Summary
Vi beskriver en egen designade in vitro- flöde kammare modell, vilket gör att utredningen av bakteriell adherencen till ympa vävnader.
Abstract
Olika vätskeserien conduits och stent-monterade ventiler används för höger kammare utflöde tarmkanalen (RVOT) ventil ersättning hos patienter med kongenital hjärtsjukdom. När du använder protetiska material emellertid, är dessa transplantat mottagliga för bakterieinfektioner och olika värd svaren.
Identifiering av bakteriell och värd faktorer som spelar en viktig roll i endovaskulär följsamhet av mikroorganismer är av betydelse att bättre förstå patofysiologin bakom uppkomsten av infektioner som endokardit (IE) och att utveckla förebyggande strategier. Därför behövs utveckling av behöriga modeller att undersöka bakteriell vidhäftning fysiologiska skeva villkor. Här, beskriver vi användningen av en nydesignade in vitro- perfusion kammare baserat på parallella plattor som gör studien av bakteriell vidhäftning till olika komponenter av transplantat vävnader såsom synliga extracellulärmatrix, endotelceller och inert områden . Denna metod kombineras med kolonibildande enhet (CFU) räknar är tillräcklig för att utvärdera transplantat material benägenhet mot bakteriell vidhäftning under flöde. Ytterligare kan på, flöde kammare systemet användas för att undersöka betydelsen av blodkomponenter i bakteriell vidhäftning skeva villkor. Vi visat att källan till vävnad, deras ytan morfologi och bakteriearter specificitet inte är de stora avgörande faktorerna i bakteriell adherencen till ympa vävnader med hjälp av vår egen designade i vitro perfusion modell.
Introduction
Staphylococcus aureus (S. aureus) sysselsätter en mängd virulens strategier att kringgå immunförsvar värdsystemet kolonisera biologiska eller icke-biologiska ytor som implanteras i mänskliga cirkulationen, vilket leder till allvarlig intravaskulär infektioner såsom sepsis och IE1,2,3,4,5. IE förblir en viktig behandling associerade komplikation hos patienter efter implantation av hjärtklaffprotes medan enskilda faktorer som bidrar till uppkomsten av IEare inte ännu fullt förstådd6,7. Under flödesförhållanden möter bakterier skeva styrkor, som de måste övervinna för att hålla sig till fartygets vägg8. Modeller, som tillåter att studera samspelet mellan bakterier och protes ventil vävnad eller endotel under flöde, är av intresse då de avspeglar i vivo situationen mer.
Flera specifika mekanismer underlätta bakteriell vidhäftning till endotelceller (ECs) och den exponerade subendothelial matrix (ECM) leder till vävnad koloniseringen och mognaden av vegetation, att vara viktiga tidiga steg i IE9. Olika staphylococcal ytproteiner eller MSCRAMMs (mikrobiell ytan komponenter erkänner limmatris molekyler) har beskrivits som medlarear av vidhäftning till värdceller och ECM proteiner genom att interagera med molekyler såsom Fibronektin, fibrinogen, kollagen och von Willebrand faktor (VWF)8,10,11. Dock med tanke på inom molekylär vikning av vissa virulensfaktorer, mestadels studerade i statiska förhållanden, kan många av dessa interaktioner ha olika betydelse i endovaskulär infektioner i cirkulerande blod.
Därför presenterar vi en egen designade in vitro- parallell-plattan kammare modell för flödet, vilket gör bedömningen av bakteriell vidhäftning till olika komponenter i ECM och ECs i samband med vävnad ympkvistar implanteras i RVOT position. Det övergripande syftet med den metod som beskrivs i detta arbete är att studera mekanismer i samspelet mellan bakterier och underliggande endovaskulär vävnader i flödet villkorar, som är nära relaterade till den in-vivo -miljön i blodomloppet patogener såsom S. aureus. Denna nya strategi fokuserar på känslighet av transplantat vävnaden ytor till bakteriell vidhäftning att identifiera potentiella riskfaktorer för utveckling av IE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. förbereda Graft vävnader för In Vitro studier
Obs: Användes tre typer av vävnader: nötkreatur hjärtsäck patch (BP), fryst tillstånd Homograft (CH) och bovin halsvenen transplantat (BJV). Vid BJV conduit och CH (vävnad behandlas av den europeiska Homograft Bank (EHB) och lagras i flytande kväve före användning), användes både vägg och valvulär broschyrer. BP patch och BJV conduit köptes från tillverkarna. Före användning, Tina CH efter EHB instruktioner12.
- Skölj alla vävnader med 0,9% NaCl före användning.
- Förbereda vävnadsbiopsier använder en disponibel hudbiopsi punch att skära cirkulära vävnad bitar (10 mm i diameter).
- Skär alla vävnad patchar till samma höjd med disponibel steril skalpeller.
- För vävnader fast med glutaraldehyd (till exempel BJV conduit), inkubera transplantat bitar över natten vid 4 ° C med 200 g/L av humant albumin att neutralisera fixativ.
- Tvätta ut rester av glutaraldehyd med 0,9% NaCl i en mikrotiterplattan. Upprepa 3 gånger i 1 minut.
2. förbereda bakterier för Perfusion experiment
Obs: Tre bakteriella isolat användes: S. aureus Cowan (ATCC 12598), S. epidermidis ATCC 149900 och S. sanguinis NCTC 7864. S. aureus och S. epidermidis odlades vid 37 ° C i tryptic soy buljong (TSB) och S. sanguinis odlades vid 37 ° C med 5% CO2 i hjärnan hjärtat infusion buljong (BHI).
- Förbereda overnight kultur av bakterier på en solid blodagar tallrik.
- Använd en steril ögla att skrapa frysta bakterierna bort och Inokulera på Mueller-Hinton blodagar plåt för övernattning kultur vid 37 ° C.
- Använd en steril inympning slinga att plocka upp en enda koloni från övernattning blodagar kulturen och Inokulera i 10 mL av TSB eller BHI i en 14 mL tub och kultur över natten vid 37 ° C.
- Centrifugera övernattning kulturer (3000 x g, 4 ° C, 10 min) och återsuspendera pellets i 10 mL av fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Placera 14 mL tuber på is.
- Förbereda en alikvot av 3,7 mg/mL lösning 5 (6) - karboxi - fluorescein N-hydroxy-succinimidyl Ester (CF) i etanol och förvaras vid-20 ° C. Späd ytterligare beståndet av CF till 150 µg/mL med hjälp av 'ultrarent' vatten.
Obs: Ljuskänsligt rören med hjälp av aluminiumfolie och förvaras vid-20 ° C. - Centrifugera bakterierna (3000 x g, 4 ° C, 10 min) och återsuspendera pellets i 800 µL av PBS och tillsätt 200 µL av 150 µg/mL CF lösningen (slutlig koncentration på 30 µg/mL som används för perfusion experiment). Skydda rören mot ljus med aluminiumfolie och inkubera i 30 min med orbitalskak.
- Efter märkning, block med 2% bovint serumalbumin (BSA) lösning i PBS och snurra (3000 x g, 4 ° C, 10 min). Följ med en TVÄTTNINGSSTEGET med 10 mL PBS och pellet bakterier genom centrifugering (3000 x g, 4 ° C, 10 min).
- Späd ut bakterier med PBS att erhålla 107 kolonibildande enheter (CFU) /mL (verifierad av CFU räknar Mueller-Hinton blodagar plattor), vilket motsvarar en OD600 (optisk densitet) på 0,65. Hålla rören i mörkret på is före perfusion experiment.
Observera. Tänk på att OD600 mätningar återspeglar det ungefärliga antalet bakterier. För att räkna effektivt inympning dosen, är seriell utspädning metoden ytterligare ett nödvändigt steg att verifiera OD baserat siffror som beskrivs i avsnitt 3.8.
3. in vitro Perfusion experiment med en parallell-plattan Flow kammare
- Montera vävnadsbiopsier 10 mm i diameter och av samma tjocklek (förberedd i steg 1,1-1,5) i ett flöde kammaresystem med insidan uppåt till komma i kontakt med bakteriesuspensionen.
Obs: Samma vävnad tjocklek över olika ympkvistar säkerställer att samma vävnad höjd nås i kanalen så att laminärt flöde i alla förhållanden. Alla delar av flödet kammaren presenteras och beskrivs i figur 1.- För att påbörja protokollet, placera runda vävnad pjäsen mellan ett objektglas med en 8 mm cirkulär perforering och en gummipackning.
Obs: Objektglas äger Ultra-tunn botten filmen så att generationen av 8 mm hålet. Tillsammans med bladet gummi, det fixar vävnaden för att aktivera direktkontakten mellan preparatet och det flödande medlet och förhindrar också förskjutning av biopsi under experimentet. Ytan av den undersökta vävnaden, som är utsatt för flödet (mindre diameter) kan inte manipuleras av tången. - Sätt hållaren med vävnaden i bladet packning som är inbäddad i botten metallramen på avdelningen.
- Fäst den övre metallramen med motsvarande packning bladet på den nedre delen av kammaren med tidigare infogat vävnad innehavaren. Därefter montera hela kammaren med åtta skruvarna och skruva nötter. Se till att kammaren höjden över ympkvistar är alltid samma.
Obs: Kammaren höjden bör bestämmas alltid vid dra åt skruvarna. Använd ett skjutmått eller linjal.
- För att påbörja protokollet, placera runda vävnad pjäsen mellan ett objektglas med en 8 mm cirkulär perforering och en gummipackning.
- Anslut flöde kammaren med en Peristaltisk pump och vätske behållaren med rör.
- BEGJUTA vävnader med suspensioner av 107 CFU/mL (verifierad av CFU räknar och relaterade till OD600 mätningar) fluorescently-märkt bakterier i PBS med en skjuvspänning 3 dyn/cm2 (dyn per kvadratcentimeter tryckenheten) av medel av den peristaltiska pumpen (flödeshastighet 4 mL/min) för 1 h med en 400 mL bakteriell reservoar (egen design, figur 1) luftkonditionerade vid 37 ° C med en plåt termostat (Tabell för material).
- Återcirkulera kontinuerligt 100 mL bakteriesuspensionen använder samma samling reservoaren.
- Efter perfusion, Demontera kammaren för att släppa transplantat och tvätta vävnad stycke två gånger med 4 mL PBS i en 12-well platta med laboratorium orbital shaker för 3 min varje. Därefter skär den inre delen av graften använder en hudbiopsi punch av mindre diameter.
- Placera varje vävnad biopsi i en separat 14 mL tub innehållande 1 mL steril 0,9% NaCl. Märk röret som #1.
- Koppla bort bakterierna från vävnaden med ett ultraljudsbehandling bad för 10 min (amplitud = 100% och frekvens = 45 kHz).
Obs: Fullständig avskildhet av bakterier från vävnaden grafts utvärderas vid inkubering av patchar över natten vid 37 ° C i TSB flytande medium följt av OD600 mätningar jämfört styra fläckar behandlas med en bakterier gratis lösning. - Använda en seriell utspädning metoden på Mueller-Hinton blodagar tallrikar för att räkna CFUs.
- Förbereda en enda 14 mL tub med 10 mL steril koksaltlösning att göra seriespädningar av bakteriesuspensionen erhålls efter ultraljudsbehandling. Etikett denna tube som #2.
Obs: För varje vävnad experiment en tub med 10 mL 0,9% NaCl är nödvändigt. - Förbered tre 14 mL rör med 10 mL steril 0,9% NaCl för seriespädningar av inledande bakteriesuspensionen från steg 2,7. Märk rören enligt följande #3, #4, #5.
Obs: Detta steg är nödvändigt att veta antalet verkliga CFU i bakteriesuspensionen används för perfusion experimentet. - Vortex blanda varje rör för 15 s. Vortex rören med vävnad biopsi samt inledande bakteriesuspensionen att göra seriespädningar.
- Förbered tre agarplattor, två för vävnad experimentet (perfusion av bakterier och kontroll genomblödning av PBS) och den tredje för inledande bakteriesuspensionen används för perfusioner.
- Märka tre sektorer per platta för vävnad experimentet i den följande sätt 10-1, 10-3 och 10-4. För att räkna antalet CFUs i den bakteriella perfusates, etikett plattan enligt följande: 10-1, 10-3, 10-5 och 10-7.
Obs: Alla indikationer på agar plattor som 10-1, 10-3 och så vidare hänvisa till det slutliga antalet CFU/mL beräknat på nästa dag. Kontrollplattan kräver inte några sektorer. Före användning ska blodagar plattor placeras under laminärt huven och öppnade för att avlägsna överskottsfukt. - För att fortsätta förbereda de seriella utspädningarna, överföra 100 µL av tube #1 till #2-röret och blanda kraftigt med vortex.
- Sprida 100 µL av innehållet i röret #1 och #2 på den motsvarande sektorer 10-1 och 10-3 Skyltens agar. Likaså sprida 10 µL av röret #2 på den sektorn 10-4, upprepa detta 4 gånger för att få 4 separata utväxter från varje volym av 10 µL.
Obs: På grund av den lilla volymen används för plätering på den sektorn 10-4, är det klokt att ha flera antal droppar att göra ett genomsnittligt antal odlade CFUs. - För att förbereda de seriella utspädningarna av den ursprungliga kulturen, överföra 100 µL av bakteriesuspensionen från steg 2,7 till tube #3 och blanda kraftigt med vortex. Tillsätt 100 µL av tube #3 i rör #4 och blanda väl, upprepa proceduren för efterföljande tube #5.
- Breds 100 µL av innehållet i rör #3, #4, #5 och justerade bakteriesuspensionen (steg 2,7), respektive på sektorer 10-3, 10-5, 10-7 och 10-1 Skyltens blodagar.
- Lämna blodagar plattorna i laminar huven till luft torrt de bakteriella sprider, typiskt för 10 minuter. Efteråt, placera plattorna vid 37 ° C under natten inkubation.
- Efter natten inkubation, räknas de bakterie kolonierna för att erhålla antalet CFUs som härrör från vidhäftningen till vävnadsbiopsier as well as CFUs/mL i Start bakteriesuspensionen används för perfusionen. Redovisa resultatet som CFU/cm2.
- Förbereda en enda 14 mL tub med 10 mL steril koksaltlösning att göra seriespädningar av bakteriesuspensionen erhålls efter ultraljudsbehandling. Etikett denna tube som #2.
4. fluorescensmikroskopi av vidhäftat bakterier att ympa vävnader vid Perfusion
- Efter perfusion, tvätta vävnad bitar med PBS (se steg 3.5) och skär den inre delen av ett transplantat som använder en punsch med en mindre diameter.
- Förbereda en 6-väl tallrik och placera droppar av monteringsmedium (Tabell för material).
- Placera varje bit vävnad med dess perfunderade ytan nedåt på en enda droppe monteringsmedium.
- Läs en tallrik med en fluorescens skanner (Tabell för material). Ställa in parametrar av excitation och utsläpp våglängder enligt en fluorophore används för bakteriell märkning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Att bättre förstå mekanismerna bakom IE utveckling, denna modell möjliggör utvärdering av bakteriell och vävnad associerade faktorer förekommer i vivo situationen för infektion debut.
I detalj, den nya in vitro- metoden gör det möjligt för att kvantifiera bakteriell vidhäftning i flödesförhållanden till olika transplantat vävnader av startas fluorescently märkta bakterier över vävnader att utöva skjuvspänningar i fysiologiska intervallet 3-10 dyne / cm2 för RVOT. I detta arbete använde vi en flödeshastighet av 4 mL/min som motsvarade 3 dyn/cm2. Perfusion kammaren (visas i figur 1) med hänsyn till kanal höjd 0,3 mm över alla vävnad patchar, avståndet mellan monterade transplantat och cirka 39 mm medium inlopp, och garanterar fullt utvecklad laminärt flöde (Re = 3.89 är betydligt lägre än 2000; entré längd = 0,05 mm är betydligt mindre än avståndet 'inlopp-graft', parametrar som är nödvändiga för förutsatt att lämpligt flödesmönster).
Under skjuvspänning sågs en liknande bakteriell fastsättning över olika transplantat vävnader för både S. aureus och S. epidermidis infektion (figur 2 och figur 3). Även om inte betydande, märktes en trend mot högre vidhäftning av S. aureus till CH flygbladen.
För S. sanguinis en betydande minskning av adherencen till väggens BJV hittades jämfört med BP plåstret (figur 4. P < 0,05). När man jämför 3 arter av bakterierS. sanguinis presenterar betydligt lägre vidhäftning till BJV väggen i förhållande till S. aureus och S. epidermidis (P < 0,01 och P < 0,05 respektive, se videon). I allmänhet observerade vi en liknande bakteriell vidhäftning till alla vävnader undersökt under skjuvspänning.
Våra data från CFU räknar (figur 2, figur 3, figur 4) stöds av fluorescensmikroskopi använder en hög genomströmning skanner (figur 5, figur 6, figur 7). Bilder presenterar uttalad foci av märkta bakterier följa för att ympa vävnader. På grund av detta synsätt kunde vi direkt visualisera vävnader vid perfusion utan någon post experimentell behandling för illustration ändamål.
Resultaten visar att källan till en transplantat vävnad, surface morfologiska skillnader samt bakteriell adhesiner inte är viktigaste faktorerna för bakteriell vidhäftningatt dessa biologiska material.
Figur 1: bilden av en nyutvecklad flöde kammaresystem (egen design av institutionen av Biohybrid & medicinska textilier, AME - Helmholtz Institute for Biomedical Engineering, Aachen, Tyskland). A. flöde kammaren (1) monterad flöde uppsättning mått LxBxH: 125 x 55 x 18 mm (skruvar i kombination med muttrar håll avdelningens delar tillsammans och sätta trycket via metallramen på packningar att förhindra läckage); (2) den övre delen i kolumnen. (3) övre packning arket med två hål att fixa slangar kopplingar, som förbinder flödet kammaren med pumpen och reservoaren vätska genom slangen systemet; (4) avståndet mellan medelstora inloppet och vävnaden (entré längd); (5) tunn folie bilden (med en 8 mm cirkulär perforering att vävnaden exponering för bakteriesuspensionen) (i en fördjupning av bilden finns utrymmet för en gummipackning B9, att immobilisera vävnad bit under perfusionen); (6) botten packning arket med en dedikerad rasterna för att placera den vävnad graften monteras mellan objektglas och gummipackningen; (7) den nedre delen av flödet kammaren. B. fullständig set-up (8) i tunn folie bilden. (9) gummipackningen; (10) åtta skruvar med motsvarande (11) åtta-muttrar; (12) den vätska reservoaren (400 mL); (13) rörsystem; C. Perfusion enheten (14) den peristaltiska pumpen; (15) dedikerade slangar som klarar påfrestningarna i peristaltiska pumpverkan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Adhesion av S. aureus Cowan att ympa vävnader under flödesförhållanden. Var fluorescently märkta bakterier perfunderade över 5 transplantat vävnader (conduit väggar eller valvulär broschyrer) i PBS. Bakterier var fristående från infekterad vävnad bitar av ultraljudsbehandling. Bakteriell vidhäftning var utvärderas av seriespädningar räknande metoden CFU och anges som CFU/cm2. Alla resultat uttrycks som menar ± SEM (n > 3 för valvulär broschyrer på grund av begränsning av material; n > 5 för conduit väggar). CFU: kolonibildande enhet; BP: nötkreatur hjärtsäck; BJV: nötkreatur halsvenen; CH: frysförvarade homograft. Denna siffra har ändrats från Veloso o.a. (Tidning av bröstkorg och kardiovaskulär kirurgi 155 (1), 325-332 (2018)). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Adhesion av S. epidermidis att ympa vävnader under flödesförhållanden. Var fluorescently märkta bakterier perfunderade över 5 transplantat vävnader (conduit väggar eller valvulär broschyrer) i PBS. Bakterier var fristående från infekterad vävnad bitar av ultraljudsbehandling. Bakteriell vidhäftning var utvärderas av seriespädningar räknande metoden CFU och anges som CFU/cm2. Alla resultat uttrycks som menar ± SEM (n > 3 för valvulär broschyrer på grund av begränsning av material; n > 5 för conduit väggar). CFU: kolonibildande enhet; BP: nötkreatur hjärtsäck; BJV: nötkreatur halsvenen; CH: frysförvarade homograft. Denna siffra har ändrats från Veloso o.a. (Tidning av bröstkorg och kardiovaskulär kirurgi 155 (1), 325-332 (2018)). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Adhesion av S. sanguinis att ympa vävnader under flödesförhållanden. Var fluorescently märkta bakterier perfunderade över 5 transplantat vävnader (conduit väggar eller valvulär broschyrer) i PBS. Bakterier var fristående från infekterad vävnad bitar av ultraljudsbehandling. Bakteriell vidhäftning var utvärderas av seriespädningar räknande metoden CFU och anges som CFU/cm2. Alla resultat uttrycks som menar ± SEM (n = 3 för valvulär broschyrer på grund av begränsning material; n > 5 för conduit väggar). CFU: kolonibildande enhet; BP: nötkreatur hjärtsäck; BJV: nötkreatur halsvenen; CH: frysförvarade homograft. Denna siffra har ändrats från Veloso o.a. (Tidning av bröstkorg och kardiovaskulär kirurgi 155 (1), 325-332 (2018)). * P < 0,05. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Visualisering av S. aureus Cowan följsamhet att ympa vävnader genom fluorescensmikroskopi. Vänster till höger: BJV conduit wall, BJV bipacksedel, CH wall och CH bipacksedeln. Denna siffra har ändrats från Veloso o.a. (Tidning av bröstkorg och kardiovaskulär kirurgi 155 (1), 325-332 (2018)). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Visualisering av S. epidermidis följsamhet att ympa vävnader med fluorescensmikroskopi. Vänster till höger: BJV conduit wall, BJV bipacksedel, CH wall och CH bipacksedeln. Denna siffra har ändrats från Veloso o.a. (Tidning av bröstkorg och kardiovaskulär kirurgi 155 (1), 325-332 (2018)). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: Visualisering av S. sanguinis följsamhet att ympa vävnader med fluorescensmikroskopi. Vänster till höger: BJV conduit wall, BJV bipacksedel, CH wall och CH bipacksedeln. Denna siffra har ändrats från Veloso o.a. (Tidning av bröstkorg och kardiovaskulär kirurgi 155 (1), 325-332 (2018)). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Senaste kliniska observationer ge särskilda medvetenhet till IE som en komplikation hos patienter som genomgått ventil ersättning av RVOT6,13. Dysfunktion av implanterade ventilen i IE är resultatet av bakteriell interaktion med endovaskulär graften leder till omfattande inflammatoriska och prokoagulanta reaktioner1,14. Presenterade nya in vitro- modellen tillät oss att undersöka om skillnader i vävnad strukturer och bakteriella faktorer är sannolikt att modulera mottagligheten för infektioner i vivo används transplantat15. BJV och CH transplantat vävnad visade liknande benägenhet mot bakteriell rekrytering i flödesförhållanden. Data tyder därför på att i allmänhet källan till vävnaden och dess ytstruktur samt specifika bakteriell självhäftande proteiner i sig inte är de stora avgörande faktorerna i inledande bakteriell vidhäftning.
I allmänhet vägar frammana inflammation, vävnad skada, trombocyter och fibrin nedfall på webbplatsen infekterade endovaskulär aktiveras av flera spelare1,16. En stor fördel med den utveckla in vitro- modellen är möjlighet att analysera stegvis bidrag inblandade spelare. Enda bakteriella faktorer kan undersökas med hjälp av muterade bakteriestammar eller genetiskt modifierade bakterier att uttrycka inre friktion proteiner på deras yta14. Genom att välja olika perfusion media, plasma eller blod, kan medverkan av plasmaproteiner och blodkroppar utvärderas. Fortsatta studier kommer att fokusera på vävnad relaterade faktorer för vilka vävnader kommer att pre ruvade med till exempel plasmaproteiner innan monterad i flödet kammaren för efterföljande perfusion. Sedan spelare som bidrar till uppkomsten av protes ventil dvs förblir oklart, framtida studier kan riva upp de potentiella faktorerna genom att bygga upp till en mer komplexa experiment. Dessutom ärver detta experimentellt ställa in möjligheten att vävnader kan vara seedad med en EG-lager för att analysera skjuvning-beroende EG genuttryck. Parallell-plattan flöde kammaren tillåter också perfusion över EG-täckt objektglas på grund av en flexibel inre höjd av perfusion kammaren. Olika beläggningar av täckglas använder olika extracellulära matrix proteiner är också ett möjligt alternativ att bedöma viktiga interaktioner med subendothelial matrisen. Dessutom kan farmakologiska hämmare eller funktionella antikroppar undersökas för sin effekt i respektive skick i kammaren flöde. Sammanfattningsvis kan olika förhållanden studeras av ökande komplexitet.
Inflammatorisk aktivering på det smittade området av transplantatet är ett avgörande, skjuvning-kontrollerad steg som gynnar nedfall av aktiverade trombocyter och monocyter. Effekterna av skjuvning styrkor på bakteriell adherence till vävnaden ytor är till stor oro. För att lösa problemet, nyhet presenteras i vitro systemet fokuserar på möjligheten att montera vävnader i ett flöde. Detta förstärker betydelsen av metoden utöver befintliga alternativ, där vanligtvis statiska samspelet mellan bakterier och underliggande vävnader har undersökts. Även om skjuvspänningen lämnades av skakningar eller andra yttre krafter, har det inte standardiserats till samma nivå som vi kan få från vår enhetliga flöde modell.
In vivo en icke-fysiologisk flödesmönster kan gynna bakteriell vidhäftning som uppkomsten av IE på nivån ventil inopererad conduits. Skjuvspänningen konstaterades att uppreglera endothelial inflammatoriska parametrar såsom cytokin sekretion och öka vävnadsfaktor medierad koagulering17. Samspelet mellan den underliggande vävnad används för ventil proteser med bakterier och deras inflytande på EG genuttryck under skjuvspänning är viktigt att konstruera en ventil som är mindre kapabla av bakteriell vidhäftning och kronisk inflammation.
De basala tekniska frågorna fabricerade avdelning tillåta utredningar under standardiserade förhållanden i laminärt flöde18. För att säkerställa en fullt utvecklad laminärt flöde på platsen för den undersökta vävnaden kammaren är konstruerad för att montera transplantat i ett visst avstånd från medelstora inlopp (betydligt längre än den beräknade entré längden, se resultat och figur 1). Använder olika pumpar i systemet skulle tillåta utför experiment under pulserande eller turbulenta flödesförhållanden i framtiden.
Den flexibla bildrutan i kammaren förhindrar kammaren effektivt från att läcka och den inre höjden av ramen tillåter anpassning för vävnad tjocklek. Byggandet av hela systemet möjliggör ett cirkulerande flöde, som är av betydelse att utföra långvarig perfusioner med användning av en respektive mängd medium. Utifrån tidigare studier vår vidhäftning protokollet antas en bakteriell inympning dos av 107 CFU/mL för en 1 h inkubation4,19. Genom att använda dessa inställningar, var vidhäftning nivåerna detekterbart, om än tillräckligt låg för att kunna iaktta betydande förbättring av bakteriell vidhäftning utan mättnad av transplantat vävnadsytan. I denna tid var det dessutom möjligt att märka potentiella skillnader i bindande över stammar tas i denna studie. Skjuvning parametrar behandlas här var i intervallet fysiologiska och optimerad för blodkärlen, vilket var vårt mål med avseende på RVOT.
Ytterligare ändringar av metoden kommer att fokusera på effektivare förbrukning av medium under förfarandet samt förenkling av montering setup. Dessutom skulle en ny design inklusive flera slots för vävnad församlingen underlätta ett hela experiment i aspekter som effektivitet.
I detta skede vår metod är fokuserad på slutpunkten resultaten och har inte testats för realtidsapplikationer såsom tidsförloppet för dynamiska händelser som inträffar i vävnadsytan. Alltså fortfarande denna bredare ansökan övervägs; frågor såsom vävnad autofluorescens, optimering av ett lämpligt fluorescens Mikroskop protokoll samt anpassningar av kammaren behöver dock åtgärdas. På, får ytterligare metoden i dess nuvarande skick anpassas till realtidsövervakning av bakteriell bindning till EG lager på objektglas av upprätt fluorescens Mikroskop. För närvarande kan vi visualisera bakterier och andra komponenter/blodkroppar bunden till vävnader med konfokalmikroskopi utan behov av experimentella vävnad efterbearbetning, som predisponerande för realtid visualisering under flöde av inverterad fluorescens Mikroskop.
I denna studie var kvantifiering av bakteriell vidhäftning som tillhandahålls av CFU räknar medan fluorescensmikroskopi var ett stödjande, icke-kvantitativa verktyg. På grund av problem med namnmatchning följd av avsaknaden av en adekvat mikroskop lins, visade fluorescens imaging sig vara mindre reproducerbara i våra händer än seriespädningar. Det är dock möjligt att använda fluorescens skanning för kvantifiering när passande objektiv kunde belysa hela transplantat storlek 8 mm i diameter för tillförlitlig foci kvantifiering. Använda en bild bearbetningsprogram (såsom ImageJ), absoluta fluorescens enheter kan kvantifieras för utredas vävnadsprover och bakteriell vidhäftning kan till exempel uttryckas som en relativ signal till den interna kontrollen (ympkvistar perfusion med icke-märkta bakterier).
Den största begränsningen av denna experimentella inställning är frågor som är associerad med in vitro- studier i allmänhet. Resultat som uppnåtts med hjälp av denna kammare i vitro flöde modell skulle kunna överföras till en djurmodell i vivo bekräftelse.
Sammanfattningsvis kan denna modell in vitro- undersökning av enda bakteriell, vävnad och skjuvning-baserade faktorer som bidrar till uppkomsten av bakteriell vidhäftning till vävnader i en stegvis sätt. Härmed aktiverade kunskap kan bidra till utvecklingen av effektivare förebyggande och behandling av IE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Denna studie var sponsrad av ett bidrag på den forskning fonden KU Leuven (OT/14/097) ges till RH. TRV var postdoktor för CVE Research Foundation - Flandern (Belgien. Bevilja nummer - 12K0916N) och RH stöds av kliniska forskning fonden UZ Leuvens.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Pericardium (BP) patch, Supple Peri-Guard Pericardium | Synovis Surgical Innovations, USA | PC-0404SN | |
| Bovine Jugular Vein conduits (BJV) | Contegra conduit; Medtronic Inc, USA | M333105D001 | |
| CH cryopreserved homograft | European Homograft Bank (EHB) | - | |
| Acu-Punch | Acuderm Inc, USA | P850 (8 mm); P1050 (10 mm) | |
| human Albumin | Flexbumin; Baxter, Belgium | BE171464 LOT:16G12C |
|
| Tryptic soy broth (TSB) | Fluka, Steinheim, Germany | 22092-500G | |
| Heart infusion broth (BHI) | Fluka | 53286-500G | |
| Phosphate buffered saline (PBS). | Gibco | 14190-094 | |
| 5(6)-Carboxyfluorescein N-hydroxysuccinimide ester (CF) | Sigma-Aldrich, Germany | 21878-100MG-F | |
| Peristaltic pump (MODEL ISM444B) | Ismatec BVP-Z Standard; Cole Parmer, Wertheim, Germany | 631942-2 | |
| Sonication bath | VWR Ultrasonic Cleaner; VWR, Radnor, Pa | 142-6044 | 230V/50 -60Hz 60VA; HF45kHz, 30W |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen by ThermoFisher | P36930 | |
| InCell Analyzer 2000 (fluorescence scanner) | GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, Pa | 29027886 | |
| Arium Pro VF - ultrapure water - H2O MilliQ | Millipore | 87206462 | |
| Microscopic slides - Tissue Culture Chambers (1-well) | Sarstedt | 94.6140.102 | |
| 1-well on Lumox detachable | Sarstedt | 94.6150.101 | |
| Stainless Steel - surgical Blades | Swann-Morton | 311 | |
| Tygon Silicone Tubing, 1/8"ID x 1/4"OD | Cole-Parmer | EW-95702-06 | Temperature range: –80 to 200°C Sterilize: With ethylene oxide, gamma irradiation, or autoclave for 30 min, 15 psi of pressure |
| PharMed BPT Tubing | Saint-Gobain | AY242012 | Autoclavable 30 min at 121°C |
| Tygon LMT-55 Tubing | Saint Gobain Performance Plastics™ | 15312022 | |
| Thermostat | BMG BIOMEDIZINTECHNIK | 300-0042 | 230V, 90VA, 50Hz |
References
- Que, Y. A., Moreillon, P.
- Werdan, K., et al. Mechanisms of infective endocarditis: pathogen-host interaction and risk states. Nature Reviews Cardiology. 11 (1), 35-50 (2014).
- Moreillon, P., Que, Y. A.
- Jalal, Z., et al. Selective propensity of bovine jugular vein material to bacterial adhesions: An in vitro study. International Journal of Cardiology. 198, 201-205 (2015).
- Sharma, A., Cote, A. T., Hosking, M. C. K., Harris, K. C. A Systematic Review of Infective Endocarditis in Patients With Bovine Jugular Vein Valves Compared With Other Valve Types. JACC Cardiovascular Interventions. 10 (14), 1449-1458 (2017).
- Malekzadeh-Milani, S., et al. Incidence and predictors of Melody(R) valve endocarditis: a prospective study. Archives of Cardiovascular Diseases. 108 (2), 97-106 (2015).
- Hill, E. E., et al. Management of prosthetic valve infective endocarditis. American Journal of Cardiology. 101 (8), 1174-1178 (2008).
- Claes, J., et al. Clumping factor A, von Willebrand factor-binding protein and von Willebrand factor anchor Staphylococcus aureus to the vessel wall. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 15 (5), 1009-1019 (2017).
- Fowler, T., et al. Cellular invasion by Staphylococcus aureus involves a fibronectin bridge between the bacterial fibronectin-binding MSCRAMMs and host cell beta1 integrins. European Journal of Cell Biology. 79 (10), 672-679 (2000).
- Patti, J. M., Hook, M. Microbial adhesins recognizing extracellular matrix macromolecules. Current Opinion in Cell Biology. 6 (5), 752-758 (1994).
- Massey, R. C., et al. Fibronectin-binding protein A of Staphylococcus aureus has multiple, substituting, binding regions that mediate adherence to fibronectin and invasion of endothelial cells. Cellular Microbiology. 3 (12), 839-851 (2001).
- Jashari, R., et al. Belgian and European experience with the European Homograft Bank (EHB) cryopreserved allograft valves--assessment of a 20 year activity. Acta Chirurgica Belgica. 110 (3), 280-290 (2010).
- Cheatham, J. P., et al. Clinical and hemodynamic outcomes up to 7 years after transcatheter pulmonary valve replacement in the US melody valve investigational device exemption trial. Circulation. 131 (22), 1960-1970 (2015).
- Que, Y. A., et al. Fibrinogen and fibronectin binding cooperate for valve infection and invasion in Staphylococcus aureus experimental endocarditis. The Journal of Experimental Medicine. 201 (10), 1627-1635 (2005).
- Veloso, T. R., et al. Bacterial adherence to graft tissues in static and flow conditions. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 155 (1), 325-332 (2018).
- Liesenborghs, L., Verhamme, P., Vanassche, T. Staphylococcus aureus, master manipulator of the human hemostatic system. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16 (3), 441-454 (2018).
- Chiu, J. J., et al. Shear stress increases ICAM-1 and decreases VCAM-1 and E-selectin expressions induced by tumor necrosis factor-[alpha] in endothelial cells. Artheriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 24 (1), 73-79 (2004).
- Jockenhoevel, S., Zund, G., Hoerstrup, S. P., Schnell, A., Turina, M. Cardiovascular tissue engineering: a new laminar flow chamber for in vitro improvement of mechanical tissue properties. ASAIO Journal. 48 (1), 8-11 (2002).
- Veltrop, M. H. A. M., et al. Bacterial Species- and Strain-Dependent Induction of Tissue Factor in Human Vascular Endothelial Cells. Infection and Immunity. 67 (11), 6130-6138 (1999).
