Summary
Nous décrivons un interne conçu in vitro chambre modèle d’écoulement, qui permet à l’enquête de l’adhérence des bactéries à la greffe de tissus.
Abstract
Divers vannées conduites et vannes stent montés sont utilisés pour un remplacement valvulaire ventriculaire droite sortie voies (RVOT) chez les patients présentant une cardiopathie congénitale. Lorsque vous utilisez des matériaux prothétiques, cependant, ces greffes sont sensibles aux infections bactériennes et les différentes réactions de l’hôte.
Identification des facteurs bactériens et hôte qui jouent un rôle essentiel dans le respect du traitement endovasculaire des micro-organismes est d’importance pour mieux comprendre la physiopathologie de l’apparition d’infections telles que l’endocardite infectieuse (IE) et de développer la prévention stratégies. Par conséquent, l’élaboration de modèles compétentes pour enquêter sur l’adhérence bactérienne dans des conditions physiologiques de cisaillement est nécessaire. Nous décrivons ici l’utilisation d’une nouvellement conçu in vitro perfusion chambre basée sur des plaques parallèles qui permet que l’étude de l’adhérence des bactéries aux différentes composantes des tissus greffés exposés tels que la matrice extracellulaire, les cellules endothéliales et les zones inertes . Cette méthode combinée avec formant colonie (UFC) unité de comptage est suffisante pour évaluer la propension des matériaux de greffe à adhérence bactérienne sous flux. De plus, le système de chambre de flux peut-être servir d’enquêter sur le rôle des composants sanguins dans l’adhésion bactérienne dans des conditions de cisaillement. Nous avons démontré que la source du tissu, leur morphologie de la surface et la spécificité des espèces bactériennes ne sont pas les principaux facteurs déterminants dans l’adhérence des bactéries à la greffe de tissus à l’aide de notre modèle de perfusion interne conçu in vitro .
Introduction
Staphylococcus aureus (S. aureus) emploie une variété de stratégies de virulence de contourner le système de défense immunitaire hôte coloniser les surfaces biologiques ou non biologiques, implantés dans la circulation humaine, ce qui conduit à des infections intravasculaires sévères comme la septicémie et IE1,2,3,4,5. Restes de IE un traitement important associé à complication chez les patients après l’implantation de prothèses valvulaires tandis que les facteurs individuels qui contribuent à l’apparition de IEare ne pas encore pleinement compris6,7. Conditions d’écoulement, bactéries rencontrent les forces de cisaillement, dont ils ont besoin pour surmonter afin de respecter le mur de navire8. Modèles, qui permettent d’étudier l’interaction entre les bactéries et tissu valvulaire prothétique ou endothélium sous flux, sont intéressantes car elles reflètent la situation in vivo plus.
Plusieurs mécanismes spécifiques facilitent l’adhérence des bactéries aux cellules endothéliales (ce) et à la matrice étant exposée (ECM) conduisant à la colonisation des tissus et la maturation des végétations, sont des étapes essentielles au début dans IE9. Diverses protéines de surface staphylococciques ou MSCRAMMs (surfaces composants microbiens en reconnaissant les molécules de la matrice adhésive) ont été décrits comme des médiateurs de l’adhérence aux cellules hôtes et aux protéines ECM en interagissant avec des molécules telles que la fibronectine, facteur de fibrinogène, de collagène et de von Willebrand (VWF)8,10,11. Toutefois, compte tenu de pliage intra moléculaire de certains facteurs de virulence, étudiés pour la plupart dans des conditions statiques, plusieurs de ces interactions peuvent avoir un rapport différent endovasculaire des infections dans le sang circulant.
Par conséquent, nous présentons un interne conçu in vitro plaques parallèles flux chambre modèle, qui permet l’évaluation de l’adhérence des bactéries aux différentes composantes d’ECM et ECs dans le cadre de greffes de tissus implantés dans la position de RVOT. L’objectif global de la méthode décrite dans le présent travail est d’étudier les mécanismes d’interaction entre les bactéries et les tissus sous-jacents endovasculaire dans des conditions d’écoulement, qui sont étroitement liées à l’environnement en vivo de pathogènes de circulation sanguine tels que S. aureus. Cette nouvelle approche met l’accent sur la sensibilité des surfaces tissus greffés à l’adhérence des bactéries à identifier les facteurs de risque potentiels pour le développement d’Internet Explorer.
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Protocol
1. préparer la greffe de tissus pour des études In Vitro
Remarque : Trois types de tissus ont été utilisés : patch de péricarde bovin (BP), greffes Cryopreserved homogreffe (CH) et de la veine jugulaire de bovin (BJV). En cas de conduite BJV et CH (tissus traités par la Banque européenne de homogreffe (EHB) et stockés dans l’azote liquide avant de l’utiliser), le mur et les feuillets valvulaires ont été utilisés. Patch de BP et conduit BJV furent achetées chez les fabricants. Avant utilisation, décongeler le CH suivant les instructions de EHB12.
- Rincer tous les tissus à 0,9 % NaCl avant de l’utiliser.
- Préparer des biopsies tissulaires à l’aide d’une biopsie cutanée jetables punch pour couper les morceaux de tissu circulaire (10 mm de diamètre).
- Couper tous les patchs de tissus à la même hauteur à l’aide de bistouris stériles jetables.
- Pour les tissus fixés au glutaraldéhyde (par exemple les conduits BJV), incuber les morceaux de greffon durant la nuit à 4 ° C, avec 200 g/L d’albumine humaine pour neutraliser le fixateur.
- Laver les résidus de glutaraldéhyde avec 0,9 % NaCl dans une plaque de microtitration. Répétez 3 fois pendant 1 minute.
2. préparation de bactéries pour expériences de Perfusion
Remarque : Les trois isolats bactériens ont été utilisées : S. aureus Cowan (ATCC 12598), s. epidermidis ATCC 149900 et S. sanguinis NCTC 7864. S. aureus et S. epidermidis sont cultivées à 37 ° C dans un bouillon trypticase soja (TSB) et S. sanguinis a été cultivé à 37 ° C, avec 5 % de CO2 dans bouillon de cerveau coeur cervelle (BHI).
- Préparer une culture de bactéries sur une gélose au sang solide.
- Utilisez une boucle stérile pour gratter les bactéries congelées et ensemencer sur une gélose Mueller-Hinton sang pour une culture à 37 ° C.
- Utiliser une anse à inoculation stérile pour ramasser une colonie unique de la culture de gélose au sang durant la nuit et ensemencer dans 10 mL de BST ou BHI dans un tube de 14 mL et de la culture pendant une nuit à 37 ° C.
- Centrifuger les cultures pendant la nuit (3000 x g, 4 ° C, 10 min) et remettre en suspension les pellets dans 10 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Placer les tubes de 14 mL sur la glace.
- Préparer une partie aliquote de la solution de 3,7 mg/mL de 5 (6) - carboxy - fluorescéine N-hydroxy-succinimidyl ester (CF) dans l’éthanol et conserver à-20 ° C. Plus loin, diluer le stock des FC à 150 µg/mL avec de l’eau « ultrapure ».
Remarque : Protéger les tubes de lumière à l’aide de papier d’aluminium et conserver à-20 ° C. - Centrifuger les bactéries (3000 x g, 4 ° C, 10 min) et remettre en suspension les pellets dans 800 µL de PBS et ajouter 200 µL de la solution de CF 150 µg/mL (concentration finale de 30 µg/mL utilisés pour les expériences de perfusion). Protéger les tubes de lumière avec du papier aluminium et incuber 30 min à l’aide d’un agitateur orbital.
- Après marquage, bloc avec 2 % de solution d’albumine sérique bovine (BSA) dans du PBS et essorage (3000 x g, 4 ° C, 10 min). Faire suivre par un lavage à l’aide de 10 mL de PBS et pellet bactéries par centrifugation (3000 x g, 4 ° C, 10 min).
- Diluer les bactéries avec PBS pour obtenir 10 unités formant colonie de7 (UFC) par millilitre (vérifié par UFC comptage sur plaques de gélose au sang de Mueller-Hinton), ce qui correspond à une OD600 (densité optique) de 0,65. Garder les lampes dans l’obscurité sur la glace avant d’expériences de perfusion.
Remarque. N’oubliez pas que OD600 mesures reflètent le nombre approximatif de bactéries. Pour compter la dose efficace de l’inoculation, la méthode de dilution en série est une étape supplémentaire nécessaire pour vérifier la division d’opposition selon nombres tel que décrit dans l’article 3.8.
3. in vitro expériences de Perfusion à l’aide d’une chambre d’ionisation de plaques parallèles
- Monter des biopsies tissulaires de 10 mm de diamètre et la même épaisseur (préparé dans les étapes de 1,1 à 1,5) dans un système de chambre de flux avec la surface intérieure vers le haut pour entrer en contact avec la suspension bactérienne.
Remarque : La même épaisseur de tissu à travers différents greffons fait en sorte que la même hauteur de tissu est atteinte dans le chenal permettant l’écoulement laminaire dans toutes les conditions. Tous les éléments de la chambre de flux sont présentés et décrits à la Figure 1.- Pour commencer le protocole, placez le morceau de tissu ronde entre une lame de microscope avec une perforation circulaire de 8 mm et un joint de caoutchouc.
Remarque : La lame de microscope possède le film ultra-mince bas afin de permettre la génération de l’orifice de 8 mm. Ainsi que la feuille de caoutchouc, il fixe le tissu afin de permettre le contact direct entre l’échantillon et le milieu fluide et empêche également la dislocation de la biopsie au cours de l’expérience. La surface du tissu étudié, qui est exposée à l’écoulement (petit diamètre) ne peuvent pas être manipulée par les pinces. - Insérez le support avec le tissu dans la feuille de joint qui est incorporée dans la structure métallique du fond de la chambre.
- Fixer le cadre métallique supérieur avec la feuille correspondante de joint d’étanchéité sur la partie inférieure de la chambre avec le support de papier inséré précédemment. Par la suite monter la chambre ensemble avec huit vis et visser les écrous. S’assurer que la hauteur de la chambre est toujours le même à travers des greffes.
Remarque : La hauteur de la chambre doit être déterminée toujours sur les vis de serrage. Utilisez une pince ou une règle.
- Pour commencer le protocole, placez le morceau de tissu ronde entre une lame de microscope avec une perforation circulaire de 8 mm et un joint de caoutchouc.
- Connectez la chambre flow avec une pompe péristaltique et le réservoir de fluide avec les tubes.
- Perfuse les tissus avec des suspensions de 107 UFC/mL (vérifié par UFC comptage et relatives aux mesures de600 OD) fluorescent des bactéries marquées dans du PBS avec une contrainte de cisaillement de 3 dyne/cm2 (dyne par centimètre carré unité de pression) par moyen de la pompe péristaltique (débit de 4 mL/min) pendant 1 h à l’aide d’un réservoir bactérien de 400 mL (conception interne, Figure 1), conditionné à 37 ° C à l’aide d’un thermostat de plaque (Table des matières).
- Recycler en permanence la suspension bactérienne de 100 mL à l’aide du même réservoir collecteur.
- Après la perfusion, démonter la chambre pour libérer la prothèse et laver le morceau de tissu deux fois avec 4 mL de PBS dans une plaque de 12 puits à l’aide de l’agitateur orbital de laboratoire pendant 3 min chaque. Par la suite, couper la partie interne de la prothèse à l’aide d’une biopsie cutanée poinçon d’un diamètre inférieur.
- Placez chaque biopsie de tissu dans un tube séparé 14 mL contenant 1 mL de stérile 0,9 % NaCl. Marquer le tube comme #1.
- Détacher les bactéries provenant du tissu à l’aide d’un bain de sonication pendant 10 min (amplitude = 100 % et la fréquence = à 45 Hz).
Remarque : Un détachement complet de bactéries provenant du tissu greffes doivent être évaluées lors de l’incubation des patches pendant une nuit à 37 ° C dans un milieu liquide du BST suivi de mesures de600 OD par rapport à contrôler les parcelles traitées avec une solution libre de bactéries. - Utilisez une méthode de dilution en série sur plaques de gélose au sang de Mueller-Hinton pour compter UFC.
- Préparer un tube unique de 14 mL avec 10 mL de sérum physiologique stérile pour faire des dilutions successives de la suspension bactérienne obtenue après sonication. Qualifier ce tube #2.
Remarque : Pour chaque expérience un tube de tissu avec 10 mL de 0,9 % NaCl est nécessaire. - Préparer trois 14 mL tubes 10 ml stérile 0,9 % NaCl pour les dilutions en série de la suspension bactérienne de l’étape 2.7. Identifier les tubes comme suit 3 #, 4 #, 5 #.
Remarque : Cette étape est nécessaire de connaître le nombre d’UFC réel dans une suspension bactérienne utilisé pour l’expérience de la perfusion. - Vortex mélanger chaque tube pendant 15 s. Vortex les tubes avec la biopsie de tissu ainsi que la suspension bactérienne initiale pour faire des dilutions successives.
- Préparer trois boîtes de gélose, deux pour l’expérience de tissu (perfusion de bactéries et contrôle perfusion de PBS) et la troisième pour la suspension bactérienne initiale utilisée pour les perfusions.
- Étiqueter les trois secteurs par plaque pour l’expérience de tissu en le suivant de manière 10-1, 10-3 et 10-4. Pour compter le nombre d’UFC dans les perfusats bactériennes, étiqueter la plaque comme suit : 10-1, 10-3, 10-5 et 10-7.
Remarque : Toutes les indications sur la gélose plaques comme 10-1, 10-3 et ainsi de suite se référer au nombre final d’UFC/mL, calculé sur le lendemain. Plaque de commande ne nécessite pas de tous les secteurs. Avant utilisation, géloses au sang devraient être placées sous la hotte laminaire et ouvert pour enlever l’excès d’humidité. - Pour poursuivre l’élaboration de la série de dilutions, transférer 100 µL du tube #1 sur le tube #2 et mélanger vigoureusement avec vortex.
- Étaler les 100 µL du contenu du tube #1 et #2 sur les correspondants de secteurs 10-1 et 10-3 de la gélose. De même, répandre 10 µL de tube #2 sur le secteur 10-4, répétez cette opération 4 fois pour obtenir 4 crus séparés de chaque volume de 10 µL.
Remarque : En raison du faible volume utilisé pour le placage sur le secteur 10-4, il est conseillé d’avoir plusieurs nombre de gouttelettes de faire un nombre moyen d’UFC cultivés. - Pour préparer les dilutions en série de la culture initiale, transférer 100 µL de la suspension bactérienne de l’étape 2.7 au tube #3 et mélanger vigoureusement avec vortex. Ajouter 100 µL de tube #3 au tube #4 et bien mélanger, répétez la procédure pour tube ultérieure #5.
- Étaler 100 µL du contenu des tubes 3 #, 4 #, 5 # et la suspension bactérienne ajustée (étape 2.7), respectivement, sur les secteurs 10-3, 10-5, 10-7 et 10-1 de la gélose au sang.
- Laissez les géloses au sang dans la hotte laminaire à l’air sec les spreads bactériennes, généralement pendant 10 minutes. Ensuite, placez les plaques à 37 ° C pendant une nuit d’incubation.
- Après incubation pendant la nuit, compter les colonies bactériennes pour obtenir le nombre d’UFC résultant de l’adhésion à des biopsies tissulaires et le CFU/mL dans la suspension bactérienne départ utilisée pour la perfusion. Exprimer les résultats en CFU/cm2.
- Préparer un tube unique de 14 mL avec 10 mL de sérum physiologique stérile pour faire des dilutions successives de la suspension bactérienne obtenue après sonication. Qualifier ce tube #2.
4. Fluorecence de bactéries collés à la greffe de tissus à la Perfusion
- Après la perfusion, laver les morceaux de tissus avec du PBS (voir étape 3.5) et couper la partie intérieure d’un greffon à l’aide d’un poinçon d’un diamètre inférieur.
- Préparer une plaque 6 puits et placer les gouttelettes du milieu de montage (Table des matières).
- Placez chaque morceau de tissu avec sa surface perfusé à la baisse sur une seule goutte de milieu de montage.
- Lire une plaque à l’aide d’un scanner de fluorescence (Table des matières). Définir les paramètres de longueur d’onde d’excitation et d’émission selon un fluorophore utilisés pour l’étiquetage bactérienne.
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Representative Results
Pour mieux comprendre les mécanismes derrière IE développement, ce modèle permet l’évaluation de bactérien et facteurs de tissus associés présent dans la situation in vivo de l’apparition de l’infection.
En détail, l’approche novatrice en vitro permet de quantifier l’adhésion bactérienne dans des conditions d’écoulement aux tissus différents greffons en perfusant les bactéries fluorescent étiquetés sur les tissus exerçant les contraintes de cisaillement dans les limites physiologiques de dyne 3-10 / cm2 pour le RVOT. Dans ce travail, nous avons utilisé un débit de 4 mL/min, ce qui correspond à 3 dyne/cm2. Compte tenu de la hauteur de canal de 0,3 mm à travers tous les patchs de tissus, de la distance entre le greffon monté et la bouche moyenne d’environ 39 mm, la chambre de perfusion (illustrée à la Figure 1) garantit pleinement développés à flux laminaire (Re = 3,89 est significativement inférieur à 2000 ; la longueur d’entrée = 0,05 mm est significativement inférieure à la distance « entrée-greffe », les paramètres nécessaires pour assumer l’écoulement approprié).
Dans des conditions de contrainte de cisaillement, un attachement des bactéries semblable à travers les différents tissus de greffon a été observé pour les S. aureus et S. epidermidis infection (Figure 2 et Figure 3). Bien que non significative, une tendance à l’adhérence supérieure de S. aureus fiches CH était perceptible.
Pour S. sanguinis une réduction significative de l’adhérence à la paroi BJV a été constaté par rapport à la correction de BP (Figure 4; P < 0,05). Lorsqu’en comparant les 3 espèces de bactériesS. sanguinis présente significativement plus faible adhérence au mur BJV par rapport à S. aureus et S. epidermidis (P < 0,01 et P < 0,05 respectivement, voir la vidéo). En général, nous avons observé une adhérence bactérienne semblable à tous les tissus étudiés sous la contrainte de cisaillement.
Nos données d’UFC comptage (Figure 2, Figure 3, Figure 4) sont pris en charge par microscopie de fluorescence à l’aide d’un scanner haut débit (Figure 5, Figure 6, Figure 7). Images présentent des foyers prononcés des bactéries étiquetées adhérant pour greffer des tissus. En raison de cette approche, nous étions en mesure de visualiser directement les tissus lors de perfusion sans n’importe quel poste expérimental de traitement à des fins d’illustration.
Les résultats démontrent que la source d’un tissu de greffe, les différences morphologiques surfaces ainsi que les adhésines bactériennes ne sont pas des déterminants majeurs de l’adhérence bactérienneà ces biomatériaux.
Figure 1 : Image d’un système de chambre de flux nouvellement développés (conception interne par le département de Biohybrides & Textiles médicaux, AME - Helmholtz Institut de génie biomédical, Aix-la-chapelle, Allemagne). A. la chambre de flux (1) monté ensemble écoulement de dimensions Lxlxh : 125 x 55 x 18 mm (vis en combinaison avec vis-écrous maintiennent pièces ensemble et mettre de la pression via la chambre le cadre métallique sur les joints pour éviter les fuites) ; (2) la partie supérieure de la colonne ; (3) la feuille de joint d’étanchéité supérieure avec deux trous pour la fixation des raccords de tubulure, qui relient la chambre de flux avec la pompe et le réservoir de fluide au moyen du système de tuyauterie ; (4) distance entre l’entrée de la moyenne et le tissu (la longueur d’entrée) ; lame feuille mince (5) (avec une perforation circulaire de 8 mm pour permettre l’exposition des tissus à la suspension bactérienne) (dans une niche de la diapositive, il y a l’espace pour une garniture en caoutchouc B9, pour immobiliser la pièce de tissu pendant la perfusion) ; (6) le drap de dessous joint avec un évidement dédié à placer la greffe de tissu monté entre la lame de microscope et le joint en caoutchouc ; (7) la partie inférieure de la chambre de flux ; B. la mise en place complète (8) la diapositive feuille mince ; (9) le joint en caoutchouc ; (10) huit vis correspondantes (11) huit vis-écrous ; (12) le réservoir de fluide (400 mL) ; système de tube (13) ; Appareil de Perfusion C. (14) la pompe péristaltique ; (15) dédié tube qui résiste aux rigueurs de l’action de pompage péristaltique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Adhérence de S. aureus Cowan à la greffe de tissus dans des conditions de circulation. Des bactéries fluorescent étiquetés ont été perfusés tissus greffés sur 5 (parois des canalisations ou des feuillets valvulaires) dans du PBS. Des bactéries ont été détachés de morceaux de tissus infectés par sonication. Adhérence bactérienne a été évaluée par dilutions successives à l’aide de la méthode de comptage UFC et indiqué comme CFU/cm2. Tous les résultats sont exprimées en moyenne ± SEM (n > 3 pour des feuillets valvulaires en raison de la limitation du matériel ; n > 5 pour les parois des canalisations). UFC : unité formant colonie ; BP : péricarde bovin ; BJV : bovine veine jugulaire ; CH : cryoconservé homogreffe. Ce chiffre a été modifié par Veloso et al. (Journal de chirurgie thoracique et cardiovasculaire 155 (1), 325-332 (2018)). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Adhérence S. epidermidis à la greffe de tissus dans des conditions de circulation. Des bactéries fluorescent étiquetés ont été perfusés tissus greffés sur 5 (parois des canalisations ou des feuillets valvulaires) dans du PBS. Des bactéries ont été détachés de morceaux de tissus infectés par sonication. Adhérence bactérienne a été évaluée par dilutions successives à l’aide de la méthode de comptage UFC et indiqué comme CFU/cm2. Tous les résultats sont exprimées en moyenne ± SEM (n > 3 pour des feuillets valvulaires en raison de la limitation du matériel ; n > 5 pour les parois des canalisations). UFC : unité formant colonie ; BP : péricarde bovin ; BJV : bovine veine jugulaire ; CH : cryoconservé homogreffe. Ce chiffre a été modifié par Veloso et al. (Journal de chirurgie thoracique et cardiovasculaire 155 (1), 325-332 (2018)). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Adhésion du S. sanguinis de greffer des tissus dans des conditions de circulation. Des bactéries fluorescent étiquetés ont été perfusés tissus greffés sur 5 (parois des canalisations ou des feuillets valvulaires) dans du PBS. Des bactéries ont été détachés de morceaux de tissus infectés par sonication. Adhérence bactérienne a été évaluée par dilutions successives à l’aide de la méthode de comptage UFC et indiqué comme CFU/cm2. Tous les résultats sont exprimés en moyenne ± SEM (n = 3 pour les feuillets valvulaires en raison de la limitation du matériel ; n > 5 pour les parois des canalisations). UFC : unité formant colonie ; BP : péricarde bovin ; BJV : bovine veine jugulaire ; CH : cryoconservé homogreffe. Ce chiffre a été modifié par Veloso et al. (Journal de chirurgie thoracique et cardiovasculaire 155 (1), 325-332 (2018)). * P < 0,05. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Visualisation de S. aureus Cowan adhérence à la greffe de tissus au moyen de la microscopie en fluorescence. De gauche à droite : mur conduit BJV, dépliant BJV, mur CH et CH de la brochure. Ce chiffre a été modifié par Veloso et al. (Journal de chirurgie thoracique et cardiovasculaire 155 (1), 325-332 (2018)). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Visualisation de S. epidermidis adhérence à la greffe de tissus à l’aide de la microscopie de fluorescence. De gauche à droite : mur conduit BJV, dépliant BJV, mur CH et CH de la brochure. Ce chiffre a été modifié par Veloso et al. (Journal de chirurgie thoracique et cardiovasculaire 155 (1), 325-332 (2018)). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Visualisation de l’adhérence de S. sanguinis de greffer des tissus à l’aide de la microscopie de fluorescence. De gauche à droite : mur conduit BJV, dépliant BJV, mur CH et CH de la brochure. Ce chiffre a été modifié par Veloso et al. (Journal de chirurgie thoracique et cardiovasculaire 155 (1), 325-332 (2018)). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Les observations cliniques récentes donnent spéciale sensibilisation à IE comme complication chez des patients ayant subi un remplacement valvulaire des RVOT6,13. Dysfonctionnement de la valve implantée dans IE est le résultat d’interactions bactériennes avec la prothèse endovasculaire, menant à une vaste inflammatoires et procoagulant réactions1,14. Le modèle présenté roman in vitro nous a permis de vérifier si les différences dans les structures tissulaires et facteurs bactériens sont susceptibles de moduler la susceptibilité aux infections in vivo utilisés greffes15. BJV et tissu de greffe CH ont montré même propension à recrutement bactérienne dans des conditions d’écoulement. Par conséquent, les données suggèrent qu’en général la source du tissu et sa structure de surface ainsi que des protéines bactériennes adhésif spécifiques en soi ne sont pas les principaux facteurs déterminants dans l’adhérence bactérienne initiale.
En général, évoquant l’inflammation des voies, dépôts de dommages, de plaquettes et de fibrine tissu sur le site infecté endovasculaires sont activés par plusieurs joueurs1,16. Un avantage majeur du modèle développé in vitro est la possibilité d’analyser pas à pas la contribution des acteurs impliqués. Seul facteurs bactériens peuvent être étudiées à l’aide de souches mutantes ou des bactéries génétiquement modifiées exprimant des protéines d’adhésion unique sur leur surface14. En choisissant des médias différents de perfusion, de plasma ou de sang, l’implication des protéines de plasma et cellules sanguines peut être évaluée. D’autres études seront concentrera sur le tissu des facteurs pour lesquels tissus sera préalablement incubées avec par exemple des protéines plasmatiques avant monté dans la chambre de débit de perfusion ultérieure. Depuis les acteurs contribuant à l’apparition des prothèses IE demeurent obscures, de futures études pourraient élucider les facteurs potentiels de bâtiment jusqu'à un montage expérimental plus complex. En outre, ce dispositif expérimental hérite de la possibilité que les tissus peuvent être semées avec une couche d’EC d’analyser l’expression de gènes dépendant de cisaillement EC. La chambre à plaques parallèles flow permet également de perfusion sur les lames ce-visés en raison d’une hauteur intérieure flexible de la chambre de perfusion. Différents revêtements de lamelles à l’aide de diverses protéines de la matrice extracellulaire sont également une option possible pour évaluer les interactions importantes avec la matrice sous-endothélial. En outre, les inhibiteurs pharmacologiques ou anticorps fonctionnels peuvent être étudiées pour leur effet dans l’état respectif dans notre chambre à flux. En résumé, les diverses conditions peuvent être étudiées par une complexité croissante.
Activation inflammatoire à la zone infectée du greffon est une étape cruciale, cisaillement contrôlée favorisant les dépôts de plaquettes activées et les monocytes. L’effet de cisaillement forces sur l’adhérence des bactéries aux tissus des surfaces sont source de grande préoccupation. Pour résoudre ce problème, la nouveauté du système présenté dans vitro met l’accent sur la possibilité de monter des tissus dans une chambre à flux. Cela renforce l’importance de la méthode au-delà des alternatives existantes, où généralement les interactions statiques entre les bactéries et les tissus sous-jacents ont été étudiées. Même si la contrainte de cisaillement a été soumise par agitation ou d’autres forces extérieures, mais elle n’a pas été normalisée au même niveau que nous pouvons gagner à notre modèle d’écoulement uniforme.
Modèle In vivo, un non physiologique d’écoulement peut favoriser l’adhérence bactérienne comme le début de l’IE au niveau de la vanne de conduits implantés. Contrainte de cisaillement a été trouvée à régulation endothéliales paramètres inflammatoires telles que la sécrétion de cytokines et d’augmenter le facteur tissulaire médiée par coagulation17. L’interaction du tissu sous-jacent utilisé pour les prothèses valvulaires avec des bactéries et leur influence sur l’expression génique EC sous la contrainte de cisaillement est importante pour construire une soupape moins capable d’adhérence bactérienne et une inflammation chronique.
Les questions techniques basales de la chambre fabriquée permettent enquêtes dans des conditions normalisées dans le flux laminaire18. Pour assurer l’écoulement laminaire pleinement développé sur le site du tissu étudié, la chambre est construite pour monter le greffon à une certaine distance de l’entrée de la moyenne (significativement plus longtemps que la longueur calculée entrée, voir résultats et Figure 1). À l’aide de pompes différentes dans le système permettrait de réaliser des expériences dans des conditions de flux pulsatile ou turbulent à l’avenir.
Le cadre flexible de la chambre empêche la chambre efficacement contre les fuites et la hauteur intérieure du cadre permet de s’adapter pour des épaisseurs de tissu. La construction de l’ensemble du système permet un flux circulant, ce qui est important pour effectuer des perfusions de longue durées avec l’aide d’un montant respectif de milieu. Basé sur des études antérieures notre protocole d’adhésion a pris une dose de l’inoculation bactérienne de 107 UFC/mL pour une 1 h d’incubation4,19. Avec ces paramètres, des niveaux d’adhérence sont décelables, quoique assez bas pour être en mesure d’observer une amélioration significative de l’adhérence bactérienne sans saturation de la surface de greffe de tissus. En outre, dans ce laps de temps, il était possible de constater des différences potentielles dans la liaison entre souches prises dans cette étude. Paramètres de cisaillement abordés ici étaient de l’ordre physiologique et optimisé pour les vaisseaux sanguins, ce qui était notre objectif en ce qui concerne le RVOT.
Des modifications supplémentaires de la méthode mettra l’accent sur la consommation plus efficace du milieu au cours de la procédure, ainsi que sur la simplification de la configuration de montage. En outre, un nouveau design dont plusieurs créneaux horaires pour l’assemblage de tissus faciliterait une expérience complète dans les aspects tels que l’efficacité.
A ce stade, notre méthode est axée sur les résultats de point final et n’était pas testé pour les applications en temps réel l’évolution temporelle des événements dynamiques qui ont lieu sur la surface du tissu. Ainsi, cette application plus vaste demeure l’examen ; Cependant, des questions telles que les tissus autofluorescence, optimisation d’un protocole de microscope de fluorescence appropriée ainsi que des adaptations de la chambre doivent être abordées. Plus loin, la méthode dans son état actuel peut-être être adaptée à la surveillance en temps réel de fixation bactérienne aux couches d’EC sur lames de microscope par microscope à fluorescence verticale. Actuellement, nous sommes en mesure de visualiser les bactéries et autres composants/cellules sanguines liés aux tissus par microscopie confocale sans une nécessité pour le post-traitement tissu expérimental, qui est prédisposition pour la visualisation en temps réel dans un écoulement par inversé microscopes de fluorescence.
Dans cette étude, la quantification de l’adhérence bactérienne a été fournie en comptant les CFU tandis que la microscopie de fluorescence a été un outil de soutien, non quantitatifs. En raison de problèmes de résolution résultant de l’absence d’un objectif de microscope adéquate, imagerie de fluorescence avéré pour être moins reproductible entre nos mains que les dilutions en série. Néanmoins, il est possible d’utiliser fluorescence lorsque l’objectif approprié pourrait mettre en lumière la taille de la prothèse complète de 8 mm de diamètre pour la quantification fiable foyers à balayage pour la quantification. À l’aide d’un programme de traitement d’image (par exemple ImageJ), unités de fluorescence absolue peuvent être quantifiées pour des échantillons de tissus étudiés et l’adhérence bactérienne peut être exprimée par exemple comme un signal relatif au contrôle interne (greffes perfusés avec bactéries non marqué).
La limitation majeure de ce paramètre expérimental sont les enjeux liés aux études in vitro en général. Résultats atteints à l’aide de ce modèle de chambre in vitro flux pourraient être transférées à un modèle animal in vivo de confirmation.
En conclusion, ce modèle in vitro permet aux enquêtes bactérienne unique, tissus et axée sur le cisaillement des facteurs qui contribuent à l’apparition de l’adhérence bactérienne aux tissus de façon progressive. La connaissance par les présentes activée pourrait contribuer à l’élaboration d’une prévention plus efficace et le traitement d’IE.
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Disclosures
Aucun.
Acknowledgments
Cette étude a été financée par une subvention de la recherche fonds KU Leuven (OT/14/097) accordée aux RH. VRT a été stagiaire postdoctoral de la fondation de recherche de FWO - Vlaanderen (Belgique ; Grant Number - 12K0916N) et RH est pris en charge par le fonds de recherche clinique de UZ Leuven.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Pericardium (BP) patch, Supple Peri-Guard Pericardium | Synovis Surgical Innovations, USA | PC-0404SN | |
| Bovine Jugular Vein conduits (BJV) | Contegra conduit; Medtronic Inc, USA | M333105D001 | |
| CH cryopreserved homograft | European Homograft Bank (EHB) | - | |
| Acu-Punch | Acuderm Inc, USA | P850 (8 mm); P1050 (10 mm) | |
| human Albumin | Flexbumin; Baxter, Belgium | BE171464 LOT:16G12C |
|
| Tryptic soy broth (TSB) | Fluka, Steinheim, Germany | 22092-500G | |
| Heart infusion broth (BHI) | Fluka | 53286-500G | |
| Phosphate buffered saline (PBS). | Gibco | 14190-094 | |
| 5(6)-Carboxyfluorescein N-hydroxysuccinimide ester (CF) | Sigma-Aldrich, Germany | 21878-100MG-F | |
| Peristaltic pump (MODEL ISM444B) | Ismatec BVP-Z Standard; Cole Parmer, Wertheim, Germany | 631942-2 | |
| Sonication bath | VWR Ultrasonic Cleaner; VWR, Radnor, Pa | 142-6044 | 230V/50 -60Hz 60VA; HF45kHz, 30W |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen by ThermoFisher | P36930 | |
| InCell Analyzer 2000 (fluorescence scanner) | GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, Pa | 29027886 | |
| Arium Pro VF - ultrapure water - H2O MilliQ | Millipore | 87206462 | |
| Microscopic slides - Tissue Culture Chambers (1-well) | Sarstedt | 94.6140.102 | |
| 1-well on Lumox detachable | Sarstedt | 94.6150.101 | |
| Stainless Steel - surgical Blades | Swann-Morton | 311 | |
| Tygon Silicone Tubing, 1/8"ID x 1/4"OD | Cole-Parmer | EW-95702-06 | Temperature range: –80 to 200°C Sterilize: With ethylene oxide, gamma irradiation, or autoclave for 30 min, 15 psi of pressure |
| PharMed BPT Tubing | Saint-Gobain | AY242012 | Autoclavable 30 min at 121°C |
| Tygon LMT-55 Tubing | Saint Gobain Performance Plastics™ | 15312022 | |
| Thermostat | BMG BIOMEDIZINTECHNIK | 300-0042 | 230V, 90VA, 50Hz |
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