Summary
여기, 선물이 원형질 막, 세포질 및 고속 원심 분리의 사용 없이 U937 세포의 미토 콘 드리 아를 분리 하는 프로토콜. 이 기술은 정화 subcellular 분수 immunoblotting 통해 단백질 지역화의 후속 검사에 대 한 사용할 수 있습니다.
Abstract
이 프로토콜에서 우리를 ultracentrifugation 또는 무차별 세제의 사용 없이 U937 세포의 subcellular 분수를 받는 방법을 자세하게. 이 메서드 사용 소형 버퍼, digitonin, 기계적인 세포 및 세포질, 미토 콘 드리 아 및 원형질 막 분리 차등 원심 분리 합니다. 과정은 연구자의 요구에 맞게 확장할 수 있습니다, 그리고 저렴 하 고 간단. 이 메서드는 특수 원심 분리기와 둘 다 엄청나게 비쌀 수 있는 상업용 키트를 사용 하지 않고 셀에 단백질 지 방화를 결정 하기 위해 연구원 수 있게 됩니다. 성공적으로 인간 monocyte 셀 라인 U937이 cytosolic 분리 하는 방법, 원형질 막 및 미토 콘 드리 아 단백질 사용 했습니다.
Introduction
단백질 지 방화의 신뢰할 수 있는 id는 진 핵 세포에 있는 분자 통로 조사할 때 경우가 많습니다. 방법 subcellular 분수를 더 밀접 하 게 검사 세포 구성 성분의 연구자에 의해 활용 됩니다.
기존의 셀 분류 방법의 대부분은 일반적으로 두 개의 넓은 범주로, 세제 기반1,2 , ultracentrifugation 기반3,,45, 될 수 있는 속도, 정확성 및 비용에 의해 분화 된다. 셀의 고유 구성 요소를 solubilize 세제 힘 증가 함께 버퍼의 사용에 의존 하는 세제 기반된 프로토콜. 이 샘플을 처리 하는 신속 하 고 편리한 방법 이며, 비용 효과적일 수 있다 수와 샘플의 크기는 작은 하는 경우. 세포질, 막/세포 기관이 (혼합된 분수), 및 세포에서 핵 분수 분리 세제 기반 키트를 구입할 수 있습니다. 그러나, 이러한 장비와 관련 된 몇 가지 단점이 연구원에 게 그들의 유용성을 제한 한다. 그들은 쉽게 셀의 하나 또는 두 개의 구성 요소를 분리 하도록 설계 되었습니다 하지만 샘플에서 모든 분수를 동시에 차단 할 수 있다. 세제의 사용 의미는 원형질 막과 세포 막 동봉 하는 것입니다 수 똑같이 solubilized 및, 그러므로, 서로에서 분리 될 수 없습니다. 추가 합병증이 키트 연구원은 특정 응용 프로그램에 대 한 조건을 변경 하지 못하도록 독점 구성 요소에서 발생 합니다. 마지막으로, 그들은 사용에 제한 되 고 엄청나게 큰 규모의 실험에 대 한 비용이 있을 수 있습니다. 그러나 비 세제 기반된 키트 미토 콘 드리 아의 격리에 대 한 존재,, 원형질 막 분리 설계 되지 않았습니다 및 샘플 수율은 훨씬 밀도 원심에서 저것 보다는 더 적은 격리 프로토콜6,7 기반으로 .
분수를 ultracentrifugation를 사용 하는 메서드는 더 시간이 소모, 하지만 종종 세제 기반 키트 보다 순수한 분수에 결과. 그들 뒤에 세포질 분 대를 통해 차동의 분리 비 세제 메서드에서 lysed 첫 solubilizing 그들 (막 세포와 오염 결과로) 하지 않고 셀에서 플라즈마 막 분리 필요 원심 분리-원형질 막 절연 요구를 달성 하기 위해 100000 × g 의 속도. 대부분의 경우, isopycnic 밀도 그라데이션 원심 분리 추가 대 한 셀룰러 분수 또는 오염 물질의 제거의 차등 원심을 뒤 합니다. 이러한 방법은 철저 하 고 수정할 수 있지만, 단점 등 비용, 시간 소비, 분수와 더 정화를 통해 밀도 그라데이션 원심 분리에 대 한 ultracentrifuge에 대 한 필요. 대부분 고속 원심 분리기는 개별 조사와는 종종 교육 기관에서 장비를 코어 공유, 금지는 비용에 있습니다. 따라서, ultracentrifuge 가용성 이러한 상황에서 금지 된다.
이 분류 프로토콜 solubilizing 세제의 사용 없이 및 고속 원심 분리 하지 않고 subcellular 분수의 보여 줍니다. 이 메서드는 원형질 막, 미토 콘 드리 아 및 분수 사이 최소한의 오염으로 진 핵 세포의 세포질 구성 요소를 분리 하는 연구자 수 있게 됩니다.
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Protocol
1. 버퍼와 시 약 준비
주: 표 1을 참조 하십시오.
- 버퍼 A, 세포의 용 해 버퍼 B, 샘플 버퍼 및 digitonin의 솔루션을 준비 합니다.
- NaCl의 8.77 g와 900 mL 이온된 물, HEPES (1 M, pH 7.4) 50 mL 조정 이온 물 1 L에 최종 볼륨을 추가 하 여 버퍼 A를 준비 합니다.
참고: 최종 농도 150 mM NaCl 및 50 mM HEPES. - 에틸렌 글리콜-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N의 2 mL KCl, MgCl2, Ethylenediaminetetraacetic 산 (0.5 M EDTA)의 2 개 mL의 0.19 g의 0.75 g HEPES (1 M, pH 7.4) 20 mL를 추가 하 여 세포의 용 해 버퍼 B 준비 ', N'-tetraacetic 산 (0.5 M EGTA) 38.26 g 마 니 톨 및 이온된 물 900 mL에 자당의 23.96 g 이온 물 1 L에 최종 볼륨을 조정.
참고: 최종 농도 20 mM HEPES, 10mm KCl, 2 m MgCl2m, 1 mM EDTA, 1mm EGTA, 210 m m 마 니 톨 및 70mm 자당. - 0.1 %SDS 최종 농도 대 한 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS)의 0.01 g을 추가 하 여 tris 버퍼 염 분 (TBS)의 10ml 샘플 버퍼를 준비 합니다.
- 이온된 수 (최종 농도 250 µ g/mL)의 100 mL에 digitonin의 25 mg을 추가 하 여 digitonin의 재고 솔루션을 준비 합니다.
- 실험의 시작까지 4 ° C에서 모든 버퍼 솔루션 및-20 ° C에서 digitonin를 저장 합니다.
- NaCl의 8.77 g와 900 mL 이온된 물, HEPES (1 M, pH 7.4) 50 mL 조정 이온 물 1 L에 최종 볼륨을 추가 하 여 버퍼 A를 준비 합니다.
- 셀에 추가 하기 전에 버퍼 솔루션에 추가 될 프로 테아 제와 인산 가수분해 효소 억제제의 새로운 솔루션을 준비 합니다.
- 100% 에탄올의 1 mL에 PMSF의 17.4 mg을 추가 하 여 phenylmethanesulfonyl 불 소 (PMSF)의 재고 솔루션을 준비 (최종 농도 100 mM).
주의: 적절 한 보호 장비와 운동 주의 PMSF 처리할 때 착용 하십시오. PMSF는 섭취 하는 경우에 유해 하 고 약간 위험한 (자극성) 피부 접촉, 눈 접촉 (자극성) 또는 흡입; 그것은 눈과 피부에 부식성입니다. - 제조업체의 지침에 따라 상용 프로 테아 제 억제 물 칵테일 (100 ×) 준비 ( 재료의 표참조).
- SOV의 92 mg 이온된 수 (최종 농도 500 m m)의 1 mL에 추가 하 여 나트륨 orthovanadate (SOV)의 재고 솔루션을 준비 합니다.
주의: 적절 한 보호 장비를 착용 하 고 처리할 때 주의 사용 합니다. SOV (자극성) 눈 접촉, 섭취 또는 흡입 위험입니다. 심한 노출은 죽음에 발생할 수 있습니다.
- 100% 에탄올의 1 mL에 PMSF의 17.4 mg을 추가 하 여 phenylmethanesulfonyl 불 소 (PMSF)의 재고 솔루션을 준비 (최종 농도 100 mM).
2. PBS 워시
- 집중 하 고 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 분류 이전에 세포를 씻어.
- 원심 분리기 세포 현 탁 액 만드는 펠 릿을 적절 한 속도로. 예를 들어 10 분 400 × g 에서 U937 세포의 현 탁 액을 원심.
- 제거는 상쾌한, 4 × 106 셀/mL 및 덩어리 헤어를 부드럽게 피 펫의 최종 농도에서 실내 온도 PBS에 셀 펠 릿 resuspend.
- 셀 서 스 펜 션 10 분 작은 셀 400 × g 에서 원심
- 상쾌한을 제거 하 고 셀 펠 릿 2 × 107 셀/mL의 최종 농도에 차가운 얼음 버퍼 A에에서 resuspend.
참고: 모든 후속 단계 4 ° C 에서 실행 되어야 한다 또는 얼음 및 모든 버퍼에 미리 냉장되어야 합니다.
3. cytosolic 단백질 격리
- 세제 digitonin 가진 외피에 의해 cytosolic 단백질을 추출 합니다.
- 셀 (단계 3.1.3)의 물의 resuspension 직전 추가 재고 PMSF (100 m m), 프로 테아 제 억제제의 10 µ L 10 µ L (100 ×), SOV (500mm) 주식의 2 µ L 및 버퍼 A의 878 µ L 재고 digitonin (250 µ g/mL)의 100 µ L (최종 농도 1 밀리미터 PMSF 1 × protease 억제제, 1 mM SOV와 25 µ g/mL digitonin; 사용 되는 셀의 수에 의하여 최종 볼륨 조정). 셀 펠 릿에 추가 될 때까지 얼음 에 솔루션을 계속.
- 10 분 동안 400 × g 에서 세포 현 탁 액을 원심 고는 상쾌한을 제거 합니다.
- 억제제 및 digitonin (단계 3.1.1에서에서 준비) 2 × 107 셀/mL, 덩어리 헤어를 부드럽게 피 펫의 최종 농도에 포함 하는 버퍼 A 솔루션에서 셀 펠 릿을 resuspend.
- 셀 서 스 펜 션에서 20 분 동안 4 ° C 이상 끝 회전에 품 어.
- 원심 10 분 수집에 대 한 400 × g 에서 셀 서 스 펜 션은 상쾌한 하 고 깨끗 한 원심 분리기 튜브에.
- 작은 세포 파편을 20 분에 대 한 18000 × g 에서 수집 된 상쾌한 원심
- 깨끗 한 원심 분리기 튜브는 상쾌한 전송.
- 때까지 아무 펠 릿은 원심 분리에 따라 3.1.5-3.1.6 단계를 반복 합니다.
- Cytosolic 단백질 을 포함 하는 상쾌한을 수집 하 고 그것은 4 ° C (단기) 또는-20 ° C (긴 기간) 저장.
- 원심 분리에 의해 초과 digitonin 및 cytosolic 단백질을 제거 합니다.
- 4 × 106 셀/mL 및 덩어리 헤어를 부드럽게 피 펫의 최종 농도에 버퍼 A에에서 resuspend (3.1.5 단계)에서 digitonin permeabilized 셀 펠 릿.
- 10 분 동안 400 × g 에서 digitonin permeabilized 세포 현 탁 액을 원심 고는 상쾌한을 제거 합니다.
참고: 초과 cytosolic 오염 물질을 제거 하는 버퍼 A에에서 반복된 세척을 수행할 수 있습니다.
4. 세포 균질
- 세포 세포의 용 해 버퍼 B에에서 얼음에 품 어 및 기계적 방법으로 그들을 lyse.
- 셀 (4.1.2 단계)의 물의 resuspension 직전 주식 PMSF (100 mM)의 10 µ L 및 추가 재고 SOV (500 m m)의 2 µ L B 세포의 용 해 버퍼의 988 µ L (최종 농도 1 밀리미터 PMSF와 1mm SOV; 되 lysed 세포의 수에 맞게 최종 볼륨 조정) solu 유지 기 셀 펠 릿에 추가 될 때까지 얼음 에.
- 차가운 얼음 세포의 용 해 버퍼 B 솔루션 PMSF 및 SOV (4.1.1 단계에서 준비) 4 × 106 셀/mL의 최종 농도에 포함 된 셀 펠 릿 (3.2.2 단계)에서 resuspend.
- 30 분 동안 얼음에 세포 현 탁 액을 품 어.
- 얼음에 (꽉 끼는 B 유 봉)과 미리 냉장된 Dounce 균질 화기에 세포 현 탁 액을 전송 하 고 천천히, 심지어 스트로크를 사용 하 여 균질 화기 유 봉과 40 패스를 수행 합니다.
참고: 또는 토론 섹션에서 자세한 기계적 세포 세포의 용 해의 다른 수단을 사용 합니다. - homogenate를 수집 하 고 깨끗 한 원심 분리기 튜브에 그것을 전송.
- 균질 화기 유 봉 및 B 세포의 용 해 버퍼의 소량 (1 ~ 2 mL) 튜브를 세척 하 고는 homogenate에 그것을 추가.
- Homogenate 400 × g (또는 작은 손상 되지 않은 세포에 필요한 최소 속도)에서 10 분 원심.
- 깨끗 한 원심 분리기 튜브는 상쾌한 전송.
참고: 중요 한 펠 릿 반복 단계 4.1.6로 분수의 수확량을 증가 시키기를 통해 4.1.4 경우 토론 섹션에 자세히. 프로토콜은 여기, 일시 중지할 수 있습니다 그리고는 homogenate 단기 (24 시간) 4 ° C에서 저장.
5. 차동 원심 분리
- 세포질 파편, 격리 미토 콘 드리 아 및 막 분수 제거 하는 속도 증가에서 homogenate 원심
- 10 분 전송 상쾌한에 대 한 500 × g 에서 깨끗 한 원심 분리기 튜브 (4.1.8 단계)에서 상쾌한 원심 그리고 어떤 펠 릿을 삭제.
- 원심 (5.1.1 단계)에서 10 분 전송에 대 한 1000 × g 에서 상쾌한 깨끗 한 원심 분리기 튜브에 상쾌한 고 어떤 펠 릿을 삭제.
- 10 분 전송에 상쾌한에 대 한 2000 × g 에서 깨끗 한 원심 분리기 튜브 (5.1.2 단계)에서 상쾌한 원심 그리고 어떤 펠 릿을 삭제.
- 깨끗 한 원심 분리기 튜브, 미토 콘 드리 아를 포함 하는 계속 펠 릿에 15 분 전송 상쾌한에 대 한 4000 × g 에서 (에서 단계 5.1.3) 상쾌한 원심
- B. 세포의 용 해 버퍼의 작은 볼륨 (0.5\u20121 mL)에서 미토 콘 드리 아 펠 릿 resuspend
- 상쾌한, resuspend 4000 × g 15 분 제거에서 일시 중단 된 펠 릿을 원심는 미토 콘 드리 아 의 샘플 버퍼 (예를 들어, 250 ~ 500 µ L, 펠 릿의 크기에 따라 그리고 원하는 원하는 최종 볼륨에서 펠 릿 농도)입니다.
- 원심 분리기 (5.1.4 단계)에서 상쾌한 4000 × g 에서 15 분에 대 한 깨끗 한 원심 분리기 튜브는 상쾌한 전송. 때까지 아무 펠 릿은 원심 분리에 따라이 단계를 반복 합니다.
- 3 h에 대 한 18000 × g 에서 상쾌한 스핀.
- 상쾌한, 제거 하 고 막 단백질을 포함 하는 펠 릿을 유지. 작은 볼륨에서 막 펠 릿 resuspend (0.5-1 mL) 세포의 B. 버퍼
- 1 시간에 대 한 18000 × g 에서 일시 중단 된 펠 릿 원심
- 상쾌한을 제거 하 고 원하는 마지막 양의 샘플 버퍼 (250 ~ 500 µ L, 펠 릿 및 원하는 농도의 크기에 따라)에 막 펠 릿 resuspend.
- 3 샘플 펠 릿을 sonicate 5의 전원 설정에서 얼음 목욕에서 s (20 kHz에서 125 W 최대 전력의 50%는 테이블의 자료참조).
- 샘플 4 ° C (단기) 또는-20 ° C (장기)를 저장 합니다.
- 서쪽 오 점 단백질 마커는 세포의 세포질, 미토 콘 드리 아 막 구획에서 발견에 대 한 항 체를 이용 하 여 분류의 순수성에 대 한 샘플을 검사 (대표적인 결과 섹션을 참조 하십시오).
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Representative Results
Undifferentiated U9378 셀 서 스 펜 션에서의 성공적인 분류는 위에서 자세히 설명 하 고 그림 1에 나와 있는 프로토콜을 사용 하 여 달성 되었다. 이 방법으로 얻은 샘플 polyvinylidene 불 소 (PVDF) 막에 젖은 전송 방법을 이용 하 여 서쪽 더 럽 히9 를 받게 했다. 막에 대 한 항 체와 조사 이후에 세포질, 미토 콘 드 리아 멤브레인 지역화 단백질 마커 (그림 2, 그림 3, 그림 4). 세포질 단백질의 추출은 일반적으로 세포의 세포질에 지역화 cytosolic 단백질 glyceraldehyde-3-인산 효소10 (GAPDH)에 대 한 항 체와 오 검색을 통해 확인할 수 있습니다. (그림 2, 하단 패널, 1, 2 차선) immunoblot에 의해 같이 GAPDH 에서만 발견 된다 digitonin 추출 샘플 및 오염 없이 (그림 4; 3, 하단 패널에 4 차선) 4000 × g 발 또는 18000 × 에서 관찰 g 펠 릿 (그림 4, 5와 하단 패널에 6 차선). 전압 의존 음이온 채널 (VDAC), 외부 미토 콘 드 리아 멤브레인11로 단백질에 대 한 4000 × g 발 (그림 4; 3, 중간에 4 차선에서는 미토 콘 드리 아의 성공적인 절연 패널), 동안 다른 분수에이 단백질의 부재는 18000 × g 펠 릿 또는 digitonin 추출 견본에서 미토 콘 드리 아 오염의 부족을 보여줍니다. 18000 × g 발 (그림 4, 5와 상단에 6 차선에에서 위치한이 단백질의 대부분을 보여줍니다 Na/K-ATPase α1 소 단위는 통합 막 heterodimer12원형질 막 주로 발견의 일부에 대 한 패널)입니다. 이 단백질은 또한 4000 × g 발 (그림 4, 상단 패널의 3, 4 차선)에 검출이 가능성은 가능성이 낮은 속도이 펠 릿 얻은 플라즈마 막으로 가능한 오염 제안. 더 그럴듯한 설명을 바인딩과 그물 (ER)의 존재 4000 × g 알 약 샘플에서은 나, 원형질 막에 응급실에서 K ATPase subunits의 교통 연구원13에 의해 입증 되었습니다. 나의 부족, (그림 4, 상단 패널에 1, 2 차선) digitonin 추출 견본에서 K ATPase α1 단백질이이 분수의 순도 보여 줍니다.
성공적인 분류 (그림 2) 동안 관찰 결과, 달리는 프로토콜의 잘못 된 실행 교차 오염의 세포질 구성 요소 (그림 3, 그림 4)의 발생할 수 있습니다. 나, 18000 × g 펠 릿에 비해 4000 × g 발에 K ATPase α1 단백질의 높은 농도 (그림 3 {상위 패널, 차선 2-3]과 그림 4B [상위 패널, 차선 5-12]), 세포 기관이 분수 있음을 나타냅니다 플라즈마 막 단백질 오염 되었습니다. Digitonin 추출 세포질 샘플 이외의 어떤 분수에서 GAPDH의 존재 ([하단 패널, 레인 4]그림 3 및 그림 4A [하단 패널, 차선 5-12] 후속 단계에 세포질 단백질을 제거 하는 실패의 지표 이다.
그림 1: 세포 분별 법 프로토콜의 다이어그램. 흐름 차트 표현 세포 분별 법 프로토콜의 개요. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: U937 세포 세포질, 세포 기관이, 그리고 막 분수의 성공적인 절연. 셀 분수의 서쪽 오 점 두 U937 세포 배양에서 분리 된 고 막 (Na, K ATPase α1, 맨 위 패널), 미토 콘 드리 아 (VDAC, 중간 패널)과 세포질 (GAPDH, 하단 패널)의 표식에 대 한 조사. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 충분치 U937 세포 구성 요소 실패. Na K ATPase α1와 세포 기관이 분수 (2 차선)의 오염 보여주는 단일 U937 세포 배양에서 분리 된 셀 분수의 서쪽 오 점 (상단 패널)와 막 펠 릿 (4 차선)의 상쾌한에 세포질 구성의 손실. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 교차 하는 세포질의 오염과 막 구성 요소 분류 중. (A) 분별 세포 기관이 (하단 패널, 차선 5-8)와 막 분수 (하단 패널, 레인 9-12)에서 GAPDH의 세포질 교차 오염 시도. (B) 분류 나, 미토 콘 드 리아 분수 (최고 패널, 차선 5-8)에 K ATPase의 플라즈마 멤브레인 오염 시도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 이름 | 구성 (재고 농도) | 최종 농도 |
| 버퍼 A | NaCl (150 m m)와 HEPES (50mm) | (재고 동일) X 1 |
| 세포의 용 해 버퍼 B | HEPES (20 m m), KCl (10 m m), MgCl2 (2 mM), EDTA (1 m m), EGTA (1mm), 마 니 톨 (210mm) 및 자당 (70mm) | (재고 동일) X 1 |
| 샘플 버퍼 | Tris 버퍼 식 염 수에 나트륨 라우릴 황산 염 (0.1%) | (재고 동일) X 1 |
| Digitonin | Digitonin (250 µ g/ml) 이온을 제거 된 물에 | 25 µ g/ml |
| Phenylmethanesulfonyl 불 소 | 100% 에탄올에 Phenylmethanesulfonyl 불 소 (100 mM) | 1mm |
| 프로 테아 제 억제 물 칵테일 | (참조 제조 업체 제품 시트를)를 변화 한다 | 1 X |
| 나트륨 Orthovanadate | 이온된 수에 나트륨 Orthovanadate (500mm) | 1mm |
표 1: 버퍼 및 솔루션. 버퍼 및 프로시저에 대 한 필요한 솔루션의 구성.
| 프로토콜 단계 | 중요 한 요소 | 설명 | 잠재적인 문제 | 가능한 솔루션 |
| 세포 준비 | 셀 농도 | 이 메서드를 처리할 수 있는 셀의 최적 농도 최상의 결과 얻기 위하여 함께 일 되 고 셀 형식에 대 한 실험적으로 결정 되어야 합니다. | 비효율적인 세포, 미토 콘 드리 아 막의 낮은 수율으로 이어지는 분수 농축된 셀 정지 발생할 수 있습니다. | 최상의 결과 확인 하려면 셀 농도의 범위와 초기 절차를 수행 합니다. |
| 셀의 사전 처리 | 세포 분별 법 절차에 대 한 서 스 펜 션에 있어야,이 문화 표면에서 부착 세포 분리 또는 조직 균질을 필요 합니다. | 비효율적인 처리 낮은 분수 수율, 교차 오염의 subcellular 분수 또는 기타 예기치 않은 결과가 발생할 수 있습니다. | 메서드는 프로시저에 대 한 충분 한 셀에서 결과 고용 확인 합니다. 처리 후 농도 결정 하 고 그에 따라 조정에 셀을 계산 합니다. | |
| 방법이 타협 원형질 막, 조 세포 발생할 수 있습니다, 교차 오염의 분수의 결과로. | 원형질 막 무결성 셀의 손상을 방지 하는 방법을 사용 하 여 셀 수확 하는 동안 유지 됩니다 확인 하십시오. (예: Trypan 블루) 막 스며들 지 않는 염료의 포함과 함께 현미경 검사 막 무결성을 확인 합니다. | |||
| Cytosolic 단백질 격리 | Digitonin 농도 | Digitonin의 최적 농도 기 공 형성을 통해 cytosolic 단백질 추출 하면서 세포 세포의 용 해를 피하기 위해 결정 합니다. | Digitonin의 높은 농도 막 파열, 세포 세포의 용 해 및 cytosolic 분수의 오염 될 수 있습니다. 차선의 농도 cytosolic 단백질의 비효율적인 추출 및 후속 분수의 가능한 상호 오염 발생 합니다. | 과도 한 세포 세포의 용 해 관찰 되는 경우 digitonin의 농도 감소 한다. Digitonin 부 화에 따라 얻은 작은 세포 펠 릿 막 파열을 표시 하 고 세포 세포의 용 해 수 있습니다. |
| 게시물 추출 워시 | Digitonin 및 permeabilized 세포에서 cytosolic 단백질의 제거는 교차 오염을 피하기 위하여 수행 되어야 합니다. | Cytosolic 추출 될 수 있습니다 후 세포를 충분히 씻어 실패 다른 분수 cytosolic 단백질의 월. | 추가 버퍼와 세척 한 다음 digitonin 및 남아 있는 cytosolic 단백질 digitonin 외피 희석 됩니다. | |
| 미토 콘 드리 아 절연 | 세포 세포의 용 해 | 세포의 용 해 방법 이후 격리에 대 한 미토 콘 드리 아 무결성을 유지 하면서 세포 내용 공개 철저 해야 합니다. | 셀의 기계적 lysis 셀 그대로 결과로 미토 콘 드리 아 단백질의 낮은 수율을 떠나 효율적인 수 있습니다. | 세포를 lyse 미토 콘 드리 아를 출시 하는 데 필요한 힘의 양은 다른 세포 유형에 대 한 실험적으로 결정 되어야 합니다. 세포 단계 후 얻은 큰 펠 릿 (뿐만 아니라 작은 미토 콘 드리 아 그리고 막 펠 릿) 차선 세포를 나타낼 수 있습니다. (유 봉 선, 바늘 구절, 등) 게시물 세포 pellet을 최소화 하기 위해 힘의 양을 증가. |
| 너무 많은 기계적인 힘 미토 콘 드리 아, 미토 콘 드 리아 멤브레인 단백질 플라즈마 멤브레인 분수 오염 lyse 수 있습니다. | 미토 콘 드리 아 단백질 마커 막 샘플에서 발견 되 면 힘의 양을 줄입니다. | |||
| 파편 제거 | 그대로 세포 및 더 큰 파편 세포 미토 콘 드 리아 샘플 오염 방지 하려면 다음 homogenate에서 제거 되어야 합니다. | 미토 콘 드리 아 샘플 파편과 그대로 세포는 미토 콘 드리 아를 산 전에 제거 되지 세포질 구성 요소 또는 플라즈마 막 단백질 오염 될 수 있습니다. | 저속 원심 분리 단계 전에 미토 콘 드리 아 격리 스핀의 수를 늘립니다. 미토 콘 드 리아 수익률 낮은 경우에, 그것을 펠 릿 저속 회전에서 미토 콘 드리 아 마커를 위한 서쪽 오 점을 통해 확인 필요할 수 있습니다. | |
| 후 분리 세척 | 미토 콘 드리 아 샘플 그들과 작은 수 오염 파편 제거를 철저 하 게 세척 한다. | 셀 조각 5 월 집계 및 미토 콘 드리 아, 교차 하는 세포질의 오염에 지도와 연관 또는 막 단백질. | 펠 릿 오염 물질을 제거 하는 버퍼 충분히 씻어 있습니다 확인 합니다. | |
| 막 분리 | 원심 분리 시간 | 원심 회 막 일부 샘플의 수확량 증가를 확장할 필요가 있습니다. | 처리 된 세포의 총 수와 세포 세포의 용 해의 효율성에 따라 막 분수 샘플 수익률 낮은 있을 수 있습니다. | 원심 분리 시간 플라즈마 멤브레인 분수의 수율을 높일 수 있습니다. 제안된 시간 셀의 대량 시작에 대 한 충분 한 동안, 더 긴 시간 작은 수량에 대 한 필요할 수 있습니다. |
표 2: 중요 한 단계. 프로토콜 단계, 잠재적인 문제 및 프로토콜 문제 해결에 대 한 가능한 솔루션의 요약 테이블.
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Discussion
이 프로토콜의 개발은 미토 콘 드리 아를 분리 하는 무 능력 하 고 막 샘플, necroptosis14동안 단백질 지 방화의 분석을 위해 상용 키트를 사용 하 여에서 발생 했다. Premade 키트의 주요 한계는 그들의 무 능력 개인 연구자의 요구에 적응 될 샘플 및 샘플 처리 수의 제한 된 수의 비용. 비싼 시 약의 사용과 고가의 장비에 대 한 필요성 없이 여기에 제시 된 메서드를 수행할 수 있습니다. 이 메서드는 셀의 수에 맞게 확장 될 수 있습니다 하 고 연구자의 요구에 맞게 변경 되는. 이 메서드의 실행에 증가 각 분수의 수익률, 수행 중인 연구 단계 조정 및 유연성 수 있습니다. 버퍼에서 나트륨 orthovanadate의 추가 연구 최종 샘플에 있는 단백질의 인 산화 상태를 검사 하지는 경우 생략할 수 있습니다. 마지막 버퍼에 SDS의 포함 마찬가지로 더 밀도 그라데이션 원심을 통해 샘플을 정화 하고자 하는 연구 하는 경우 생략할 수 있습니다. 우리만이 방법은 성공적으로 충분치 U937 세포, 비 점착 monocyte 셀 라인을 사용 하는 동안 프로시저 여러 세포와 조직, 사소한 변경 작동 합니다. 셀 서 스 펜 션에 성장 부착 세포 필요이 프로토콜을 시작 하기 전에 성장 표면에서 분리 하는 동안 여기에, 자세한 U937 세포에 유사 하 게 pelleted 수 있습니다. 마찬가지로, 조직 해야 합니다 수 완전히 무 균 분류 포함 하는 셀의 이전. 이 느슨한 피팅 Dounce 균질 화기, 포터 Elvehjem 유리 polytetrafluoroethene 균질 화기를 이용 하 여 또는 다른 (상업용) 방법15에 의해 수행할 수 있습니다.
최적의 결과 및 순수한 분수 (표 2)에 주의 필요로 하는 프로토콜에 중요 한 단계는 여러 가지가 있습니다. 여기 (2.1.2, 단계 2.1.4, 3.1.3, 3.2.1 4.1.2) 권장 하는 세포의 농도 U937 세포에 관련 되며, 시행 착오를 통해 결정 했다. 이러한 값은 프로토콜을 실행할 때 차선의 결과 가져온 경우 세포의 종류에 맞게 조정 될 필요가 있습니다. 세포질 추출 단계 (3.1 단계) digitonin의 농도가 완전히 세포를 lysing 없이 원형질 막 permeabilize 충분 해야 합니다. 이 부 화에 따라 세포는 철저 하 게 후속 단계에서 cytosolic 단백질을 제거 하기 위하여 세척 한다 또는 교차 오염 다운스트림 샘플 (그림 4A)에서 발생 합니다. 균질 단계 (단계 4.1.4) 기계 세포의 어떤 형태로 수행할 수 있습니다, 그리고 하지만 결과 여기에 제시 된 Dounce 균질 화기와 가져온. Dounce 균질 화기를 사용 하는 대신 반복적으로 충분 한 셀 세포까지 좁은 계기 바늘 (27 G 권장, 20-40 통과) 세포를 통과 달성 이다. 그것은 손상 되지 않은 세포의 큰 펠 릿 균질 (4.1.7 단계) 후 얻은 경우 선 (또는 주사기 패스)의 수를 늘리기 위해 필요할 수 있습니다. 연구원은 가능성이 되 고 분류 한 세포의 종류에 대 한 균질의 최적의 금액을 결정 해야 합니다. 균질에 따라 세포질 파편의 제거 원형질 막의 구성 요소 (그림 4B)와 세포 기관이 분수의 오염 방지에 철저 해야 합니다. 이 경우, 추가 저속 원심 분리 단계 세포 파편을 제거 하려면 수행 되어야 한다. 이 방법의 개발 하는 동안 최대 18000 × g 에서 원심의 18 h 3 h 회전 (그림 2, 5-6 차선) 이상의 원형질 막의 최소한의 증가 함께, 시험 되었다. 연구진은 더 나은를 원심 분리 시간을 증가 해야 플라즈마 멤브레인 샘플의 생성 찾을 수 있습니다.
여기에 제시 된 방법 ultracentrifugation 관련 된 더 철저 한 정화 방법에 비해 제한 됩니다. Isopycnic 밀도 원심 분리를 사용 하지 않고 셀 균질 후 얻은 개별 세포 분리 수는. 4000 × g 분수 미토 콘 드리 아 (로 VDAC, 그림 2의 존재에 의해 입증) 포함, 그들은 가능성이 또한 포함 ER, 골 및 추가 세포내 세포. 세포 기관이 분수가 중요 한 연구를 수행 하는 경우 다른 세포의 단백질 마커를 추가 항 체의 사용에 의해 확인 되어야 한다.
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Disclosures
저자 아무 상충 선언
Acknowledgments
작업은 NIH-1R15HL135675-01 티모시 J. LaRocca에 의해 지원 되었다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digitonin | TCI Chemicals | D0540 | For Cytoplasm Extraction |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | For Lysis buffer B |
| Dounce homogenizer | VWR | 22877-282 | For Homogenization |
| end-over-end rotator | Barnstead | N/A | For Cytoplasm Extraction |
| ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Alfa Aesar | J61721 | For Lysis buffer B |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E7889 | For Lysis buffer B |
| GAPDH (14C10) | Cell Signalling Technologies | 2118 | For detection of cytoplasmic fractions on western blot, dilution: 1:10000 |
| HEPES | VWR | J848 | For Lysis buffers A and B |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | For Lysis buffer B |
| MgCl2 | Alfa Aesar | 12315 | For Lysis buffer B |
| Na, K-ATPase a1 (D4Y7E) | Cell Signalling Technologies | 23565 | For detection of plasma membrane fractions on western blot, dilution: 1:1000 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | For Lysis buffer A |
| phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | VWR | M145 | For Cytoplasm Extraction and Homogenization Buffer |
| probe sonicator | Qsonica | Q125-110 | For Final Samples |
| Protease Inhibitor Cocktail, General Use | VWR | M221-1ML | For Cytoplasm Extraction |
| refrigerated centrifuge | Beckman-Coulter | N/A | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | VWR | 227 | For Sample buffer |
| sodium orthovanadate (SOV) | Sigma-Aldrich | 450243 | For Lysis buffers A and B |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | For Lysis buffer B |
| Tris-buffered Saline (TBS) | VWR | 788 | For Sample buffer |
| VDAC (D73D12) | Cell Signalling Technologies | 4661 | For detection of mitochondrial fractions on western blot, dilution: 1:1000 |
References
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