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Developmental Biology

Ein In-vitro- Modell eines Systems Parallel-Platte Perfusion, bakteriellen Einhaltung der Gewebe Transplantat zu studieren

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58476
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 3, 3, 3, 4, 1, 5, 2, 1
1Cardiovascular Developmental Biology, Department of Cardiovascular Sciences, KU Leuven, 2Centre for Molecular and Vascular Biology, Department of Cardiovascular Sciences, KU Leuven, 3Department of Biohybrid & Medical Textiles, AME - Helmholtz Institute for Biomedical Engineering, RWTH Aachen University, 4European Homograft Bank, Saint Jean Clinique, 5Division of Clinical Cardiac Surgery, Department of Cardiovascular Sciences, KU Leuven

Summary

Wir beschreiben eine Inhouse entwickelten in-vitro- Flow Kammer-Modell, ermöglicht die Untersuchung der bakteriellen Einhaltung Gewebe Transplantat.

Abstract

Rechtsventrikuläre Abfluss-Darm-Trakt (RVOT) Klappenersatz bei Patienten mit angeborenen Herzfehlern dienen verschiedene Ventil Leitungen und Ventile Stent montiert. Bei Verwendung von prothetische Materialien jedoch, sind diese Transplantate anfällig für bakterielle Infektionen und verschiedene Host Antworten.

Identifizierung von Bakterien und Host Faktoren, die eine entscheidende bei endovaskulären Einhaltung von Mikroorganismen Rolle ist wichtig zum besseren Verständnis die Pathophysiologie der das Auftreten von Infektionen wie infektiöse Endokarditis (IE) und präventiv zu entwickeln Strategien. Daher muss die Entwicklung zuständigen Modelle, bakterielle Adhäsion unter physiologischen scher Bedingungen zu untersuchen. Hier beschreiben wir die Verwendung einer neu gestalteten in-vitro- Perfusion Kammer basierend auf parallelen Platten, die ermöglicht, dass die Untersuchung der bakteriellen Einhaltung der verschiedenen Komponenten des Transplantats Gewebe ausgesetzt wie extrazelluläre Matrix, Endothelzellen und inerte Bereiche . Diese Methode kombiniert mit koloniebildenden Stückzählen (CFU) ist ausreichend, um die Neigung des Knochenmaterials gegen bakterielle Adhäsion unter Strömung zu bewerten. Könnte die Flow-Kammer-System weiterverwendet werden, die Rolle von Blutbestandteilen in bakterielle Adhäsion unter Scherung Bedingungen zu untersuchen. Wir bewiesen, dass die Quelle der Gewebe, ihre Oberflächenmorphologie und Bakterienarten Spezifität sind nicht die großen bestimmenden Faktoren im bakteriellen Einhaltung Gewebe Transplantat durch unsere hauseigene gestaltete in-vitro- Perfusion Modell.

Introduction

Staphylococcus aureus (S. Aureus) beschäftigt eine Vielzahl von Virulenz Strategien zur Umgehung der Host Immunabwehr besiedeln biologische oder nicht-biologischen Oberflächen implantiert in den menschlichen Kreislauf, führt zu schweren intravaskuläre Infektionen wie Sepsis und IE1,2,3,4,5. IE bleibt eine wichtige Behandlung verbundene Komplikation bei Patienten nach Implantation der Prothese Herzklappen während der einzelnen Faktoren für das Auftreten von IEare nicht noch völlig verstanden6,7. Unter Strömungsbedingungen begegnen Bakterien Scherkräfte, die sie benötigen, zu überwinden, um das Schiff Wand8einhalten. Modelle, die studieren des Zusammenspiel zwischen Bakterien und prothetische Ventil Gewebe oder Endothel unter Strömung zu ermöglichen, sind von Interesse, da sie die in-Vivo -Situation mehr widerspiegeln.

Mehrere spezifische Mechanismen ermöglichen bakterielle Einhaltung der Endothelzellen (ECs) und der exponierten subendothelial Matrix (ECM) führt zu Gewebe Kolonisation und Reifung der Vegetationen, wesentlichen frühen Schritte in IE9. Verschiedene Staphylokokken Oberflächenproteine oder MSCRAMMs (mikrobielle DGM-Komponenten erkennen Haftmatrix Moleküle) wurden als Vermittler der Adhäsion Wirtszellen und ECM Proteine beschrieben durch die Interaktion mit Molekülen wie Fibronektin, Fibrinogen, Kollagen und von-Willebrand-Faktor (VWF)8,10,11. Jedoch haben viele dieser Interaktionen aufgrund intramolekularer Falte der einige Virulenzfaktoren, meist unter statischen Bedingungen untersucht unterschiedliche Relevanz endovaskuläre Infektion im Blut zirkulieren.

Deshalb präsentieren wir ein Inhouse gestalteten in-vitro- Parallel-Platte Fluss Kammer-Modell, ermöglicht die Beurteilung der bakteriellen Einhaltung der verschiedenen Komponenten von ECM und ECs im Zusammenhang mit Gewebetransplantate in die RVOT-Position implantiert. Das allgemeine Ziel des in dieser Arbeit beschriebenen Verfahrens ist es, Mechanismen der Interaktion zwischen Bakterien und darunter liegende endovaskuläre Gewebe in Strömungsverhältnisse, die eng, für die in-Vivo -Umwelt Blutkreislauf Krankheitserreger wie verbunden sind zu studieren S. Aureus. Dieser neuartige Ansatz konzentriert sich auf die Anfälligkeit der Transplantat Gewebe Oberflächen zu bakteriellen Einhaltung der Risikofaktoren für die Entwicklung von IE zu identifizieren.

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Protocol

1. Vorbereitung Graft Gewebe für In-vitro- Studien

Hinweis: Drei Arten von Geweben wurden verwendet: Bovine Perikard Patch (BP), kryokonserviert Homograft (CH) und Rinder Halsschlagader Transplantate (BJV). Im Falle der BJV Conduit und CH (Gewebe durch europäische Homograft Bank (EHB) verarbeitet und gespeichert in flüssigem Stickstoff vor der Verwendung) dienten die Wand und Herzklappenfehler Flugblätter. BP-Patch und BJV Conduit wurden von den Herstellern gekauft. Vor dem Gebrauch auftauen der EHB Anweisungen12nach CH.

  1. Spülen Sie alle Gewebe mit 0,9 % NaCl vor dem Gebrauch ab.
  2. Bereiten Sie Gewebebiopsien Einweg Hautbiopsie mit Punsch, kreisförmige Gewebe Stücke (10 mm Durchmesser) zu schneiden.
  3. Schneiden Sie alle Gewebe-Patches auf die gleiche Höhe mit sterilen Einweg-Skalpelle.
  4. Inkubieren Sie für Gewebe mit Glutaraldehyd (z. B. BJV Conduit) fixiert Transplantat Stücke über Nacht bei 4 ° C mit 200 g/L von Humanalbumin, das Fixiermittel zu neutralisieren.
  5. Auswaschen Rückstände von Glutaraldehyd mit 0,9 % NaCl in einer Mikrotiterplatte.  Wiederholen Sie 3-Mal für 1 Minute.

2. Vorbereitung Perfusion Experimente mit Bakterien

Hinweis: Drei bakterielle Isolate wurden verwendet: S. Aureus Cowan (ATCC 12598), ATCC 149900 S. Epidermidis und S. Sanguinis NCTC 7864. S. Aureus und S. Epidermidis wurden bei 37 ° C in tryptic Soy Bouillon (TSB) und S. Sanguinis wurde bei 37 ° C mit 5 % CO2 im Gehirn Herz Infusion Brühe (BHI) angebaut.

  1. Über Nacht Kultur von Bakterien auf einem soliden Blutagar Teller vorzubereiten.
    1. Verwenden Sie eine sterile Schleife um die gefrorenen Bakterien abkratzen und impfen auf einen Mueller-Hinton-Blutagar-Teller für Übernachtung Kultur bei 37 ° C.
  2. Verwenden Sie eine sterile Inokulation Schleife zu holen eine einzige Kolonie von der Übernachtung Blutagar Kultur und impfen in 10 mL TSB oder BHI 14 mL-Tube und Kultur über Nacht bei 37 ° C.
  3. Zentrifugieren Sie Übernacht Kulturen (3000 x g, 4 ° C, 10 min) und erneut die Pellets in 10 mL von Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Legen Sie 14 mL-Tuben auf Eis.
  4. Bereiten Sie eine aliquote 3,7 mg/mL Lösung von 5 (6) - Carboxy - Fluorescein N-hydroxy-Succinimidyl Ester (CF) in Ethanol und Lagerung bei-20 ° C. Weiter verdünnen Sie den Bestand an CF 150 µg/ml mit "Reinstwasser".
    Hinweis: Rohre vor Licht mit Alufolie schützen und speichern bei-20 ° C.
  5. Zentrifugieren Sie die Bakterien (3000 x g, 4 ° C, 10 min) und Aufschwemmen Sie der Pellets in 800 µL PBS und fügen Sie 200 µL der 150 µg/mL CF Lösung (Endkonzentration von 30 µg/mL für Perfusion Experimente genutzt). Rohre vor Licht mit Alufolie schützen und 30 min mit einem Orbitalschüttler inkubieren.
  6. Nach der Kennzeichnung, block mit 2 % Rinderserumalbumin (BSA) Lösung mit PBS-Puffer und spin (3000 x g, 4 ° C, 10 min). Folgen Sie mit einem Waschschritt mit 10 mL PBS und Pellet Bakterien durch Zentrifugieren (3000 x g, 4 ° C, 10 min).
  7. Verdünnen Sie Bakterien mit PBS zu 107 Koloniebildenden Einheiten (KBE) /mL (überprüft von KBE zählen auf Mueller-Hinton-Blutagar-Platten), das entspricht einer OD600 (Extinktion) von 0,65. Halten Sie die Rohre in der Dunkelheit auf dem Eis vor Perfusion Experimente.
    Hinweis. Denken Sie daran, dass die OD600 Messungen die ungefähre Anzahl der Bakterien widerspiegeln. Um die wirksame Impfung Dosis zu zählen, ist die serielle Verdünnungsmethode ein zusätzliche notwendiger Schritt zur Überprüfung der OD Zahlen wie im Abschnitt 3.8 beschrieben.

3. in-vitro- Perfusion Experimente mit einer Parallel-Platte fließen Kammer

  1. Montieren Sie Gewebebiopsien von 10 mm im Durchmesser und gleicher Dicke (vorbereitet in den Schritten 1.1-1.5) in ein Flow-Kammer-System mit der Innenfläche nach oben kommt man in Kontakt mit der Bakteriensuspension.
    Hinweis: Die gleiche Dicke der Gewebe in verschiedenen Transplantate sorgt dafür, dass die gleiche Höhe der Gewebe in den Kanal, so dass Laminar-Flow unter allen Bedingungen erreicht wird. Alle Elemente der Strömungsraum vorgestellt und in Abbildung 1beschrieben.
    1. Um das Protokoll zu beginnen, legen Sie die Runde Gewebe zwischen einen Objektträger mit einer 8 mm Runde Perforation und eine Gummidichtung.
      Hinweis: Die Objektträger besitzt die ultra-dünnen Unterfolie um die Generation der 8 mm Bohrung zu ermöglichen. Zusammen mit dem Gummiblatt es behebt das Gewebe um den direkten Kontakt zwischen der Probe und das strömende Medium zu ermöglichen und auch verhindert, dass die Versetzung der Biopsie während des Experiments. Die Oberfläche des untersuchten Gewebes, welches den Fluss (kleiner Durchmesser) ausgesetzt ist nicht von der Zange zu manipulieren.
    2. Legen Sie den Halter mit dem Gewebe in das Dichtung-Blatt, das in den unteren Metallrahmen der Kammer eingebettet ist.
    3. Befestigen Sie den oberen Metallrahmen mit dem entsprechenden Dichtung Blatt auf den Unterteil der Kammer mit dem zuvor eingefügten Gewebe-Halter. Anschließend montieren Sie die ganze Kammer mit acht Schrauben und Muttern. Stellen Sie sicher, dass die Höhe der Kammer in Transplantate immer identisch ist.
      Hinweis: Die Höhe der Kammer sollte immer beim Anziehen der Schrauben bestimmt werden. Verwenden Sie eine Zange oder Herrscher.
  2. Verbinden Sie die Fluss-Kammer mit einer peristaltischen Pumpe und Ausgleichsbehälter mit den Rohren.
  3. Durchspülen der Gewebe mit Suspensionen von 107 KBE/mL (verifiziert durch KBE zählen und im Zusammenhang mit OD600 Messungen) Eindringmittel beschriftet Bakterien mit PBS-Puffer mit einer Scherbeanspruchung von 3 dyn/cm2 (Dyne pro Quadratzentimeter Druckeinheit) durch Mittel der peristaltischen Pumpe (Durchflussmenge 4 mL/min) für 1 h mit 400 mL bakterielle Reservoir (Werksdesign, Abbildung 1) bei 37 ° C über eine Platte-Thermostat (Table of Materials) konditioniert.
  4. Umwälzen Sie kontinuierlich die 100 mL Bakteriensuspension verwenden den gleichen Sammelbehälter.
  5. Demontieren Sie nach Perfusion die Kammer um das Transplantat freizugeben und das Gewebe Stück zweimal mit 4 mL PBS in einer 12-Well-Platte mit dem Labor Orbitalschüttler für 3 min waschen. Anschließend Schneiden der innere Teil des Transplantats eine Hautbiopsie mit Punsch mit kleinerem Durchmesser.
  6. Legen Sie jeder Gewebeentnahme in einer separaten 14 mL Röhrchen mit 1 mL steriler 0,9 % NaCl. Beschriften Sie das Rohr als #1.
  7. Lösen Sie die Bakterien aus dem Gewebe mit einer Beschallung Bad für 10 min (Amplitude = 100 % und Frequenz = 45 kHz).
    Hinweis: Vollständige Loslösung von Bakterien aus dem Gewebe, die Transplantate nach Inkubation von Patches über Nacht bei 37 ° C im flüssigen Medium TSB gefolgt von OD600 Messungen ausgewertet werden sollen im Vergleich um zu steuern, Patches mit einer Bakterien-frei-Lösung behandelt.
  8. Verwenden Sie ein serielles Verdünnungsmethode auf Mueller-Hinton-Blutagar-Platten KBE zählen.
    1. Bereiten Sie einen einzigen 14 mL-Tube mit 10 mL steriler Kochsalzlösung Verdünnungsreihen die Bakteriensuspension erhalten nach Beschallung zu machen. Beschriften Sie diese Röhre als #2.
      Hinweis: Für jedes Gewebe Experiment eine Tube mit 10 mL 0,9 % NaCl ist erforderlich.
    2. Bereiten Sie drei 14 mL Röhrchen mit 10 mL steriler 0,9 % NaCl für serielle Verdünnungen des ersten Bakteriensuspension aus Schritt 2.7. Beschriften Sie die Schläuche wie folgt #3, #4, #5.
      Hinweis: Dieser Schritt ist notwendig, die echte KBE-Zahl in Bakteriensuspension verwendet für die Perfusion Experiment kennen.
    3. Vortex mischen jedes Rohr 15 S. Wirbel die Rohre mit der Gewebeentnahme sowie die ersten Bakteriensuspension Verdünnungsreihen zu machen.
    4. Bereiten Sie drei Agarplatten, zwei für die Gewebe-Experiment (Perfusion von Bakterien und Kontrolle Perfusion der PBS) und die dritte für die anfängliche Bakteriensuspension für Perfusionen verwendet.
    5. Beschriften Sie in drei Sektoren pro Platte für die Gewebe-Experiment in der folgenden Weise 10-1, 10-3 und 10-4. Zum zählen der Anzahl der KBE in der bakteriellen Perfusates beschriften Sie die Platte wie folgt: 10-1, 10-3, 10-5 bis 10-7.
      Hinweis: Alle Angaben auf Agar Platten wie 10-1, 10-3 usw. beziehen sich auf die endgültige Anzahl der KBE/mL am nächsten Tag berechnet. Steuerplatte erfordert keine Sektoren. Vor Gebrauch sollte Blutagar Platten platziert unter der laminar Haube und geöffnet, um überschüssige Feuchtigkeit zu entfernen.
    6. Um den Vorgang fortzusetzen, Vorbereitung der Verdünnungsreihen, übertragen Sie 100 µL Röhre #1 Rohr #2 und mischen Sie kräftig mit Vortex.
    7. 100 µL der Inhalt der Tube #1 und #2 auf die entsprechenden Sektoren 10-1 und 10-3 der Agar-Platte zu verbreiten. Ebenso verbreitet 10 µL des Rohres #2 auf dem Sektor 10-4, wiederholen Sie diesen Schritt 4 mal 4 separate Wucherungen von jedem Volumen von 10 µL zu erhalten.
      Hinweis: Aufgrund des geringen Volumens für die Beschichtung auf dem Sektor 10-4verwendet, ist es ratsam, mehrere Anzahl der Tröpfchen zu einer durchschnittlichen Anzahl von gewachsenen KBE.
    8. Um die serielle Verdünnungen der ursprünglichen Kultur vorzubereiten, übertragen Sie 100 µL Bakteriensuspension vom Schritt 2.7 auf Rohr #3 und mischen Sie kräftig mit Vortex. Tube #4 100 µL Rohr #3 hinzufügen und gut mischen, wiederholen Sie den Vorgang für nachfolgende Röhre #5.
    9. 100 µL des Inhalts der Röhren #3, #4 und #5 bereinigte Bakteriensuspension (Schritt 2.7), bzw. auf Sektoren 10-3, 10-5, 10-7 und 10-1 der Blutagar Platte verteilt.
    10. Lassen Sie den Blutagar-Platten in der laminaren Haube an der Luft trocknen die bakterielle Spreads in der Regel für 10 Minuten. Danach legen Sie die Platten bei 37 ° C für die Inkubation über Nacht.
    11. Zählen Sie nach der Inkubation über Nacht die Bakterienkolonien um die Anzahl der KBE, aus dem die Haftung an der Gewebebiopsien sowie KBE/mL in den Start Bakteriensuspension verwendet für die Perfusion zu erhalten. Drücken Sie die Ergebnisse als KBE/cm2.

(4) Fluoreszenzmikroskopie haftende Bakterien Gewebe bei der Perfusion verpflanzen

  1. Nach Perfusion, Gewebe Stücke mit PBS waschen (siehe Punkt 3.5) und schneiden Sie den inneren Teil der ein Transplantat mit einem Schlag mit einem kleineren Durchmesser.
  2. Bereiten Sie eine 6-Well-Platte und legen Sie Tröpfchen Eindeckmedium (Table of Materials).
  3. Legen Sie jedes Stück des Gewebes mit seiner perfundierten Oberfläche nach unten auf einen einzigen Tropfen Eindeckmittel.
  4. Lesen Sie einen Teller mit einem Fluoreszenz-Scanner (Table of Materials). Eingestellten Parameter des Anregung und Emission Wellenlängen entsprechend einem Fluorophore für bakterielle Kennzeichnung verwendet.

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Representative Results

Besseres Verständnis die Mechanismen hinter IE Entwicklung, dieses Modell ermöglicht die Auswertung der bakteriellen und Gewebe verbundenen Faktoren zu präsentieren, in der in-Vivo -Situation der Infektion auftreten.

Im Detail, die neuartige in-vitro- Ansatz ermöglicht die bakterielle Adhäsion in Strömungsverhältnisse zu verschiedenen Transplantat Geweben quantifizieren von Vorrichtung Eindringmittel beschriftete Bakterien in das Gewebe übt der Schubspannungen im physiologischen Bereich von 3-10 Testtinten / cm2 für die RVOT. In dieser Arbeit verwendeten wir eine Durchflussmenge von 4 mL/min, die 3 dyn/cm2entsprach. Unter Berücksichtigung der Kanalhöhe von 0,3 mm in alle Gewebe-Patches, der Abstand zwischen der montierten Transplantat und mittlere Einlauf von ca. 39 mm, die Perfusion Kammer (siehe Abbildung 1) garantiert ausgereifte laminare Strömung (Re = 3,89 ist deutlich niedriger als 2000; der Eingang Länge = 0,05 mm ist deutlich kleiner als der Abstand "Einlass-Graft", Parameter, die für die Übernahme geeigneter Strömungsmuster).

Unter Scherbelastung Bedingungen wurde eine ähnliche bakterielle Befestigung über die verschiedenen Transplantat Gewebe für S. Aureus und S. Epidermidis Infektion (Abbildung 2 und Abbildung 3) beobachtet. Zwar nicht erheblich, war ein Trend zu höheren Haftung von S. Aureus auf die CH-Flugblätter bemerkbar.

Für S. Sanguinis eine signifikante Reduktion der Einhaltung der BJV Wand fand sich im Vergleich zu den BP-Patch (Abbildung 4; P < 0,05). Beim Vergleich der 3 Arten von BakterienS. Sanguinis präsentiert deutlich geringere Adhäsion an der BJV Wand in Bezug auf S. Aureus und S. Epidermidis (P < 0,01 und P < 0,05 bzw. das Video sehen). Im Allgemeinen, beobachteten wir eine ähnliche bakterielle Adhäsion zu allen Geweben untersucht unter Scherbelastung.

Unsere Daten von KBE zählen (Abbildung 2, Abbildung 3, Abbildung 4) werden durch Fluoreszenz-Mikroskopie mit einem hohen Durchsatz-Scanner (Abbildung 5, Bild 6, Bild 7) unterstützt. Bilder sind ausgeprägte Brennpunkte der beschrifteten Bakterien haften Gewebe Transplantat präsentieren. Durch diesen Ansatz konnten wir Gewebe bei der Perfusion ohne irgendwelche Post experimentelle Bearbeitung zur Veranschaulichung direkt sichtbar zu machen.

Ergebnisse zeigen, dass die Quelle für ein Transplantat Gewebe, Oberfläche morphologische Unterschiede, sowie bakterielle Adhesins sind nicht wichtige Determinanten der bakteriellen Einhaltungzu diesen biologischen Materialien.

Figure 1
Abbildung 1: Bild des neu entwickelten Flow-Kammer-System (Werksdesign von der Abteilung biohybride & medizinische Textilien, AME - Helmholtz-Institut für biomedizinische Technik, Aachen, Deutschland). A. die Strömungsraum (1) montiert Fluss Satz von Dimensionen LxBxH: 125 x 55 x 18 mm (Schrauben mit Muttern festhalten der Kammer Teile zusammen und setzen Druck über den Metallrahmen der Dichtungen auslaufen zu verhindern); (2) der obere Teil der Säule; (3) die obere Dichtung Blatt mit zwei Löchern, Schlauch-Anschlüsse, festzusetzen, die den Strömungsraum mit der Pumpe und der Ausgleichsbehälter durch das Rohrsystem zu verbinden; (4) Abstand zwischen den mittleren Einlass und des Gewebes (Eingang Länge); (5) dünne Folie Folie (mit einer 8 mm Runde Perforation ermöglichen die Belichtung des Gewebes um die Bakteriensuspension) (in einer Ausnehmung der Folie ist der Raum für eine Gummidichtung B9, um das Stück Gewebe während der Perfusion zu immobilisieren); (6) die untere Dichtung Blatt mit einer dedizierten Ausnehmung, legen Sie das Gewebe Transplantat zwischen Objektträger und die Gummidichtung montiert; (7) das Unterteil der Kammer fließen; B. das vollständige Set-up (8) die dünne Folie Folie; (9) die Gummidichtung; (10) acht Schrauben mit entsprechenden Muttern (11) acht; (12) der Ausgleichsbehälter (400 mL); Schlauchsystem (13) ; C. Perfusion Einheit (14) der peristaltischen Pumpe; (15) gewidmet, die Schläuche widersteht die Strapazen der peristaltischen Pumpwirkung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Haftung von S. Aureus Cowan Gewebe unter Strömungsbedingungen zu verpflanzen. Eindringmittel beschriftete Bakterien wurden perfundierten über 5 Transplantat-Gewebe (Conduit Wände oder Herzklappenfehler Flugblätter) mit PBS-Puffer. Bakterien waren losgelöst von infiziertem Gewebe Stücke durch Ultraschallbehandlung. Bakterielle Adhäsion wurde von Verdünnungsreihen mit der KBE Zählmethode ausgewertet und als KBE/cm2. Alle Ergebnisse werden ausgedrückt als ± SEM (n > 3 für Herzklappenfehler Flugblätter wegen Beschränkung des Materials; n > 5 für Conduit Wände) bedeuten. KBE: koloniebildenden Einheit; BP: bovine Perikard; BJV: bovine Halsschlagader; CH: kryokonservierten Homograft. Diese Zahl wurde von Veloso Et Al. modifiziert (Zeitschrift für Thorax- und kardiovaskuläre Chirurgie 155 (1), 325-332 (2018)). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Haftung von S. Epidermidis Gewebe unter Strömungsbedingungen zu verpflanzen. Eindringmittel beschriftete Bakterien wurden perfundierten über 5 Transplantat-Gewebe (Conduit Wände oder Herzklappenfehler Flugblätter) mit PBS-Puffer. Bakterien waren losgelöst von infiziertem Gewebe Stücke durch Ultraschallbehandlung. Bakterielle Adhäsion wurde von Verdünnungsreihen mit der KBE Zählmethode ausgewertet und als KBE/cm2. Alle Ergebnisse werden ausgedrückt als ± SEM (n > 3 für Herzklappenfehler Flugblätter wegen Beschränkung des Materials; n > 5 für Conduit Wände) bedeuten. KBE: koloniebildenden Einheit; BP: bovine Perikard; BJV: bovine Halsschlagader; CH: kryokonservierten Homograft. Diese Zahl wurde von Veloso Et Al. modifiziert (Zeitschrift für Thorax- und kardiovaskuläre Chirurgie 155 (1), 325-332 (2018)). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Haftung von S. Sanguinis Gewebe unter Strömungsbedingungen zu verpflanzen. Eindringmittel beschriftete Bakterien wurden perfundierten über 5 Transplantat-Gewebe (Conduit Wände oder Herzklappenfehler Flugblätter) mit PBS-Puffer. Bakterien waren losgelöst von infiziertem Gewebe Stücke durch Ultraschallbehandlung. Bakterielle Adhäsion wurde von Verdünnungsreihen mit der KBE Zählmethode ausgewertet und als KBE/cm2. Alle Ergebnisse werden ausgedrückt als ± SEM bedeuten (n = 3 für Herzklappenfehler Flugblätter wegen Beschränkung des Materials; n > 5 für Conduit Wände). KBE: koloniebildenden Einheit; BP: bovine Perikard; BJV: bovine Halsschlagader; CH: kryokonservierten Homograft. Diese Zahl wurde von Veloso Et Al. modifiziert (Zeitschrift für Thorax- und kardiovaskuläre Chirurgie 155 (1), 325-332 (2018)). * P < 0,05. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5: Visualisierung von S. Aureus Cowan Einhaltung Gewebe mittels Fluoreszenzmikroskopie zu verpflanzen. Von links nach rechts: Prospekt BJV Conduit Wand, BJV Broschüre, CH-Wand und CH. Diese Zahl wurde von Veloso Et Al. modifiziert (Zeitschrift für Thorax- und kardiovaskuläre Chirurgie 155 (1), 325-332 (2018)). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6: Visualisierung von S. Epidermidis Einhaltung Gewebe mit Fluoreszenz-Mikroskopie zu verpflanzen. Von links nach rechts: Prospekt BJV Conduit Wand, BJV Broschüre, CH-Wand und CH. Diese Zahl wurde von Veloso Et Al. modifiziert (Zeitschrift für Thorax- und kardiovaskuläre Chirurgie 155 (1), 325-332 (2018)). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 7
Abbildung 7: Visualisierung von S. Sanguinis Einhaltung Gewebe mit Fluoreszenz-Mikroskopie zu verpflanzen. Von links nach rechts: Prospekt BJV Conduit Wand, BJV Broschüre, CH-Wand und CH. Diese Zahl wurde von Veloso Et Al. modifiziert (Zeitschrift für Thorax- und kardiovaskuläre Chirurgie 155 (1), 325-332 (2018)). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Neuere klinische Beobachtungen geben besondere Aufmerksamkeit auf IE als Komplikation bei Patienten nach einer Klappenersatz des RVOT6,13. Dysfunktion der implantierten Ventil im IE ist das Ergebnis der bakteriellen Interaktion mit der endovaskuläre Prothese führt zu umfangreichen Entzündungs- und gerinnungsfördernden Reaktionen1,14. Präsentiert neue in-vitro- Modell erlaubt uns zu untersuchen, ob Unterschiede in Gewebestrukturen und bakteriellen Faktoren dürften die Anfälligkeit für Infektionen in Vivo verwendet Transplantate15modulieren. BJV und CH Transplantat Gewebe zeigten ähnliche Neigung gegenüber bakteriellen Rekrutierung in Strömungsverhältnisse. Daher die Daten deuten darauf hin, dass im Allgemeinen die Quelle für das Gewebe und die Oberflächenstruktur sowie bestimmte bakterielle anhaftende Proteine schlechthin sind nicht bestimmenden Hauptfaktoren in der anfänglichen bakterielle Haftfähigkeit.

In der Regel Wege Entzündung hervorzurufen, Gewebe Schaden, Thrombozyten und Fibrin Ablagerung auf dem infizierten endovaskuläre Gelände werden aktiviert durch mehrere Spieler1,16. Ein großer Vorteil des entwickelten in-vitro- Modells ist die Möglichkeit, schrittweise den Beitrag der beteiligten Akteure zu analysieren. Einzelne bakterielle Faktoren untersucht werden können, mithilfe von mutierten Bakterienstämme oder gentechnisch veränderten Bakterien einzelne Adhäsion Proteine auf ihrer Oberfläche14zum Ausdruck zu bringen. Durch die Wahl verschiedener Perfusion Medien, Plasma oder Blut, kann die Beteiligung der Plasmaproteine und Blutzellen beurteilt werden. Weitere Studien konzentriert sich auf das Gewebe im Zusammenhang mit Faktoren, die für die Gewebe vorab inkubierten mit z.B. Plasmaproteine vor im Strömungsraum für nachfolgende Perfusion montiert werden. Da Spieler zu Beginn der prothetischen Ventil IE bleiben unklar, zukünftige Studien könnten potenziellen Faktoren durch Gebäude bis zu einer komplexeren Versuchsaufbau zu entwirren. Dieser Versuchsaufbau übernimmt darüber hinaus die Möglichkeit, dass Gewebe mit einer EG-scher-abhängige EG Genexpression analysieren ausgesät werden können. Die Parallel-Platte Strömungsraum ermöglicht auch Perfusion über EG-bedeckten Objektträger durch eine flexible Innenhöhe der Perfusion Kammer. Verschiedene Beschichtungen von Deckel rutscht mit verschiedenen extrazelluläre Matrixproteine sind ebenfalls eine mögliche Option wichtige Interaktionen mit der Subendothelial Matrix bewerten. Darüber hinaus können aufgrund ihrer Wirkung in den jeweiligen Zustand in unserem Strömungsraum pharmakologische Inhibitoren oder funktionalen Antikörper untersucht werden. Zusammenfassend können verschiedene Bedingungen untersucht werden, durch zunehmende Komplexität.

Entzündlichen Aktivierung auf den infizierten Bereich des Transplantats ist ein entscheidend, scher-kontrollierten Schritt Begünstigung Ablagerung von aktivierten Thrombozyten und Monozyten. Die Auswirkungen der Scherung zwingt zur bakteriellen Einhaltung der Gewebe, die Oberflächen von großer Bedeutung sind. Um dieses Problem zu beheben, konzentriert sich die Neuheit des Systems präsentiert in Vitro auf die Möglichkeit, Gewebe in einem Fluss zu montieren. Dies verstärkt die Bedeutung der Methode über die vorhandenen Alternativen, in denen in der Regel statische Interaktionen zwischen Bakterien und darunter liegende Gewebe untersucht worden sind. Obwohl Scherbeanspruchung durch Schütteln oder andere äußere Kräfte vorgelegt wurde, ist es nicht auf dem gleichen Niveau standardisiert wie wir aus unserer gleichförmigen Strömung Modell gewinnen können.

In vivo nicht physiologischen Strömungsmuster kann bakterielle Adhäsion als Beginn der IE Ebene Ventil implantierten Conduits begünstigen. Scherspannung wurde gefunden, bis regulieren-endothelialen entzündliche Parameter wie Zytokin-Sekretion und Gewebe-Faktor erhöhen Gerinnung17vermittelt. Das Zusammenspiel von das darunter liegende Gewebe verwendet für Ventil Prothesen mit Bakterien und deren Einfluss auf die EG-Genexpression unter Scherbelastung ist wichtig, ein Ventil weniger in der Lage, bakterielle Adhäsion und chronischen Entzündungen zu konstruieren.

Die basalen technische Probleme der vorgefertigten Kammer ermöglichen Untersuchungen unter standardisierten Bedingungen in Laminar-Flow-18. Um die ausgereifte Laminar-Flow auf dem Gelände des untersuchten Gewebes zu gewährleisten die Kammer ist konstruiert, um das Transplantat in einem gewissen Abstand vom mittleren Einlass zu montieren (deutlich länger als die Länge der berechneten Eingang, siehe Ergebnisse und Abb. 1). Über verschiedene Pumpen im System würde erlauben, Durchführung von Experimenten unter pulsierender oder turbulente Strömungsverhältnisse in der Zukunft.

Der flexible Rahmen der Kammer verhindert, dass die Kammer effektiv undicht und die Innenhöhe des Rahmens ermöglicht die Anpassung für dicke Gewebe. Der Bau des gesamten Systems ermöglicht eine zirkulierende Strömung, die für lang anhaltende Perfusionen mit mit einer entsprechenden Menge des Mediums führen von Bedeutung ist. Basierend auf früheren Studien unserer Haftung Protokoll angenommen eine bakterielle Inokulation Dosis von 107 KBE/mL für eine 1 h Inkubation4,19. Mithilfe dieser Einstellungen waren die Adhäsion nachweisbar, wenn auch niedrig genug, um erhebliche Verbesserung der bakteriellen Einhaltung ohne Sättigung der Gewebe Transplantat Oberfläche beobachten zu können. Außerdem in dieser Zeit war es möglich, beachten Sie mögliche Unterschiede in Bindung über Stämme, die in diese Studie aufgenommen. Scher Parameter, die hier angesprochen wurden in den physiologischen Bereich und für die Blutgefäße, die unser Ziel in Bezug auf die RVOT wurden optimiert.

Weitere Änderungen der Methode konzentriert sich auf effizienter Verbrauch des Mediums während des Verfahrens sowie über die Vereinfachung der Montage der Einrichtung. Darüber hinaus würde ein neues Design, darunter mehrere Slots für Gewebe Montage ein gesamtes Experiments in Aspekten wie Energieeffizienz erleichtern.

In dieser Phase unsere Methode konzentriert sich auf die Endpunkt-Ergebnisse und wurde nicht für Echtzeit-Anwendungen wie z. B. den zeitlichen Verlauf der dynamischen Ereignisse auf der Gewebeoberfläche getestet. So bleibt diese breitere Anwendung in Betracht gezogen; aber Themen wie Gewebe Autofluoreszenz, Optimierung eines entsprechenden Fluoreszenz-Mikroskop-Protokolls sowie Anpassungen der Kammer angegangen werden müssen. Weiter kann auf, die Methode in seinem aktuellen Zustand angepasst werden Echtzeit-Überwachung von bakterieller Bindung an EG-Schichten auf Objektträger durch aufrechte Fluoreszenzmikroskop. Derzeit sind wir in der Lage, Bakterien zu visualisieren und andere Komponenten/Blutkörperchen gebunden zu den Geweben durch konfokale Mikroskopie ohne eine Notwendigkeit für die experimentelle Gewebe Nachbearbeitung, die für die Echtzeit-Visualisierung unter Strömung durch prädisponierende invertiert Fluoreszenz Mikroskope.

In dieser Studie die Quantifizierung der bakterielle Adhäsion KBE zählen sorgte während Fluoreszenzmikroskopie eine unterstützende, nicht-quantitative Werkzeug war. Aufgrund der Probleme mit der Auflösung durch das Fehlen eines angemessenen Mikroskop-Objektiv erwies Fluoreszenz-Bildgebung sich als weniger in unseren Händen als Verdünnungsreihen reproduzierbar. Dennoch ist es möglich, verwenden Fluoreszenz zur Quantifizierung scannen, wenn geeignete Objektiv die gesamte Prothese Größe von 8 mm Durchmesser für zuverlässige Brennpunkte Quantifizierung erhellen könnte. Mit einem Bildbearbeitungsprogramm (z. B. ImageJ), absolute Fluoreszenz Einheiten könnte für die untersuchten Gewebeproben quantifiziert werden und die bakterielle Adhäsion könnte zum Beispiel als relative Signal für die interne Kontrolle (Transplantate durchströmt mit ausgedrückt werden nicht-markierten Bakterien).

Die größte Beschränkung dieser experimentellen Einstellung sind die Probleme im Zusammenhang mit in-vitro- Studien im Allgemeinen. Ergebnisse erreicht, indem dieser in-Vitro -Flow-Kammer-Modell konnte in einem Tiermodell für in Vivo Bestätigung übertragen werden.

Zusammenfassend, erlaubt dieses Modell in-vitro- Untersuchung von einzelnen bakterielle, Gewebe und scher-basierte Faktoren für das Auftreten von bakteriellen Adhäsion zu den Geweben in gewissem Sinne schrittweise. Das hiermit aktivierte wissen könnte zur Entwicklung effektiver Prävention und Behandlung von IE beitragen.

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Disclosures

Keine.

Acknowledgments

Diese Studie wurde gesponsert durch einen Zuschuss von der Research Fund KU Leuven (OT/14/097), RH gegeben. TRV war Postdoctoral Fellow der FWO Research Foundation - Flandern (Belgien; Gewährungsnummer - 12K0916N) und RH stützt sich auf die klinische Forschung Fonds UZ Leuven.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine Pericardium (BP) patch, Supple Peri-Guard Pericardium Synovis Surgical Innovations, USA PC-0404SN
Bovine Jugular Vein conduits (BJV) Contegra conduit; Medtronic Inc, USA M333105D001
CH cryopreserved homograft European Homograft Bank (EHB) -
Acu-Punch Acuderm Inc, USA P850 (8 mm); P1050 (10 mm)
human Albumin Flexbumin; Baxter, Belgium BE171464
LOT:16G12C
Tryptic soy broth (TSB) Fluka, Steinheim, Germany 22092-500G
Heart infusion broth (BHI) Fluka 53286-500G
Phosphate buffered saline (PBS). Gibco 14190-094
5(6)-Carboxyfluorescein N-hydroxysuccinimide ester (CF) Sigma-Aldrich, Germany 21878-100MG-F
Peristaltic pump (MODEL ISM444B) Ismatec BVP-Z Standard; Cole Parmer, Wertheim, Germany 631942-2
Sonication bath VWR Ultrasonic Cleaner; VWR, Radnor, Pa 142-6044 230V/50 -60Hz 60VA; HF45kHz, 30W
ProLong Gold Antifade Mountant Invitrogen by ThermoFisher P36930
InCell Analyzer 2000 (fluorescence scanner) GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, Pa 29027886
Arium Pro VF - ultrapure water - H2O MilliQ Millipore 87206462
Microscopic slides - Tissue Culture Chambers (1-well) Sarstedt 94.6140.102
1-well on Lumox detachable Sarstedt 94.6150.101
Stainless Steel - surgical Blades Swann-Morton 311
Tygon Silicone Tubing, 1/8"ID x 1/4"OD Cole-Parmer EW-95702-06 Temperature range: –80 to 200°C
Sterilize: With ethylene oxide, gamma irradiation, or autoclave for 30 min, 15 psi of pressure
PharMed BPT Tubing Saint-Gobain AY242012 Autoclavable 30 min at 121°C
Tygon LMT-55 Tubing Saint Gobain Performance Plastics™ 15312022
Thermostat BMG BIOMEDIZINTECHNIK 300-0042 230V, 90VA, 50Hz

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References

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Entwicklungsbiologie Ausgabe 143 Staphylococcus Aureus infektiöse Endokarditis Haftung Subendothelial Matrix Schubspannung Strömungsraum Herzklappenfehler Transplantat Gewebe RVOT
Ein <em>In-vitro-</em> Modell eines Systems Parallel-Platte Perfusion, bakteriellen Einhaltung der Gewebe Transplantat zu studieren
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Ditkowski, B., Veloso, T. R.,… More

Ditkowski, B., Veloso, T. R., Bezulska-Ditkowska, M., Lubig, A., Jockenhoevel, S., Mela, P., Jashari, R., Gewillig, M., Meyns, B., Hoylaerts, M. F., Heying, R. An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues. J. Vis. Exp. (143), e58476, doi:10.3791/58476 (2019).

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