Summary
نحن نقدم نموذجا تكون العظم قصبي الهاء ماوس تم تطويرها باستخدام distractor مصنوعة خصيصا. استخدام الماوس كهدف تحليل مفيد للنهوض بالبحوث.
Abstract
الهاء تكون العظم (DO) هو إجراء العمليات جراحية التي تنطوي على تجديد أنسجة الهيكل العظمى دون زرع الخلايا. نموذج هل يتألف من ثلاث مراحل: مرحلة الكمون بعد العظم، وإخضاع distractor الخارجية؛ وفي مرحلة الهاء، حيث نهايات العظام المنفصلة تدريجيا وباستمرار يصرف؛ ومرحلة التوطيد. هذا distractor مصنوعة خصيصا تستخدم للقيام تتألف من اثنين من حلقات ناقصة اﻷكريليك الراتنج والمسمار توسع. بدأ العملية صنع العفن مع سيليكون الانطباع بالمواد ومن ثم خلق distractor مصنوعة خصيصا. كان سكب الراتنج الأسنان في صندقة مصنوعة من مادة السيليكون الانطباع، وسمح لها بلمرة لإنشاء الخواتم ناقصة الراتنج المطلوبة ل distractor مصنوعة خصيصا. تم إصلاح هذه الحلقات مع المسمار توسع استخدام راتنج شفاف. وتعلق على الساق الفئران distractor مخصصة تم إنشاؤها عن طريق هذا النهج. الساق ثابتة للجهاز باستخدام زوج واحد من إبر ز 25 بروكسيمالي، زوج واحد من إبر ز 27 ديستالي، والاكريليك الراتنج. وبدأ الهاء بعد فترة كمون لمدة 5 أيام، بمعدل 0.2 مم/12 ساعة. إطالة قد استمر لمدة 8 أيام، أسفر عن فجوة إجمالي 3.2 مم. وقد ضحى الفئران 4 أسابيع بعد الهاء. وأكد تكوين العظام في فجوة الهاء استخدام التصوير الإشعاعي وعلم الأنسجة.
Introduction
الهاء تكون العظم (DO) أسلوب علاج المتبعة لمجموعة متنوعة من اضطرابات الهيكل العظمى، مثل اختلافات طول أطرافهم وتشوهات العظام وتقويم التشوهات1. تقوم هذه الاستراتيجية معالجة فريدة من نوعها على "مبدأ الإجهاد التوتر" اقترحها اليزاروف. الأسلوب يتطلب عدة أيام للكمون، عدة أسابيع لالهاء النشطة، وأشهر عدة لتوطيد حتى العظم ناضجة هو المشكلة2.
شروط التاكسج المحلية بسبب انسداد تدفق الدم3،4 و5،التحفيز الميكانيكي6 تكتسي أهمية خاصة في عملية الشفاء للقيام به. يحمل الأوعية الناجمة عن نقص الأوكسجين والمواد المغذية، والعوامل القابلة للذوبان والخلايا اللازمة لإصلاح الأنسجة محلياً من خلال تدفق الدم. التحفيز الميكانيكي بتمديد العملية يسبب تفاعلات بيولوجية مثل التمايز للخلايا الجذعية الوسيطة وتكوين العظام وتكلس ويعيد البناء. المسلسل العلاج يسمح تكوين الأنسجة الصلبة ليس فقط ولكن أيضا الأنسجة اللينة، بما في ذلك الأعصاب والعضلات والأوعية الدموية والأنسجة الجلد، دون الحاجة لزرع الخلايا الجذعية. ولذلك، يعتبر نموذجا تكون نموذجا ممتازا لتحليل تجديد الأنسجة المختلفة.
الأرانب والكلاب هي الحيوانات الأكثر استخداماً في البحوث الأساسية للقيام به؛ ومع ذلك، هناك عدد قليل من أدوات التحليل المتاحة لهذه الحيوانات. ويسهل استخدام نموذج الماوس تحليلاً أكثر تفصيلاً. أنها مناسبة بشكل خاص لتجارب باستخدام الفئران خروج المغلوب. ومع ذلك، عند استخدام ماوس كالحيوانات تجريبية، يجب إنشاء جهاز ملحق. هنا، نحن هذا نموذج ماوس قصبي تطويرها باستخدام distractor مخصصة تم إنشاؤها باستخدام أداة مختبر طب الأسنان والتقنية، التي استخدمت في دراسة سابقة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
جميع التجارب التي أجريت وفقا للبروتوكولات المعتمدة برعاية الحيوان واستخدام اللجنة لمؤسستنا. تعقيم كل الصكوك قبل الإجراء.
1. إعداد قالب لإنشاء Distractor مصنوعة خصيصا
- جعل اثنين حلقات ناقصة (القطر الخارجي، 20 مم؛ والقطر الداخلي، 10 ملم)، وجزء من distractor، مع ورقة واحدة من شمع البارافين (145 ملم × 74 ملم) باستخدام كارفر شمع إيفانز.
- جعل 4 القطع نفسه. استخدام ملعقة شمع ساخن مع موقد الغاز. المكدس الحلقات الأربع لسمك من 5 ملم. توفير مساحة لتوسيع المسمار والإبرة، 8 مم × 2 مم و 5 مم × 2 مم على التوالي مع كارفر الشمع إيفانز (الأرقام 1A، 1B).
- تضمين أنماط الشمع في مادة السيليكون الانطباع وإنشاء قالب الخواتم الراتنج (الشكل 1ج).
- وبعد علاج المواد الانطباع سيليكون (حوالي 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة)، إزالة أنماط الشمع.
2-إنتاج Distractor مصنوعة خصيصا
- تطبيق هلام البترول رقيقة وبشكل متساو للعفن سيليكون. ز 3 مزيج من راتنج البلمرة الأسنان وعلى الفور أنه صب في قالب سيليكون. تعيين لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
- إزالة الطوق مبلمرة الراتنج من العفن والبولندية مع شريط كربيد و micromotor أسنان لإزالة لدغ (حوالي 1 دقيقة). اثنين من حلقات راتنج مطلوبة من أجل كل distractor مصنوعة خصيصا.
- كرر الإجراء لإنشاء العدد المطلوب من الراتنج الخواتم (الشكل 1د).
- ترك فجوة حوالي 2 مم إصلاح الخواتم الراتنج ذات فائدة الشمع وتأمين خارج المسمار التوسع تماما مع الراتنج شفافة. تعيين الراتنج لمدة 5 دقائق في الرايت عند الانتهاء من البلمرة، إزالة مقبض المسمار التوسع (الشكل 1ﻫ).
3-العمليات الجراحية البروتوكول
- استخدام الفئران الذكور الأسبوع عمرها 8.
- حمل التخدير بحقنه داخل هيدروكلوريد ميديتوميديني في 0.3 مغ/ز، الميدازولام 4 مغ/كغ، وطرطرات بوتورفانول في 5 ملغ/كغ وزن الجسم.
- يحلق بعناية وتطهير المنطقة الجراحية بمحلول اليود 10%، ومن ثم، إدارة 0.5% ليدوكائين هيدروكلوريد في أطرافهم السفلية اليمنى.
- تجعل جلد طولية شق (حوالي 15 مم في الطول) في الحق خفض الساق مع مشرط رقم 15. صراحة فصل عضلات الكامنة، مع الحرص على عدم إزالة كافة السمحاق. الاقتراب من الخارج للوصول بسهولة إلى الشظية. قص الشظية مع المقص.
- أمسك الكاحل مع ملقط معقم رقيقة ضيقة، واستخدام إبرة معقمة ز 27 إلى أحداث فجوة في العظام حوالي 5 مم من الكعب. وينبغي أن تخترق الإبرة الجلد والعظام، والجلد بهذا الترتيب. عندما تخترق الإبرة، وقطع بنصيحة والجذر مع القراص حيث تكون الإبرة حوالي 15 ملم.
- جعل ثقب آخر بنفس الطريقة، حوالي 2 – 3 ملم الدانية. عقد حول الكاحل وتمرير اثنين 25 غ إبر تحت الركبة بنفس الطريقة. بعد اختراق الإبر، قص نصائح والجذور مع القراص (الشكل 1و).
- ضع distractor مصنوعة خصيصا مثل أنها موازية لاتجاه التمديد. إصلاح بالإبر والجهاز مع كافية بلمرة الراتنج الأسنان لسد أخاديد الجهاز. انتظر بلمرة لإكمال (حوالي 5 دقائق) (الشكل 1ز).
- أن الحرص على عدم الأضرار الأنسجة المحيطة بها. قطع منتصف diaphysis الساق باستخدام قرص قطع رقيقة جداً أثناء تطبيق من المحلول الملحي (1 – 2 مل).
- إغلاق الجرح بخياطة نايلون 4-0.
- تعطي الحقن تحت الجلد من البوبرينورفين (0.1 مغ/كغ) للتسكين فورا بعد العملية. مواصلة البوبرينورفين كل ح 12 عن طريق الجراحة اليوم 7 وحسب الحاجة بعد ذلك.
4-الهاء البروتوكول
ملاحظة: هناك تقارير مختلفة عن معدل الفترة والهاء الكمون، ولكن هنا، تظهر بروتوكولات تمثيلية.
- وبعد فترة كمون لمدة 5 أيام، تبدأ الهاء بمعدل 0.2 مم/12 ساعة. للتمديد، استخدام دبوس يعلق على المسمار التوسع السريع. نقل رقم pin في اتجاه السهم الأصفر يعلق على المسمار ملحق (الشكل 1ﻫ).
- التخدير ليس من الضروري خلال التمديد. اضغط الذيل بالإصبع الصغير والنخيل، وإصلاح جهاز ملحق بالسبابة والإبهام.
- تنفيذ ملحق (0.2 مم لدورة 1/4). مواصلة إطالة لمدة 8 أيام، مما سيؤدي إلى وجود فجوة إجمالي 3.2 مم.
5-تحليل
- تحليل التصوير الإشعاعي: بعد انتهاء تمديد، تقييم التجدد العظام مع التصوير المقطعي تحت التخدير العام باستخدام isoflurane 2.0 في المائة.
ملاحظة: إذا كان قد تم الحرص فيما يتعلق بموقف الجهاز التمديد، من الممكن تقييم مع التصوير الشعاعي البسيط حتى مع الجهاز المرفقة. - التحليل النسيجي: إزالة الجهاز بعناية حتى لا تتعرض لتسبب موقع الهاء كسر أثناء أخذ العينات. إصلاح العينة في 10% فورمالين مخزنة محايدة عن 24 ساعة عند درجة حرارة الغرفة. ديكالسيفي مع الحل الذي مورس (سترات الصوديوم 10%، 20% حمض الفورميك) بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الأرقام 1A و 1B يقدم حلقات غير مكتملة (الخارجي قطر، 20 مم الداخلية قطر، 10 مم؛ سمك، 5 ملم) مع شمع البارافين. نمطين من أنماط الشمع كانت جزءا لا يتجزأ من مادة السيليكون الانطباع، وشكلت قالب الخواتم الراتنج (الشكل 1ج). كان سكب الراتنج مبلمرة فورا في هذا القالب، وتم الحصول على خواتم الراتنج (الشكل 1د). تم إنشاؤه distractor مصنوعة خصيصا بالجمع بين اثنين من حلقات الراتنج وتوسيع المسمار (الشكل 1ﻫ). الشكل 2 A ويعرض نتائج التصوير الشعاعي نموذجية في 4 أسابيع بعد الهاء في النموذج. ولوحظ العظام المشكلة حديثا في موقع الهاء. ويعرض الشكل 2ب الهيماتوكسيلين وويوزين تلطيخ النتائج. لوحظ جسر عظم مشكلة حديثا، وعظم المشكلة حديثا يمكن تمييزها بسهولة من العظم الأصلي. لم يكن هناك كسر المضاعفات أو الإصابة بعد العملية الجراحية في الفئران 5 المستخدمة في هذه التجربة.
الشكل 1 : مصنوعة خصيصا distractor. (أ وب) الأبعاد التقريبية للحلقة كما يلي: القطر الخارجي، 20 مم؛ القطر الداخلي، 10 مم؛ سمك، 5 ملم. يتم تأمين مساحات للتوسع المسمار (السهم الأبيض) وابرة (السهم الأسود). (ج) نمط الشمع جزءا لا يتجزأ من مادة السيليكون الانطباع. (د) مكتمل الراتنج الخواتم. (ه) وهما راتنج خواتم والمسمار التوسع تم تأمينها بواسطة راتنج. (و) أربعة الإبر تندس في ميتافيسيس القريبة والبعيدة من الساق. (ز) وضع الجهاز الهاء في أطرافهم الماوس. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : نتائج الإشعاعية وغذائها. (أ) شعاعيا، هو لاحظ عظم المشكلة حديثا 4 أسابيع بعد الهاء. (ب) الأشيع، مليء الفجوة مع المشكلة حديثا العظام (شريط مقياس = 500 ميكرومتر). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
عندما يستخدم الحيوانات كبيرة كنموذج تجريبي، يمكن استخدام جهاز ملحق جاهزة، وأنه من السهل الحصول على التثبيت الجيد وتقييم عملية التمديد نفسها ومقدار التمديد. ومع ذلك، عندما يتم استخدام ماوس كنموذج تجريبي، من الضروري تطوير بعض أو جميع المعدات. إيسيفوكو et al. وتاي et al. الجهاز وإنشاء7،نموذجي8ماوس. كارفاهجو et al. واعتمدت أسلوب يشمل تثبيت جهاز توسيع الجاهزة (تعقب distractor: KLS مارتن) مع حرف مزدوج الأسلاك9. نحن يمكن أيضا إنشاء نموذج ماوس استخدام المنتجات الحالية لأجهزة الإرشاد ووضع أسلوب تثبيت. هذا النهج سوف تجعل من السهل تصنيع جهاز الإرشاد وتنفيذ التمديد وتقييم مبلغ التمديد. وعلاوة على ذلك، فمن المتوقع أن يمكن إنشاء نموذج قصبي عيب المجزأ باستخدام نفس الجهاز. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تعديل طول العيب في الخطوات من 0.2 مم، وهكذا، يعتبر الجهاز متعدد الاستخدامات.
في هذه تجربة، من الصعب من الناحية الفنية خيط الإبرة عن طريق الساق. على وجه الخصوص، قطر الجزء الأعلى من الساق صغيرة، وبعض التدريب مطلوب لتمرير الإبر اثنين. إذا لم يلاحظ العظام كافية، من الضروري للتحقق من ما إذا كان يتم الحصول على التثبيت جيد. من أجل الحصول على التثبيت جيدا، قد يكون من الأفضل لتمرير الإبر بزاوية، ومع وجود فجوة أوسع نطاق ممكن بين7،الإبر8. بالإضافة إلى ذلك، كما أن تغيير معدل الشفاء والأنسجة أثناء الشفاء وفقا لطريقة العظم، من الضروري القيام بهذا الإجراء بطريقة معينة.
ويمكن اعتبار حجم الحيوانات التجريبية عاملاً يحد من هذه التجربة. ليست هناك مشاكل عندما يكون الماوس الكبيرة؛ إذا كان صغير جداً، ومع ذلك، قد لا يكون ممكناً الجراحة نفسها. سابقا، ونحن استخدام فئران عمرها 4 الأسبوع وتمكنوا من القيام بتجارب دون أي مشاكل10. وفيما يتعلق بفترة التقييم، يمكن تركيب أجهزة الإرشاد دون مشاكل حتى 42 يوما بعد قطع العظام. كما إضافية لم تكن الملاحظات، إجراء بحوث إضافية غير ضرورية في المستقبل. قد يكون حدوث مضاعفات قضية عند النهوض بالتجارب. قد يحدث كسر أثناء الجراحة في حوالي 1 من أصل 30 الفئران. وبالمثل، قد تحدث عدوى الجرح بعد العملية الجراحية في حوالي 1 من أصل 30 الفئران.
وفي الختام، قدمنا نموذج ماوس الدانية تم تطويرها باستخدام distractor مصنوعة خصيصا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون السيدة ماكيكو كاتو لتوفير التشجيع لإكمال هذه الدراسة. ونشكر أيضا شعبة من الحيوانات التجريبية والبحوث الطبية الهندسية، ناغويا خريج كلية الطب في جامعة، للإسكان الفئران.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraffin wax | YAMAHACHI DENTAL MFG. CO. | - | For preparation a mold for resin rings |
| Labocone putty | GC Corporation | - | For preparation a mold for resin rings |
| Utility wax | GC Corporation | - | For preparation a mold for resin rings |
| Expansion screw | Ortho Dentaurum | 600-301-30 | Component of custom-made distractor |
| Unifast III | GC Corporation | - | Immediate polymerization resin Component of custom-made distractor |
| Ortho Crystal | NISSIN | - | Transparent resin Component of custom-made distractor |
| 25 G needle | TERUMO | NN-2516R | For custom-made distractor |
| 27 G needle | TERUMO | NN-2719S | For custom-made distractor |
| ICR mouse | Chubu Kagaku Shizai Corporation | - | Experimental animal |
| Somnopentyl | Kyoritsu Seiyaku | - | Pentobarbital sodium salt |
| Isoflurane | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 099-06571 | Isoflurane inhalation solution |
References
- Watson, J. T. Distraction osteogenesis. The Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons. 14, 168-174 (2006).
- Ilizarov, G. A. The tension-stress effect on the genesis and growth of tissues: Part II. The influence of the rate and frequency of distraction. Clinical Orthopaedics and Related Research. 239, 263-285 (1989).
- Wan, C., et al. Activation of the hypoxia-inducible factor-1 alpha pathway accelerates bone regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 686-691 (2008).
- Fujio, M., et al. Stromal cell-derived factor-1 enhances distraction osteogenesis-mediated skeletal tissue regeneration through the recruitment of endothelial precursors. Bone. 49 (4), 693-700 (2011).
- Tong, L., et al. Focal adhesion kinase expression during mandibular distraction osteogenesis: evidence for mechanotransduction. Plastic and reconstructive surgery. 111 (1), 211-222 (2003).
- Rhee, S. T., El-Bassiony, L., Buchman, S. R. Extracellular signal- related kinase and bone morphogenetic protein expression during distraction osteogenesis of the mandible: in vivo evidence of mechanotransduction mechanism for differentiation and osteogenesis by mesenchymal precursor cells. Plastic and reconstructive surgery. 117 (7), 2243-2249 (2006).
- Isefuku, S., Joyner, C. J., Simpson, A. H. A murine model of distraction osteogenesis. Bone. 27 (5), 661-665 (2000).
- Tay, B. K., Le, A. X., Gould, S. E., Helms, J. A. Histochemical and molecular analyses of distraction osteogenesis in a mouse model. Journal of Orthopaedic Research. 16 (5), 636-642 (1998).
- Carvalho, R. S., et al. The role of angiogenesis in a murine tibial model of distraction osteogenesis. Bone. 34 (5), 849-861 (2004).
- Osawa, Y., et al. Activated FGFR3 promotes bone formation via accelerating endochondral ossification in mouse model of distraction osteogenesis. Bone. 105, 42-49 (2017).
