Summary
在这里, 我们提出了一个可重复的方法, 以开发一个原位小鼠模型的头颈部鳞状细胞癌。肿瘤表现出与临床相关的组织病理学特征的疾病, 包括坏死, 分化不良, 结节转移, 和免疫浸润。荷瘤小鼠出现临床相关症状, 包括吞咽困难、颌骨移位和体重减轻。
Abstract
头颈部鳞状细胞癌 (HNSCC) 是一种使人衰弱的致命疾病, 复发率高, 治疗失败。为了制定更好的治疗策略, 了解有助于治疗耐药的肿瘤微环境因素很重要。了解疾病机制和改进治疗的一个主要障碍是缺乏类似于人类 Hnscc 的攻击性和转移性的小鼠细胞系。此外, 大多数小鼠模型采用皮下植入肿瘤, 缺乏重要的生理特征的头部和颈部区域, 包括高血管密度, 广泛的淋巴血管, 和常驻黏膜菌群。本研究的目的是开发和表征 HNSCC 的正学模型。我们使用两个基因不同的小鼠细胞系, 并在小鼠的口腔黏膜中建立肿瘤。我们优化了基于胶原蛋白的肿瘤消化方法, 以最佳方式从已建立的肿瘤中恢复单个细胞。这里提供的数据表明, 小鼠发展高度血管化的肿瘤, 转移到区域淋巴结。单细胞多参数质量细胞学分析显示存在不同的免疫群, 骨髓细胞代表大多数免疫细胞。本研究提出的模型在癌症生物学、肿瘤免疫学和临床前新型治疗方法的发展中具有应用价值。正位模型与人类疾病的临床特征相似, 将为增强翻译和改善患者结局提供一个工具。
Introduction
HNSCC 是全球第五大最常见的恶性肿瘤, 每年诊断出60多万患者 1例。尽管积极治疗涉及化疗和放疗 ( RT ) , 但没有人类状瘤病毒 ( HPV ) 感染的 HNSCC 患者的总体生存率 ( OS ) 在 5 年后 2 年后仍低于 50% 。这主要是由于高度复杂的肿瘤微环境, 因为肿瘤可以来自头部和颈部区域内的几个不同的解剖部位, 包括口腔黏膜、舌头、口腔底部、鼻腔、口腔、咽部,口咽和下咽。此外, 头部和颈部区域是高度血管化, 并包含近一半的所有淋巴结在体内3。大多数研究头颈部肿瘤生物学的研究都依赖于侧翼区域的肿瘤模型。这样的模型可以提供深入了解肿瘤固有的机制, 但缺乏本地头部和颈部微环境可以显著影响这些发现的平移潜力。一种用于诱发口腔肿瘤的方法是接触致癌物质 9, 10-二甲基-2-苯甲氨基甲酮 (DMBA)4。然而, 这种方法是一个漫长的过程, 诱导肿瘤在大鼠和仓鼠, 但不在小鼠, 由此产生的肿瘤不具备许多组织学特征的分化 scc5,6。引入致癌物 4-硝基喹啉-氧化物 (4-NGO), 一种水溶性喹诺酮衍生物, 在口服时导致小鼠口腔肿瘤, 但也经历了长时间的接触时间 (16周), 批次内和批次之间的摄入率有限老鼠 7,8,9。为了开发临床相关模型, 几个小组使用了涉及操纵驾驶员癌基因或肿瘤抑制基因的基因工程模型, 包括 TP53、TGFB、KRAS、HRAS 和 SMAD410.这些模型可以提供对肿瘤的洞察与已知的驱动基因, 但不重述复杂的异质性的人类 Hnscc。
在这项工作中, 我们证明了在小鼠的水管内接种鳞状细胞癌细胞的可行性。注射细胞在注射后1周内发展成攻击性肿瘤。与人类 Hnscc 相似, 肿瘤转移到区域淋巴结。我们描述了该疾病的组织学和临床特征, 并提供了对肿瘤免疫微环境的洞察。我们认为, 这种 HNSCC 的原位模型在癌症生物学、肿瘤免疫学和临床前研究中具有应用价值。免疫逃避、肿瘤进展、治疗阻力和转移的机制是临床意义的领域, 可以使用该模型来解决。
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Protocol
所有动物程序都是根据科罗拉多大学丹佛分校经批准的机构动物护理和使用委员会 (议定书 # 00250) 进行的。
1. 肿瘤细胞培养
请注意:B4B8 和 LY2 细胞系用于产生原位 HNSCC 肿瘤: B4B8 肿瘤细胞来源于致癌物质转化的黏膜角质形成细胞 (来自 balb 小鼠)11。Ly2 肿瘤细胞来源于自发转化的 balb 角质形成细胞系 (pam 212)12,13的淋巴结转移。这两个细胞系都由 Nadarajah Vigneswaran 博士 (美国德克萨斯州休斯敦 Uthealths) 善意提供。
- 使用杜尔贝科的改良鹰的培养基 (DMEM) f 12 补充10% 的胎儿牛血清 (FBS) 和1% 的抗菌试剂进行细胞系维持。将这些细胞系保存在37°c 和5% 二氧化碳的无菌孵化器中。细胞应用于接种之前超过15个通道。
- 板 2 x 10 6 至 4 x 10 6 细胞在175厘米2细胞培养瓶。
请注意:确保细胞的融合率低于 90%, 以避免引起应激反应。 - 当细胞是70% 融合 (~ 48小时), 从孵化器中取出烧瓶, 用冷磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 清洗细胞3倍。
- 使用0.25% 的胰蛋白酶将电池从烧瓶中分离出来, 足以覆盖板的表面。
- 要做到这一点, 在含有70% 融合细胞的175厘米2 瓶中分配4毫升胰蛋白酶。在37°c 和 5% co 2 的细胞培养孵化器中用胰蛋白酶孵育细胞 3-4分钟.
- 在显微镜下观察细胞, 以确保细胞分离。
- 加入含有 FBS 的 DMEM f2 12 培养基12毫升, 以中和胰蛋白酶活性。
- 将细胞悬浮液吸停在一个50毫升的锥形管中。
- 将含有细胞的管子反转 3x–4x, 将其抖动。
- (可选) 将10Μl 的细胞悬浮液与10μl 的 trypan 蓝色混合在微离心管中, 然后使用血细胞计对细胞进行计数。通过从细胞总数中减去 trypan-蓝阳性细胞的数量来确定细胞的活力, 并除以细胞总数。
- 在4°C 条件下, 以 300 x g离心细胞悬浮液5分钟。
- 以适当的体积重新使用不含血清和抗生素 DMEM 中的细胞, 使50μl 介质中存在 1 x 106 细胞。
请注意:根据体内细胞系的攻击性 (经验确定), 每个小鼠每个注射部位 1 x10 6个细胞被认为适合 b4b8 和 LY2 细胞。 - 将装有细胞悬浮液的小瓶放在冰上。
- 将解冻前的基底膜基质放在冰上。
请注意:基底膜基质在4°C 下被解冻过夜。
2. 小鼠细胞注射
- 准备一个 1: 1 混合的细胞: 基底膜基质 (每个 50Μl)。
- 首先添加单元格;然后, 逐渐移液器基底膜基质。避免引入气泡。确保混合物是在动物注射前立即制成的。在基底膜基质中添加细胞较长时间, 可导致基质混合物中细胞沉降, 使混合物难以严格晃动。这将导致小鼠之间肿瘤大小的相当大的变化。
- 轻轻混合。确保所有涉及矩阵的步骤都在冰上执行。地下室膜基质将在室温下聚合。
- 准备用于接种的注射器。
- 用100μl 的细胞膜基质溶液装入 0.5 mL 胰岛素注射器 (23 G)。
- 将注射器放在冰上, 以避免基底膜基质聚合。
- 将小鼠放置在含有异氟烷和氧气的室内 (2.5%)。
- 在进行注射之前, 确保小鼠被深入麻醉 (通过确保对脚趾捏缺乏反应)。
- 将针头插入右侧或左侧口腔区域。这是通过口腔两侧的可用开放空间进行的。
- 确保鼠标的舌头不妨碍。
请注意:戳舌头很容易, 会导致舌头肿瘤。如有必要, 将舌头移到另一侧。 - 在口腔内保持注射器与口腔区域平行。
- 准备注射时, 将注射器拉回来, 然后以10°的角度慢慢插入注射器。
- 在5秒的时间内注入100微米的细胞层膜基质悬浮液。
- 将注射器保持在适当的位置, 再增加 5秒, 以确保所有材料都被注射。
请注意:对于控制非肿瘤小鼠, 注射一种无血清介质和基质 (如上文所述) 的混合物, 而不含肿瘤细胞。 - 轻轻地拔出注射器。
- 继续对剩余的小鼠进行上述操作。
- 允许 1周, 直到肿瘤开始严重出现 (B4B8 和 LY2 细胞为 50–200 mm 3).
3. 鼠标监控
- 在肿瘤细胞注射后1周内使用卡钳进行第一次测量。为了使用外卡钳计算肿瘤体积, 确定最大的纵向直径 (长度) 和最大的横向直径 (宽度), 并使用修改后的椭球公式14,15。
- 继续定期对肿瘤体积进行卡钳测量 (每周定期 1x–2x)。
- 测量动物体重, 以评估肿瘤生长对喂养的影响。
4. 收获肿瘤
- 当达到实验终点时, 使用适当的措施 (例如, CO2 窒息、斩首或宫颈脱位) 对动物进行安乐死。
请注意:在这项研究中, 达到终点, 如果老鼠变得垂死 (体重减少了 gt;15 的第一, 的初始体重, 缺乏仪容整洁, 抗性) 和/或如果肿瘤大小达到1000毫米3。 -
开始解剖动物通过颈部区域的中线创建一个长切口。
- 使用钝器抓皮和锋利的剪刀来切割皮肤。
- 将剪刀轻轻插入覆盖肿瘤的皮肤下, 通过将剪刀推到皮肤上, 形成气囊。
- 一旦皮肤与肿瘤充分分离, 识别排水的淋巴结 (Dln), 并将其切除, 以避免肿瘤组织被淋巴结的存在混淆。
请注意:大肿瘤可能到达和/或覆盖 DLN。根据所进行的检测类型, 分离完整的淋巴结是必不可少的, 以避免免疫细胞溢出到肿瘤, 这将导致扭曲的检测结果。 - 穿过肿瘤的边界, 直到整个体积被分离。
5. 下游肿瘤处理
- 在下游组织学检查中, 在室温下将肿瘤放入10% 福尔拉林中。为避免过度固定, 请用70% 乙醇取代福尔拉林。对于流式细胞仪分析, 处理肿瘤, 如下所述。
请注意:组织可以在福尔拉林保存 72小时, 然后过度固定可能会成为某些类型的染色的问题。 - 使用无菌剃须刀片或锋利的剪刀将肿瘤切割成1-2 毫米大小的肿瘤。
- 将切割的肿瘤块放入一个50毫升的锥形管, 有胶原酶 III (每个样品 4, 250 单位)、DNase I (每个样品0.1 毫克) 和胰蛋白酶抑制剂 (每个样品1毫克)。
- 在37°c 下孵化 30分钟, 每10分钟晃动一次。
请注意:样品可以放在可再密封的袋子里, 用90% 的乙醇消毒, 放在细胞培养孵化器中。 - 30分钟后, 加入汉克平衡盐溶液 (HBSS) 20 毫升, 在 300 x克旋转5分钟。
请注意:HBSS 由氯化钾、氯化钠、碳酸氢钠、磷酸钠、磷酸钠和葡萄糖组成。 - 丢弃上清液, 在红血球 (RBC) 裂解缓冲液2-3 毫升中重新悬浮颗粒。严格的移液器。
请注意:红细胞裂解缓冲液由氯化铵、碳酸氢钠和二钠组成。 - 在室温下孵化2分钟。
请注意:较长的孵育可能对其他细胞群有毒。 - 加入20毫升的 HBSS, 中和裂解缓冲液的作用。
- 以 300 x g 离心 5分钟 , 并丢弃上清液。
- 在 HBSS 10 毫升中对颗粒进行再利用。
- 通过70μm 尼龙约束器和离心机以 300 x g的速度通过溶液 5分钟, 丢弃上清液。
- 重复步骤 5.8-5.10, 并通过40μm 尼龙约束器将细胞悬浮液通过, 以确保从悬浮液中取出任何额外的碎片。
6. 细胞染色和数据采集
- 在 HBSS 1 毫升中对细胞颗粒进行再利用。
- 使用血细胞计或自动细胞计数器对细胞进行计数, 如步骤1.7 中所述
-
确定染色的总细胞数量和适当浓度。
注:流式细胞术染色的理想细胞浓度为1-200万个细胞。例如, 如果在96孔板上进行染色, 并且有1000万个细胞, 则将样品重新悬挂在 1 mL 中, 板100Μl 为每口100万个细胞。 -
在浓度为1:100 的情况下添加 Fc 阻滞 (CC16/CD32), 以防止免疫球蛋白与 FcγIII 和 FcγII 受体的非抗原特异性结合。在室温下孵化5分钟。
- 在100μl 流式细胞仪染色缓冲液中离心并重新悬浮细胞颗粒 (由含有 5% FBS、2% EDTA 和 1% HEPES 的盐水组成)。
-
根据供应商提供的说明进行细胞表面染色 (在适当稀释时添加每个抗体)。在室温下孵化60分钟。
- 在100μl 的 HBSS 中离心并重新悬浮细胞颗粒。重复 2倍, 以摆脱多余的抗体。
-
在适当的流式细胞仪上运行样品。
- 如果分析细胞内标记物 (如 foxp3), 请按照供应商的说明进行细胞渗透性和染色。
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Representative Results
对 LY2 和 B4B8 细胞增殖的体外评估表明, 这两个细胞系的翻倍时间相似 (分别为21小时和 23小时)。在体内, 两个细胞系在接种后1周内形成一个单一的、可见的和明显的质量 (图 1a)。在患有 LY2 肿瘤的小鼠中, 由于肿瘤负担, 下颌被移位 3周 (图 1a)。控制没有接受肿瘤细胞的老鼠没有像预期的那样发展肿瘤。与 B4B8 肿瘤相比, LY2 肿瘤的增长速度更高。LY2 荷瘤小鼠第21天的平均肿瘤体积为 632±10 mm3 , 而 B4B8 肿瘤的平均肿瘤体积为162±4 Mm 3 (图 1 b)。由于吞咽困难, 下巴移位的小鼠体重迅速下降 (图 1c)。显示出显著体重下降的小鼠被定义为 gt;15 的初始体重和/或肿瘤体积为 & gt;1 厘米3在上述观察后1天内被安乐死。LY2 小鼠的中位生存期为 22.5天, 而 B4B8 荷瘤小鼠的平均生存期为 52.0天 (图 1d)。
荷瘤小鼠的磁共振成像 (MRI) 显示出良好的定界肿瘤延伸到口腔黏膜的内层 (图 2a)。肿瘤没有侵入舌头或附近的其他器官 (食道, 支气管, 胸腺), 如组织学评估所示。MR 图像上的信号异质性代表了血管化的超强区域 (用 V 表示) 和坏死性低尖区域 (用 N 表示) 的存在 (图 2a)。总病理检查显示 dln 扩大 (图 2B)。我们进一步评估肿瘤体积与计算机断层扫描 (CT), 以确定的可靠性的卡钳测量。利用医学中的数字成像和通信 (DICOM) 图像分析软件16对肿瘤进行了描述。用卡钳和 CT 成像对 LY2 肿瘤体积进行评估, 表明两种方法之间存在着良好的相关性 (r2 = 0.8493;图 2C)。这表明肿瘤生长主要是外生和卡尺测量是评估肿瘤生长的可靠方法。组织学检查显示, 所有 LY2 荷瘤小鼠发展分化不良的鳞状细胞癌 (图 2d)。9个 YY2 荷瘤小鼠中有9个出现转移到第一和第二梯级淋巴结的转移。结节转移主要是囊下 (九只老鼠中的七只) 和鼻窦内 (九只老鼠中有 5只), 九只小鼠中有两只表现出囊内侵袭。相反, 患有 B4B8 肿瘤的小鼠患上了中等分化的鳞状细胞癌 (图 2e), 并没有转移到区域或远处, 包括 dln。刻度: 0 = 无可见坏死, 1 = 少, 2 = 中度, 3 = 重17。所有 LY2 荷瘤小鼠均有组织学确认的坏死, 多数 (十有七位) 表现出中度至重度坏死 (图 2f)。在 B4B8 肿瘤中没有发现坏死的证据。
我们重点研究了 Y2 肿瘤模型, 以进一步表征肿瘤免疫微环境。肿瘤在肿瘤接种后3周内收获, 并使用胶原酶 III 进行消化, 然后对细胞表面和细胞内的流/质量细胞学标记进行染色 (图 3 a)。在科罗拉多大学丹佛流式细胞仪共享资源中, 使用大规模细胞仪对样本进行了处理。使用流式细胞术商业软件进行了作单和数据分析。所获得的数据显示, 不同程度上存在许多免疫细胞群。总免疫细胞 (CD45+) 占肿瘤总数的 7.3% (图 3b)。在绝对数字中, 我们平均观察到每毫克肿瘤组织 26个 CD45+细胞 (sd = 0.81) (图 3b)。骨髓细胞 (CD11b+) 占所有 cd45+细胞的 37.8% (图 37.8)。骨髓细胞主要由巨噬细胞组成 (F4/80+, 63.0%), 其次是骨髓源性抑制细胞 (Mdsc) (Gr1 +, 8.51)和中性粒细胞 (Ly6g +, 5.87)。在 cd4+ t 细胞的 cd45 + 细胞中, t 细胞总数占 15.9%, 其中53.4% 为调节 t 细胞 (tregs) (cd4 + ffsp3 +) (图 3d).自然杀伤细胞 (NK) 占所有 CD45+细胞的1.75。这些数据突出表明, 在 LY2 原位 HNSCC 肿瘤中存在各种免疫浸润, 这可能在介导肿瘤进展和免疫逃避方面发挥作用。
图 1: 监测患有原位 hnscc 肿瘤的小鼠.(A) 荷瘤小鼠的代表性图像。接种口腔的口腔在接种后1周内发展出肿瘤。3周时, 观察到下颌移位。(B) 由卡尺测量确定的 b4b8 和 LY2 荷瘤小鼠的肿瘤生长率。(C) 患有 b4b8 或 LY2 肿瘤的小鼠体重的变化。(D) b4b8 和 LY2 荷瘤小鼠的存活。条形图表示每组7–10个小鼠的平均 (SEM) 的标准误差。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 小鼠 hnscc 肿瘤的影像学和组织学特征.(A) LY2 含肿瘤鼠标的代表性核像 mr 图像。解剖站点被标记。信号超强区域代表血管化区域 (表示 V)。信号低密度的区域表示坏死区域 (表示 n)。(B) 解剖肿瘤区域的代表总图像。白色箭头指向扩大的排水淋巴结 (Dln)。(C) 经卡尺测量评估的肿瘤体积与基于计算机断层扫描 (ct) 的评估的相关性。显示了坡度、相关系数 (r2) 和最佳拟合线。(D) ly2 肿瘤的代表性血红素和 Eosin (h & e) 图像。(E) B4B8 肿瘤的 h & e 代表图像。(F) 基于 h & e 四级评分系统, 对 LY2 肿瘤坏死进行定量。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 利用飞行时间 (cytometry) 进行细胞学检查, 分析基线肺内免疫种群.肿瘤被加工成单细胞悬浮液使用胶原蛋白为基础的酶消化, 然后用细胞表面和细胞内标记物染色。(A) 使用 cytometry 平台进行质量细胞学检查。(B) 对总免疫细胞 (cd45+) 进行绝对和相对定量评估。(C) 骨髓免疫亚群的定量。(D) 淋巴免疫亚群的量化。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
对肿瘤微环境进行严格的分析和表征, 是了解肿瘤发展、进展和转移机制以及开发有效治疗方法的重要策略。头颈部癌症是一种复杂的疾病, 可源于头部和颈部区域内的多个解剖部位。了解疾病机制和改进治疗的一个主要障碍是缺乏类似于人类 Hnscc 的侵袭性和转移性的小鼠细胞系。此外, 许多小鼠模型采用皮下植入肿瘤, 缺乏重要的生理特征的头部和颈部区域, 包括高血管密度, 广泛的淋巴血管, 和常驻粘膜菌群。
在本研究中, 我们描绘了小鼠 HNSCC 的正学模型。我们选择口腔黏膜作为肿瘤接种部位的原因有很多, 包括无需图像引导就能方便地进入该区域, 使用卡钳评估肿瘤生长的能力, 在黏膜菌群中存在肿瘤,周围淋巴管的存在, 以及易于重现性。虽然将细胞注射到口腔黏膜很简单, 但针头的定位和穿透深度对于防止皮肤穿刺和确保细胞不会皮下注射至关重要。我们建议插入针内的口腔, 而它是完全平行的口腔区域和倾斜的角度不超过10°时准备注射。
我们使用的细胞系是小鼠细胞系, 允许它们植入免疫能力的小鼠, 他们来自的菌株。有超过 39个 HNSCC 人类细胞系已经在文献中进行了研究, 但不能在本地微环境存在的情况下使用18。最近的发展使得设计人性化的小鼠模型成为可能, 这些模型将人类骨髓产生的嵌合体整合在 NOD 型科学伽玛小鼠 (也称为 NSG 小鼠) 中, 从而使人类免疫系统的发展成为可能与人类肿瘤相互作用的生物模型。19型小鼠免疫缺陷。然而, 这类模型是昂贵的, 需要费力的育种方法, 并没有重述肿瘤微环境的所有组成部分, 包括内皮细胞, 成纤维细胞, 和淋巴管。我们在本研究中使用的小鼠模型概述了人类 Hnscc 的关键成分, 包括各种免疫浸润的存在。为了确保最大限度地从肿瘤中提取活的单个细胞, 必须使用消化酶。基于胶原蛋白的消化酶可能对细胞很苛刻, 对不同类型的肿瘤可能需要优化胶原酶的浓度和类型。在确定本研究中使用的胶原酶 III 是鳞状细胞肿瘤消化的最佳方法之前, 我们比较了五种消化酶。
本研究中使用的肿瘤模型对研究 HNSCC 免疫逃避机制和各种疗法的临床前评估特别有用。我们之前证明, B4B8 和 LY2 肿瘤都是辐射耐药和难治性的免疫检查点抑制剂抗 Pd-l120。这与大多数人类的 Hnscc 是一致的。最近的临床试验表明, 只有不到15% 的 hnscc 患者对 21、22、23、24、25的抗pd-ind-l1 治疗有反应。此外, 众所周知, hnscc 是放射性核素中心的 26、27。针对 HNSCC 中负责放射不应性的靶向途径是提高治疗反应能力的重要步骤。具有里程碑意义的 Bonner 等人的研究表明, 与仅在当地先进的 HNSCC 28岁的 rt 相比, 在 rt 中添加西妥昔单抗对整体生存率有显著好处。最近的数据表明, 抑制 epb4-efrin-b2 信号在原位 hnscc 可以进一步提高反应 rt 或环氧辛巴-rt 通过促进肿瘤凋亡和抑制肿瘤增殖 29,30。此外, 将 RT 与合理的免疫疗法结合, 可以增强抗肿瘤免疫反应, 增强局部肿瘤控制和远处转移的控制31。我们最近已经证明, 针对 Tregs 结合免疫检查点封锁和 RT 的结果在肿瘤根除和免疫记忆32.今后采用 HNSCC 的原位模型进行的研究将更好地为临床试验的设计提供信息, 并提高对肿瘤免疫逃避机制和治疗耐药的认识。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
没有
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase III | Worthington Biochemical Corp. | LS004183 | |
| DNase I | Worthington Biochemical Corp. | LS006328 | |
| Fc Block (CD16/32) | BD Biosciences | 553141 | Clone 2.4G2 |
| Flow Cytometry Staining Buffer | eBioscience | 00-4222-26 | |
| HBSS | ThermoFisher Scientific | 14175079 | no calcium, no magnesium, no pheno red |
| Helois mass cytometer | Fluidigm | NA | |
| Matrigel membrane matrix | Corning | CB-40234B | |
| MRI Scanner | Bruker | NA | 7.4 Tesla |
| RBC lysis buffer | BioLegend | 420301 | |
| Trypsin inhibitor | Worthington Biochemical Corp. | LS002830 |
References
- Chaturvedi, A. K., et al. Worldwide trends in incidence rates for oral cavity and oropharyngeal cancers. Journal of Clinical Oncology. 31 (36), 4550-4559 (2013).
- Ang, K. K., Sturgis, E. M. Human papillomavirus as a marker of the natural history and response to therapy of head and neck squamous cell carcinoma. Seminars in Radiation Oncology. 22 (2), 128-142 (2012).
- Amin, M. B., et al. The Eighth Edition AJCC Cancer Staging Manual: Continuing to build a bridge from a population-based to a more "personalized" approach to cancer staging. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 67 (2), 93-99 (2017).
- Salley, J. J. Experimental carcinogenesis in the cheek pouch of the Syrian hamster. Journal of Dental Research. 33 (2), 253-262 (1954).
- Morris, A. L. Factors influencing experimental carcinogensis in the hamster cheek pouch. Journal of Dental Research. 40, 3-15 (1961).
- MacDonald, D. G. Comparison of epithelial dysplasia in hamster cheek pouch carcinogenesis and human oral mucosa. Journal of Oral Pathology & Medicine. 10 (3), 186-191 (1981).
- Hawkins, B. L., et al. 4NQO carcinogenesis: a mouse model of oral cavity squamous cell carcinoma. Head & Neck. 16 (5), 424-432 (1994).
- Tang, X. H., Knudsen, B., Bemis, D., Tickoo, S., Gudas, L. J. Oral cavity and esophageal carcinogenesis modeled in carcinogen-treated mice. Clinical Cancer Research. 10 (1 Pt 1), 301-313 (2004).
- Vered, M., Yarom, N., Dayan, D. 4NQO oral carcinogenesis: animal models, molecular markers and future expectations. Oral Oncology. 41 (4), 337-339 (2005).
- Bornstein, S., et al. Smad4 loss in mice causes spontaneous head and neck cancer with increased genomic instability and inflammation. Journal of Clinical Investigation. 119 (11), 3408-3419 (2009).
- Thomas, G. R., Chen, Z., Oechsli, M. N., Hendler, F. J., Van Waes, C. Decreased expression of CD80 is a marker for increased tumorigenicity in a new murine model of oral squamous-cell carcinoma. International Journal of Cancer. 82 (3), 377-384 (1999).
- Yuspa, S. H., Hawley-Nelson, P., Koehler, B., Stanley, J. R. A survey of transformation markers in differentiating epidermal cell lines in culture. Cancer Research. 40 (12), 4694-4703 (1980).
- Chen, Z., Smith, C. W., Kiel, D., Van Waes, C. Metastatic variants derived following in vivo tumor progression of an in vitro transformed squamous cell carcinoma line acquire a differential growth advantage requiring tumor-host interaction. Clinical & Experimental Metastasis. 15 (5), 527-537 (1997).
- Euhus, D. M., Hudd, C., LaRegina, M. C., Johnson, F. E.
- Tomayko, M. M., Reynolds, C. P. Determination of subcutaneous tumor size in athymic (nude) mice. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 24 (3), 148-154 (1989).
- Yushkevich, P. A., et al. User-guided 3D active contour segmentation of anatomical structures: significantly improved efficiency and reliability. NeuroImage. 31 (3), 1116-1128 (2006).
- Dutta, S., et al. The relationship between tumour necrosis, tumour proliferation, local and systemic inflammation, microvessel density and survival in patients undergoing potentially curative resection of oesophageal adenocarcinoma. Britisch Journal of Cancer. 106 (4), 702-710 (2012).
- Li, H., et al. Genomic analysis of head and neck squamous cell carcinoma cell lines and human tumors: a rational approach to preclinical model selection. Molecular Cancer Research. 12 (4), 571-582 (2014).
- Walsh, N. C., et al. Humanized Mouse Models of Clinical Disease. Annual Review of Pathology. 12, 187-215 (2017).
- Oweida, A., et al. Ionizing radiation sensitizes tumors to PD-L1 immune checkpoint blockade in orthotopic murine head and neck squamous cell carcinoma. OncoImmunology. 6 (10), e1356153 (2017).
- Ferris, R., et al. Further evaluations of nivolumab (nivo) versus investigator’s choice (IC) chemotherapy for recurrent or metastatic (R/M) squamous cell carcinoma of the head and neck (SCCHN): CheckMate 141. Journal of Clinical Oncology. 34, (2016).
- Ferris, R. L., et al. Nivolumab for Recurrent Squamous-Cell Carcinoma of the Head and Neck. The New England Journal of Medicine. 375 (19), 1856-1867 (2016).
- Harrington, K. J., et al. Nivolumab versus standard, single-agent therapy of investigator's choice in recurrent or metastatic squamous cell carcinoma of the head and neck (CheckMate 141): health-related quality-of-life results from a randomised, phase 3 trial. The Lancet Oncology. 18 (8), 1104-1115 (2017).
- Kiyota, N., et al. A randomized, open-label, Phase III clinical trial of nivolumab vs. therapy of investigator's choice in recurrent squamous cell carcinoma of the head and neck: A subanalysis of Asian patients versus the global population in checkmate 141. Oral Oncology. 73, 138-146 (2017).
- Ling, D. C., Bakkenist, C. J., Ferris, R. L., Clump, D. A. Role of Immunotherapy in Head and Neck Cancer. Seminars in Radiation Oncology. 28 (1), 12-16 (2018).
- Perri, F., et al. Radioresistance in head and neck squamous cell carcinoma: Biological bases and therapeutic implications. Head & Neck. 37 (5), 763-770 (2015).
- Yamamoto, V. N., Thylur, D. S., Bauschard, M., Schmale, I., Sinha, U. K. Overcoming radioresistance in head and neck squamous cell carcinoma. Oral Oncology. 63, 44-51 (2016).
- Bonner, J. A., et al. Radiotherapy plus cetuximab for locoregionally advanced head and neck cancer: 5-year survival data from a phase 3 randomised trial, and relation between cetuximab-induced rash and survival. The Lancet Oncology. 11 (1), 21-28 (2010).
- Bhatia, S., et al. Inhibition of EphB4-Ephrin-B2 Signaling Enhances Response to Cetuximab-Radiation Therapy in Head and Neck Cancers. Clinical Cancer Research. 24 (18), 4539-4550 (2018).
- Bhatia, S., et al. Enhancing radiosensitization in EphB4 receptor-expressing Head and Neck Squamous Cell Carcinomas. Scientific Reports. 6, 38792 (2016).
- Tang, C., et al. Combining radiation and immunotherapy: a new systemic therapy for solid tumors? Cancer Immunology Research. 2 (9), 831-838 (2014).
- Oweida, A., et al. Resistance to radiotherapy and PD-L1 blockade is mediated by TIM-3 upregulation and regulatory T-cell infiltration. Clinical Cancer Research. , (2018).
