Summary
Bakteriyel bağlılık doku grefti incelenmesi sağlar bir in-house tasarlanmış vitro akışı odası modeli açıklar.
Abstract
Çeşitli vanalı borular ve valfler stent takılan sağ ventrikül çıkım yolu (RVOT) kapak replasmanı konjenital kalp hastalığı olan hastalarda kullanılır. Protez malzeme ancak kullanırken, bu Greftler bakteriyel enfeksiyonlar ve çeşitli ana bilgisayar yanıt yatkındır.
Mikroorganizmaların endovasküler bağlılık içinde hayati bir rol oynamaktadır bakteriyel ve ana faktörler tanımlaması enfektif endokardit (IE) gibi enfeksiyonlar başlangıcı Patofizyoloji daha iyi anlamak ve önleyici geliştirmek için önemlidir stratejileri. Bu nedenle, fizyolojik kesme koşullar altında bakteriyel yapışma araştırmak için yetkili modelleri geliştirilmesi gereklidir. Burada, farklı bileşenleri greft dokuların bakteriyel bağlılık incelenmesi gibi hücre dışı matriks, endotel hücreleri ve etkisiz alanlarda maruz sağlar paralel tabaklarda dayalı yeni tasarlanmış vitro perfüzyon odaya nasıl kullanılacağını açıklar . Bu yöntem kombine koloni oluşturan ile sayım birimi (CFU) greft malzemeleri eğilimi bakteriyel yapışma akış altında doğru değerlendirmek için yeterli olduğunu. Daha fazla, akış odası sistemi rol kesme koşullar altında bakteriyel yapışma kan bileşenlerinin araştırmak için kullanılabilir olur. Biz bizim in-house tasarlanmış vitro perfüzyon modelini kullanarak doku gerek bakteriyel uyum içinde önemli belirleyici faktörler doku, onların yüzey morfolojisi ve bakteriyel türler özgüllük kaynağı değildir gösterdi.
Introduction
Staphylococcus aureus (S. aureus) virülans stratejileri sepsis gibi ağır damar içi enfeksiyonlar neden insan dolaşımda implante biyolojik veya biyolojik olmayan yüzeyleri kolonileşmesi ana bilgisayar bağışıklık savunma sistemini aşmak için çeşitli istihdam ve IE1,2,3,4,5. Önemli bir tedavi protez kalp kapakları IEare başlangıcı için katkıda bulunmak değil bireysel faktörler henüz tam olarak anlaşılır6,7süre implantasyonu sonrası hastaların komplikasyon ilişkili IE kalır. Akış koşullar altında gemi Duvar8' e uymak için üstesinden gelmek için ihtiyaç duydukları kesme kuvvetleri bakteri karşılaşma. Vivo durum daha fazla yansıttıkları gibi modeller, bakteri ve protez kapak doku veya akış altında endotel arasındaki etkileşimi eğitim sağlayan ilgi vardır.
Çeşitli özel mekanizmalar bakteriyel bağlılık endotel hücreleri (ECs) ve doku kolonizasyon ve vejetasyon ve IE9temel erken adımlar olmak, olgunlaşma maruz subendothelial matris (ECM) kolaylaştırmak. Çeşitli Stafilokokal yüzey proteinleri veya MSCRAMMs (yapışkanlı matris molekülleri tanıma mikrobiyal yüzey bileşenleri) aracı yapıştırılması konak hücreleri ve ECM proteinler moleküllerin fibronektin ile etkileşerek tarif edilmiştir, fibrinojen, kollajen ve von Willebrand faktör (VWF)8,10,11. Ancak, çoğunlukla statik koşullarda okudu bazı virülans faktörleri intra moleküler katlama ışığında çok bu etkileşimlerin endovasküler enfeksiyonlar kan dolaşan içinde farklı alaka olabilir.
Bu nedenle, ECM ve ECs farklı bileşenleri RVOT bulunduğu implante doku greft bağlamda bakteriyel bağlılık değerlendirmesini sağlar bir in-house tasarlanmış vitro paralel-plaka akışı odası modeli mevcut. Bu çalışmada açıklanan yöntemi genel amacını bakteri ve temel endovasküler dokularda kan dolaşımına patojenler vivo içinde çevre gibi birbiriyle yakından ilişkili akışı koşulları arasındaki etkileşim mekanizmaları incelemektir S. aureus. Bu yeni yaklaşımın duyarlılık geliştirme IE için potansiyel risk faktörleri tanımlamak için bakteriyel bağlılık için greft doku yüzeylerin üzerinde duruluyor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Vitro çalışmalar için greft doku hazırlanması
Not: Doku üç tür kullanılmıştır: sığır kalp zarını yama (BP), Cryopreserved Homogref (CH) ve sığır juguler ven greft (BJV). BJV boru ve CH (Avrupa Homogref banka (EHB) tarafından işlenen ve sıvı azot kullanmak için önceden saklanan doku) durumunda, duvar ve valvular broşür kullanılmıştır. BP yama ve BJV conduit üreticilerden satın alındı. Kullanılmadan önce12EHB yönergeleri takip CH çözülme.
- Tüm dokular kullanmadan % 0,9 NaCl önce ile yıkayın.
- Tek kullanımlık deri biyopsi kullanarak doku biyopsisi punch kesim dairesel doku parçalar (10 mm çapında) hazırlayın.
- Tüm doku düzeltme eklerinin tek kullanımlık steril neşter kullanarak aynı boyda kesilmiş.
- Oxazolidin (Örneğin BJV boru) ile sabit dokular, gecede 4 ° C'de 200 g/L ile greft parçalarını sabitleştirici nötralize etmek için insan albumini kuluçkaya.
- Oxazolidin %0,9 artıkları dışarı yıkama NaCl microtiter plaka. Bir dakika için 3 kez tekrarlayın.
2. bakteri perfüzyon deneyler için hazırlanması
Not: Üç bakteriyel yalıtır kullanılmıştır: S. aureus Cowan (ATCC 12598), S. epidermidis ATCC 149900 ve S. sanguinis NCTC 7864. S. aureus ve S. epidermidis tryptic soya suyu (TSB) 37 ° C'de yetiştirilmiştir ve S. sanguinis 37 ° c % 5 CO2 beyin kalp infüzyon suyu (BHI) ile büyüdü.
- Bir katı kan agar plaka üzerinde bakterilerin gecede kültür hazırlamak.
- Bir kısır döngü kapalı donmuş bakteriler scrape ve 37 ° C'de gecede kültür için Mueller Hinton kan agar levha üzerine aşılamak için kullanın
- Steril aşılama döngü bir koloni gecede kan agar kültüründen almak ve tekerlekli sandalye basketbolu veya BHI 10 mL 14 mL tüp ve 37 ° C'de gecede kültür içine aşılamak için kullanın
- Gecede Kültür (3000 x g, 4 ° C, 10 dk) santrifüj kapasitesi ve granül fosfat tamponlu tuz (PBS) 10 mL resuspend. 14 mL tüpler buza koyun.
- 3.7 mg/mL solüsyon 5 (6) - carboxy - floresein N-hidroksi-succinimidyl ester (CF) etanol içinde bir aliquot hazırlamak ve -20 ° C'de depolayın Daha fazla CF stok 150 µg/ml 'ultrasaf' su kullanarak oranında seyreltin.
Not: alüminyum folyo kullanarak ışıktan tüpler korumak ve -20 ° C'de depolayın - Bakteri (3000 x g, 4 ° C, 10 dk) santrifüj kapasitesi ve granül PBS 800 µL içinde resuspend ve 150 µg/mL CF çözüm (30 µg/mL perfüzyon deneyler için kullanılan son konsantrasyonu) 200 µL ekleyin. Alüminyum folyo ile ışık tüpleri korumak ve 30 dk bir orbital çalkalayıcı kullanarak kuluçkaya.
- Etiketleme sonra PBS çözümde Sığır serum albumin (BSA) % 2'si ile engellemek ve (3000 x g, 4 ° C, 10 dk) spin. Santrifüjü (3000 x g, 4 ° C, 10 dk) tarafından PBS ve Pelet bakterilerin 10 mL kullanarak bir yıkama adım ile izleyin.
- Bir OD600 itibaren 0.65 için (optik yoğunluk) karşılık gelen 107 adet koloni oluşturan (CFU) /mL, (CFU Mueller Hinton kan agar tabaklarda sayma tarafından doğrulanmadı) elde etmek için PBS ile bakteri sulandırmak. Tüpler perfüzyon deneyler önce buzda anlatmamanı.
Roman OD600 ölçümleri bakteri sayısı yaklaşık yansıtacak unutmayın. Etkili aşı dozu saymak için seri seyreltme OD doğrulamak için ek bir gerekli adım sayıların 3.8 bölümünde açıklandığı gibi temel yöntemidir.
3. vitro perfüzyon bir paralel-plaka odası akışı kullanarak deneyler
- Doku biyopsisi çapı ve (1,1-1,5 adımda hazırlanan) aynı kalınlığı 10 mm bakteriyel süspansiyon ile temas almak için yukarı bakacak şekilde iç yüzeyi ile bir akış odası sistemi monte.
Not: Aynı doku yükseklik laminar akış tüm koşullarda izin kanaldaki ulaşıldığında aynı doku kalınlığı boyunca çeşitli Greftler sağlar. Akış odasının tüm öğeler sunulan ve Şekil 1' de açıklanan.- Protokol başlamak için bir 8 mm dairesel delikli ile mikroskop slayt ve lastik conta arasında yuvarlak doku parça yerleştirin.
Not: Mikroskop slayt 8 mm delik nesil izin vermek için ultra-ince alt film sahip olur. Kauçuk örtü ile birlikte numune ve akan orta arasında doğrudan temas etkinleştirmek için doku giderir ve aynı zamanda biyopsi çıkığı deney sırasında önler. (Daha küçük çaplı) akışına maruz incelenen doku yüzeyine forseps tarafından manipüle edemez. - Doku ile sahibi odası alt metal çerçeve içinde gömülü conta sayfasına ekleyin.
- Üst metal çerçeve ile ilgili conta levha üzerine odası alt kısmı ile önceden eklenmiş doku tutucu ekleyin. Daha sonra tüm odası sekiz vida ile monte ve somun vida. Oda yüksekliği her zaman aynı greft arasında olduğundan emin olun.
Not: Oda yüksekliği her zaman vida sıkma üzerine tespit edilmelidir. Bir kumpas veya cetvel kullanın.
- Protokol başlamak için bir 8 mm dairesel delikli ile mikroskop slayt ve lastik conta arasında yuvarlak doku parça yerleştirin.
- Akış odası peristaltik pompa ve sıvı havzanın tüpler ile bağlantı kurun.
- 3 din/cm2 (santimetre kare basınç birimi başına din) kesme stres ile 107 CFU/mL (sayma ve OD600 ölçümleri için ilgili CFU tarafından doğrulanmadı) fluorescently etiketli bakteri PBS süspansiyonlar kurcalayarak tarafından sıvı peristaltik pompa araçlarının (akış oranı 4 mL/dk) 1s bir plaka termostat (Tablo reçetesi) kullanarak 37 ° C'de şartına bir 400 mL bakteriyel rezervuar (Şirket içi tasarım, Şekil 1) kullanarak için.
- Sürekli aynı toplama haznesi kullanarak 100 mL bakteriyel süspansiyon recirculate.
- Perfüzyon sonra greft serbest bırakmak ve doku parçası 4 mL ile iki kez PBS 3 dk her laboratuvar orbital çalkalayıcı kullanarak bir 12-şey plaka yıkama odası sökünüz. Daha sonra deri biyopsi kullanarak greft iç kısmı daha küçük çaplı yumruk kesti.
- Her doku biyopsisi 1 mL steril %0,9 içeren bir ayrı 14 mL tüp içine yerleştirin NaCl. Tüp #1 etiketleyin.
- 10 dakikadır sonication banyo kullanarak doku bakterilerden ayırmak (genlik = % 100 ve frekans = 45 kHz).
Not: Tam dekolmanı Greftler kuluçka gecede 37 ° C'de OD600 ölçümleri tarafından takip TSB sıvı ortamda düzeltme ekleri üzerine değerlendirilmelidir dokusundan bakterilerin bir bakteri ücretsiz çözüm ile tedavi yamaları kontrol kıyasla. - Bir seri seyreltme yöntemi Mueller Hinton kan agar tabaklarda CFUs kullanın.
- Bir tek 14 mL tüp 10 mL sonication sonra elde edilen bakteriyel süspansiyon seri dilutions yapmak için steril serum fizyolojik ile hazırlayın. Bu tüp #2 olarak etiketleyin.
Not: Her doku deney bir tüp 10 mL % 0,9 NaCl gerekli içindir. - Üç 14 mL tüpler ile steril % 0,9 10 mL hazırlamak NaCl adım 2.7 ilk bakteriyel süspansiyon, seri dilutions için. #3, #4, #5 aşağıdaki gibi tüpler etiketleyin.
Not: Bu adım bakteriyel süspansiyon perfüzyon deneme için kullanılan gerçek CFU numarasını bilmeniz gereklidir. - Girdap karışımı her tüp için 15 s. girdap tüpler doku biyopsisi yanı sıra seri dilutions yapmak için ilk bakteriyel süspansiyon.
- Üç ağar kaplamalar, iki doku deney (perfüzyon bakteri ve PBS denetim perfüzyon) ve üçüncü bir perfusions için kullanılan ilk bakteriyel süspansiyon için hazırlayın.
- Doku denemede aşağıdaki şekilde 10-1, 10-3 ve 10-4plaka başına üç kesim etiket. CFUs bakteriyel perfusates içinde saymak için aşağıdaki gibi plaka etiket: 10-1, 10-3, 10-5 ve 10-7.
Not: CFU/mL ise ertesi gün hesaplanan son sayısı Tabaklar 10-1, 10-3 ve benzeri gibi anlamlara tüm göstergeler agar üzerinde. Kontrol plaka her sektörlerde gerektirmez. Kullanmadan önce kan ağar kaplamalar laminer başlık altında yer olmalı ve aşırı nem kaldırmak için açtı. - Seri dilutions hazırlanması devam etmek için tüpün #1 100 µL tüp #2 aktarmak ve kuvvetle girdap ile karıştırın.
- Tüp #1 ve #2 ilgili sektörler 10-1 üzerine içeriğinin 100 µL ve 10-3 agar plaka yayıldı. Aynı şekilde, sektör 10-4#2 metroyla 10 µL yaymak, 4 kat 4 ayrı büyümeleri 10 µL her birimden elde etmek için bu adımı yineleyin.
Not: sektör 10-4üzerine kaplama için kullanılan küçük hacimli nedeniyle, bu damlacıkları yetişkin CFUs ortalama sayısı yapmak için birden fazla sayıda tavsiye edilir. - İlk kültür seri dilutions hazırlamak için 100 µL bakteriyel süspansiyon, 2.7 adımından tube #3 aktarmak ve kuvvetle girdap ile karıştırın. 100 µL tüpün #3 #4 tüp ekleyin ve iyice karıştırın, sonraki tüp #5 için yordamı yineleyin.
- Tüpler #3 #4, #5 ve düzeltilmiş bakteriyel süspansiyon (2.7. adım), içeriğinin 100 µL sırasıyla, sektörler 10-3, 10-5, 10-7 ve 10-1 kan agar levha yayıldı.
- Laminer hood hava için kan agar levha bakteriyel yayılır, genellikle 10 dakika için kuru bırakın. Daha sonra tabakları gecede kuluçka için 37 ° C'de yerleştirin.
- Gecede kuluçka sonra yapışma doku biyopsisi hem de CFUs/mL perfüzyon için kullanılan başlangıç bakteriyel süspansiyon sonuçlanan CFUs dizi elde etmek için bakteri kolonileri saymak. Sonuçları CFU/cm2olarak hızlı.
- Bir tek 14 mL tüp 10 mL sonication sonra elde edilen bakteriyel süspansiyon seri dilutions yapmak için steril serum fizyolojik ile hazırlayın. Bu tüp #2 olarak etiketleyin.
4. floresans mikroskobu doku perfüzyon üzerine gerek yapıştırılır bakteri
- Perfüzyon sonra PBS ile doku parçaları yıkayın (bkz. Adım 3.5) ve daha küçük çaplı bir yumruk kullanarak bir greft iç kısmı kesilmiş.
- 6-şey plaka hazırlamak ve montaj Orta (Tablo reçetesi) damlacıkları yerleştirin.
- Her parça bir doku ile perfused yüzeyi aşağı doğru montaj orta tek bir damla yerleştirin.
- Bir floresan inceden inceye gözden geçirmek (Tablo reçetesi) kullanarak bir tabak okuyun. Bakteriyel etiketleme için kullanılan bir fluorophore göre uyarma ve emisyon dalga boylarında parametrelerini ayarlamak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Arkasında mekanizmaları daha iyi anlamak için IE geliştirme, bu model sağlar bakteriyel değerlendirilmesi ve doku ilişkili faktörler enfeksiyon başlangıçlı vivo içinde durumda mevcut.
Ayrıntılı olarak, 3-10 dyne fizyolojik aralığında kesme stresleri uygulamakla doku üzerinde fluorescently etiketli bakteri ventriküler tarafından akış koşullarında farklı greft dokulara bakteriyel yapışma ölçmek için roman vitro yaklaşım sağlar / RVOT için cm2 . Bu çalışmada, bir akış hızı 3 din/cm2' ye denk 4 mL/dk kullandık. 0.3 mm kanal yüksekliği göz önünde bulundurarak tüm doku yamalar, takılı greft ve 39 mm orta giriş arasındaki mesafe arasında tam olarak gelişmiş laminar akış ( Şekil 1' de gösterilen) perfüzyon odası güvence altına alır (yeniden 3.89 = olduğunu önemli ölçüde 2000'den daha düşük; giriş uzunluğu = 0.05 mm mesafe 'giriş-greft', parametreleri uygun akış deseni varsayarak için gerekli daha önemli ölçüde daha küçük).
Yamultma stres koşullarında çeşitli greft dokular arasında benzer bir bakteriyel Eki S. aureus ve S. epidermidis enfeksiyonu (Şekil 2 ve Şekil 3) gözlenmiştir. Her ne kadar önemli değil, S. aureus daha yüksek yapışma CH broşürler için doğru bir eğilim fark edildi.
S. sanguinis BJV duvar bağlılık önemli bir azalma için BP yama (Şekil 4; karşılaştırıldığında bulunamadı P < 0,05). Ne zaman bakteriS. sanguinis 3 tür karşılaştırma sunar BJV duvara S. aureus ve S. epidermidis ile ilgili olarak önemli ölçüde daha düşük adezyon (P < 0,01 ve P < 0,05 sırasıyla, video bakın). Genel olarak, biz bütün dokulara kesme stres altında soruşturma benzer bir bakteriyel yapışma gözlenen.
Bizim verilerden (Şekil 2, Şekil 3, Şekil 4) sayma CFU (Şekil 5, Şekil 6, Şekil 7) yüksek işlem hacmi tarayıcı kullanarak floresans mikroskobu tarafından desteklenir. Resimleri etiketli bakteri dokularda gerek kalarak belirgin foci bulunuyorlar. Bu yaklaşım nedeniyle doğrudan doku perfüzyon olmadan herhangi bir yazı örnek amacıyla işleme deneysel üzerine görselleştirmek başardık.
Sonuçlar göstermek bakteriyel bağlılık önemli belirleyicileri greft doku, yüzey morfolojik farklılıklar gibi bakteriyel adhesins kaynağı değildirBu biyolojik malzemeler için.
Şekil 1: yeni geliştirilmiş akış odası sistemi (Şirket içi tasarım tarafından Biohybrid bölümü & Tıbbi Tekstil, AME - Helmholtz Enstitüsü Biyomedikal Mühendisliği, Aachen, Almanya için) görüntüsünü. A. akışı odası (1) monte edilmiş boyutlar LxWxH dizi akışı: 125 x 55 x 18 mm (vida vida-somun ile birlikte tutun odası 's bölümleri birlikte ve koymak basınç yoluyla metal çerçeve kaçağı önlemek için contalar); (2) sütunun üst kısmındaki; (3) akış odası pompa ve sıvı rezervuar boru sistemi sayesinde bağlantı hortumunun bağlayıcılar, düzeltmek için iki deliği olan üst conta çarşafa; (4) mesafe arasında orta giriş ve doku (giriş uzunluğu); (5) ince folyo slayt (ile doku maruz bakteriyel süspansiyon izin vermek için bir 8 mm dairesel delikli) (mola slayt için yer bir lastik conta doku parça perfüzyon sırasında hareketsiz için, B9,); (6) , mikroskop slayt ve lastik conta doku nakli yerleştirmek için özel bir ara ile alt conta levha monte; (7) akış odası alt kısmı; B. tam kurulum (8) ince folyo slayt; (9) lastik conta; (10) sekiz vida ile ilgili (11) sekiz vida-somun; (12) sıvı rezervuar (400 mL); (13) boru sistemi; C. perfüzyon birimi (14) peristaltik pompa; adanmış (15) bu boru peristaltik pompa eylem zorluklarına dayanmaktadır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: Yapışma S. aureus Cowan akışı koşulları altındaki dokuları gerek. Fluorescently etiketli bakteri periosteum 5 greft dokularda (boru duvar veya kapak broşürler) PBS vardı. Bakteriler enfekte doku parçalarıyla sonication tarafından ayrılmış. Bakteriyel yapışma CFU sayım yöntemini kullanarak seri dilutions tarafından değerlendirilir ve CFU/cm2olarak gösterilir. Tüm sonuçları ± SEM (n > 3 malzeme sınırlaması nedeniyle valvular broşürler için; n > 5 Kanal duvarlar için) demek olarak ifade edilir. CFU: koloni oluşturan birim; BP: sığır kalp zarını; BJV: sığır juguler ven; CH: cryopreserved Homogref. Bu rakam Veloso ve ark. değiştirildi (Göğüs ve Kalp Damar Cerrahisi Dergisi 155 (1), 325-332 (2018)). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Yapışma S. epidermidis akışı koşulları altındaki dokuları gerek. Fluorescently etiketli bakteri periosteum 5 greft dokularda (boru duvar veya kapak broşürler) PBS vardı. Bakteriler enfekte doku parçalarıyla sonication tarafından ayrılmış. Bakteriyel yapışma CFU sayım yöntemini kullanarak seri dilutions tarafından değerlendirilir ve CFU/cm2olarak gösterilir. Tüm sonuçları ± SEM (n > 3 malzeme sınırlaması nedeniyle valvular broşürler için; n > 5 Kanal duvarlar için) demek olarak ifade edilir. CFU: koloni oluşturan birim; BP: sığır kalp zarını; BJV: sığır juguler ven; CH: cryopreserved Homogref. Bu rakam Veloso ve ark. değiştirildi (Göğüs ve Kalp Damar Cerrahisi Dergisi 155 (1), 325-332 (2018)). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: Yapışma S. sanguinis akışı koşulları altındaki dokuları gerek. Fluorescently etiketli bakteri periosteum 5 greft dokularda (boru duvar veya kapak broşürler) PBS vardı. Bakteriler enfekte doku parçalarıyla sonication tarafından ayrılmış. Bakteriyel yapışma CFU sayım yöntemini kullanarak seri dilutions tarafından değerlendirilir ve CFU/cm2olarak gösterilir. Tüm sonuçları ± SEM demek gibi ifade edilir (n = 3 için malzeme; sınırlaması nedeniyle valvular broşürler n > 5 Kanal duvarlar için). CFU: koloni oluşturan birim; BP: sığır kalp zarını; BJV: sığır juguler ven; CH: cryopreserved Homogref. Bu rakam Veloso ve ark. değiştirildi (Göğüs ve Kalp Damar Cerrahisi Dergisi 155 (1), 325-332 (2018)). * P < 0,05. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: görselleştirme S. aureus Cowan bağlılık floresans mikroskobu aracılığıyla dokularda gerek. Soldan sağa: BJV boru duvar, BJV broşür, CH duvar ve CH broşür. Bu rakam Veloso ve ark. değiştirildi (Göğüs ve Kalp Damar Cerrahisi Dergisi 155 (1), 325-332 (2018)). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6: görselleştirme S. epidermidis bağlılık floresans mikroskobu kullanarak doku gerek. Soldan sağa: BJV boru duvar, BJV broşür, CH duvar ve CH broşür. Bu rakam Veloso ve ark. değiştirildi (Göğüs ve Kalp Damar Cerrahisi Dergisi 155 (1), 325-332 (2018)). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 7: görselleştirme S. sanguinis bağlılık floresans mikroskobu kullanarak doku gerek. Soldan sağa: BJV boru duvar, BJV broşür, CH duvar ve CH broşür. Bu rakam Veloso ve ark. değiştirildi (Göğüs ve Kalp Damar Cerrahisi Dergisi 155 (1), 325-332 (2018)). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Son klinik gözlemler kapak replasmanı RVOT6,13geçirmiş hastalarda bir komplikasyon olarak IE özel bilinci vermek. Disfonksiyon IE implante Vana geniş inflamatuar procoagulant reaksiyonları1,ve14için önde gelen endovasküler greft ile bakteri etkileşim sonucudur. Sunulan roman vitro modeli doku yapıları ve bakteriyel etkenler farklılıklar in vivo kullanılan greft15enfeksiyonlara yatkınlık modüle olasılığı varsa araştırmak izin verdi. BJV ve CH greft doku benzer eğilimi bakteriyel işe doğru akış koşullarında gösterdi. Bu nedenle, verileri genel olarak doku ve onun yüzey yapısı gibi spesifik bakteriyel yapışkanlı proteinlerin başına kaynağı olmadığını ilk bakteriyel uyum içinde önemli belirleyici faktörler göstermektedir.
Genel olarak, yolları iltihabı çağrıştıran, doku hasarı, trombosit ve fibrin birikimi virüslü endovasküler sitesinde aktif tarafından birden fazla oyuncu1,16. Gelişmiş vitro modeli önemli bir avantajı stepwise katılan oyuncular katkısını analiz için bir fırsattır. Tek bakteriyel etkenler bakteriyel mutant suşları veya genetiği değiştirilmiş bakteri tek yapışma proteinler onların yüzey14tarihinde ifade kullanarak soruşturma olmaktır. Farklı perfüzyon medya, plazma veya kan seçerek, plazma protein ve kan hücreleri katılımı değerlendirilebilir. Daha fazla çalışmaları doku üzerinde durulacak ilgili faktörler için doku will be daha önce Örneğin Plazma proteinleri ile önceden inkübe sonraki perfüzyon için akış odasında monte. Protez kapak başlangıcı için katkıda bulunan oyuncular beri Yani belirsiz kalır, gelecek çalışmalar potansiyel faktörler tarafından bina daha karmaşık bir deneysel kuruluma kadar çözmek. Ayrıca, bu deneysel Kur doku kesme bağımlı EC gen ekspresyonu çözümlenecek bir EC katmanla numaralı seribaşı olasılık devralır. Paralel-plaka akışı odası da perfüzyon EC kaplı mikroskop slaytlar perfüzyon odası esnek iç yüksekliği nedeniyle üzerinden izin verir. Kapak kâğıdını çeşitli hücre dışı matriks proteinleri kullanarak farklı kaplamalar da subendothelial matris ile önemli etkileşimler değerlendirmek için olası bir seçenek vardır. Buna ek olarak, farmakolojik inhibitörleri veya fonksiyonel antikorlar için onların etkisi bizim akışı odasında ilgili durumda soruşturma. Özet olarak, çeşitli koşullar karmaşıklığını artırarak okudu olabilir.
İnflamatuar aktivasyonu greft enfekte alanı, etkinleştirilmiş trombosit ve monosit lehine çok önemli, yamultma kontrollü bir adımdır. Bakteriyel bağlılık yüzeyler büyük endişe vardır doku üzerinde kesme etkisini zorlar. Bu sorunu gidermek için bir akış odası dokularda monte imkanı sunulan vitro sistem yenilik odaklanır. Bu yöntem dışında mevcut alternatifleri içinde genellikle bakteri ve temel alınan dokular arasındaki statik etkileşimler soruşturma, önemini pekiştiriyor. Yamultma stres sallayarak veya diğer dış güçler tarafından gönderilmiş olsa bile, bizim uniform akış modelinden kazandıkça bu aynı seviyeye standartlaştırılmış değil.
İçinde vivo, bir sigara-fizyolojik akım paterni bakteriyel yapışma implante hatlarından Vana düzeyinde IE başlangıç olarak lehine. Yamultma stres up-endotel inflamatuar parametreler gibi sitokin salgısının düzenlenmesi ve doku faktörü artırmak için koagülasyon17aracılı bulundu. Bakteri ve EC gen ekspresyonu kesme stres altında onların etkisi ile vana protezleri için kullanılan temel doku arasındaki etkileşimin bir vana bakteriyel yapışma ve kronik inflamasyon daha az yetenekli oluşturmak önemlidir.
Bazal teknik sorunları fabrikasyon odasının laminar akış18' soruşturma standart koşullar altında izin. İncelenen doku yerinde tam gelişmiş laminar akış sağlamak için odası orta giriş belirli bir uzaklıkta greft takmak için inşa edilmiştir (önemli ölçüde hesaplanan giriş uzunluğundan daha uzun sonuçları ve Şekil 1bakınız). Sistemdeki farklı pompa kullanarak deneyler pulsatil veya türbülanslı akış koşullarında gelecekte performans sağlayacak.
Esnek çerçeve odasının odası etkili gelen sızıntı önler ve çerçevenin iç yüksekliğinin doku kalınlığı için uyum sağlar. Tüm sistem inşaatı ile ilgili bir orta miktarda kullanarak uzun süreli perfusions gerçekleştirmek için önem taşımaktadır dolaşan bir akış sağlar. Temel alınarak önceki çalışmalarda bizim yapışma protokolü kabul bir bakteriyel aşı doz 107 CFU/mL 1 h kuluçka4,19. Bu ayarları kullanarak, yapışma düzeyleri düşük de olsa yeterince doygunluk doku greft yüzey olmadan bakteriyel bağlılık önemli enhancement gözlemlemek için tespit,. Ayrıca, bu süre içinde bu çalışmada alınan suşları arasında olası bağlama farklılıkları fark için uygun oldu. Burada ele makas parametreleri olduğunu fizyolojik aralığında ve hedefimiz RVOT açısından vardı kan damarları için optimize edilmiş.
Yöntem daha fazla değişiklikler daha verimli orta işlemi sırasında tüketiminin yanı sıra kurulum montaj basitleştirme ele alınacak. Ayrıca, birden çok yuvaları doku derleme için de dahil olmak üzere yeni bir tasarım yönleri verimliliği gibi tüm deney hafifletir miydi.
Bu aşamada bizim Yöntem son nokta sonuçlarına odaklanmıştır ve doku yüzeyinde oluşan dinamik olaylar zaman seyri gibi gerçek zamanlı uygulamalar için test değil. Böylece, bu daha geniş uygulama göz altında kalır; Ancak, doku autofluorescence, optimizasyon bir uygun floresan mikroskop protokolünün yanı sıra uyarlamalar odasının gibi konuların ele alınması gerekmektedir. Daha fazla, mevcut durumda yöntem bakteriyel bağlama mikroskop slaytlarda EC katmanlara gerçek zamanlı izleme için dik floresan mikroskop tarafından adapte. Şu anda, biz bakteri görselleştirmek edebiliyoruz ve diğer kan bileşenleri/hücre confocal mikroskobu altında akış tarafından gerçek zamanlı görselleştirme için predispozan sonrası deneysel doku işleme gerek olmadan dokulara bağlı ters floresans mikroskoplar.
Floresans mikroskobu destekleyici, nicel bir araç iken bu çalışmada, CFU sayarak bakteriyel yapışma miktar sağlandı. Bir yeterli mikroskop objektif eksikliğinden kaynaklanan kararlılık sorunları nedeniyle, floresans görüntüleme seri dilutions elimizde az tekrarlanabilir olduğu ortaya çıktı. Yine de, floresans scanning miktar için ne zaman uygun objektif lens 8 mm çapında güvenilir foci miktar için tüm greft boyutunu aydınlatmak kullanmak mümkündür. (ImageJ gibi) bir görüntü işleme programı kullanarak, mutlak floresans birimleri incelenen doku örnekleri için sayısal ve bakteriyel yapışma örneğin (periosteum greft ile iç kontrol için göreli bir sinyal olarak ifade bakteri) Sigara etiketli.
Bu deneysel ayarı büyük sınırlama genel vitro çalışmalar ile ilişkili sorunları vardır. Bu vitro akışı odası modeli kullanarak ulaştığı sonuçları bir hayvan modeli vivo içinde onay için transfer.
Sonuç olarak, bu vitro modeli soruşturma tek bakteriyel, doku ve dokulara bakteriyel yapışma başlangıcı için kademeli bir şekilde katkıda bulunan faktörler kesme tabanlı verir. Bu vesile ile etkin bilgi daha etkili önleme ve diğer tedavi IE katkıda bulunabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Hiçbiri.
Acknowledgments
Bu çalışmada RH için verilen bir hibe araştırma fonu KU Leuven (OT/14/097) sponsor oldu. TRV iki Araştırma Vakfı - Flanders (Belçika; doktora sonrası bursu aldı Sayı - 12K0916N vermek) ve RH klinik araştırma fonu UZ Leuven tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Pericardium (BP) patch, Supple Peri-Guard Pericardium | Synovis Surgical Innovations, USA | PC-0404SN | |
| Bovine Jugular Vein conduits (BJV) | Contegra conduit; Medtronic Inc, USA | M333105D001 | |
| CH cryopreserved homograft | European Homograft Bank (EHB) | - | |
| Acu-Punch | Acuderm Inc, USA | P850 (8 mm); P1050 (10 mm) | |
| human Albumin | Flexbumin; Baxter, Belgium | BE171464 LOT:16G12C |
|
| Tryptic soy broth (TSB) | Fluka, Steinheim, Germany | 22092-500G | |
| Heart infusion broth (BHI) | Fluka | 53286-500G | |
| Phosphate buffered saline (PBS). | Gibco | 14190-094 | |
| 5(6)-Carboxyfluorescein N-hydroxysuccinimide ester (CF) | Sigma-Aldrich, Germany | 21878-100MG-F | |
| Peristaltic pump (MODEL ISM444B) | Ismatec BVP-Z Standard; Cole Parmer, Wertheim, Germany | 631942-2 | |
| Sonication bath | VWR Ultrasonic Cleaner; VWR, Radnor, Pa | 142-6044 | 230V/50 -60Hz 60VA; HF45kHz, 30W |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen by ThermoFisher | P36930 | |
| InCell Analyzer 2000 (fluorescence scanner) | GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, Pa | 29027886 | |
| Arium Pro VF - ultrapure water - H2O MilliQ | Millipore | 87206462 | |
| Microscopic slides - Tissue Culture Chambers (1-well) | Sarstedt | 94.6140.102 | |
| 1-well on Lumox detachable | Sarstedt | 94.6150.101 | |
| Stainless Steel - surgical Blades | Swann-Morton | 311 | |
| Tygon Silicone Tubing, 1/8"ID x 1/4"OD | Cole-Parmer | EW-95702-06 | Temperature range: –80 to 200°C Sterilize: With ethylene oxide, gamma irradiation, or autoclave for 30 min, 15 psi of pressure |
| PharMed BPT Tubing | Saint-Gobain | AY242012 | Autoclavable 30 min at 121°C |
| Tygon LMT-55 Tubing | Saint Gobain Performance Plastics™ | 15312022 | |
| Thermostat | BMG BIOMEDIZINTECHNIK | 300-0042 | 230V, 90VA, 50Hz |
References
- Que, Y. A., Moreillon, P.
- Werdan, K., et al. Mechanisms of infective endocarditis: pathogen-host interaction and risk states. Nature Reviews Cardiology. 11 (1), 35-50 (2014).
- Moreillon, P., Que, Y. A.
- Jalal, Z., et al. Selective propensity of bovine jugular vein material to bacterial adhesions: An in vitro study. International Journal of Cardiology. 198, 201-205 (2015).
- Sharma, A., Cote, A. T., Hosking, M. C. K., Harris, K. C. A Systematic Review of Infective Endocarditis in Patients With Bovine Jugular Vein Valves Compared With Other Valve Types. JACC Cardiovascular Interventions. 10 (14), 1449-1458 (2017).
- Malekzadeh-Milani, S., et al. Incidence and predictors of Melody(R) valve endocarditis: a prospective study. Archives of Cardiovascular Diseases. 108 (2), 97-106 (2015).
- Hill, E. E., et al. Management of prosthetic valve infective endocarditis. American Journal of Cardiology. 101 (8), 1174-1178 (2008).
- Claes, J., et al. Clumping factor A, von Willebrand factor-binding protein and von Willebrand factor anchor Staphylococcus aureus to the vessel wall. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 15 (5), 1009-1019 (2017).
- Fowler, T., et al. Cellular invasion by Staphylococcus aureus involves a fibronectin bridge between the bacterial fibronectin-binding MSCRAMMs and host cell beta1 integrins. European Journal of Cell Biology. 79 (10), 672-679 (2000).
- Patti, J. M., Hook, M. Microbial adhesins recognizing extracellular matrix macromolecules. Current Opinion in Cell Biology. 6 (5), 752-758 (1994).
- Massey, R. C., et al. Fibronectin-binding protein A of Staphylococcus aureus has multiple, substituting, binding regions that mediate adherence to fibronectin and invasion of endothelial cells. Cellular Microbiology. 3 (12), 839-851 (2001).
- Jashari, R., et al. Belgian and European experience with the European Homograft Bank (EHB) cryopreserved allograft valves--assessment of a 20 year activity. Acta Chirurgica Belgica. 110 (3), 280-290 (2010).
- Cheatham, J. P., et al. Clinical and hemodynamic outcomes up to 7 years after transcatheter pulmonary valve replacement in the US melody valve investigational device exemption trial. Circulation. 131 (22), 1960-1970 (2015).
- Que, Y. A., et al. Fibrinogen and fibronectin binding cooperate for valve infection and invasion in Staphylococcus aureus experimental endocarditis. The Journal of Experimental Medicine. 201 (10), 1627-1635 (2005).
- Veloso, T. R., et al. Bacterial adherence to graft tissues in static and flow conditions. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 155 (1), 325-332 (2018).
- Liesenborghs, L., Verhamme, P., Vanassche, T. Staphylococcus aureus, master manipulator of the human hemostatic system. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16 (3), 441-454 (2018).
- Chiu, J. J., et al. Shear stress increases ICAM-1 and decreases VCAM-1 and E-selectin expressions induced by tumor necrosis factor-[alpha] in endothelial cells. Artheriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 24 (1), 73-79 (2004).
- Jockenhoevel, S., Zund, G., Hoerstrup, S. P., Schnell, A., Turina, M. Cardiovascular tissue engineering: a new laminar flow chamber for in vitro improvement of mechanical tissue properties. ASAIO Journal. 48 (1), 8-11 (2002).
- Veltrop, M. H. A. M., et al. Bacterial Species- and Strain-Dependent Induction of Tissue Factor in Human Vascular Endothelial Cells. Infection and Immunity. 67 (11), 6130-6138 (1999).
