Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

En In Vitro Model af en Parallel-plade Perfusion System at studere bakteriel tilslutning til at pode væv

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58476
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 3, 3, 3, 4, 1, 5, 2, 1
1Cardiovascular Developmental Biology, Department of Cardiovascular Sciences, KU Leuven, 2Centre for Molecular and Vascular Biology, Department of Cardiovascular Sciences, KU Leuven, 3Department of Biohybrid & Medical Textiles, AME - Helmholtz Institute for Biomedical Engineering, RWTH Aachen University, 4European Homograft Bank, Saint Jean Clinique, 5Division of Clinical Cardiac Surgery, Department of Cardiovascular Sciences, KU Leuven

Summary

Vi beskriver en in-house designet i vitro flow kammer model, som giver mulighed for undersøgelse af bakteriel tilslutning til at pode væv.

Abstract

Forskellige ventil ledningsanlæg og stent monterede ventiler bruges til højre ventrikel udstrømning tarmkanalen (RVOT) ventil udskiftning hos patienter med medfødt hjertesygdom. Når du bruger proteser materialer dog, er disse grafts modtagelige for bakterielle infektioner og forskellige vært svar.

Identifikation af bakterie og vært faktorer, der spiller en afgørende rolle for endovaskulære overholdelsen af mikroorganismer er af betydning for bedre at forstå Patofysiologi af udbrud af infektioner såsom infektiøs endocarditis (IE) og at udvikle forebyggende strategier. Udviklingen af kompetente modeller at undersøge bakteriel adhæsion fysiologiske shear betingelser er derfor nødvendigt. Her, beskriver vi brugen af en nyligt udformet i vitro perfusion kammer baseret på parallelle plader der giver mulighed for undersøgelse af bakteriel tilslutning til forskellige komponenter af transplantat væv såsom fritliggende ekstracellulære matrix, endotelceller og inert områder . Denne metode kombineres med kolonidannende enhed (CFU) tælle er tilstrækkelige til at vurdere graft materialer tilbøjelighed mod bakteriel adhæsion under flow. Yderligere kan på, flow kammer system bruges til at undersøge rollen af blodkomponenter i bakteriel adhæsion shear betingelser. Vi viste, at kilden til væv, deres overflade morfologi og bakteriearter specificitet ikke er de store afgørende faktorer i bakteriel tilslutning til pode væv ved hjælp af vores in-house designet i vitro perfusion model.

Introduction

Staphylococcus aureus (S. aureus) beskæftiger en række virulens strategier til at omgå immunforsvaret værtssystemet koloniserer biologiske eller ikke-biologiske overflader implanteres i det menneskelige omsætning, hvilket fører til alvorlige intravaskulær infektioner såsom sepsis og IE1,2,3,4,5. IE er fortsat et vigtigt behandling forbundet komplikation hos patienter efter implantation af kunstige hjerteklapper mens individuelle faktorer, der bidrager til udbrud af IEare ikke endnu fuldt ud forstået6,7. Under strømningsforhold støder bakterier shear styrker, som de skal overvinde for at overholde fartøj væg8. Modeller, som gør det muligt at studere samspillet mellem bakterier og proteser ventil væv eller endotel under flow, er af interesse, da de afspejler i vivo situationen mere.

Flere specifikke mekanismer lette bakteriel tilslutning i endothelial celler (ECs) og til den eksponerede subendothelial matrix (ECM) fører til væv kolonisering og modning af vegetationen, er væsentlige tidlige trin i IE9. Forskellige stafylokokker overflade proteiner eller MSCRAMMs (mikrobielle overflade komponenter anerkende klæbende matrix molekyler) er blevet beskrevet som mediatorer af adhæsion værtsceller og ECM proteiner ved at interagere med molekyler såsom fibronektin, fibrinogen, kollagen og von Willebrands faktor (VWF)8,10,11. Men i betragtning af intra molekylære foldning af nogle virulens faktorer, for det meste studerede under statiske forhold, mange af disse interaktioner kan have forskellige relevans i endovaskulære infektioner i cirkulerende blod.

Derfor præsenterer vi en in-house designet i vitro parallel-plade flow kammer model, som giver mulighed for vurdering af bakteriel tilslutning til forskellige komponenter af ECM og ECs i forbindelse med væv grafts implanteret i RVOT position. Det overordnede formål med metoden i dette arbejde er at studere mekanismer af interaktion mellem bakterier og underliggende endovaskulære væv i flow betingelser, som er tæt knyttet til blodbanen patogener i vivo miljø som S. aureus. Denne nye fremgangsmåde fokuserer på modtagelighed for graft væv overflader til bakteriel tilslutning til at identificere potentielle risikofaktorer for udvikling af IE.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. forberede Graft væv til In vitro- undersøgelser

Bemærk: Tre typer af væv blev brugt: kvæg hjertesækken patch (BP), befrugtede Homograft (CH) og bovin halsfedt grafts (BJV). I tilfælde af BJV conduit og CH (væv behandles af den europæiske Homograft (EHB) og lagres i flydende nitrogen forudgående at bruge), blev både væg og utætte hjerteklapper foldere brugt. BP patch og BJV conduit blev købt fra producenter. Før brug, tø CH efter EHB instruktioner12.

  1. Skyl alle væv med 0,9% NaCl før brug.
  2. Forberede væv biopsier ved hjælp af en engangs hudbiopsi punch at skære cirkulære væv stykker (10 mm i diameter).
  3. Skære alle væv patches til samme højde ved hjælp af engangs sterile skalpeller.
  4. Væv fast med glutaraldehyd (for eksempel BJV conduit), Ruger graft stykker natten over ved 4 ° C med 200 g/L af humant albumin til at neutralisere fiksativ.
  5. Vask ud restkoncentrationer af glutaraldehyd med 0,9% NaCl i et mikrotiter plade.  Gentag 3 gange i 1 minut.

2. forberede Perfusion forsoeg til bakterier

Bemærk: Tre bakteriel isolater blev brugt: S. aureus Cowan (ATCC 12598), S. epidermidis ATCC 149900 og S. sanguinis NCTC 7864. S. aureus og S. epidermidis blev dyrket ved 37 ° C i tryptic soja bouillon (TSB) og S. sanguinis blev dyrket ved 37 ° C med 5% CO2 i hjernen hjerte infusion bouillon (BHI).

  1. Forberede overnight kultur af bakterier på en solid blod agar plade.
    1. Brug en steril løkke til at skrabe de frosne bakterier ud og podes på en Mueller-Hinton blod agar plade for natten kultur ved 37 ° C.
  2. Brug en steril podning løkke til at afhente en enkelt koloni fra overnight blod agar kultur og podes i 10 mL af TSB eller BHI i en 14 mL rør og kultur natten over ved 37 ° C.
  3. Centrifugeres overnight kulturer (3000 x g, 4 ° C, 10 min) og resuspend pellets i 10 mL af fosfatbufferet saltopløsning (PBS). Placer 14 mL rør på is.
  4. Forberede en alikvot af 3,7 mg/mL opløsning af 5 (6) - carboxy - fluorescein N-hydroxy-succinimidyl ester (CF) i ethanol og opbevares ved-20 ° C. Yderligere fortyndes bestand af CF til 150 µg/mL ved hjælp af 'laves' vand.
    Bemærk: Beskytte rør fra lys ved hjælp af alufolie og opbevar ved-20 ° C.
  5. Centrifugeres bakterier (3000 x g, 4 ° C, 10 min) og resuspend pellets i 800 µL af PBS og tilføje 200 µL af opløsningen 150 µg/mL CF (endelig koncentration 30 µg/ml anvendes til perfusion forsøg). Beskytte rør fra lys med aluminiumsfolie og Inkuber i 30 min. ved hjælp af en orbitalryster.
  6. Efter mærkning, blokere med 2% bovint serumalbumin (BSA) løsning i PBS og spin (3000 x g, 4 ° C, 10 min). Følg med en vask trin ved hjælp af 10 mL af bakterier, PBS og pellet ved centrifugering (3000 x g, 4 ° C, 10 min).
  7. Fortynd bakterier med PBS at opnå 107 kolonidannende enheder (CFU) /mL (verificeret af CFU regner Mueller-Hinton blod agar plader), hvilket svarer til en OD600 (ekstinktionen) af 0,65. Holde rør i mørke på is før perfusion eksperimenter.
    Bemærk. Husk på at OD600 målinger afspejler det omtrentlige antal bakterier. Hvis du vil tælle effektiv podning dosis, er metoden seriel fortynding yderligere nødvendige trin for at kontrollere OD baseret numre som beskrevet i afsnit 3.8.

3. in vitro Perfusion eksperimenter ved hjælp af en Parallel-plade Flow kammer

  1. Montere væv biopsier af 10 mm i diameter og den samme tykkelse (udarbejdet i trin 1.1-1.5) i et flow kammer system med den indvendige overflade, vender opad til at komme i kontakt med den bakterielle suspension.
    Bemærk: Samme væv tykkelsen på tværs af forskellige grafts sikrer, at samme væv højde nås i kanalen giver laminar flow under alle forhold. Alle elementer af flow kammer præsenteres og beskrives i figur 1.
    1. Til at begynde protokollen, Placér runde væv mellem et objektglas med et 8 mm cirkulære perforering og en gummipakning.
      Bemærk: Objektglas besidder ultra-tynd bund filmen for at tillade generation af 8 mm hul. Sammen med gummiplade, det løser væv for at aktivere den direkte kontakt mellem modellen og det flydende medium og forhindrer også dislokation af biopsi under eksperimentet. Overfladen af det undersøgte væv, som er udsat for flow (mindre diameter) kan ikke manipuleres ved pincet.
    2. Indsæt holderen med vævet i pakning ark, der er integreret i bunden metal ramme i salen.
    3. Fastgør den øverste metalramme med den tilsvarende pakning ark på den nederste del af salen med tidligere indsat væv indehaveren. Efterfølgende montere i hele salen med otte skruer og skrue nødder. Sørg for at kammer højde er altid den samme på tværs af podninger.
      Bemærk: Kammer højde bør afgøres altid ved stramme skruerne. Bruge en skydelære eller lineal.
  2. Tilslut strømmen kammer med en peristaltisk pumpe og flydende reservoir med rør.
  3. Perfuse væv med suspensioner af 107 CFU/mL (verificeret af CFU tælle og OD600 målinger i forbindelse) fluorescently mærket bakterier i PBS med en shear stress af 3 dyne/cm2 (dyne pr. kvadratcentimeter pres enhed) ved middel til den peristaltiske pumpe (flow hastighed 4 mL/min) i 1 time ved hjælp af en 400 mL bakteriel reservoir (In-house design, figur 1) konditioneret ved 37 ° C ved hjælp af en plade termostat (Tabel af materialer).
  4. Recirkulere løbende 100 mL bakteriel suspensionen ved hjælp af den samme samling reservoir.
  5. Efter perfusion, demontere kammer for at frigive graften og vaske væv stykke to gange med 4 mL PBS i en 12-godt plade ved hjælp af laboratoriet orbitalryster i 3 min. Efterfølgende skåret den inderste del af graften ved hjælp af en hudbiopsi punch med en mindre diameter.
  6. Læg hver væv biopsi i et separat 14 mL rør indeholdende 1 mL steril 0,9% NaCl. Mærke røret som #1.
  7. Frigør bakterier fra væv ved hjælp af sonikering bad for 10 min (amplitude = 100%, og frekvensen = 45 kHz).
    Bemærk: Fuld løsrivelse af bakterier fra væv grafts bør vurderes efter inkubation af patches natten over ved 37 ° C i TSB flydende medium efterfulgt af OD600 målinger i forhold til at styre pletter behandlet med en bakterier gratis løsning.
  8. Bruge en seriel fortynding metode på Mueller-Hinton blod agar plader til at tælle CFUs.
    1. Forberede en enkelt 14 mL tube med 10 mL sterilt saltvand serielle fortyndinger af bakteriel suspension opnås efter ultralydbehandling. Mærke dette rør som #2.
      Bemærk: Til hver enkelt væv eksperiment en tube med 10 mL 0,9% NaCl er nødvendige.
    2. Forberede tre 14 mL reagensglas med 10 mL steril 0,9% NaCl for serielle fortyndinger af indledende bakteriel suspension fra trin 2.7. Label rør som følger #3, #4, #5.
      Bemærk: Dette trin er nødvendigt at kende den virkelige CFU nummer i bakteriel suspension bruges til perfusion eksperiment.
    3. Vortex mix hver tube til 15 s. Vortex rør med væv biopsi samt den indledende bakteriel suspension serielle fortyndinger.
    4. Forberede tre agar plader, to for væv eksperiment (perfusion af bakterier og kontrol perfusion af PBS) og den tredje indledende bakteriel suspension bruges til perfusions.
    5. Label tre sektorer pr. plade til væv eksperiment i den følgende måde 10-1, 10-3 og 10-4. Hvis du vil tælle antallet af CFUs i den bakterielle perfusates, mærke pladen som følger: 10-1, 10-3, 10-5 og 10-7.
      Bemærk: Alle angivelser på agar plader som 10-1, 10-3 og så videre refererer til det endelige antal CFU/mL beregnes på den næste dag. Kontrol plade kræver ikke nogen sektorer. Før brug, bør blod agar plader placeret under laminar kølerhjelmen og åbnet for at fjerne overskydende fugt.
    6. For at forberede de serielle fortyndinger, overføres 100 µL af røret #1 til tube #2 og bland energisk med vortex.
    7. Sprede 100 µL af indholdet af røret #1 og #2 på den tilsvarende sektorer 10-1 og 10-3 af agar plade. Ligeledes, sprede 10 µL af røret #2 på sektor 10-4, Gentag dette trin 4 gange for at få 4 separate vækster fra hver volumen af 10 µL.
      Bemærk: På grund af den lille mængde anvendes til plating på sektor 10-4, det tilrådes at have flere antal dråber til at gøre et gennemsnitligt antal vokset CFUs.
    8. For at forberede de serielle fortyndinger af den oprindelige kultur, overføres 100 µL af bakteriel suspension fra trin 2,7 til tube #3 og bland energisk med vortex. Tilføj 100 µL af røret #3 at røret #4 og bland godt, Gentag proceduren for efterfølgende tube #5.
    9. Spredes 100 µL af indholdet af rør #3, #4, #5 og den justerede bakteriel suspension (trin 2.7), henholdsvis på sektorer 10-3, 10-5, 10-7 og 10-1 i blodet agar plade.
    10. Forlade blod agar plader i laminar hætten til luft tørre bakteriel spreads, typisk i 10 minutter. Bagefter, læg pladerne ved 37 ° C i natten inkubation.
    11. Efter natten inkubation, bakteriel kolonierne for at få antallet af CFUs skyldes vedhæftning til væv biopsier samt CFUs/mL i udgangspunktet bakteriel suspensionen anvendes til perfusion. Express resultater som CFU/cm2.

4. Fluorescens mikroskopi af overholdt bakterier at pode væv ved Perfusion

  1. Efter perfusion, vaske væv stykker med PBS (Se trin 3,5) og skære den inderste del af en graft ved hjælp af en hulning af en mindre diameter.
  2. Forberede en 6-godt plade og placere dråber med montering medium (Tabel af materialer).
  3. Placer hvert stykke væv med sin perfused overfladen nedad på en enkelt dråbe af montering medium.
  4. Læs en plade ved hjælp af et fluorescens scanner (Tabel af materialer). Angive parametre af excitations- og bølgelængder ifølge en fluorophore bruges til bakteriel mærkning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For bedre at forstå mekanismerne bag IE udvikling, denne model giver mulighed for evaluering af bakteriel og væv i forbindelse faktorer til stede i infektion debut i vivo situation.

Detaljeret, Roman i vitro tilgang gør det muligt for at kvantificere bakteriel adhæsion i strømningsforhold til forskellige graft væv af perfusing fluorescently mærket bakterier over væv øve shear understreger i den fysiologiske række 3-10 dyne / cm2 for RVOT. I dette arbejde brugte vi en gennemstrømningshastighed på 4 mL/min., der svarede til 3 dyne/cm2. Under hensyntagen til kanal højden af 0,3 mm på tværs af alle væv patches, afstanden mellem monteret graften og omkring 39 mm medium indfaldende, perfusion salen (vist i figur 1) garanterer fuldt udviklede laminar flow (Re = 3,89 er betydeligt lavere end 2000; indgangen længde = 0,05 mm er betydeligt mindre end afstanden "inlet-graft", parametre, der er nødvendige for at påtage sig passende strømningsmønster).

Betingelser, shear stress, blev en lignende bakterielle vedhæftet fil på tværs af de forskellige graft væv observeret for både S. aureus og S. epidermidis infektion (figur 2 og figur 3). Selv om ikke signifikant, var en tendens til højere vedhæftning af S. aureus CH indlægssedler mærkbar.

For S. sanguinis en betydelig reduktion af overholdelse af BJV væggen blev fundet i forhold til BP patch (figur 4; P < 0,05). Når man sammenligner de 3 arter af bakterierS. sanguinis præsenterer betydeligt lavere friktion på BJV væggen i forbindelse med S. aureus og S. epidermidis (P < 0,01 og P < 0,05 henholdsvis, se videoen). Generelt har observeret vi en lignende bakteriel adhæsion til alt væv undersøges under shear stress.

Vores data fra CFU tælle (figur 2, figur 3, figur 4) understøttes af Fluorescens mikroskopi ved hjælp af en høj overførselshastighed scanner (figur 5, figur 6, figur 7). Billeder præsenterer udtalt foci af mærket bakterier overholde for at pode væv. På grund af denne tilgang kunne vi direkte visualisere væv ved perfusion uden nogen post eksperimentel behandling til illustration formål.

Resultaterne viser, at kilden til en graft væv, overflade morfologiske forskelle samt bakteriel adhesins ikke er store determinanter for bakteriel tilslutningtil disse biologiske materialer.

Figure 1
Figur 1: billede af en nyudviklet flow kammer system (in-house design af Institut for Biohybrid & medicinsk tekstiler, AME - Helmholtz Institut for Biomedical Engineering, Aachen, Tyskland). A. flow kammer (1) monteret flow sæt dimensioner LxBxH: 125 mm x 55 mm x 18 mm (skruer i kombination med skrue-nødder hold kammerets dele sammen og lægge pres via den metalramme på pakninger til at forhindre lækage); (2) den øverste del af kolonnen. (3) den øverste pakning ark med to huller til at fix slange stik, som forbinder flow kammer med pumpen og flydende reservoir via slanger-systemet; (4) afstand mellem mellemstore indløbet og væv (indgangen længde); (5) tynd folie dias (med en 8 mm cirkulære perforering tillade eksponering af væv til bakteriel suspension) (i en fordybning af diaset der er plads til en gummipakning B9, at immobilisere væv stykket under perfusion); (6) Bund pakning ark med en dedikeret fordybning til at placere væv graft monteret mellem objektglas og gummipakning; (7) den nederste del af kammerets flow B. den fulde set-up (8) den tynde folie dias; (9) gummipakning; (10) otte skruer med tilsvarende (11) otte skrue-nødder; (12) den flydende reservoir (400 mL); (13) slanger system; C. Perfusion enhed (14) den peristaltiske pumpe; (15) dedikeret slanger der tåler rigor af peristaltiske pumpefunktion. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Vedhæftning af S. aureus Cowan at pode væv flow betingelser. Fluorescently mærket bakterier var perfunderet over 5 graft væv (conduit vægge eller utætte hjerteklapper foldere) i PBS. Bakterier blev løsrevet fra inficeret væv stykker ved hjælp af sonikering. Bakteriel adhæsion blev evalueret af serielle fortyndinger metoden CFU tælle, og angivet som CFU/cm2. Alle resultater udtrykt som betyder ± SEM (n > 3 for utætte hjerteklapper foldere på grund af begrænsningen af materiale; n > 5 til conduit vægge). CFU: kolonidannende enhed; BP: kvæg hjertesækken; BJV: kvæg halsfedt; CH: befrugtede homograft. Dette tal er blevet ændret fra Veloso et al. (Journal of thorax og hjerte-kar-kirurgi 155 (1), 325-332 (2018)). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Vedhæftning af S. epidermidis at pode væv flow betingelser. Fluorescently mærket bakterier var perfunderet over 5 graft væv (conduit vægge eller utætte hjerteklapper foldere) i PBS. Bakterier blev løsrevet fra inficeret væv stykker ved hjælp af sonikering. Bakteriel adhæsion blev evalueret af serielle fortyndinger metoden CFU tælle, og angivet som CFU/cm2. Alle resultater udtrykt som betyder ± SEM (n > 3 for utætte hjerteklapper foldere på grund af begrænsningen af materiale; n > 5 til conduit vægge). CFU: kolonidannende enhed; BP: kvæg hjertesækken; BJV: kvæg halsfedt; CH: befrugtede homograft. Dette tal er blevet ændret fra Veloso et al. (Journal of thorax og hjerte-kar-kirurgi 155 (1), 325-332 (2018)). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Vedhæftning af S. sanguinis at pode væv flow betingelser. Fluorescently mærket bakterier var perfunderet over 5 graft væv (conduit vægge eller utætte hjerteklapper foldere) i PBS. Bakterier blev løsrevet fra inficeret væv stykker ved hjælp af sonikering. Bakteriel adhæsion blev evalueret af serielle fortyndinger metoden CFU tælle, og angivet som CFU/cm2. Alle resultaterne udtrykkes som betyder ± SEM (n = 3 for utætte hjerteklapper foldere på grund af begrænsningen af materiale; n > 5 til conduit vægge). CFU: kolonidannende enhed; BP: kvæg hjertesækken; BJV: kvæg halsfedt; CH: befrugtede homograft. Dette tal er blevet ændret fra Veloso et al. (Journal of thorax og hjerte-kar-kirurgi 155 (1), 325-332 (2018)). * P < 0,05. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Visualisering af S. aureus Cowan overholdelse at pode væv ved hjælp af Fluorescens mikroskopi. Fra venstre mod højre: BJV conduit væg, BJV folder, CH væg og CH indlægsseddel. Dette tal er blevet ændret fra Veloso et al. (Journal of thorax og hjerte-kar-kirurgi 155 (1), 325-332 (2018)). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Visualisering af S. epidermidis overholdelse at pode væv ved hjælp af Fluorescens mikroskopi. Fra venstre mod højre: BJV conduit væg, BJV folder, CH væg og CH indlægsseddel. Dette tal er blevet ændret fra Veloso et al. (Journal of thorax og hjerte-kar-kirurgi 155 (1), 325-332 (2018)). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: Visualisering af S. sanguinis overholdelse at pode væv ved hjælp af Fluorescens mikroskopi. Fra venstre mod højre: BJV conduit væg, BJV folder, CH væg og CH indlægsseddel. Dette tal er blevet ændret fra Veloso et al. (Journal of thorax og hjerte-kar-kirurgi 155 (1), 325-332 (2018)). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Nylige kliniske observationer give særlig opmærksomhed til IE som en komplikation hos patienter har undergået ventil udskiftning af RVOT6,13. Dysfunktion af den implanterede ventil i IE er resultatet af bakteriel interaktion med for Intravaskulært transplantat fører til omfattende inflammatoriske og prokoagulant reaktioner1,14. Modellen præsenteres nye in vitro- tilladt os at undersøge hvis forskelle i strukturer og bakterielle faktorer er tilbøjelige til at modulere modtagelighed for infektioner i vivo brugte podninger15. BJV og CH graft væv viste lignende tilbøjelighed mod bakteriel rekruttering i strømningsforhold. Derfor tyder data på, at i almindelighed kilde til væv og dens overfladestruktur samt specifikke bakteriel klæbende proteiner i sig selv ikke er de store afgørende faktorer i indledende bakteriel tilslutning.

I almindelighed, veje fremkalde betændelse, væv skader, trombocyttal og fibrin aflejring på webstedet inficerede endovaskulære aktiveres ved flere spillere1,16. En stor fordel af den udviklede i vitro model er mulighed for at analysere trinvis bidrag involverede spillere. Fælles bakterielle faktorer kan undersøges ved hjælp af mutant bakteriestammer eller genetisk modificerede bakterier at udtrykke indre friktion proteiner på deres overflade14. Ved at vælge forskellige perfusion medier, plasma eller blod, kan inddragelse af plasmaproteiner og blodlegemer evalueres. Yderligere undersøgelser vil fokusere på væv relaterede faktorer som væv vil blive præ rugede med for eksempel plasmaproteiner før monteret i flow salen for efterfølgende perfusion. Siden spillere bidrage til udbrud af proteser ventil dvs forbliver uklart, fremtidige undersøgelser kunne optrævle de potentielle faktorer af bygningen op til en mere kompleks eksperimentel opsætning. Desuden, denne eksperimentelle opsætning arver muligheden at væv kan være seedet med en EF lag til at analysere shear-afhængige EF genekspression. Parallel-plade flow kammeret tillader også perfusion over EF-dækket objektglas på grund af en fleksibel indre højde perfusion kammer. Forskellige belægninger af dæksel glider ved hjælp af forskellige ekstracellulære matrix proteiner er også en mulighed at vurdere vigtigt interaktioner med subendothelial matrix. Derudover kan farmakologiske hæmmere eller funktionelle antistoffer undersøges for deres virkning i de respektive betingelse i vores flow kammer. I Resumé, kan forskellige betingelser studeres af stigende kompleksitet.

Inflammatorisk aktivering på det inficerede område af graften er en afgørende, Forskyd-kontrollerede trin fremmer aflejring af aktiverede blodplader og monocytter. Virkningen af shear styrker på bakteriel tilslutning til væv overflader er stor bekymring. For at løse dette problem, nyhed i præsenteres i vitro system fokuserer på muligheden for at montere væv i et flow kammer. Dette styrker betydningen af metoden ud over eksisterende alternativer, som normalt statisk interaktioner mellem bakterier og underliggende væv er blevet undersøgt. Selvom shear stress var indsendt af omrystning eller andre eksterne kræfter, har det ikke været standardiseret til samme niveau som vi kan få fra vores ensartet flow model.

In vivo, en ikke-fysiologisk strømningsmønster kan favor bakteriel adhæsion som udbrud af IE på niveauet ventil af implanterede ledningsanlæg. Shear stress blev fundet, at op-regulere endotel inflammatoriske parametre såsom cytokin sekretion og øge væv faktor medieret koagulation17. Samspillet mellem det underliggende væv bruges til valve proteser med bakterier og deres indflydelse på EF genekspression under shear stress er vigtigt at konstruere en ventil mindre i stand til at bakteriel adhæsion og kronisk inflammation.

De basale tekniske spørgsmål af opdigtede kammeret tillader undersøgelser under standardiserede betingelser i laminar flow18. For at sikre den fuldt udviklede laminar flow i stedet for de undersøgte væv salen er konstrueret til at montere graft i en vis afstand fra medium-fjorden (betydeligt længere end den beregnede indgang længde, se resultater og figur 1). Ved hjælp af forskellige pumper i systemet vil tillade udfører eksperimenter under pulsatile eller turbulente strømningsforhold i fremtiden.

Den fleksible ramme i salen forhindrer salen effektivt fra utætte og den interne højde på rammen giver mulighed for tilpasning til væv tykkelse. Opførelsen af hele systemet muliggør en cirkulerende strøm, som er af betydning til at udføre langvarige perfusions med ved hjælp af en respektive mængde af medium. Baseret på tidligere undersøgelser vores vedhæftning protokol antaget en bakteriel podning dosis af 107 CFU/mL for en 1 h inkubation4,19. Ved hjælp af disse indstillinger, var vedhæftning niveauer påviselig, omend lav nok til at kunne observere betydelig forøgelse af bakteriel tilslutning uden mætning af væv graft overflade. I denne periode var det desuden muligt at lægge mærke til eventuelle forskelle i bindende på tværs af stammer, der er taget i denne undersøgelse. Shear parametre behandlet her var i området fysiologisk og optimeret til blodkar, som var vores mål med hensyn til RVOT.

Yderligere ændringer af metoden vil fokusere på mere effektiv forbrug af medium under proceduren samt om forenkling af montering opsætningen. Derudover ville et nyt design, herunder flere slots for væv forsamling lette en hel eksperiment i aspekter såsom effektivitet.

På nuværende tidspunkt vores metode er fokuseret på end-point resultater og blev ikke testet for realtid applikationer såsom tidsforløb af dynamiske begivenheder på væv overflade. Således, denne bredere anvendelse fortsat er under overvejelse; spørgsmål som væv autofluorescence, optimering af en passende fluorescens mikroskop protokol samt tilpasninger af kammeret skal dog løses. Yderligere kan på, metoden i sin nuværende tilstand tilpasses til real-time overvågning af bakteriel binding til EF lag på objektglas af opretstående fluorescens mikroskop. I øjeblikket er vi i stand til at visualisere bakterier og andre komponenter/blodlegemer bundet til væv af konfokalmikroskopi uden behov for eksperimentel væv efterbehandling, der disponerende for real-time visualisering under flow af inverteret Fluorescens mikroskoper.

I denne undersøgelse, blev kvantificering af bakteriel adhæsion leveret af CFU optælling mens Fluorescens mikroskopi var en støttende, ikke-kvantitative værktøj. På grund af resolution spørgsmål som følge af manglen på en tilstrækkelig mikroskop linse, viste fluorescens imaging sig for at være mindre reproducerbare i vores hænder end serielle fortyndinger. Det er dog muligt at bruge fluorescens scanning for kvantificering når egnet mål lup kunne belyse hele graft størrelse på 8 mm i diameter for pålidelig foci kvantificering. Bruger et billede behandlingsprogram (såsom ImageJ), absolut fluorescens enheder kan kvantificeres for undersøgte væv enheder og bakteriel adhæsion kan udtrykkes for eksempel som en relativ signal til intern kontrol (grafts perfunderet med ikke-mærket bakterier).

De store begrænsning af denne eksperimentelle indstilling er de spørgsmål i forbindelse med in vitro- undersøgelser i almindelighed. Resultater opnået ved hjælp af denne in vitro- flow kammer model vil kunne overføres til en dyremodel for i vivo bekræftelse.

Afslutningsvis, dette i vitro model giver mulighed for undersøgelse af enkelt bakteriel, væv og shear-baserede faktorer, der bidrager til udbrud af bakteriel adhæsion til væv i en trinvis måde. Den herved aktiveret viden kunne bidrage til udviklingen af mere effektiv forebyggelse og behandling af IE.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen.

Acknowledgments

Denne undersøgelse var sponsoreret af et tilskud af forskning fond KU Leuven (OT/14/097) givet til RH. TRV var postdoc stipendiat af CVE Research Foundation - Flandern (Belgien; Giver nummer - 12K0916N) og RH understøttes af klinisk forskning fond UZ Leuven.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine Pericardium (BP) patch, Supple Peri-Guard Pericardium Synovis Surgical Innovations, USA PC-0404SN
Bovine Jugular Vein conduits (BJV) Contegra conduit; Medtronic Inc, USA M333105D001
CH cryopreserved homograft European Homograft Bank (EHB) -
Acu-Punch Acuderm Inc, USA P850 (8 mm); P1050 (10 mm)
human Albumin Flexbumin; Baxter, Belgium BE171464
LOT:16G12C
Tryptic soy broth (TSB) Fluka, Steinheim, Germany 22092-500G
Heart infusion broth (BHI) Fluka 53286-500G
Phosphate buffered saline (PBS). Gibco 14190-094
5(6)-Carboxyfluorescein N-hydroxysuccinimide ester (CF) Sigma-Aldrich, Germany 21878-100MG-F
Peristaltic pump (MODEL ISM444B) Ismatec BVP-Z Standard; Cole Parmer, Wertheim, Germany 631942-2
Sonication bath VWR Ultrasonic Cleaner; VWR, Radnor, Pa 142-6044 230V/50 -60Hz 60VA; HF45kHz, 30W
ProLong Gold Antifade Mountant Invitrogen by ThermoFisher P36930
InCell Analyzer 2000 (fluorescence scanner) GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, Pa 29027886
Arium Pro VF - ultrapure water - H2O MilliQ Millipore 87206462
Microscopic slides - Tissue Culture Chambers (1-well) Sarstedt 94.6140.102
1-well on Lumox detachable Sarstedt 94.6150.101
Stainless Steel - surgical Blades Swann-Morton 311
Tygon Silicone Tubing, 1/8"ID x 1/4"OD Cole-Parmer EW-95702-06 Temperature range: –80 to 200°C
Sterilize: With ethylene oxide, gamma irradiation, or autoclave for 30 min, 15 psi of pressure
PharMed BPT Tubing Saint-Gobain AY242012 Autoclavable 30 min at 121°C
Tygon LMT-55 Tubing Saint Gobain Performance Plastics™ 15312022
Thermostat BMG BIOMEDIZINTECHNIK 300-0042 230V, 90VA, 50Hz

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Que, Y. A., Moreillon, P. Infective endocarditis. Nature Reviews Cardiology. 8 (6), 322-336 (2011).
  2. Werdan, K., et al. Mechanisms of infective endocarditis: pathogen-host interaction and risk states. Nature Reviews Cardiology. 11 (1), 35-50 (2014).
  3. Moreillon, P., Que, Y. A. Infective endocarditis. The Lancet. 363 (9403), 139-149 (2004).
  4. Jalal, Z., et al. Selective propensity of bovine jugular vein material to bacterial adhesions: An in vitro study. International Journal of Cardiology. 198, 201-205 (2015).
  5. Sharma, A., Cote, A. T., Hosking, M. C. K., Harris, K. C. A Systematic Review of Infective Endocarditis in Patients With Bovine Jugular Vein Valves Compared With Other Valve Types. JACC Cardiovascular Interventions. 10 (14), 1449-1458 (2017).
  6. Malekzadeh-Milani, S., et al. Incidence and predictors of Melody(R) valve endocarditis: a prospective study. Archives of Cardiovascular Diseases. 108 (2), 97-106 (2015).
  7. Hill, E. E., et al. Management of prosthetic valve infective endocarditis. American Journal of Cardiology. 101 (8), 1174-1178 (2008).
  8. Claes, J., et al. Clumping factor A, von Willebrand factor-binding protein and von Willebrand factor anchor Staphylococcus aureus to the vessel wall. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 15 (5), 1009-1019 (2017).
  9. Fowler, T., et al. Cellular invasion by Staphylococcus aureus involves a fibronectin bridge between the bacterial fibronectin-binding MSCRAMMs and host cell beta1 integrins. European Journal of Cell Biology. 79 (10), 672-679 (2000).
  10. Patti, J. M., Hook, M. Microbial adhesins recognizing extracellular matrix macromolecules. Current Opinion in Cell Biology. 6 (5), 752-758 (1994).
  11. Massey, R. C., et al. Fibronectin-binding protein A of Staphylococcus aureus has multiple, substituting, binding regions that mediate adherence to fibronectin and invasion of endothelial cells. Cellular Microbiology. 3 (12), 839-851 (2001).
  12. Jashari, R., et al. Belgian and European experience with the European Homograft Bank (EHB) cryopreserved allograft valves--assessment of a 20 year activity. Acta Chirurgica Belgica. 110 (3), 280-290 (2010).
  13. Cheatham, J. P., et al. Clinical and hemodynamic outcomes up to 7 years after transcatheter pulmonary valve replacement in the US melody valve investigational device exemption trial. Circulation. 131 (22), 1960-1970 (2015).
  14. Que, Y. A., et al. Fibrinogen and fibronectin binding cooperate for valve infection and invasion in Staphylococcus aureus experimental endocarditis. The Journal of Experimental Medicine. 201 (10), 1627-1635 (2005).
  15. Veloso, T. R., et al. Bacterial adherence to graft tissues in static and flow conditions. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 155 (1), 325-332 (2018).
  16. Liesenborghs, L., Verhamme, P., Vanassche, T. Staphylococcus aureus, master manipulator of the human hemostatic system. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16 (3), 441-454 (2018).
  17. Chiu, J. J., et al. Shear stress increases ICAM-1 and decreases VCAM-1 and E-selectin expressions induced by tumor necrosis factor-[alpha] in endothelial cells. Artheriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 24 (1), 73-79 (2004).
  18. Jockenhoevel, S., Zund, G., Hoerstrup, S. P., Schnell, A., Turina, M. Cardiovascular tissue engineering: a new laminar flow chamber for in vitro improvement of mechanical tissue properties. ASAIO Journal. 48 (1), 8-11 (2002).
  19. Veltrop, M. H. A. M., et al. Bacterial Species- and Strain-Dependent Induction of Tissue Factor in Human Vascular Endothelial Cells. Infection and Immunity. 67 (11), 6130-6138 (1999).

Tags

Udviklingsmæssige biologi spørgsmålet 143 Staphylococcus aureus infektiøs endocarditis vedhæftning subendothelial matrix shear stress flow kammer utætte hjerteklapper graft væv RVOT
En <em>In Vitro</em> Model af en Parallel-plade Perfusion System at studere bakteriel tilslutning til at pode væv
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ditkowski, B., Veloso, T. R.,… More

Ditkowski, B., Veloso, T. R., Bezulska-Ditkowska, M., Lubig, A., Jockenhoevel, S., Mela, P., Jashari, R., Gewillig, M., Meyns, B., Hoylaerts, M. F., Heying, R. An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues. J. Vis. Exp. (143), e58476, doi:10.3791/58476 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter