Analyser la taille, la forme et la directionnalité des réseaux des Astrocytes induits

De nombreuses études ont décrit comment le dialogue neuron-astrocyte à un niveau subcellulaire ou synaptic peut avoir des implications dans les fonctions neuronales et la transmission synaptique. Il est bien établi que les astrocytes sont sensibles aux entourant l’activité neuronale ; en fait, ils ont des récepteurs de nombreux neurotransmetteurs dont glutamate, GABA, acétylcholine et ATP (voir commentaires déjà publiés,^2,3,4). En retour, astrocytaires traite les deux éléments synaptiques forte et influence l’activité neuronale là que sur les sites extrasynaptic par régulation de l’homéostasie ionique extracellulaire et libérant plusieurs facteurs ou émetteurs tels que le glutamate, la D-sérine et ATP ^{5 , 6 , 7}.

L’idée que les astrocytes peuvent également moduler fonction neuronale au niveau du réseau a vu le jour, avec la preuve que les astrocytes couplage est réglementée dans l’espace et correspond à une segmentation neuronale dans des zones caractérisées par une claire anatomiques cloisonnement (comme les zones avec des représentations sensorielles), indiquant que les astrocytes seront accoupler au autres astrocytes desservant la même fonction, plutôt que seulement ceux qui sont à proximité. Dans l’olive supérieure latérale, par exemple, réseaux plus astrocytaires sont orientées perpendiculairement à l' axe de tonotopique⁸, alors que dans les glomérules de cortex ou olfactoty de Canon, communication entre astrocytes est beaucoup plus forte au sein des barils ou des glomérules et le plus faible entre adjacentes ceux^9,10. Dans les deux cas, les réseaux astrocytaires sont orientés vers le Centre des glomérules ou tonneau^9,10.

Nous avons montré récemment qu’activité astrocytaires l'module tir neuronale en diminuant la concentration extracellulaire Ca^{2 +} ([Ca^{2 +}]_e), probablement par le biais de la sortie de S100β, un Ca^{2 +}-binding protein¹¹. Cet effet, qui a été démontré dans une population de neurones trigéminaux rhythmogenic dans la partie dorsale du trijumeau main sensorielle noyau (NVsnpr, semble jouer un rôle important dans la génération de mouvements masticatoires), provient du fait que rythmique tir dans ces neurones dépend un persistant Na⁺ actuel qui est favorisée par une diminution de [Ca^{2 +}]_e^11,,¹². Rythmique tir dans ces neurones peut être déclenché « physiologiquement » par stimulation de leurs intrants ou diminution artificielle du [Ca^{2 +}]_e. Encore, nous avons montré qu’il fallait astrocytaires couplage pour tir rythmique neuronale¹. Cela a soulevé la possibilité qu’astrocytaires réseaux peuvent se former des domaines fonctionnels circonscrits où l’activité neuronale peut être synchronisée et coordonnée. Pour évaluer cette hypothèse, il nous fallait tout d’abord élaborer une méthode pour rigoureusement documenter l’organisation de ces réseaux au sein de la NVsnpr.

Des études antérieures sur les réseaux astrocytes ont décrit surtout la mesure de couplage en termes de nombre de cellules, la densité et la zone couverte. Tentatives pour évaluer la forme de réseaux astrocytaires et la direction de colorant-accouplement ont été principalement réalisées en comparant la taille des réseaux le long des deux axes (x et y) dans le baril cortex⁹, hippocampe^{13,14, 15}, barreloid domaines du thalamus¹⁶, latérale supérieure olive⁸, glomérules olfactifs¹⁰et cortex¹⁴. Les méthodes décrites ici permettent impartiaux chefs de cellules marquées dans un réseau et une estimation de la superficie qu’ils couvrent. Nous avons développé également des outils pour définir l’orientation préférentielle de couplage au sein d’un réseau et d’évaluer si l’orientation préférentielle est vers le centre du noyau ou dans une autre direction. En comparaison avec les méthodes précédemment utilisées, ce protocole prévoit un moyen de décrire l’organisation et l’orientation des réseaux astrocytaires dans des structures comme le noyau dorsal de sensoriel principal du trijumeau qui n’ont pas un connu clairement anatomique compartimentation. Dans les études susmentionnées, l’orientation du réseau est décrite comme une relation à la forme de la structure elle-même, qui est déjà documentée (par exemple., la barreloid dans le thalamus, barils dans le cortex, couches dans l’hippocampe et le cortex, le glomérules dans le bulbe olfactif, etc.). En outre, l’analyse vectorielle permet pour les comparaisons des orientations révélées dans différentes conditions de couplage. Pour analyser si ces paramètres changés selon la position du réseau au sein du noyau, nous avons aussi développé une méthode pour remplacer chaque réseau en ce qui concerne les limites du noyau. Ces outils peuvent être facilement adaptés à d’autres domaines pour les réseaux d’instruction des cellules couplées.

Toutes les procédures demeure par les règles d’instituts de recherche en santé du Canada et ont été approuvés par le Comité de l’utilisation et de soins aux animaux de l’Université de Montréal.

1. préparation des coupes de cerveau de Rat

1. Préparer 1 L d’une solution de saccharose (tableau 1) et 1 L de liquide standard de cérébral-moelle artificiel (FSCA) (tableau 2).
2. Bulle la solution saccharose avec un mélange de 95 % d’O₂ et 5 % CO₂ (carbogen) pendant 30 min avant de le placer à-80 ° C pendant environ 30 min, jusqu'à ce que la solution est froid mais pas entièrement gelé. Utiliser cette saccharose glacée comme le tampon de coupe pour le découpage du cerveau. Gardez-le sur la glace une fois qu’il est retiré du congélateur.
3. Bulle le FSCA avec carbogen par le biais de l’expérience entière. Utilisez cette solution pour le stockage de la tranche et le tampon de perfusion dans lequel le serrage patch et la biocytine-remplissage des astrocytes seront effectuées. Préparer une reprise de tranche maintenant Chambre de déposer les tranches de cerveau dès qu’ils sont coupés.
   Remarque : La chambre de holding de reprise tranche pourrait être fait sur commande et se compose essentiellement d’un petit puits avec un maillage en bas suspendu dans un endroit bien plus grand qui est rempli de FSCA, dans lequel un tube est inséré pour amener des carbogen du bas.
4. Utiliser des rats Sprague-Dawley âgée de 15 à 21 jours sans aucune partialité de sexe ou de souche. Anesthésier l’animal à l’isoflurane (1 mL d’isoflurane dans une chambre d’induction de l’anesthésie). Vérifier la profondeur de l’anesthésie en pinçant doucement la patte arrière ou la queue de l’animal.
5. Décapiter le rat à l’aide d’une guillotine, couper son crâne avec des ciseaux et rapidement enlever le cerveau du crâne avec une spatule plate.
6. Tremper le cerveau dans la solution de sucrose glacée pour 30 s et transfert il (avec la solution) à un petri dish. Avec une lame de rasoir, enlever les parties qui sont antérieures et postérieures à la zone à être sectionnées, si les tranches de coupe dans le plan transversal.
7. Coller le bloc restant du tissu cérébral sur son côté rostral et continuez de couper des tranches de cerveau (350 µm d’épaisseur) dans le milieu à base de saccharose à l’aide d’un vibratome. Ensuite, transférer les tranches recueillis dans une reprise tenant chambre remplie de FSCA carbogenated à température ambiante (RT) jusqu'à ce qu’ils sont prêts à être utilisés (laisser au moins 1 heure pour la récupération).
   Remarque : Les développements récents dans le domaine permettent une incubation prolongée jusqu'à 24h de tranches de cerveau in vitro les conditions¹⁷.

2. la Sulforhodamine 101 (SR-101), étiquetage des Astrocytes

1. Préchauffer un bain d’eau à 34 ° C et placez les deux chambres de tranche d’incubation dedans. Remplissez une des chambres d’incubation tranche avec une solution de FSCA contenant 1 μM SR-101 et remplir l’autre seulement avec fsca.
2. Incuber les tranches dans la chambre d’incubation contenant le 1µm SR-101 pendant 20 min et puis transfert dans l’incubation deuxième chambre pour rincer les excès SR-101 du tissu. Laisser incuber pendant 20 min ou plus à 34 ° C, puis garder la chambre d’incubation contenant les tranches à la droite, jusqu'à ce qu’ils soient nécessaire¹⁸.

3. astrocyte patcher et remplissage de la biocytine

1. Sélectionnez une tranche et placez-le dans la chambre d’enregistrement du microscope. Patch des astrocytes, utilisez les électrodes avec une résistance de 4-6MΩ lorsque rempli d’une solution à base de gluconate de potassium (voir tableau 3).
2. Sous guidage visuel et à l’aide d’un micromanipulateur, diriger l’électrode d’enregistrement vers un astrocyte SR-101-étiqueté comme illustré à la Figure 1. Évitez les cellules situées à la surface de la tranche, car ils sont plus susceptibles d’être endommagés ou qui ont perdu des connexions vers les cellules voisines.
3. Pour éviter les fuites de la biocytine dans les tissus, réduire au minimum la pression positive, ajoutée à la pipette et appliquez-le uniquement lorsqu’il est à proximité de l’astrocyte qui sera patché (0,1 à 0,4 mL dans une seringue de 1 mL).
4. Avant l’application de correctifs, régler le décalage de la pipette et de sa capacité. Corriger des potentiels de jonction liquide, que les commandes de tension exactes et précises sont essentielles pour les expériences¹⁹.
5. Déplacer la pipette assez proche de l’astrocyte d’observer la dépression causée par la pression positive. Ensuite, enlever la pression positive et lentement s’appliquent une pression négative. Fixez l’astrocyte à -70 mV Lorsque le sceau atteint 100 MΩ. Attendez que le phoque atteint 1-3 GΩ. Continuer à appliquer une pression négative jusqu'à la rupture dans la cellule. Soyez prudent tout en appliquant une pression négative, étant donné que les astrocytes sont très fragiles.
6. Évaluer les propriétés électrophysiologiques de la cellule patchée. En mode voltage clamp, exécute un protocole courant-tension de cellules entières avec une commande de tension de rampe de 600 ms durée allant de -120 à + 110 mV. Mode de courant-clamp, exécute un protocole étape IV dans laquelle l’injection de 1000 ms pas actuel de 100 pA de -1 à 1 nA, le taux d’échantillonnage des enregistrements cellule entière est 10kHz.
   Remarque : Les Astrocytes montrent un profil de courant-tension linéaire sans aucune sorte de rectification (tel qu’illustré dans la Figure 1 b) et aucun potentiel d’action de tir à la dépolarisation de la membrane (Figure 1). Le potentiel membranaire de repos (RMP) doit être stable et pas positive à - 60mV. Dans certaines régions du cerveau, le RMP des astrocytes est plus hyperpolarisé que dans le NVsnpr.
7. Permettre à la biocytine diffuser au sein de l’astrocyte pendant 30 min, tout en effectuant une étape Protocole IV toutes les 5 min.
8. Rétracter et détacher la pipette avec soin sans endommager l’astrocyte patché et immédiatement prendre note de l’offset de la pipette avant de sortir de la chambre d’enregistrement. Soustraire cette valeur à partir des enregistrements de potentiel de membrane.
9. Quitter la tranche de cerveau se reposer dans la chambre d’enregistrement pendant au moins 15 min (en plus des 30 minutes pour injection) afin de permettre la diffusion du traceur de l’astrocyte raccordé à tout le réseau de cellules couplées.
   Remarque : Pour révéler un réseau de cellules couplées, seulement une seule cellule devrait être corrigée dans le noyau d’intérêt. Si plusieurs tentatives sont nécessaires afin d’atteindre un patch réussi, jeter le cas et essayer de patch sur le côté controlatéral ou dans une autre tranche de cerveau.
10. Faire une marque ou une incision dans le tissu afin d’identifier de quel côté de la tranche est vers le haut et transférer la tranche tout d’abord dans une boîte de Pétri contenant FSCA normal, puis dans une solution de paraformaldéhyde à 4 % (PFA). Incubez la tranche à 4 ° C durant la nuit.
    ATTENTION : PFA est extrêmement dangereux. Utiliser un équipement de protection sous une hotte ventilée. S’assurer que tout matériel (pinceaux, tubes, etc.) qui ont été en contact avec l’IFP ne contact pas la récupération tenant chambre, chambre d’incubation ou autres matériaux utilisés pour le tissu frais d’enregistrement.

4. révélation de la biocytine

1. Révélation avec la streptavidine fluorescent
   1. Laver le cerveau tranches 2 x 10 min au salin de tampon phosphate 0,1 M (PBS) à température ambiante. Puis, révèlent la biocytine en incubant les tranches de cerveau avec la streptavidine conjuguée à un fluorophore à dilution de 1/200 en PBS avec un détergent non ionique 4 % pendant 4 heures à température ambiante.
   2. Laver les tranches de cerveau 3 x 10 min dans du PBS de 0,1 M à la droite et montez les sections sur les lames de verre à l’aide d’un support de montage aqueux. Placez les côtés qui ont été injectées vers le haut, lamelle couvre-objet les diapositives et les sceller avec du vernis à ongles.
2. Révélation avec DAB
   Remarque : Révélation DAB (3,3-diaminobenzidine) peut être utilisée lorsque la fluorescence ne peut pas être utilisé. Dans ce cas, méthode qu’une révélation devrait être utilisée pour faire des comparaisons.
   1. Laver les tranches de cerveau 3 x 10 min dans du PBS à température ambiante. Incuber les tranches en PBS + H₂O₂ 0,5 % pendant 1 heure à température ambiante.
   2. Rincer les tranches de 3 x 10 min dans du PBS à température ambiante. Puis, incuber les tranches dans une solution de coloration complexe avidine-biotine composé de PBS et 0,1 % de détergent non ionique + avidine-biotine peroxydase complexe standard coloration réactifs du kit au 1/100 pendant 24 heures à température ambiante.
   3. Rincer les tranches de 3 x 10 min dans du PBS à ta, leur incubation dans une solution de PBS + DAB 0.05 % pendant 20 min à ta et transférer dans une solution de PBS + DAB 0,05 % + H₂O₂ 0,5 %.
      ATTENTION : DAB est extrêmement dangereux. Utiliser un équipement de protection sous une hotte ventilée. La réaction de la couleur s’arrête quand les tranches sont transférés dans du PBS.
   4. Rincer les tranches de 5 x 10 min dans du PBS à la droite, montez les sections sur lames de verre (relever les côtés qui ont été injectées vers le haut) et les laisser sécher sur une lame de séchage audience du jour au lendemain à 34 ° C.
   5. Plonger les lames de verre pendant 1 min dans plusieurs bains d’alcool à 70 %, 95 % et 100 % et fin avec un bain de xylène pendant 1 min.
   6. Monter les lames de verre à l’aide d’une résine synthétique axée sur le toluène, milieu de montage. Placer les lamelles sur les diapositives et les sceller avec du vernis à ongles.

5. réseau d’imagerie

1. Visualiser les astrocytes réseaux à l’aide d’un microscope à balayage confocal équipé de 20 X et 4 X objectifs (ou un objectif approprié pour visualiser le noyau entier où se trouve le réseau) et un laser pour détecter le fluorophore (dans ce cas, Alexa-594 est utilisé).
2. Utilisez le grossissement X 20 pour faire une pile z du réseau de cellules marquées. Utilisez une résolution de 800 x 800 pixels et vitesse de 12,5 μs/pixel de numérisation.
   Remarque : Pour l’ensemble du réseau de l’image, les piles multiples sont habituellement exigées, et le nombre de piles doit être ajustée pour chaque réseau. La vitesse de résolution et de balayage peut être modifiée, mais assurez vous d’utiliser les mêmes paramètres pour toutes les données d’image.
3. Le grossissement de X 4 permet de prendre des images de la région d’intérêt et de réseau.
   Remarque : Le 4 X de l’imagerie est utilisée pour déterminer la position du réseau dans le noyau d’intérêt. L’image toujours le même champ en lumière transmise. Cette image sera utile si vous ne pouvez pas déterminer la frontière du noyau dans l’image confocale fluorescent.

6. image Analysis

1. Préparation des données
   1. Utiliser le logiciel ImageJFIJI (Téléchargez-le à https://fiji.sc/). Ouvrez le fichier, puis cliquez sur OK dans la fenêtre « Options d’importation de Bio-Formats ».
   2. Pour redéfinir une z-pile qui contiendra uniquement les tranches optiques nécessaires pour la finale z-pile (Figure 2 a), cliquez sur le bouton « Pile » dans la barre d’outils (pour trouver, commencez par sélectionner stk | Projet de Z). Sélectionnez « Intensité Max » dans le paramètre du type projection (Figure 2 a). Enregistrez le fichier et nommez-le « empiler file ».
   3. Si le fichier image contient plusieurs canaux, diviser pour conserver uniquement le canal avec l’imagerie du réseau astrocytaires (Image | Couleur | Fractionner des chaînes).
   4. Vérifiez les paramètres de pixel de l’image [Image | Propriétés | Pixel (avec « 1 » pour la dimension en pixels)].
   5. Utilisez l’outil de fond subtract (processus | Soustraire le fond) pour supprimer le fond de la biocytine étiquetage. Utilisez la fonction de prévisualisation pour définir le rayon roulement de la balle, qui est généralement fixé à 50 pixels (Figure 2 b).
   6. Utilisez l’outil de suppression des valeurs aberrantes (processus | Bruit | Supprimer les valeurs aberrantes) si elle est exigée par suite de l’étape de fond de soustraction. Sélectionnez « Bright » dans le cadre de « Valeurs aberrantes qui » (Figure 2). Utilisez la fonction de prévisualisation pour définir le rayon et le seuil. Soyez prudent avec cet outil, car il peut brouiller les données, comme illustré à la Figure 2D.
      Remarque : Cet outil supprime les petites taches causées par des dépôts non spécifiques de streptavidine (comme indiqué par les flèches blanches dans la Figure 2 b et 2C avant et après traitement, respectivement).
   7. Régler le seuil (Image | Ajuster | (Seuil). Sélectionnez le mode « Default » et « B & W » (Figure 2E). Cliquez sur « Appliquer ».
      Remarque : Réglage automatique peut être utilisé, mais un réglage manuel avec les deux barres de glisseur est préférable. Cette étape vise à réduire le bruit au maximum sans perdre les cellules marquées.
   8. Convertir l’image en une image binaire avec l’outil binaire de processus (processus | Binaire | Rendre le fichier binaire) comme illustré à la Figure 2F. Enregistrez le fichier sous un fichier TIFF et nommez-le « fichier binaire ».
2. Cellule de comptage
   1. Vérifiez le réglage de la fonction de mesure (Analyze | Set de mesure). Sélectionnez l’option « Centre de gravité ».
   2. Utiliser l’outil « Analyser les particules » sur le fichier « binaire » (Figure 3 a) produites à l’étape précédente (Analyze | Analyser les particules) (Figure 3 sur la gauche). Sélectionnez « Contours » dans le cadre de « Show » (Figure 3). Cela génère un nouveau fichier qui montre le résultat de la détection (Figure 3 b).
   3. Jouer avec les paramètres : taille (pour détecter uniquement les cellules, utilisez des valeurs comprises entre 30 et 6000) et circularité (afin de déterminer un intervalle entre 0 à 1, dans laquelle « 1 » définit un cercle parfait et « 0 » une forme aléatoire) pour affiner la détection (Figure 3, partie à gauche). Exécuter la détection en cliquant sur « OK ».
      Remarque : Les deux tables seront affiche suite à la détection : 1) un tableau intitulé « Sommaire » qui fournit le nombre de cellules détectées et 2) une table intitulée « Résultats » (Figure 3, partie droite) qui fournit les coordonnées x et y de chaque cellule.
   4. Copier les valeurs et les coller dans un tableur. Enregistrer cette table sous la table de noms « détection ». Un fichier avec un terrain de cellules détectées apparaît (Figure 3 b). Enregistrez ce fichier au format TIFF dans le fichier de nom « détection ».
   5. Si un groupe de cellules de 2 ou plus marquées dans le réseau est détecté comme une seule cellule avec l’outil d’analyse des particules parce qu’ils sont trop près les uns aux autres, utilisez l’outil de bassin versant (processus | Binaire | Bassin hydrographique) sur l’image binaire avant d’appliquer l’analyse des particules outil, puis refaire les étapes de particules analyze.
      Remarque : L’outil du bassin crée une délimitation de 1 pixel de large entre les cellules extrêmement étroites. Un plug-in peut de cellule compteur être utilisé lorsque l’étiquetage est sans équivoque et peut être effectuée manuellement.
3. Zone de mesurage réseau astrocytaires
   1. Pour mesurer la superficie des réseaux, utilisez le fichier de détection à l’aide d’Image J.
   2. Utilisez l’outil de sélection polygone (clic gauche sur le bouton dans la barre d’outils pour le sélectionner) pour trace un polygone qui relie toutes les cellules situé dans la périphérie externe du réseau (Figure 4 a). Faites un clic gauche pour commencer à tracer le polygone et faites un clic droit pour le fermer.
      Remarque : Ce polygone sera définie comme une région d’intérêt (ROI) et sa surface sera mesurée pour déterminer la superficie du réseau.
   3. Ouvrez la fenêtre de mesure réglée (Analyze | Set de mesure) et sélectionnez l’option « Espace ». Ouvrez le gestionnaire de ROI (analyser | Outils | Gestionnaire de ROI) (Figure 4 b). Ensuite, ajoutez le polygone tracé dans le gestionnaire de ROI en cliquant sur '' ajouter '' (Figure 4 b) et exécuter la mesure en cliquant sur '' mesure '' dans le gestionnaire de ROI.
      Remarque : La mesure de la zone apparaîtra dans une table et être exprimée en pixels. N’oubliez pas de convertir cette valeur avec le facteur de conversion pour le microscope permet d’obtenir une valeur en μm².
4. Détermination du vecteur direction principale
   1. Détermination de la cellule patchée
      1. Ouvrez le fichier de pile dans ImageJFIJI et identifier la cellule patchée dans le fichier de pile basée sur sa plus forte intensité étiquetage (Figure 4). Ensuite, ouvrez le fichier nommé « tableau de détection » dans un tableur et trouver le numéro de port associé à la cellule patchée et ses coordonnées correspondantes.
      2. S’il est impossible de déterminer avec exactitude la cellule patchée, entourent la zone où le dépôt de la biocytine est plus dense dans le réseau imagé des cellules couplées, à l’aide de l’outil Polygone dans ImageJFIJI, et se référer à ce poste que celui de la cellule patchée (Figure 4).
      3. Utilisez le gestionnaire de ROI (analyser | Outils | Gestionnaire de retour sur investissement). Ensuite, tirer un retour sur investissement dans cet emplacement de cellule patché et ajoutez-le au gestionnaire de retour sur investissement (voir Figure 4 b).
      4. La valeur d’une mesure (Analyze | Set de mesure) et sélectionnez l’option « Centre de gravité ».
      5. Dans le gestionnaire de ROI, cliquez sur « Mesure » pour obtenir les coordonnées du centroïde de la zone tracée. Utiliser ces coordonnées comme point de référence pour ce réseau spécifique.
   2. Traduction référentielle
      1. Calculer les coordonnées de chaque cellule en référence à l’astrocyte raccordé à l’aide de la formule suivante :
          
         Avec : comme les coordonnées pour une cellule donnée ; comme les coordonnées de la cellule patchée (ou le point référentiel du réseau) ; et comme les coordonnées pour une cellule donnée dans le nouveau référentielle.
         Note : Exprimer les coordonnées de chaque cellule en référence à l’astrocyte patché est une étape importante dans le calcul des vecteurs de l’astrocyte patché. Soyez prudent lorsque vous utilisez ImageJFIJI que le référentiel pour n’importe quelle image se trouve dans le coin supérieur gauche de l’image.
   3. Détermination du vecteur principal d’orientation préférentielle
      1. Calculer les coordonnées du vecteur principal d’orientation préférentielle avec la formule suivante :
         
         Avec : () comme les coordonnées du vecteur principal d’orientation préférentielle ; et comme les coordonnées de chaque cellule du réseau obtenu avec la tache cellulaire comme référentiel.
         Remarque : Pour chaque cellule dans le réseau, un vecteur est déterminé relatif aux coordonnées de l’astrocyte patché. Le principal vecteur d’une orientation préférentielle du réseau est la somme de tous ces vecteurs.
      2. Diviser la longueur du vecteur principal (fourni par les coordonnées obtenues à l’aide de la formule ci-dessus) par le nombre de cellules dans le réseau moins 1 (puisque les coordonnées de la cellule patchée ne sont pas incluses), à normaliser les valeurs et permettent des comparaisons entre réseaux. Une vue schématique de cette analyse est présentée à la Figure 5.
5. Mise en place de réseaux analysés dans le noyau d’intérêt
   1. Alignement de la 20 X et 4 X photos
      1. Pour déterminer la position de chaque réseau dans le noyau d’intérêt (NVsnpr), utilisez l’image de X 4. Ouvrez l’image de X 4 avec un éditeur d’images vectorielles.
      2. Sélectionnez l’image de X 4 et modifier sa taille en le multipliant par 5. La fenêtre de dimension est située dans la partie droite de la barre d’outils horizontale supérieure. Par exemple, une image 4 X a été échantillonnée à 800 x 800 pixels, changer la résolution d’échantillonnage à 4000 x 4000 pixels (pour définir l’unité de travail en pixels, allez dans « Document Setup » sous l’onglet Fichier : fichier | Format de document). Exportez le fichier au format TIFF et nom il « redimensionné 4 X ».
      3. Aligner le coin supérieur gauche de l’image avec le coin inférieur gauche du document Adobe Illustrator.
         Remarque : Le logiciel fournit les coordonnées d’un point référentielle du coin inférieur gauche.
      4. Ouvrez l’image de X 20 du réseau. Utiliser le '' fichier binaire '' ou '' détection '' parce qu’ils sont plus faciles à aligner. Ensuite, jouer avec l’outil d’opacité sur le '' fichier binaire '' de l’image de X 20 pour l’aligner avec le re-taille 4 X image.
         Remarque : L’outil de l’opacité est dans la barre d’outils horizontale supérieure.
      5. Lorsque l’alignement est, sélectionnez et maintenez l’outil pipette pour l’outil de mesure s’affiche et le sélectionner dans la barre d’outils de gauche.
      6. Utilisation de l’outil de mesure de cliquer sur le coin supérieur gauche de l’image de X 20 pour obtenir les coordonnées de la 20 X référentielle pointer sur le redimensionnée 4 X image.
         Remarque : Ces coordonnées, qui sont appelées les 20 X référentielle (20XR dans la Figure 5), sera utile pour exprimer la position de chaque réseau sur un schéma du noyau.
   2. Normalisation du noyau d’intérêt
      Remarque : Pour résumer les données, une normalisation du noyau (NVsnpr) sous forme de rectangle est utilisée. Les étapes sont décrites ci-dessous.
      1. Ouvrir les 4 fichier redimensionné dans ImageJFIJI et utiliser l’outil Polygone pour entourer le noyau (NVsnpr). Utiliser l’image avec la lumière transmise si les frontières du noyau ne sont pas en mesure d’être vu ; dans ce cas, n’oubliez pas de redimensionner tout d’abord.
      2. Ouvrez le gestionnaire de ROI et ajouter le ROI dessiné. Dans « Mesure de la valeur », sélectionnez l’option '' Bounding Rectangle''.
         Remarque : L’option « Bounding Rectangle » calcule le plus petit rectangle autour du noyau dessiné.
      3. Cliquez sur « Mesure ».
         Remarque : Un tableau s’affiche avec la BX et BY, les coordonnées de l’angle supérieur gauche du rectangle : '' Rectangle Position'' et fournit la largeur et la hauteur. BX et BY sont les coordonnées du rectangle englobant référentielle qui sont appelées et .
   3. Expression de chaque poste du réseau dans le noyau normalisé
      1. Exprimer les coordonnées de chaque cellule avec le 4 X référentielle (carré noir dans la Figure 5) en utilisant la formule suivante :
         
         Où : sont les coordonnées de la cellule avec le 4 X référentielles ; sont les coordonnées de cellule avec les 20 X référentielle (carré orange à la Figure 5) ; et sont les coordonnées de la 20 X point référentielle dans l’image de X 4 (20XR).
      2. Exprimer les coordonnées de cellule dans le rectangle englobant référentielle (bleu sur la Figure 5) en utilisant la formule suivante :
         
         Où : sont les coordonnées de la cellule dans le rectangle englobant référentiel ; sont les coordonnées de cellule dans le 4 X référentielles ; et sont les coordonnées du rectangle englobant référentielle dans l’image de X 4.
      3. Transformer les coordonnées de cellule dans le rectangle englobant référentielle pour le pourcentage de la largeur et la hauteur du rectangle englobant à l’aide de la formule suivante :
         
         Où : sont les coordonnées de la cellule dans le pourcentage de la largeur et la hauteur du rectangle englobant ; sont les coordonnées de la cellule dans le rectangle englobant référentiel ; est la largeur du rectangle englobant mesurée au-dessus du protocole ; et est mesurée à la hauteur du rectangle englobant au-dessus dans le protocole.
      4. Pour représenter tous les réseaux sur le même chiffre, prendre en compte l’orientation de la tranche (gauche ou droite). Pour uniformiser les données, le référentiel est appliqué sur le côté gauche de la tranche. Transférer les coordonnées du réseau du côté droit au côté gauche en appliquant la formule suivante uniquement aux coordonnées x :
         
         Où : est la coordonnée x du côté droit de la tranche ; et  est l’abscisse nouveau exprimée dans le référentiel du côté gauche de la tranche.
         Remarque : Vous pouvez également miroir l’image en ImageJFIJI avant l’analyse (Image | Transformer | Miroir horizontal).
      5. Pour exprimer les coordonnées du vecteur principal d’orientation préférentielle, suivez les mêmes étapes avec les coordonnées de la cellule (étapes 6.5.3.1 à 6.5.3.4).
         Remarque : L’expression des coordonnées en pourcentages permet une compilation des données dans une seule parcelle dont le noyau (NVsnpr) est conçu comme un rectangle.
6. Étude de la différence angulaire entre le principal vecteur de direction préférentielle
   Remarque : La différence angulaire d’un réseau d’astrocytes est utilisée pour déterminer si son orientation préférentielle est vers le centre du noyau d’intérêt. Pour calculer la différence angulaire (α sur la Figure 5), qui est l’angle entre le vecteur principal de direction préférentielle du réseau (ligne de PD, rouge dans la Figure 5) et la ligne reliant P à C, appliquer le théorème d’Al-Kashi dans le triangle PDC (voir encart de la Figure 5 et Méthodes complémentaires).
   1. Tout d’abord, calculez les différentes longueurs à l’aide de l’application du théorème de Pythagore dans un référentiel cartésien selon l’équation suivante :
      
      Où : les coordonnées de P et C sont et , respectivement, dans le rectangle englobant référentiel (calculé plus haut).
   2. Déterminer l’écart angulaire en radians à l’aide de la formule suivante :
      
   3. Convertir la différence angulaire en degrés (par exemple, avec la fonction DEGRES dans le logiciel Excel).
   4. Compilez toutes les différences angulaires en leur traçant dans les graphiques à barres verticales (Figure 7 et 7D) et déterminer s’il y a une orientation préférentielle des réseaux astrocytaires.

Couplage entre les cellules du cerveau n’est pas statique mais plutôt dynamiquement réglementé par de nombreux facteurs. Les méthodes décrites ont été mis au point pour analyser les réseaux astrocytaires révélés dans des conditions différentes et à comprendre leur organisation en NVsnpr. Ces résultats ont déjà été publiés1. Nous avons effectué la biocytine remplissage des astrocytes unique dans la partie dorsale de la NVsnpr dans trois conditions différentes : au repos (dans des conditions témoins en l’absence de toute stimulation), Ca2 +-sans conditions et suite à la stimulation électrique des fibres sensitives qui se projettent vers le noyau. Les paramètres expérimentaux pour le remplissage de la biocytine des astrocytes pour chaque condition sont illustrées du côté gauche de la Figure 6 a-C.

Réseaux de cellules la biocytine marquées ont été observées dans des conditions de contrôle et confirment un état basal de la cellule de couplage entre astrocytes NVsnpr au repos. Dans 11 cas testés, la biocytine diffusion ont montré des réseaux composée de 11 ± 3 cellules (panneau central en Figure 6 a, Figure 6) qui s’étend sur une superficie de 34737 ± 13254 µm2 (Figure 6E). Carbénoxolone (CBX, 20 μM), un inhibiteur non spécifique des jonctions lacunaires, a été utilisé dans un ensemble indépendant d’expériences pour s’assurer que l’étiquetage observée résulte de la biocytine diffusion à travers les jonctions lacunaires et pas d’absorption par les cellules de la biocytine, qui pourrait fuir dans l’espace extracellulaire de la pression positive appliquée à la pipette avant de patcher. Application du bain de CBX réduit le nombre de cellules marquées à ± 0,5 2 cellules (panneau de droite dans la Figure 6 a, Figure 6; Méthode de iman-Conover, P = 0,016 ; Test de Holm-Sidak, P = 0,010) et la zone de la biocytine étend à 2297 ± 1726 µm2 (Figure 6E; Méthode de iman-Conover, P = 0,0009 ; Test de Holm-Sidak, P = 0,025).

L’effet de suppression de calcium provenant du milieu sur le NVsnpr réseaux astrocytaires a été testé, parce que la concentration de calcium extracellulaire faible est connue pour ouvrir les connexines et gap jonctions20,21,22et il peut être utilisé comme un stimulus massif et uniform d’ouvrir le syncytium et maximiser la diffusion de traceur par l’intermédiaire de jonctions lacunaires. Les astrocytes réseaux qui ont été révélés dans Ca2 +-gratuit conditions (n = 10) ont montré un plus grand nombre de cellules que les réseaux ont révélé dans des conditions de contrôle, avec 37 ± 10 étiquetés cellules (panneau central dans la Figure 6, Figure 6; Méthode de iman-Conover, P = 0,016 ; Test de Holm-Sidak, P < 0,001) couvrant une superficie de 108123 ± 27450 μm2 (panneau central dans la Figure 6, Figure 6E; Méthode de iman-Conover, P = 0,009 ; Test de Holm-Sidak, P = 0,001).

Par rapport à l’élimination complète du calcium du milieu, la stimulation électrique des intrants afférentes au noyau d’intérêt est un stimulus plus physiologique qui concerne directement le circuit neuronal d’intérêt. Par conséquent, les résultats de ce type de manipulation peuvent fournir des renseignements utiles concernant les implications fonctionnelles des réseaux astrocytaires observés. Par exemple, entrée de deux voies différentes peut conduire à des effets différents sur l’état basal des cellules de couplage dans une zone donnée, ou il peut soutirer de couplage entre astrocytes dans des subdivisions distinctes du noyau. Dans notre circuit, la stimulation électrique des fibres sensorielles qui se projettent à le NVsnpr à l’aide de trains de 2 secondes de 0.2 ms impulsions à 40-60 Hz (n = 11) a provoqué une augmentation du couplage entre NVsnpr astrocytes, par rapport à des conditions non stimulées, avec 23 ± 6 cellules (panneau central dans la Figure 6, Figure 6; Méthode de iman-Conover, P = 0,016 ; Test de Holm-Sidak, P = 0,012) s’étalant sur une superficie de 814174 ± 15270 μm2 (panneau central en Figure 6 b, Figure 6E; Méthode de iman-Conover, P = 0,009 ; Test de Holm-Sidak, P = 0,004).

Les effets de ces deux types de stimulation, l’élimination du calcium du milieu et la stimulation électrique des afférences entrées, tous sont perturbés par la CBX. Le réseau astrocytaires dans cet État constitué seulement 5 ± 1 cellules Ca2 +-FSCA gratuit (panneau de droite dans la Figure 6, Figure 6; n = 4 ; Méthode de iman-Conover, P = 0,016 ; Test de Holm-Sidak, P < 0,001) et 9 ± 2 cellules avec stimulation des fibres sensitives (panneau de droite dans la Figure 6, Figure 6; n = 6 ; Méthode de iman-Conover, P = 0,016 ; Test de Holm-Sidak, P = 0,023). Les superficies de réseau ont également été réduits à 17987 ± 98432 µm avec Ca2 +-FSCA libre (Figure 6E; n = 4 ; Méthode de iman-Conover, P = 0,009 ; Test de Holm-Sidak, P = 0,004) et à 39379 ± 11014 µm2 avec stimulation des fibres sensitives (Figure 6E; n = 6 ; Méthode de iman-Conover, P = 0,009 ; Test de Holm-Sidak, P = 0,055).

Analyse anatomique a été réalisée uniquement dans les cas où les limites de NVsnpr peuvent être clairement définis sur 4 X de l’imagerie, qui a été le cas pour les réseaux de 9 sur 10 obtenu avec Ca2 +-FSCA libre et 8 des 11 réseaux obtient avec la stimulation électrique. Traçage de tous les réseaux astrocytaires analysées sur une NVnspr théorique montre que la plupart des cellules dans les réseaux ont été confinés dans les limites de noyau (Figures 7 a et 7 b, les panneaux de gauche et du milieu). Au titre de Ca2 +-FSCA gratuit, 4 sur 9 réseaux astrocytaires répandre à l’extérieur de la NVsnpr en direction du noyau moteur situé en dedans de la NVsnpr. Dans ces 4 cas, la grande majorité des cellules marquées ont été confinée dans le noyau. Les réseaux de cellules marquées obtenus avec la stimulation électrique des fibres sensorielles sont plus restreintes. Seulement 2 réseaux s’étendus sur les frontières du noyau, dans lequel une réparties sur la frontière médiodorsales dans la zone latérale supratrigeminal (réseau vert foncé dans la Figure 7 b, les panneaux de gauche et du milieu). Dans le second cas, 2 astrocytes dans le réseau rouge (Figure 7 b, les panneaux de gauche et du milieu) a traversé la partie ventrale de la NVsnpr.

L’analyse vectorielle pour l’orientation préférentielle des réseaux astrocytaires (panneau de droite dans la Figure 7 a et 7 b) produite des résultats différents selon le stimulus utilisé. En effet, pour les réseaux astrocytaires observés avec Ca2 +-FSCA gratuit, tous sauf un des vecteurs d’orientation préférentielle ont été orientés vers le centre de la NVsnpr. Toutefois, pour les réseaux astrocytaires observées avec la stimulation électrique, les vecteurs d’orientation préférentielle étaient pour la plupart orientés vers les frontières du noyau. Ceci est reflété par les différences angulaires calculées dans une orientation préférentielle entre les réseaux astrocytes obtenus avec Ca2 +-free FSCA et ceux obtenus avec la stimulation électrique des fibres sensorielles. Au titre de Ca2 +-FSCA gratuit, les graphiques à barres verticales de la distribution de la différence angulaire a montré que la plupart des réseaux de cellules marquées ont une différence angulaire entre 0 et 40 ° c, avec une moyenne de différence angulaire de 39,5 ± 12,7 degrés ( La figure 7). Avec la stimulation électrique des fibres sensitives, la distribution est plus uniforme, et la différence angulaire moyenne (99,5 ± 17 degrés) est sensiblement différente (Figure 7, test t de student, P = 0,012).

Ces données montrent que la biocytine étiquetage analyse permet de distinguer les effets de différents stimuli modulant couplage astrocytaires. Par ailleurs, la cartographie des réseaux astrocytaires dans un noyau normalisé suivie d’analyse vectorielle fournit des renseignements précieux sur la taille et l’Organisation anatomique de ces réseaux.

Figure 1 : Whole-cell patch clamp d’astrocyte. (A) les astrocytes marquées avec un chargement du marqueur sulforhodamine 101 (SR-101) en NVsnpr. Un soma SR-101-étiqueté astrocyte est ciblée avec la pipette (ligne pointillée blanche). Echelle = 100 μm. (B) un protocole dépolarisant de rampe est effectué en voltage clamp (à partir de -120 à 110mV) afin d’évaluer les caractéristiques passives astrocyte. (C) évaluation de l’absence de potentiel d’action tir dans les astrocytes en injectant des impulsions de courant en mode courant-clamp. Ce chiffre est une adaptation de la Condamine et al. (2018) 1. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : traitement et analyse de réseaux astrocytaires avec le logiciel ImageJFIJI. (A) création de la Z-pile de l’imagerie confocale d’un réseau d’astrocytes. À la fenêtre de Z-pile haut-gauche, en ImageJFIJI. (B) processus de soustraction de fond. En haut à gauche, soustraire fenêtre fond dans ImageJFIJI. Le cercle en pointillé met l’accent sur la zone sur l’image où l’effet de la commande arrière-plan de soustraction est le plus évident quand par rapport à l’image dans le processus de A. (C) Remove valeurs aberrantes. Ce procédé élimine les petites taches due à des dépôts non spécifiques de streptavidine couplé à un 594 Alexa. Les flèches blanches indiquent le dépôt avant (Figure 2 b) et après (Figure 2), la commande a été traitée. En haut à gauche, enlever la fenêtre de valeurs aberrantes dans ImageJFIJI. (D) exemple de l’effet de flou qui peut être produite par un ajustement inadéquat des paramètres supprimer des valeurs aberrantes. Flèches jaunes montrent certaines cellules floues. (E) régler le processus de seuil. En haut à gauche, ajuster fenêtre limite dans ImageJFIJI. Les barres de défilement agissent sur l’ajustement de signal de seuil. (F) faire étape binaire. L’image est convertie en un fichier binaire en ImageJFIJI. Echelle = 100 μm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : détection des cellules astrocytaires réseaux avec ImageJFIJI. (A) exemple d’une image binaire d’un réseau d’astrocytes obtenu en ImageJFIJI. Echelle = 100 μm. (B) illustre le fichier « détection », obtenu après l’application du processus de particules d’analyser sur le fichier binaire. Les formes correspondent à toutes les cellules détectées avec leur nombre en rouge. (C) partie gauche : analyser la fenêtre de particules en ImageJFIJI. Cette fonction détecte les cellules du réseau dans l’image binaire. La taille des cellules détectées et leur circularité peut être ajustée. Numéros à utiliser doivent être réglés par essais et erreurs, jusqu'à l’obtention d’un résultat satisfaisant. Partie à droite : tableau de détection généré par le processus d’analyse des particules. La liste des colonnes X et Y les coordonnées de chaque cellule dans l’image. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : réseau zone analyse et détermination de la cellule patchée dans ImageJFIJI. (A) en utilisant de que l’outil Polygone dans ImageJFIJI, un retour sur investissement est tracé autour de l’amas détecté des cellules (ligne rouge) qui servira à déterminer la superficie du réseau. (B) le retour sur investissement est ajouté dans le gestionnaire de ROI. (C) exemple de réseau astrocytaires dans lequel la cellule patchée (flèche blanche) est facilement identifiable en raison de l’intensité saisissante de son étiquette de la biocytine. (D) exemple d’un réseau d’astrocytes où la cellule patchée n’a pas pu être identifiée, mais lorsqu’une zone des plus denses d’étiquetage clairement indique la biocytine dépôts. Un retour sur investissement est dessiné autour de cette zone et ajouté au gestionnaire de ROI. Son centre de gravité est calculée et considérée comme la position de la cellule patchée à utiliser pour l’analyse vectorielle. Echelle = 100 μm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : diagramme des différents référentiels utilisés pour l’analyse de réseaux astrocytaires. Le carré gris est l’image de X 4 avec le référentiel 4XR point à être aligné avec le coin en bas à gauche du document Adobe Illustrator. Le carré blanc entouré en orange est l’image de X 20 avec la 20XR point référentielle. Les deux images sont alignés entre eux, comme décrit dans le protocole. Le rectangle englobant (bleu) définit NVsnpr (ligne violette en pointillés) et est gradué en pourcentage avec le point référentiel (BR). Le centre théorique de la partie dorsale du NVsnpr est schématisé par le point bleu foncé (C). Le réseau astrocytaires est schématisé par la cellule patchée (point noir, P) et le principal vecteur de l’orientation préférentielle (ligne rouge). Chaque ligne pointillée noire est le vecteur de chaque cellule du réseau astrocytaires. La différence angulaire du réseau astrocytaires (α) est l’angle entre la principale orientation préférentielle du réseau (ligne rouge) et la ligne noire qui relie l’astrocyte raccordé au centre du noyau théorique. Inset est un zoom de l’image de X 20 montrant le triangle formé par le centre théorique de la NVsnpr (C), la cellule patchée et le principal vecteur de direction préférentielle (D) de PCD. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : réseaux astrocytaires étiquetés avec la biocytine dans NVsnpr dans des conditions différentes, montrant les différentes tailles. (A-C) À gauche, un schéma de la condition expérimentale. Dans toutes les conditions, un seul astrocyte étiqueté par SR-101 a été ciblé pour l’enregistrement de la cellule entière et rempli la biocytine (0,2 %). Colonne centrale : photomicrographies illustrant les réseaux astrocytes obtenus dans le cadre de contrôle des conditions (A), après une stimulation électrique des voies Vème (2 trains s, 40-60 Hz, 10-300 µA, impulsions 0,2 ms) (B) ; et après une perfusion avec un Ca2 +-FSCA libre (C). Colonne de droite : photomicrographies illustrant les réseaux astrocytes obtient dans les mêmes conditions mais en présence de CBX (20 μM) dans l’avant de la baignoire. Echelle = 100 μm. (D et E) Graphique de barres verticales représentant le nombre de couplés des cellules et la superficie, respectivement, des réseaux de la biocytine remplis des astrocytes dans les trois conditions expérimentales présentées ci-dessus (A, B et C) en présence (partie hachurée) et en absence (solide) de CBX (20 ΜM). Données sont représentées en moyenne ± SEM. Multiple de comparaisons (Holm-Sidak test) : * = P < 0,05 ; ** = P < 0,001. Ce chiffre est une adaptation de la Condamine et al. (2018) 1. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7 : Caractérisation des réseaux en NVsnpr au titre de Ca2 +-FSCA libre et avec la stimulation électrique des voies Vth . (A et B) Gauche : Toutes les cellules marquées en 9 réseaux rempli sous perfusion avec Ca2 +-gratuit aCSF (A) ou dans les 8 réseaux remplis tout en stimulant les voies Ve (B) sont tracées selon leur position dans un noyau de NVsnpr théorique (rectangle gris). Chaque réseau (et les cellules qui la composent) sont représentés par une couleur différente. Milieu: limites de chaque réseau. Le point dans chaque secteur représente la cellule patchée. Droite: représentation du principal vecteur de l’orientation préférentielle de chaque réseau. Le point représente la cellule patchée et la flèche du vecteur de direction préférentielle. (C et D) Distribution des différences angulaires entre le principal vecteur de l’orientation préférentielle et une ligne droite reliant la cellule raccordée au centre de la partie dorsale du NVsnpr (situé à 25 % sur l’axe dorsoventral et 50 % sur l’axe médio-latérale) en vertu de la deux conditions étudiées. La différence angulaire moyenne était de 39,5 ± 12,7 degrés dans Ca2 +-FSCA libre, ce qui indique une orientation préférentielle vers le centre du noyau et 99,5 ± 17 degrés avec la stimulation électrique, ce qui indique une orientation préférentielle vers le périphérie (test t de student, P = 0,012). Ce chiffre est une adaptation de la Condamine et al. (2018) 1. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Composition de la solution de sucrose utilisée pour trancher le cerveau. (*) = pH et l’osmolarité ont été ajustés à 7,3 à 7,4 et 300-320 mosmol/kg, respectivement.

Tableau 2 : Composition de la solution de FSCA utilisée pour le stockage de la tranche et enregistrement de cellules entières. (*) = pH et l’osmolarité ont été ajustés à 7,3 à 7,4 et 290-300 mosmol/kg, respectivement.

Tableau 3 : Composition de la solution interne utilisée pour l’enregistrement de la cellule entière. (*) = pH et l’osmolarité ont été ajustés à 7,2-7.3 et 280-300 mosmol/kg, respectivement.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.