CSM-Leu-Trp media och de andra som innehåller 750 mL CSM-Leu-Trp-hans med den lägsta nivån av 3AT som eliminerar bakgrund (tidigare bestäms i avsnitt 4.5). Blanda de nya kulturerna (770 mL) väl genom omskakning och ta en inledande OD₆₀₀.
9. Inkubera kulturer vid 30 ° C under omskakning vid 180 rpm tills de når mättnad, vilket vanligtvis sker inom 24 h för den omarkerade CSM-Leu-Trp-kulturen och kan ta över 70 h för kulturer under markeringen för Y2H interaktioner.
10. När kulturer har nått mättnad (OD ~ 2.0), ta bort 11 mL med pipett, sediment cellerna med en 5 min spin på 4.696 x g rumstempererat, Kassera supernatanten med pipett och frysa vid-20 ° C eller Fortsätt på DNA-extraktion. Både kommer att markerade och omarkerade proverna användas för djupsekvensering.

6. provberedning för DEEPN djupa sekvensering

1. DNA-extraktion.
   1. Använd en pipett för att resuspendera cell pellets från protokollet avsnitt 5.7 i 500 µL av sTE buffert och överföring till ett 1,5 mL mikrocentrifug rör. Lägga till 3 µL av betamercaptoethanol och 10 µL Zymolase lager. Blanda väl och inkubera i 37 ° C inkubator för 24-36 h.
   2. Extrahera provet två gånger 500 µL fenol/kloroform/isopentanol medan du använder en rök hood¹⁶.
   3. Lägg till 7 µL av 4 M NaCl, 900 µL av iskall 100% etanol (ETOH), blanda genom inversion och antingen frys-20 ° C eller fortsätta till sediment DNA genom att snurra på 21,130 x g under 10 minuter vid rumstemperatur i en mikrocentrifug.
   4. Kassera supernatanten med pipett. Tvätta pelleten trefalt med 900 µL av 70% ETOH.
   5. Sediment pellet 21,130 x g i 2 min och ta bort resterande ETOH tvätta med pipett. Torra pellets för 7 min på 42 ° C.
   6. Återsuspendera pelleten i 120 µL 0,1 x ste i 37 ° C vattenbad för 90 min, svep rören för att blanda varje 30 min.
   7. Pipettera 60 µL av extraherat DNA i en steril 1,5 mL mikrocentrifug rör. Tillsätt 120 µL av sTE, 3,5 µL av RNase A lager, flick att blanda och inkubera vid 37 ° C i 1 h.
   8. Etanol fällningen som tidigare gjort i avsnitt 6.1.3 - 6.1.5, men använder 7 µL 5 M ammoniumacetat istället för 4 M NaCl.
   9. Återsuspendera RNase A-behandlade DNA i 55 µL 0,1 x ste i 37 ° C vattenbad för 90 min, svep rören för att blanda varje 30 min. kvantifiera DNA av absorbansen vid 260 nm på en spektrofotometer.
2. PCR-cDNA infogar.
   1. Utför två, 50 μl PCR-reaktioner per DNA-provet. Varje reaktion innehåller 25 pmol varje framåt och bakåt primer matchande byten-bibliotek plasmiden (se material). Reaktioner också innehåller 25 µL av HiFi-2 x PCR Master Mix, 5 µg av DNA-prov, och vatten upp till 50 µL. Amplify reaktioner för 25 cykler med förlängning gånger 3 min vid 72 ° C, en glödgningen temperatur 55 ° c i 30 s och denatureringen vid 98 ° C i 10 s. Precede Cykling en 30 s denaturering på 98 ° C och följ med en 5 minuters inkubation vid 72 ° C.
   2. Analysera 4 µL av varje PCR-reaktion av 1% DNA agaros gel-elektrofores med DNA Agarens gel innehållande 0,2 - 0,5 µg/mL EtBr¹⁷. Visualisera DNA-prov av UV-genomlysning. Prover kommer att visa ett utstryk av DNA runt 1-3 kb, där banding mönstret kan hittas för prover där en Y2H interaktion var utvalda (figur 6).
   3. Kombinera dubbla PCR prover och rena med hjälp av PCR-rening kit i enlighet med tillverkarens anvisningar och kvantifiera DNA av absorbansen vid 260 nm på en spektrofotometer.

7. djupsekvensering

Obs: Provberedning och sekvensering på en djupsekvensering plattform är vanligtvis tillgängliga i kommersiella och akademiska DNA sekvensering corefaciliteter.

1. Skjuvning 600 ng av PCR-produkten med hjälp av en högpresterande ultra-någon sonikator ge fragment av en genomsnittlig längd av ~ 300 bp.
2. Generera indexerade sekvensering bibliotek med en förberedelse för djupsekvensering som lägger till linkers kodning streckkoder, priming platser, och fånga sekvenser asymmetriskt på ändarna av de DNA-fragment.
3. Utföra bibliotek beredning enligt tillverkarens anvisningar. Pool indexerade bibliotek och sekvens som länge Parade-end läser på en djupsekvensering plattform (t.ex. 2 x 150 bp PE läsningar). Önskat antal läsningar måltavlan för varje prov är mellan 10 och 40 miljoner, med fler läser önskas för de omarkerade befolkningarna som är vanligtvis mer komplexa. Vi rekommenderar minst 20 miljoner eller fler läsningar för de omarkerade populationerna.

8. bioinformatiska bearbetning och kontroll

1. Processen DNA sekvensering data i form av fastq med en uppsättning fristående programvara program inbyggda mappa (1) sekvens läsa filer i ett universellt SAM format (2) kvantifiera gen anrikning mellan datauppsättningar (3) utföra statistisk analys av data i för att rangordna vilken kandidat gener är positiva för Y2H interaktion () 4) tillhandahålla information om vad regionerna och vilken translationell ram varje av de bytesdjur cDNA per gen fragment som ger positiva Y2H interaktioner består, och (5) verktyg för att rekonstruera inte bara de 5' utan även 3' ände samverkande fragment att låta sin återuppbyggnad och verifiering i en traditionell Y2H format. Driften av dessa program är detaljerad i medföljande studien.

Representative Results

Y2H analysen har använts för att hitta protein: protein interaktioner och flera anpassningar och system har utvecklats. För det mesta, är samma överväganden som säkerställer framgång med dessa tidigare synsätt viktiga för DEEPN. Några av de viktiga riktmärkena inkluderar: att säkerställa uttryck för DNA-bindande domän fusionsproteinerna, säkerställa en låg bakgrund av falska hans + tillväxt i de diploider som innehåller betet av intresse med en tom prey plasmid, en parning högeffektiv av betet som innehåller MATA jästen med de bibliotek som innehåller MATalpha jäst, och slutligen låg-stränghet villkor som gör att befolkningen att växa under förhållanden som väljer för många positiva Y2H reaktioner, även sådana som producerar låga nivåer av His3 verksamhet och en svag Y2H transkriptionell svar.

En av de kritiska aspekterna av DEEPN är att införa reproducibly Y2H biblioteket i stammar som innehåller olika bete plasmider och tillförlitligt välja dessa populationer för dessa bibliotek plasmider som skapar positiva Y2H interaktioner. Detta blir svårare när komplexiteten i Y2H biblioteket ökar eftersom det är svårare att säkerställa adekvat överföring av hela biblioteket över olika inledande populationer. Storleken på befolkningen som valt att växa under urval förhållanden och djup av sekvensering har dessutom vara tillräckligt stor för att observera reproducerbara ändringar i Y2H plasmid sammansättning att tillförlitligt identifiera sant positiva Y2H interaktioner. I tidigare studier har använt vi kommersiellt tillgängliga Y2H cDNA bibliotek. Vi hittade variabiliteten i Y2H bibliotek fördelning mellan de åtskilda populationer bär på samma bete plasmider är låg, med en overdispersion mellan de två inledande populationerna innan urval av < 0,01 vanligtvis och 0,35 - 0,55 för separat dessa populationer efter urval⁴. Komplexiteten i vissa av dessa kommersiellt tillgängliga Y2H bibliotek är dock ganska låg (figur 7). Dessutom är många av klonerna inom it (~ 60%) gjorda helt av cDNA fragment som är 3' av regionen kodning, vilket ytterligare begränsar deras användbarhet. För att påvisa att metoderna ovan kan ta emot mer komplexa Y2H bibliotek, vi skapade ett nytt Y2H bibliotek i strömlinjeformad 'offer' plasmid vektorn (pGal4AD) som innehåller fragment av genomisk DNA från Saccaromyces cerevisiae (stam PLY5725). Genomiskt DNA var splittrad efter klippning, storlek valts för spänner av 600-1500 bp, modifierad med adaptrar, och infogas i pGal4AD skapa SacCer_TAB Y2H biblioteket (figur 8). Biblioteket förvandlades till PLY5725, som producerade en jäst befolkning som parades sedan till separata prover av PJ69-4A MATA transporterar pTEF-GBD plasmiden ensam. Dubbla diploida populationer odlades under icke-selektiva och selektiva. Y2H plasmid bibliotek skären analyserades genom djupsekvensering. När mappas till genomiskt DNA som omfattar 100 bp uppströms och nedströms varje protein kodande regionen (84% av hela genomet), Vi hittade > 1,1 miljoner olika plasmider i biblioteket för en uppskattad total storlek på biblioteket i jäst av ~1.35 miljoner olika plasmider. Som en jämförelse vi också omvandlas en tidigare beskrivna jäst genomisk Y2H bibliotek¹¹ (PJ_C1, C2, C3 Y2H bibliotek) i MATalpha jäst och underkastas det samma analys som ovan. Vi fann att komplexiteten i vårt slumpmässiga fragment jäst Y2H bibliotek var betydligt högre och hade långt mer plasmider kodning i-frame fragment av varje gen än det tidigare publicerade biblioteket (figur 9). Generering av inledande bibliotek som innehåller diploida populationer var huvudsakligen, mycket reproducerbara med en overdispersion av < 0,01 (figur 10). Dessutom producerar reproducerbarheten för att ha två separata jäst befolkningarna liknande återdistribution av plasmider efter att välja för positiva Y2H interaktioner var mycket bra, ger en overdispersion 0,3. Således rymma metoderna här större Y2H bibliotek av högre komplexitet än de tidigare använt.

När det gäller ökar användarvänlighet DEEPN, föredrar vi att använda gen syntes för att göra infogar kodar för proteinet bete av intresse. Detta tillåter kodning regioner för protein domäner, chimärer och mutanter införlivas enkelt Y2H bete plasmider, men också tillåter deras kodon ska optimeras för uttryck i S. cerevisiae. Uttryck för två olika Gal4-DNA-bindande domänen fusionsproteinerna demonstreras i figur 3. Två olika jäst transformants uttrycker endera av två bete fusionsproteinerna preparerades och utsätts för SDS-PAGE och immunoblotting med anti myc-antikroppar. Observera uttrycksnivåerna för bete proteiner i förhållande till Gal4 DNA-bindande domänen ensam från Tom vektorn. Vi hittade att det är viktigt inte bara att kontrollera uttrycket av bete fusion proteinet, men också att verifiera uttryck i exakta MATA jästen transformant kolonin som används för att expandera och kompis till byten bibliotek som innehåller jäst. När en transformant har identifierats, är det möjligt att frysa den ned och lagra för senare användning.

Figur 4 visar en test för själv aktivering där en seriell utspädning av diploida celler är pläterade på CSM-Leu-Trp (+ hans), CSM-Trp-Leu-hans (-hans), och CSM-Trp-Leu-hans + 3AT (-hans + 3AT) plattor och tillåts växa vid 30 ° C i 3 dagar. Önskat resultat är att observera tillväxt i närvaro men inte avsaknad av histidin oavsett om det finns 3AT. Detta kommer att tillåta användning av CSM-Trp-Leu-hans att välja för jäst med en positiv jäst 2-hybrid interaktion. Om det är tillväxt på CSM-Leu-Trp-hans tallrikar, kan sedan ett Y2H urval fortfarande erhållas med hjälp av den lägsta koncentrationen av 3AT som förhindrar tillväxt. Vi finner att om tillväxten kan blockeras i CSM-Trp-Leu-hans + 0,1 mM 3AT, då DEEPN analysen kan gå vidare med detta villkor för att välja för Y2H interaktioner. Om hämning av tillväxten av diploider som innehåller pGal4AD eller andra tomma prey plasmid och pTEF-GBD-bete fusion plasmiden kräver dock högre koncentrationer av 3AT, kommer att det äventyra utförandet av förfarandet för DEEPN och en annan bete plasmid bör eftersträvas. Observera att hans + tillväxt är enda valet för en positiv Y2H interaktion. Vi har hittat är tillräckligt för att berika för Y2H interaktioner i batch.

En av de mest kritiska förfarandena i DEEPN arbetsflödet är att uppnå hög effektivitet parning av MATA jästen bär bete plasmiden med MATalpha jästen bär Y2H byte biblioteket. Vi fann att vissa stammar (t.ex. Y187)¹⁸, bostäder kommersiellt tillgängliga cDNA bibliotek, har relativt dålig parning effektivitet. Därför konstruerade vi en stam för att bära Y2H bibliotek. Denna stam är baserad på BY4742, ett derivat av S288c. Denna stam saknar GAL4, GAL80, TRP1, LEU2och HIS3. Den innehåller inga reportrar som är lyhörda för en hybrid Gal4 protein eller en annan hybrid (t.ex. LexA-VP16). Istället ligger källan till Y2H-inducerad His3 produktion inom MATA stammen som skulle bära särskilda bete Plasmiden. Detta förenklar systemet och tillåter större flexibilitet i att man kan använda samma bibliotek-innehållande MATalpha celler för att para sig med en stam som uttrycker en LexA-bete fusionsprotein och LexA(UAS) -HIS3 reporter eller ett Gal4-DBD-bete fusionsprotein och en Gal4 (UAS)-HIS3 reporter.

När de diploida populationer som transporterar både en AGN-plasmid och biblioteket genereras, de är utspädd och tillåts växa under förhållanden som bara väljer för båda plasmider (t.ex. CSM-Trp-Leu) eller för både plasmider och en positiv Y2H samverkan som driver produktionen av His3 (t.ex. CSM-Leu-Trp-hans). Det är viktigt att börja med en stor mängd börjar befolkningen att undvika en evolutionär 'flaskhals' som kan skeva befolkningen som resultat efter urval för en positiv Y2H interaktion. Vår procedur anger således med 20 mL av de 500 mL av diploida befolkningen kultur odlas i 750 mL färsk CSM-Leu-Trp-hans lagringsmedium för att undvika detta problem. Med pTEF-GBD som bete plasmiden fann vi att en enda runda för spädning och tillväxt var tillräcklig att utvecklas en informativ befolkning. Använda olika bete plasmider tidigare, vi använde två rundor av utspädning och tillväxt, en inledande 20 mL i 750 mL, och sedan 2 mL från det mättade kultur utspätt i 75 mL. Figur 6 visar resultaten från PCR-amplifiering över bibliotek skären för diploida befolkningen vuxit under icke-selektiva villkor, liksom en första och andra efterföljande runda utspädning och tillväxt i selektiv skick för två olika bete plasmider. Observera att med inget val, det finns en generaliserad utstryk av PCR-produkter vägledande av en komplex och relativt väl normaliserade blandning av fragment. Vid urval ändrar det mönstret, med vissa arter mycket berikande så att enskilda band kan urskiljas. Viss grad av banding är typisk för de framgångsrika experiment som utförs så långt, men ett utstryk mönster utöver eller i stället för en banding mönster, är ett tecken på en komplex blandning av bytesdjur skär och är önskvärt om man vill maximera antalet kandidater som upptäcker DEEPN. Mycket stark banding mönster, där de flesta av PCR-produkten finns i 1-3 band, visar att de flesta sekvensering data kommer att domineras av endast 1-3 byten infogar. Man kan kompensera för detta delvis genom ägnar mer läser från det här exemplet. Man kan se att om befolkningen är utspädd och vuxit ytterligare (se 'valda d2' i figur 5), banding mönstret är mer framträdande, som visar att byten plasmider som ger svag men autentiska Y2H interaktioner är minskar medan ett fåtal utvalda offer plasmider ökar deras överflöd. Successiv utspädning och tillväxt till denna överdriven nivå bedöms kontraproduktivt att målet att fånga det största antalet potentiella kandidater och således med protokollet här, rekommenderar vi en runda för spädning och tillväxt användas.

Figur 1: Schematisk av DEEPN arbetsflöde. Disponeras av laboratoriet procedurer visas till vänster tillsammans med den ungefärliga tid som behövs för att slutföra den motsvarande uppgiften. Till höger är bioinformatik arbetsflödet använder de DEEPN och Stat_Maker programvarupaket. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2: Schematisk av pTEF-GBD. Den TRP1-innehållande låg kopia Gal4 DNA-bindande domänen fusion protein uttryck plasmid visas. Här erbjuds en konstitutiv TEF1 promotorn, myc epitop tagg, Gal4 DNA bindande domänen följt en T7 RNA-polymeras bindningsställe, polylinker och PRM9 terminator inom en centromer (CEN)-baserat plasmid. Detta plasmiden bär också Kanamycin motstånd och den ColE1 bakterie-beskärningen av replikering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3: uttryck för Gal4-betet fusionsproteinerna. Lysates från jäst uttrycker olika bete proteiner smält till Gal4 DNA-bindande domänen uttryckt i pTEF-GBD utsattes för SDS-PAGE och immunoblotting med anti myc-antikroppar. pTEF-GBD uttrycker bara Gal4-DNA-bindng domänen ensam; pTEF-GBD-bait1 uttrycker domänen Gal4-DNA-bindng smält till en RhoA saknar sin C-terminal prenylation webbplats och bostäder en mutation låsa den till en GTP-bundna konformation; pTEF-GBD-bait2 uttrycker domänen Gal4-DNA-bindng smält till en RhoA saknar sin C-terminal prenylation webbplats och bostäder en mutation låsa den till en BNP-bundna konformation. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4: själv aktiveringen Test. Diploider från PJ69-4A bär de indikerade bete plasmidsna och PLY5725 celler bär angivna byte plasmiden var seriellt spädas och fläckig på CSM-Leu-Trp plåt, CSM-Leu-Trp-hans plattor och CSM-Leu-Trp-hans + 3AT plattor och odlas för 3 dagar på 30 ° C. De PJ69-4A transformants används för parning var först i varje par som visas i figur 3. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5: parning effektivitet av Y187 vs. PLY5725. Parning reaktionen mellan PJ69-4A som innehåller en TRP1-innehållande bete vektor- och Y187 eller PLY5725 redovisade prey plasmid utfördes. 1:10,000 utspädningar var klädd på CSM-Trp-Leu välja för diploider. Den PLY5725 stammen visar en parning verkningsgrad än den Y187 stammen med ~ 10 gånger fler kolonier produceras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 6: PCR av bytesdjur bibliotek vändskär. DNA var isolerad från diploida jäst som innehåller ett bytesdjur bibliotek som odlades under icke-selektiva förhållanden (CSM-Leu-Trp media) eller villkor att välja för en positiv Y2H samverkan (CSM-Leu-Trp-hans media). PCR över biblioteket infogar avslöjar skillnader i repertoaren av skär valt. Två rundor av selektiv tillväxt användes. Den första omgången av tillväxten gjort genom att späda ut 20 mL 500 ml diploida kultur i 750 mL av icke-selektiva CSM-Leu-Trp media och ytterligare 20 mL i 750 mL CSM-Leu-Trp-hans media för den första omgången av selektiv tillväxt (d1). Detta följdes av en ytterligare omgång tillväxt (d2) som tar 2 mL av d1 kultur och späda i 75 mL selektiva medier gjort CSM-Leu-Trp-hans. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 7: komplexiteten i Y2H cDNA bibliotek. Analys av innehållet i en kommersiellt tillgänglig mus cDNA Y2H byte bibliotek: ett bibliotek från cDNA mus hjärnan och en från flera mus vävnader. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 8: Generation av Y2H jäst genomisk fragment bibliotek. A. schematiskt beskriva montering av jäst genomisk fragment biblioteket i pGal4AD. Genomiskt DNA från stam PLY5725 var slumpmässigt klippt, sammanskrivna med de angivna Y-adaptrarna och sammanskrivna i SfiI-cut pGal4AD. Nering förvandlades till bakterier till kapacitet 2,2 x 10⁶ oberoende kolonier som var kombineras och odlas före isolering av sin plasmid DNA ska bestå SacCer_TAB Y2H biblioteket. B. den LEU2-innehållande plasmid (pGal4AD) bostäder i Gal4 transkriptionell aktiveringen domänen visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 9: komplexiteten i Y2H jäst genombibliotek. Den SacCer_TAB genombibliotek förvandlades till den PLY5725 MATalpha stammen och PJ_C1, C2, C3 jäst genombibliotek förvandlades till den Υ187 ΜΑΤalpha stammen. Diploider av dessa populationer har gjorts genom parning till PJY69-4A stam. Befolkningen har vuxit 10 generationer och prey fragment PCR amplifieras utsattes för storskalig sekvensering och analys. A. visar rangordning av läsningar per varje gen i Y2H biblioteken dividerat med läser per gen hittats av sekvensering jäst genomet. Med tanke på motsvarande överflöd av varje gen, skulle varje gen ha värdet 1. B. histogrammet visar antalet unika plasmider per genen som kodar för ett fragment som är både i proteinet kodande regionen (ORF) och i ramen korrekt translationell läsning. C. jämförelse av antalet olika plasmider i varje bibliotek som kodar jäst gener och andelen av dessa som är och inte är i korrekta translationell läsningen ramen eller infogas bakåt. D. Tomter visar positioner och överflöd av korsningar som mappas till exempel gener (VPS8 och VPS16) hittades för plasmidsna i varje bibliotek. Plasmider med genfusioner i ramen korrekt translationell läsning designeras blå. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 10: reproducerbarhet av DEEPN med komplexa Y2H jäst genombibliotek. A. fyra olika jäst diploida populationer har skapats genom parning med SacCer_TAB Y2H biblioteket inrymt i PLY5725, odlas under icke-selektiva förhållanden och sekvenserade. Läser per genen för varje befolkning individuellt ritas som en funktion av värdet genomsnittliga rangordning över alla populationer. B. visar läser per gen mellan två prover efter urval för positiva Y2H interaktioner. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Här tillhandahåller vi en guide för hur du utför Y2H analyser i batch med optimerade metoder. Det finns några kritiska steg i förfarandet för att säkerställa att befolkningen av jäst som skulle placeras under urvalet är representativt för start biblioteket och att nog av start jäst befolkningen för att genomgå urval för att begränsa variabilitet . Ännu viktigare, är dessa riktmärken relativt enkelt att uppnå tillsammans med anpassning av metoder och material för en traditionell Y2H analys, vilket gör denna metod tillgänglig för de flesta laboratorier som är utrustade för standard molekylärbiologi. DEEPN möjliggör urval från samma prey bibliotek befolkningen medan du använder olika bete plasmider. Uppsättningen samverkande kandidater som producerar en Y2H interaktion med en bete vs. en annan kan därför jämföras direkt. Eftersom djupsekvensering används, kan man kontrollera den starta bibliotek-sammansättningen för varje bete-specifika jäst befolkningen och följ anrikningen av varje kandidat prey gen i biblioteket självständigt. Batch-bearbetning kan fråga samma bibliotek mot olika beten på ett semikvantitativt sätt som sedan gör att man kan beräkna en statistisk ranking⁴.

I området i närheten finns det flera steg i detta protokoll som är avgörande för framgång. En är att ett stort antal diploider måste erhållas för att säkerställa tillräcklig representation av Y2H byte biblioteket blandas med varje bete plasmid sevärdheter. Parning proceduren som beskrivs här har optimerats genom att variera flera parametrar. Vi hittade att vissa stammar som hus kommersiella Y2H bibliotek mate dåligt i allmänhet, emellertid, parning proceduren som beskrivs här kan generera 2 x 10⁶- 2 x 10⁷ diploider när följs, så att adekvat och reproducerbara överföring av Y2H biblioteket till befolkningen. En annan viktig aspekt av förfarandet är att säkerställa att bete plasmiden sevärdheter inte skapar en positiv Y2H interaktion på egen hand eller med Tom Gal4 aktiveringen domän offer plasmid. Metoden för att välja en Y2H interaktion är krävande tillväxt i avsaknad av histidin vari en positiv Y2H interaktion inducerar transkription av HIS3 att låta celler vara hans +. Medan rutinmässigt de traditionella Y2H-analyserna kan lägga den kompetitiv hämmare 3AT för att minska bakgrunden tillväxt eller använda andra reportrar³ , detta förfarande fungerar bäst när celler med svag Y2H interaktioner kan växa och därmed öka striktheten för tillväxt och välja bara för celler med stark Y2H interaktioner gränser repertoaren av bytesdjur plasmider som kan identifieras. En annan viktig aspekt är att se till att en stor mängd start diploida befolkningen brukade växa selektiva och icke-selektiva villkor att undvika evolutionära flaskhalsar från provtagning fel⁴ . Efter kulturvolymer och cell nummer som anges här kommer att hjälpa säkerställa reproducerbarhet och minska buller.

En av anledningarna till den DEEPN metoden är kraftfulla är att det omfattande kan följa alla plasmidsna i ett visst byte bibliotek för sin förmåga att interagera med bete av intresse. Således är en av begränsningarna av DEEPN komplexiteten i biblioteket som används. För vissa av de kommersiella bibliotek som de som vi används här, fann vi att antalet plasmider som kodar för bona fide fragment av cDNA ORF som är i samma läsning ram av Gal4 aktivering domän är mellan 3-6 x 10⁴ med representation av ~ 6.000 - 8,00 0 olika gener. Vi fann att nästan 75% av dessa bibliotek innehöll fragment endast motsvarar cDNA regioner som var 3' av kodande DNA-sekvensen (CDS/ORF). Nästan en tredjedel av de gener som hade fragment i biblioteket hade dessutom ingen som motsvarade regioner i ORFEN eller uppströms av ORF.

Vi gjorde tre andra ändringar till metoden DEEPN. En är en ny MATalpha stam som kan bära 'offer' bibliotek inrymt i en TRP1 -plasmid och att kompisar som är långt bättre än vissa kommersiellt tillgängliga bibliotek-innehållande stammar såsom Y187. Detta säkerställer fullständig överföring av bibliotek befolkningen för varje bete av intresse. Vi gjorde också en ny 'bete' uttryck plasmid, som skiljer sig från tidigare beskrivna plasmider som använder en variabel kopia 2µ-baserade stamnät¹⁰. Här beskriver vi en låg-kopia CEN plasmid (pTEF-GBD) och upptäcker att en enda omgång med selektiv tillväxt är tillräcklig för att berika för samverkande prey plasmider. Slutligen, vi bygger en strömlinjeformad 'byte' bibliotek vektor och används för att producera en hög densitet random-fragment Y2H genombibliotek för Saccharomces cerevisiae, som bör vara till hjälp i framtiden för att upptäcka och karaktärisera interaktioner jämförelse jästen proteiner. Sammantaget gör förbättringar i material och bioinformatiska verktyg (som beskrivs i det medföljande arbetet) DEEPN närma en tillgänglig, genomförbara och effektiva sättet att utföra omfattande och jämförande Y2H skärmar.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Illumina HiSeq 4000	Illumina		deep sequencing platform
Monoclonal anti-HA antibodies	Biolegend	901514	Primary Antibody to detect expression of HA in pGal4AD constructs
Polyclonal anti-myc antibodies	QED Biosciences Inc	18826	Primary Antibody to detect expression of MYC in pTEF-GBD constructs
NarI	New England BioLabs	R0191S
EcoRI-HF	New England BioLabs	R3101S
BamHI-HF	New England BioLabs	R3236S
XhoI	New England BioLabs	R0146S
Polyethylene Glycol 3350, powder	J.T. Baker	U2211-08
Salmon Sperm DNA	Trevigen, Inc sold by Fisher Scientific	50-948-286	carrier DNA for yeast transformation section 3.2.1.
Kanamycin Monosulfate	Research Products International	K22000
LE Agarose	GeneMate	E-3120-500	used for making DNA agarose gels
Sodium Chloride	Research Products International	S23025
Tryptone	Research Products International	T60060
D-Sorbitol	Research Products International	S23080
Lithium Acetate Dihydrate	MP Biomedicals	155256
Calcium Chloride	ThermoFisher	C79
EDTA Sodium Salt	Research Products International	E57020
Yeast Extract Powder	Research Products International	Y20020
Yeast Nitrogen Base (ammonium sulfate) w/o amino acids	Research Products International	Y20040
CSM-Trp-Leu+40ADE	Formedium	DCS0789
CSM-Trp-Leu-His+40ADE	Formedium	DCS1169
CSM-Leu-Met	Formedium	DCS0549
CSM-Trp-Met	Bio 101, Inc	4520-922
L-Methionine	Formedium	DOC0168
Adenine	Research Products International	A11500
D-(+)-Glucose	Research Products International	G32045
Bacto Agar	BD	214010	used for making media plates in section 1
Peptone	Research Products International	P20240
3-amino-1,2,4 Triazole	Sigma	A8056
2-Mercaptoehanol (BME)	Sigma-Aldrich	M6250
Zymolyase 100T	USBiological	Z1004
Potassium phosphate dibasic	Sigma	P8281
Phenol:Chloroform:IAA	Ambion	AM9732
Ammonium Acetate	Sigma-Aldrich	238074
Ethanol	Decon Laboratories, INC	2716
RNAse A	ThermoFisher	EN0531
Urea	Research Products International	U20200
SDS	Research Products International	L22010
glycerol	Sigma Aldrich	G5516
Tris-HCl	Gibco	15506-017
bromophenol blue	Amresco	449
Gibson Assembly Cloning Kit	New England Biolabs	E5510S	Rapid assembly method for cloning of plasmids in section 2
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix	New England Biolabs	M0541S	Used for amplification of products for Gibson Assembly in Section 2.3 as well assample preparation for DEEPN deep sequencing in section 6.2.1
Ethidium Bromide	Amresco	0492-5G
QIAquick PCR purification kit	Qiagen	28104	Used for purification of pcr products in section 6.2.3
Qiaquick DNA Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	Used for purification of digested pTEF-GBD in section 2.1
KAPA Hyper Prep kit	KAPA Biosystems	KK8500	preparation kit for deep sequencing
Codon optimization	http://www.jcat.de
Codon optimization	https://www.idtdna.com/CodonOpt
gBlocks	Integrated DNA Technologies		DNA fragments used for cloning in Section 2.2
Strings	Thermofisher		DNA fragments used for cloning in Section 2.2
GenCatch Plasmid DNA mini-prep Kit	EPOCH Life Sciences		Used to prepare quantities of DNA in Section 2.3
Covaris E220	Covaris		high performance ultra-sonicator in section 7
oligo nucelotide 5’- CGGTCTT CAATTTCTCAAGTTTCAG -3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		used for pcr amplification and sequencing 5' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-GAGTAACG ACATTCCCAGTTGTTC-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		used for pcr amplification and sequencing 5' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-CACCGTAT TTCTGCCACCTCTTCC-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		used for pcr amplification and sequencing 3' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-GCAACCGC ACTATTTGGAGCGCTG-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		used for pcr amplification and sequencing 3' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligonucleotide 5’-GTTCCGATG CCTCTGCGAGTG-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		5' Pimer used for insert amplification of pGAL4AD
oligonucelotide 5’-GCACATGCT AGCGTCAAATACC-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		3' Pimer used for insert amplification of pGAL4AD
oligonucelotide 5’-ACCCAAGCA GTGGTATCAACG-3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		5' Pimer used for insert amplification of pGADT7
oligonucelotide 5’- TATTTAGA AGTGTCAACAACGTA -3’	Integrated DNA Technologies or Thermofisher		3' Pimer used for insert amplification of pGADT7
PJ69-4A MatA yeast strain	http://depts.washington.edu/yeastrc/ James P, Halladay J, Craig EA: Genomic Libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast. GENETICS 1996 144:1425-1436		MATA leu2-3,112 ura3-52 trp1-901 his3-200 gal4D, gal80D, GAL-ADE2 lys2::GAL1-HIS3 met2::GAL7
pTEF-GBD	Dr. Robert Piper Lab		Gal4-DNA binding doimain expression plasmid
pGal4AD (pPL6343)	Dr. Robert Piper Lab		Gal4-activation domain expression plasmid
100 mm petri dishes	Kord-Vallmark sold by VWR	2900
125 mL PYREX Erlenmeyer flask	Fisher Scientific	S63270
250 mL PYREX Erlenmeyer flask	Fisher Scientific	S63271
1,000 mL PYREX Erlenmeyer flask	Fisher Scientific	S63274
2,000 mL PYREX Erlenmeyer flask	Fisher Scientific	S63275
20 X 150 mm Disposable Culture Tube	Thermofisher	14-961-33
pipet-aid	Drummond	4-000-100
5 mL Serological Pipette	Denville	P7127
10 mL Serological Pipette	Denville	P7128
25 mL Serological Pipette	Denville	P7129
1,000 mL PYREX Griffin Beaker	Fisher Scientific	02-540P
1,000 mL PYREX Reuasable Media Storage Bottle	Fisher Scientific	06-414-1D
1,000 mL graduated cylinder	Fisher Scientific	08-572-6G
SpectraMax 190	Molecular Devices		used to measure the Optical Density of cells
NanoDrop 2000	Thermo Scientific	ND-2000	Spectrophotometer used to quantify amount of DNA
Electronic UV transilluminator	Ultra Lum	MEB 20	used to visualize DNA in an Ethidium Bromide agarose gel
P1000 Gilson PIPETMAN	Fisher Scientific	F123602G
P200 Gilson PIPETMAN	Fisher Scientific	F123601G
P20 Gilson PIPETMAN	Fisher Scientific	F123600G
P10 Gilson PIPETMAN	Fisher Scientific	F144802G
1250 µL Low Retention Pipette Tips	GeneMate	P-1236-1250
200 µLLow Retention Pipette Tips	VWR	10017-044
10 µL XL Low Retention Pipette Tips	VWR	10017-042
50 mL conical tube	VWR	490001-627
15 mL conical tube	VWR	490001-621
cell scraper	Denville Scientific	TC9310
1.5 mL Microcentrifuge tubes	USA Scientific	1615-5500
HCl	Fluka Analytical	318949-1L
NaOH	J.T. Baker	5674-02
Wooden applicators	Solon Care	55900
Eppendorf microcentrifuge 5424	Fisher Scientific	05-400-005	microcentrifuge
Sorvall ST16R	Thermo Fisher Scientific	75004381	benchtop centrifuge
Amersham ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey)	GE Healthcare	NA934-1ML	Secondary Antibody
Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep)	GE Healthcare	NA931-1ML	Secondary Antibody
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate	Thermo Fisher Scientific	34080	ECL detection solution
Isotemp Incubator	Thermo Fisher Scientific		Incubator
Mutitron 2	INFORS HT		Shaking incubator
Isotemp Digital-Control Water Bath Model 205	Fisher Scientific		water bath
Y2H mouse cDNA library in Y187 (pan tissue)	Clontech	630482	commercially available cDNA Library
Y2H mouse cDNA library in Y187 (mouse brain)	Clontech	630488	commercially available cDNA Library
pGADT7 AD Vector	Clontech	630442	commercially available AD Vector housing many cDNA libraries
pGBKT7 DNA-BD Vector	Clontech	630443	commercially available DNA-BD Vector
Biolase DNA Polymerase	Bioline	BIO-21042	DNA polymerase used for section 2.4
GeneMate GCL-60 Thermal Cycler	BioExpress	P-6050-60	pcr machine
TempAssure 0.5 mL PCR tubes	USA Scientific	1405-8100