Summary
Здесь мы представляем протокол изолировать плазматической мембраны, цитоплазмы и митохондрии клеток U937 без использования высокоскоростной центрифуги. Этот метод может использоваться для очистки субцеллюлярные фракций для последующего изучения белков локализации через immunoblotting.
Abstract
В этом протоколе мы подробно метод для получения субцеллюлярные фракций U937 клеток без использования ultracentrifugation или неизбирательного моющих средств. Этот метод использует гипотонический буферов, digitonin, механический лизис и дифференциального центрифугирования изолировать цитоплазмы, митохондрии и плазматической мембраны. Этот процесс может масштабироваться для удовлетворения потребностей исследователей, является недорогим и простым. Этот метод позволит исследователям для определения локализации белка в клетках без специализированных центрифуги и без использования коммерческих комплекты, оба из которых могут быть дорогими. Мы успешно использовали этот метод, чтобы отделить цитозольной, плазматической мембраны и митохондриальных протеинов в линии клеток человека Моноцит U937.
Introduction
Надежная идентификация белка локализации часто бывает необходимо при рассмотрении молекулярные пути в эукариотических клеток. Методы для получения субцеллюлярные фракции используются исследователями более внимательно изучить клеточных компонентов, представляющих интерес.
Большинство существующих методов фракционировки клетки, как правило, делятся на две широкие категории, на основе моющих средств1,2 и на основе ultracentrifugation3,4,5, который может быть различаются по скорости, точности и стоимости. Стиральный порошок на основе протоколов полагаются на использование буферов с увеличения моющая сила чтобы солюбилизировать последнего отдельных компонентов клетки. Это быстрый и удобный метод для обработки образцов и может быть экономически эффективным, если количество и размер образцов малы. Комплекты на основе моющих средств могут быть приобретены изолировать цитоплазмы, мембраны/органелл (смешанная дробь) и ядерных фракций из клеток. Однако некоторые недостатки, связанные с эти комплекты ограничивает их полезность для исследователей. Они предназначены для легко изолировать одного или двух компонентов клетки, но способны одновременно изолируя всех дробей от образца. Использование моющих средств означает, что будет одинаково солюбилизирован плазматической мембраны и мембраны закрытых органелл и, следовательно, не могут быть отделены друг от друга. Дополнительное усложнение возникает от несвободных компонентов в эти комплекты, препятствующая исследователей от изменения условий для конкретных приложений. Наконец они ограничены в число случаев использования и могут быть дорогими для больших масштабах экспериментов. Non-моющее средство на основе наборы для изоляции митохондрий существуют, однако, они не предназначены для изоляции плазматической мембраны и образец урожайность является значительно меньше, чем от плотности центрифугирования изоляции протоколы6,7 .
Методы, которые используют ultracentrifugation для получения фракций больше времени, но часто результат в чище фракций, чем наборы на основе моющих средств. Чтобы изолировать мембраны плазмы от клеток без первого растворяющие их (в результате загрязнения с Органеллы мембраны) требует от них лизированы методом без моющих средств, следуют разъединения клетчатых компонентов через дифференциальный центрифугирование — с изоляцией плазматической мембраны, требующие скорости 100 000 × g для выполнения. Во многих случаях дифференциального центрифугирования должны сопровождаться isopycnic плотность градиентного центрифугирования для дальнейшего разделения сотовой фракций или удаления загрязняющих веществ. Хотя эти методы являются тщательное и модифицируемый, недостатки включают стоимость, время потребления и потребность ультрацентрифуга для разделения фракций и дальнейшей очистки через плотность градиентного центрифугирования. Большинство Высокоскоростные центрифуги, ценой, что непомерно высока для отдельных следователей и часто разделяют, стержневое оборудование в академических учреждениях. Таким образом наличие ультрацентрифуга становится непомерно в таких ситуациях.
В этом протоколе фракционирование мы демонстрируем изоляции субцеллюлярные фракций без использования растворяющие моющие средства и высокая скорость центрифугирования. Этот метод позволит исследователям изолировать плазматической мембраны, митохондрии и цитоплазматических компонентов эукариотических клеток с минимальным загрязнением между фракциями.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовьте буферов и реагенты
Примечание: См. таблицу 1.
- Подготовка решений буфер A, литического буфера B, буфер образца и digitonin.
- Подготовка буфера A, добавив 8.77 г NaCl и 50 мл HEPES (1 М, рН 7,4) до 900 мл деионизированной воды, настроить конечный объем до 1 Л деионизированной водой.
Примечание: Окончательный концентрации являются 150 мм NaCl и 50 мм HEPES. - Подготовка буфера lysis B, добавив 20 мл HEPES (1 М, рН 7,4), 0,75 г KCl, 0,19 g MgCl2, 2 мл Этилендиаминтетрауксусная кислота (0,5 М ЭДТА), 2 мл этиленгликоля bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N', N'-tetraacetic кислота (0,5 М EGTA) , 38.26 g маннит и 23.96 г сахарозы в 900 мл деионизированной воды, настроить конечный объем до 1 Л деионизированной водой.
Примечание: Окончательный концентрации являются 20 мм HEPES, 10 мм KCl, 2 мм MgCl2, 1 мм ЭДТА, 1 мм EGTA, маннитол 210 мм и 70 мм сахарозы. - Подготовьте буфер образца, добавляя 0.01 g додецилового сульфата натрия (SDS) до 10 мл трис амортизированное saline (TBS) для окончательного концентрации 0,1% SDS.
- Подготовьте Стоковый раствор digitonin путем добавления 25 мг digitonin 100 мл деонизированной воды (конечная концентрация составляет 250 мкг/мл).
- Храните все буферных растворов в 4 ° C и digitonin при-20 ° C до начала эксперимента.
- Подготовка буфера A, добавив 8.77 г NaCl и 50 мл HEPES (1 М, рН 7,4) до 900 мл деионизированной воды, настроить конечный объем до 1 Л деионизированной водой.
- Подготовьте свежие решения ингибиторов протеаз и фосфатазы добавляемый к буферных растворов перед добавлением к клеткам.
- Подготовить раствор phenylmethanesulfonyl фтора (PMSF) путем добавления 17,4 мг PMSF 1 мл 100% этанола (конечная концентрация составляет 100 мм).
Предупреждение: Носить соответствующего защитного оборудования и проявлять осторожность при обработке PMSF. PMSF опасными, если его проглотить и слегка опасных в случае контакта с кожей (раздражающие), контакт глаз (раздражающие) или ингаляционно; коррозионное воздействие на глаза и кожу. - Приготовить коктейль ингибитор протеазы коммерчески доступных (100 ×) согласно инструкциям производителя (см. Таблицу материалов).
- Подготовьте Стоковый раствор Ортованадат натрия (SOV) путем добавления 92 мг SOV 1 мл деонизированной воды (конечная концентрация составляет 500 мм).
Предупреждение: Использовать соответствующие средства индивидуальной защиты и осторожность при обработке. SOV опасных в случае контакта глаз (раздражающие), при приеме внутрь или ингаляции. Тяжелые чрезмерное воздействие может привести к смерти.
- Подготовить раствор phenylmethanesulfonyl фтора (PMSF) путем добавления 17,4 мг PMSF 1 мл 100% этанола (конечная концентрация составляет 100 мм).
2. PBS мыть
- Концентрат и вымыть клетки в фосфат амортизированное saline (PBS) до фракционирования.
- Суспензию клеток в центрифуге при соответствующей скорости для создания гранул. Например центрифуга подвеска U937 клеток на 400 × g за 10 мин.
- Удалить супернатант, Ресуспензируйте Пелле клеток в комнатной температуре PBS в конечной концентрации 4 × 106 клеток/мл и пипетки нежно порвать пряди.
- Центрифуга суспензию клеток на 400 × g за 10 мин до Пелле клетки.
- Удалить супернатант и Ресуспензируйте Пелле ячейки в буфер A ледяной в конечной концентрации 2 × 107 кл/мл.
Примечание: Все последующие шаги должны осуществляться при Температуре 4 ° C или на льду и все буферы должны быть предварительно охлажденным.
3. цитозольной белка изоляции
- Извлечь цитозольной белки, инкубация с моющим средством digitonin.
- Непосредственно перед ресуспендирования клеток (шаг 3.1.3) мкл 10 акций PMSF (100 мм), 10 мкл ингибитор протеазы (100 ×), 2 мкл запасов SOV (500 мм) и 100 мкл запасов digitonin (250 мкг/мл) в 878 мкл буфера A (окончательный концентрации являются 1 мм PMSF , 1 × ингибитор протеазы, 1 мм SOV и 25 мкг/мл digitonin; громкость окончательный согласно количество ячеек используются). Держите решение на льду до дополнение к ячейке Пелле.
- Центрифуга суспензию клеток на 400 × g 10 мин и удалить супернатант.
- Ресуспензируйте Пелле ячейки в буфер A решения, содержащие ингибиторы и digitonin (подготовленных на шаге 3.1.1) в конечной концентрации 2 × 107 кл/мл, Пипетка нежно порвать пряди.
- Инкубируйте суспензию клеток на конец над конец ротатор на 4 ° C в течение 20 мин.
- Центрифуга суспензию клеток на 400 × g для 10 минут собрать супернатант и поместите его в чистый пластиковых пробирок.
- Центрифуга собранные супернатант в 18 000 × g за 20 мин до Пелле сотовой мусора.
- Передать супернатант чистых пластиковых пробирок.
- Повторите шаги 3.1.5 и 3.1.6, до тех пор, пока не Пелле получается после центрифугирования.
- Собирать супернатанта, содержащий цитозольной белков и хранить его на 4 ° C (краткосрочные) или от-20 ° C (долгосрочные).
- Удалите излишки digitonin и цитозольной белки центрифугированием.
- Ресуспензируйте Пелле digitonin-permeabilized клеток (от шага 3.1.5) в буфере A в конечной концентрации 4 × 106 клеток/мл и пипетки нежно порвать пряди.
- Центрифуга суспензию клеток digitonin-permeabilized на 400 × g 10 мин и удалить супернатант.
Примечание: Неоднократных стирок в буфере A может быть проведена для удаления избыточных цитозольной загрязнений.
4. клетки гомогенизации
- Инкубировать клетки на льду литического буфера B и лизируют их механическими средствами.
- Непосредственно перед ресуспендирования клеток (шаг 4.1.2) добавить 10 мкл запасов PMSF (100 мм) и 2 мкл запасов SOV (500 мм) 988 мкл буфера lysis B (окончательный концентрации 1 мм PMSF и 1 мм SOV; окончательного громкость для размещения количество клеток лизированы) и держать Солу Тион на льду до дополнение к ячейке Пелле.
- Ресуспензируйте ячейки Пелле (из шага 3.2.2) в ледяной лизис буфера B раствор, содержащий PMSF и SOV (подготовленных на шаге 4.1.1) в конечной концентрации 4 × 106 клеток/мл.
- Инкубируйте суспензию клеток на льду за 30 мин.
- Передавать предварительно охлажденные Dounce гомогенизатора (с пестиком B облегающие) суспензии клеток на льду и 40 проходит с пестиком гомогенизатор, медленно, используя даже штрихов.
Примечание: Можно также используйте другие средства лизис механические клетки как описано в разделе "обсуждение". - Собирать огневки и перенести его на чистых пластиковых пробирок.
- Вымойте гомогенизатор пестик и трубки с небольшой объем (1-2 мл) буфера lysis B и добавить его в огневки.
- Центрифуга огневки на 400 × g (или минимальная скорость для пеллет непрерывной клетки) 10 мин.
- Передать супернатант чистых пластиковых пробирок.
Примечание: Если значительный Пелле остается повторите шаги 4.1.4 через 4.1.6 увеличить выход фракций как подробно в разделе обсуждения. Протокол может быть приостановлена здесь, и огневки температуре 4 ° C на короткий срок (24 h).
5. дифференциального центрифугирования
- Центрифуга огневки на повышение скорости для удаления сотовой мусора, изолировать митохондрии и мембраны фракций.
- Центрифуга супернатант (из шага 4.1.8) на 500 × g для передачи супернатант 10 мин для чистых пластиковых пробирок и отменить любые Пелле.
- Центрифуга супернатант (из шага 5.1.1) на 1000 × g 10 мин передачи супернатант в чистых пластиковых пробирок и отменить любые Пелле.
- Центрифуга супернатант (из шага 5.1.2) на 2000 × g 10 мин передачи супернатант в чистых пластиковых пробирок и отменить любые Пелле.
- Центрифуга супернатант (из шага 5.1.3) на 4000 × g для передачи супернатант 15 мин для чистых пластиковых пробирок, держать гранулы, содержащие митохондрий.
- Ресуспензируйте Пелле митохондрий в небольшом объеме (0.5\u20121 мл) буфера lysis б.
- Центрифуги подвесные гранул на 4000 × g 15 мин удалить супернатант и Ресуспензируйте митохондриальной Пелле в нужный конечный объем буфера выборки (например, 250 до 500 мкл, в зависимости от размера гранул и желаемого концентрация).
- Центрифуга супернатант (от шага 5.1.4) на 4000 × g 15 мин передачи супернатант чистых пластиковых пробирок. Повторите этот шаг до тех пор, пока не Пелле получается после центрифугирования.
- Спиновые супернатант в 18 000 × г за 3 ч.
- Удалить супернатант и держать гранулы, содержащие мембранных белков. Ресуспензируйте Пелле мембраны в небольшом объеме (0,5 – 1 мл) из лизис буфера б.
- Центрифуги подвесные гранул на 18 000 × г за 1 ч.
- Удалить супернатант и Ресуспензируйте Пелле мембраны в нужный конечный объем буфера выборки (250-500 мкл, в зависимости от размера гранул и желаемой концентрации).
- Sonicate образец гранулы для 3 s в ледяной ванне при мощности 5 (50% 125 Вт Максимальная мощность на 20 кГц, см. Таблицу материалы).
- Храните образцы на 4 ° C (краткосрочные) или от-20 ° C (долгосрочные).
- Проверьте образцы для чистоты фракционирования, выполняя Западная помарка, используя антитела против белков маркеры в цитоплазме, митохондрии и мембраны отсеков ячейки (см. раздел представительных результатов).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Успешное фракционирование недифференцированных клеток U9378 , выращенных в подвеска была выполнена с использованием протокола подробно изложенных выше и показан на рисунке 1. Образцы, полученные с помощью этого метода были подвергнуты западных blotting9 , используя влажный передачи метода винилидена фторида (PVDF) мембраны. Мембрана впоследствии был исследован с антителами против цитоплазмы, митохондриальных и мембраны локализованных белковых маркеров (рис. 2, рис. 3, рис. 4). Успешное извлечение цитоплазматических белков может быть проверены путем прощупывания блот с антителами против цитозольной белка Глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа10 (GAPDH), обычно локализованы в цитоплазму клетки. Как показали immunoblot (рис. 2; нижней панели, полосы, 1 и 2), GAPDH встречается только в digitonin извлечены образцы и загрязнения не наблюдается в 4000 × g окатышей (рис. 4; майнах 3 и 4 на нижней панели) или 18 000 × g гранулы (рис. 4; полосы 5 и 6 на нижней панели). Зондирования для анион напряжени тока зависимых каналов (VDAC), белка локализован внешней митохондриальной мембраны11, показывает успешное изоляции митохондрий в 4000 × g гранулы (рис. 4; майнах 3 и 4 на середине Группа), в то время как отсутствие этого белка в других фракций показывает отсутствие митохондриальной загрязнения в 18 000 × g гранулы или digitonin извлечены образцы. Зондирования для субблока α1 Na/K-АТФазы, частью интегральный мембранный гетеродимер, главным образом в плазматической мембране12, показывает большинство этого белка, расположенный в 18 000 × g окатышей (рис. 4; полосы 5 и 6 на вершине Группа). Этот белок обнаруживается также в 4000 × g окатышей (рис. 4; майнах 3 и 4 на верхней панели), предложив возможные загрязнения с плазматической мембраны, хотя эта возможность вряд ли на низкой скорости, с которой был получен этот Пелле. Более правдоподобное объяснение является наличие эндоплазменный ретикулум (ER) в 4000 × g гранулы образца, как исследователи13было продемонстрировано транспорта Na, K-АТФазы субблоков от ER к плазматической мембраны. Отсутствие Na, K-АТФазы α1 белка в digitonin извлечены образцы (рис. 4; дорожки 1 и 2 на верхней панели) демонстрирует чистоту этой фракции.
В отличие от результатов во время успешной фракционирование (рис. 2) ненадлежащее исполнение протокола может привести к перекрестного загрязнения клеточных компонентов (рис. 3, рис. 4). Высокая концентрация Na, K-АТФазы α1 белка в 4000 × g окатышей, когда по сравнению с 18 000 × g окатышей (рис. 3 {верхней панели, переулок 2-3] и Рисунок 4B [верхней панели, полосы 5-12]), указывает, что фракция органеллы заражены с белками плазмы мембраны. Присутствие GAPDH в любой фракции извлечено digitonin цитоплазматических образца (рис. 3 [нижняя панель, переулок 4] и Рисунок 4A [нижней панели, полосы 5-12] является показателем отказа для удаления цитоплазматических белков в последующих шагах.
Рис 1: Диаграмма протокол фракционировки клетки. Обзор протокола фракционировки клетки, представлены в виде диаграммы потока. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: успешный изоляции цитоплазме клеток U937, органелл и мембраны фракций. Западных помарках клеток фракций изолированы от двух культур клеток U937 и исследован для маркеров мембраны (Na, K-АТФазы α1, верхней панели), митохондрии (VDAC, средняя группа) и цитоплазмы (GAPDH, Нижняя панель). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: невозможность фракционировать компонентов клеток U937. Западных помарках фракций клетки изолированы от одного U937 клеточной культуры показаны загрязнения фракции органелл (полоса 2) с Na, K-АТФазы α1 (Верхняя панель) и потери цитоплазматических компонентов в надосадке мембраны Пелле (пер. 4). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: крест загрязнения цитоплазмы и мембранных компонентов при фракционировании. (A) фракционирование попытка с цитоплазматических перекрестного заражения GAPDH органеллы (нижней панели, полосы 5-8) и мембраны фракций (нижней панели, полосы 9-12). (B) фракционирование пытаются с плазматической мембраны загрязнение Na, K-АТФазы в митохондриальной фракций (верхней панели, полосы 5-8). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Имя | Состава (биржевых концентрации) | Конечная концентрация |
| Буфер A | NaCl (150 мм) и HEPES (50 мм) | 1 x (так же, как запас) |
| Буфер Lysis B | HEPES (20 мм), KCl (10 мм), MgCl2 (2 мм), ЭДТА (1 мм), EGTA (1 мм), маннитол (210 мм) и сахарозы (70 мм) | 1 x (так же, как запас) |
| Буфер образца | Лаурилсульфат натрия (0,1%) в трис амортизированное Saline | 1 x (так же, как запас) |
| Digitonin | Digitonin (250 мкг/мл) в деионизированной воде | 25 мкг/мл |
| Фторид Phenylmethanesulfonyl | Фторид (100 мм) Phenylmethanesulfonyl в 100% этанола | 1 мм |
| Ингибитор протеазы коктейль | Изменяется (см. производителя продукта лист) | 1 X |
| Натрия Ортованадат | Натрия Ортованадат (500 мм) в деионизированной воде | 1 мм |
Таблица 1: решения и буферов. Композиция из буферов и необходимых решений для процедуры.
| Протокол шаг | Решающим фактором | Объяснение | Потенциальные проблемы | Возможные решения |
| Подготовка клетки | Концентрация клеток | Оптимальная концентрация клеток, которые может обрабатывать этот метод должен быть определен эпирически для типа ячейки, работал с для того, чтобы получить наилучшие результаты. | Высококонцентрированный клеточных суспензий может привести к неэффективной лизиса, приводит к низкой урожайностью митохондрии и мембраны фракций. | Первоначальный процедура с диапазоном концентрации клеток для определения лучших результатов. |
| Предварительная обработка клеток | Клетки должны быть в суспензии для фракционирования процедуры, это требует отсоединения адэрентных клеток от культуры поверхностей или гомогенизации тканей. | Неэффективные обработка может привести к низкой доли урожайности, перекрестного загрязнения между субцеллюлярные фракций или другие непредвиденные результаты. | Убедитесь, что метод работает результаты достаточно клеток для процедуры. Подсчитать ячейки в виде суспензии для определения концентрации после обработки и соответствующим образом скорректировать. | |
| Если метод компромиссы плазматической мембраны, преждевременной лизис может произойти, в результате перекрестного загрязнения фракций. | Убедитесь, что целостность плазматической мембраны сохраняется во время уборки клеток с помощью методов, которые избежать повреждения клеток. Проверьте целостность мембраны при исследовании под микроскопом с включением мембраны непроницаемой краситель (например Трипановый синий). | |||
| Цитозольный белка изоляции | Digitonin концентрация | Оптимальная концентрация digitonin должна определяться избежать lysis клеток пока все еще позволяющ цитозольной белка добычу через порообразования. | Высокая концентрация digitonin может привести к плодного, лизис клетки и загрязнения, цитозольной фракции. Неоптимальный концентрации приведет к неэффективным добычи цитозольной белков и возможного перекрестного заражения последующих фракций. | Концентрация digitonin следует снижается, если наблюдается чрезмерное клеток лизис. Мелкоклеточный Пелле, полученные после инкубации digitonin может указывать плодного и lysis клетки. |
| Мыть после экстракции | Чтобы избежать перекрестного загрязнения должны выполняться удаление digitonin и цитозольной белков из permeabilized клеток. | Неспособность вымыть клетки достаточно после цитозольной извлечения может привести к переносите цитозольной белков для других фракций. | Дополнительные автомойки с буфером следующее digitonin инкубации будет разбавить digitonin и оставшиеся цитозольной белков. | |
| Митохондриальные изоляции | Lysis клетки | Лизис методы должны быть тщательно освободить клеточного содержания, при сохранении митохондриальной целостности для последующего изоляции. | Механический lysis клеток может быть неэффективным, оставляя клетки нетронутыми и приводит к низкой урожайностью митохондриальных протеинов. | Количество необходимых для Лизируйте клетки и выпустить митохондрий силы должны быть определены эпирически для различных типов клеток. Крупные гранулы, полученной после шага лизис (а также небольшой митохондриальных и мембраны гранул) может указывать субоптимальные lysis. Увеличьте количество силы (пестик штрихов, игла отрывки и т.д.), для сведения к минимуму пост лизис Пелле. |
| Слишком много механической силы могут лизировать митохондрий, загрязняя плазматической мембраны дроби с белками митохондриальной мембраны. | Уменьшить количество силы, если митохондриальных белок маркеров находятся в образцах мембраны. | |||
| Удаление мусора | Нетронутым клеток и более крупных фрагментов должны быть удалены из огневки, после лизиса, чтобы избежать загрязнения митохондриальных образцов. | Митохондриальных образцов могут оказаться загрязненными цитоплазматических компоненты или плазмы мембранных белков если мусора и нетронутыми клетки не удаляются перед гранулированием митохондрий. | Увеличьте количество шагов низкая скорость центрифугирования до спин митохондриальной изоляции. Если Митохондриальные урожайность низкая, она может быть необходимо сохранить гранулы от низкой скорости вращения и проверить через западную помарку для митохондриального маркеров. | |
| Мыть после изоляции | Митохондриальных образцов следует тщательно промывают для удаления загрязняющих мусора, который может на гранулах с ними. | Мобильный фрагментов мая совокупные и ассоциированным с митохондрий, ведущих к перекрестного загрязнения из цитоплазмы или мембранных белков. | Убедитесь, что гранулы достаточно мыть с буфером для удаления загрязнений. | |
| Мембранная изоляция | Время центрифугирования | Центрифугирование раз может потребоваться распространить увеличить доходность мембранные часть образца. | В зависимости от общего числа обработанных клеток и эффективности лизис клеток мембранные часть образца доходность может быть низкой. | Увеличивая время центрифугирования может улучшить доходность фракции плазматической мембраны. Хотя предлагаемое время достаточно для начала большое количество клеток, больше времени может потребоваться для меньших количествах. |
Таблица 2: критические шаги. Сводная таблица протокола шаги, возможные проблемы и возможные решения для устранения неполадок в протоколе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В разработке этого протокола, обусловленные неспособность отделить митохондриальных и мембраны образцов, используя коммерчески доступные наборы для анализа белка локализации во время necroptosis14. Основная ограничения готовые комплекты являются их неспособность быть адаптированы к потребностям отдельных исследователей, их стоимость образца и ограниченное количество образцов может быть обработан. Метод, представленный здесь могут выполняться без использования дорогостоящих реагентов и без необходимости дорогостоящего оборудования. Этот метод может масштабироваться для размещения любого количества клеток и может быть изменена с учетом потребностей исследователей. Это позволяет выход каждой фракции следует увеличить, пошив шагов для исследования и гибкость в выполнении метода. Добавление Ортованадат натрия в буферах может быть опущен, если не исследователи изучают состояние фосфорилирование белков в окончательных выборок. Включение SDS в буфере последний также может быть опущен, если исследователей для дальнейшей очистки образцов через плотность градиентного центрифугирования. Хотя мы только использовали этот метод успешно фракционировать U937 клетки, не сторонник Моноцит линии клеток, процедура должна работать с несколькими линий клеток и тканей, с небольшими изменениями. Клеток, выращиваемых в подвеска может аналогичным образом гранулированных в U937 клетки, подробно здесь, в то время как адэрентных клеток линии требуют диссоциации от поверхности роста до начала этот протокол. Аналогичным образом ткани должны тщательно гомогенизированные до фракционирования содержащие клетки. Это может быть достигнуто путем использования свободной одежде Dounce гомогенизатор, гомогенизатор стекла polytetrafluoroethene Поттер-Elvehjem или другие методы (коммерческих)15.
Существует целый ряд важных шагов в протокол, который требуется пристальное внимание чтобы получить оптимальные результаты и чистой фракций (Таблица 2). Концентрация клеток, рекомендуется здесь (шаги 2.1.2, 2.1.4, 3.1.3, 3.2.1 и 4.1.2) являются специфическими для U937 клеток и были определены путем проб и ошибок. Эти значения может потребоваться быть скорректирована с учетом различных типов клеток, если субоптимальные результаты получаются при выполнении протокола. На шаге цитоплазматических извлечения (шаг 3.1) концентрация digitonin должно быть достаточно для разрушения плазматической мембраны без полностью лизировать клетки. После инкубации клетки должны быть тщательно промывают для удаления цитозольной белки из последующих шагов или перекрестного загрязнения будет происходить в нижнем течении образцах (Рисунок 4A). Гомогенизация шаг (шаг 4.1.4) можно использовать с любой формой механических лизис, хотя здесь представлены результаты были получены с гомогенизатор Dounce. Альтернативой использованию Dounce гомогенизатор-пройти неоднократно клетки иглой узкой колеи (27 G рекомендуется, проходит 20-40) до достаточно лизис клеток достигается. Это может быть необходимо увеличить количество штрихов (или шприц проходов), если большие лепешки непрерывной клеток получается после гомогенизации (шаг 4.1.7). Исследователи скорее всего нужно будет определить оптимальное количество гомогенизации для типа ячейки фракционированный. Удаление сотовой мусора после гомогенизации должна быть тщательно, чтобы избежать загрязнения органеллы дроби с плазматической мембраны компонентов (рис. 4В). Если это происходит, дополнительные низкая скорость центрифугирования шаги должны выполняться для удаления сотовой мусора. Во время разработки этого метода был испытан до 18 h центрифугирования в 18 000 × g , с минимальным увеличением доходности плазматической мембраны над 3 h закрутки (Рисунок 2, полосы 5-6). Исследователи могут найти необходимым увеличить центрифугирования раз получить лучше дает образца плазматической мембраны.
Метод, представленный здесь ограничен по сравнению с более тщательные методы очистки, с участием ultracentrifugation. Без использования isopycnic плотность центрифугирования невозможно отделить отдельные органеллы, полученные после гомогенизации клеток. В то время как 4000 × g фракции содержат митохондрии (о чем свидетельствует присутствие VDAC, рис. 2), они вероятно также содержат ER, Гольджи и дополнительных внутриклеточных органелл. Органеллы фракции должны быть проверены с помощью дополнительных антител к белковых маркеров другие органеллы, если это имеет значение для исследования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют никакого конфликта интересов
Acknowledgments
Работа была поддержана низ 1R15HL135675-01 для Ларокка Тимоти Дж.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digitonin | TCI Chemicals | D0540 | For Cytoplasm Extraction |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | For Lysis buffer B |
| Dounce homogenizer | VWR | 22877-282 | For Homogenization |
| end-over-end rotator | Barnstead | N/A | For Cytoplasm Extraction |
| ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Alfa Aesar | J61721 | For Lysis buffer B |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E7889 | For Lysis buffer B |
| GAPDH (14C10) | Cell Signalling Technologies | 2118 | For detection of cytoplasmic fractions on western blot, dilution: 1:10000 |
| HEPES | VWR | J848 | For Lysis buffers A and B |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | For Lysis buffer B |
| MgCl2 | Alfa Aesar | 12315 | For Lysis buffer B |
| Na, K-ATPase a1 (D4Y7E) | Cell Signalling Technologies | 23565 | For detection of plasma membrane fractions on western blot, dilution: 1:1000 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | For Lysis buffer A |
| phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | VWR | M145 | For Cytoplasm Extraction and Homogenization Buffer |
| probe sonicator | Qsonica | Q125-110 | For Final Samples |
| Protease Inhibitor Cocktail, General Use | VWR | M221-1ML | For Cytoplasm Extraction |
| refrigerated centrifuge | Beckman-Coulter | N/A | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | VWR | 227 | For Sample buffer |
| sodium orthovanadate (SOV) | Sigma-Aldrich | 450243 | For Lysis buffers A and B |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | For Lysis buffer B |
| Tris-buffered Saline (TBS) | VWR | 788 | For Sample buffer |
| VDAC (D73D12) | Cell Signalling Technologies | 4661 | For detection of mitochondrial fractions on western blot, dilution: 1:1000 |
References
- Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells. MethodsX. 2, e440-e445 (2015).
- Hwang, S. II, Han, D. K. Subcellular fractionation for identification of biomarkers: Serial detergent extraction by subcellular accessibility and solubility. Methods in Molecular Biology. 1002, 25-35 (2013).
- Song, Y., Hao, Y., et al. Sample preparation project for the subcellular proteome of mouse liver. Proteomics. 6 (19), 5269-5277 (2006).
- Lenstra, J. A., Bloemendal, H. Topography of the total protein population from cultured cells upon fractionation by chemical extractions. European Journal of Biochemistry. 135 (3), 413-423 (1983).
- Michelsen, U., von Hagen, J. Chapter 19 Isolation of Subcellular Organelles and Structures. Methods in Enzymology. 463 (C), 305-328 (2009).
- Stimpson, S. E., Coorssen, J. R., Myers, S. J. Optimal isolation of mitochondria for proteomic analyses). Analytical Biochemistry. 475, 1-3 (2015).
- Williamson, C. D., Wong, D. S., Bozidis, P., Zhang, A., Colberg-Poley, A. M. Isolation of Endoplasmic Reticulum, Mitochondria, and Mitochondria-Associated Membrane and Detergent Resistant Membrane Fractions from Transfected Cells and from Human Cytomegalovirus-Infected Primary Fibroblasts. Current protocols in cell biology. 68, 3.27.1-3.27.33 (2015).
- Sundström, C., Nilsson, K. Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937). International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Barber, R. D., Harmer, D. W., Coleman, R. A., Clark, B. J. GAPDH as a housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues. Physiological Genomics. 21 (3), 389-395 (2005).
- Hodge, T., Colombini, M. Regulation of metabolite flux through voltage-gating of VDAC channels. Journal of Membrane Biology. 157 (3), 271-279 (1997).
- Therien, aG., Blostein, R. Mechanisms of sodium pump regulation. American journal of physiology. Cell physiology. 279 (3), C541-C566 (2000).
- Devarajan, P., Stabach, P. R., De Matteis, M. A., Morrow, J. S. Na,K-ATPase transport from endoplasmic reticulum to Golgi requires the Golgi spectrin-ankyrin G119 skeleton in Madin Darby canine kidney cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (20), 10711-10716 (1997).
- McCaig, W. D., Patel, P. S., et al. Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis. Cell Death Discovery. 4, 55 (2018).
- Simpson, R. J.
