Summary
כאן אנו מציגים שיטה ישימה לפיתוח מודל מאתר orthotopic של הראש והצוואר קרצינומה של תאים קשקשיים. גידולים מדגימים הרלוונטית קלינית תכונות histopathological של המחלה, לרבות נמק, בידול המסכן, גרורות קטרי הסתננות המערכת החיסונית. עכברים נושאות לפתח תסמינים הרלוונטית קלינית כולל בבליעה, הלסת הזחה של ירידה במשקל.
Abstract
הראש והצוואר קרצינומה של תאים קשקשיים (HNSCC) היא מחלה מתישה וקטלנית עם שכיחות גבוהה של מופע חוזר, כישלון הטיפול. לפתח אסטרטגיות טיפוליות כדאי, חשוב הבנה הגידול microenvironmental גורמים שתורמים עמידות לטיפול. מכשול מרכזי להבנת מנגנוני מחלות, שיפור טיפול כבר מחסור של שורות תאים מאתר הדומות הטבע אגרסיבי ולא גרורתי של האדם HNSCCs. יתר על כן, רוב דגמי מאתר מעסיקים השתלות תת עורית של גידולים שחסרה חשוב תכונות פיזיולוגיות של אזור הראש והצוואר, לרבות צפיפות כלי דם, להערכת הלימפה נרחב תושב פלורה הרירית. מטרת מחקר זה היא לפתח, לאפיין את מודל orthotopic של HNSCC. אנו מעסיקים שני קווים ברורים גנטית תא מאתר וגידולים הוקמה רירית buccal של עכברים. אנו לייעל שיטות גידול מבוססי collagenase עיכול להתאוששות האופטימלית של תאים בודדים גידולים הוקמה. הנתונים המוצגים כאן מראים כי עכברים לפתח גידולים מאוד vascularized גרורות לבלוטות הלימפה האזוריות. ניתוח cytometry המוני multiparametric תא בודד מראה הנוכחות של אוכלוסיות מגוונות מחוסן עם התאים מיאלואידית המייצג את הרוב של תאים חיסוניים כל. המודל המוצע במחקר זה יש יישומים וביולוגיה של סרטן, הגידול אימונולוגיה ו פיתוח טרום-קליניים של הריפוי. הדמיון של המודל orthotopic על המאפיינים הקליניים של מחלות אנושיות תספק כלי תרגום משופרת, שיפור תוצאות המטופל.
Introduction
HNSCC ממאירות החמישי הנפוצים ברחבי העולם, עם-600,000 חולים מאובחנים מדי שנה1. למרות טיפול אגרסיבי מעורבים כימותרפיה והקרנות (RT), שיעור ההישרדות (OS) הכולל לחולים HNSCC ללא זיהום וירוס הפפילומה האנושי (HPV) נשאר מתחת ל 50% לאחר 5 שנים2. זו במידה רבה מיוחסת microenvironment הגידול מורכב כמו גידולים יכול לנבוע במספר אתרים אנטומי ברורים בתוך אזור הראש והצוואר, לרבות buccal רירית, הלשון, הרצפה של הפה, חלל האף, חלל הפה, הלוע, oropharynx, hypopharynx. בנוסף, באזור הראש והצוואר מאוד vascularized והוא מכיל כמעט מחצית כל בלוטות הלימפה הגוף3. רוב של מחקרים חוקרת ביולוגיה סרטן הראש והצוואר להסתמך על מודלים הגידול באזור האגף. מודל שכזה יכול להציע תובנה מנגנונים פנימיים-הגידול, אך חוסר microenvironment מקורית הראש והצוואר יכול להשפיע באופן משמעותי את הפוטנציאל translational של ממצאים כאלה. אחת השיטות שבה נעשה שימוש כדי לעודד גידולים אוראלי היא באמצעות חשיפה מסרטן 9,10-דימתיל-1, 2-benzanthracene (DMBA)4. עם זאת, שיטה זו מזוהה עם תהליך ארוך, גורם גידולים חולדות, אוגרים, אבל לא אצל עכברים, גידולים וכתוצאה מכך לא ניחנת רבות מהתכונות היסטולוגית של SCCs הבדיל5,6. המבוא של carcinogen4-nitroquinoline 1-אוקסיד (4-NQO), נגזרת quinolone מסיסים במים, גרמו גידולים אוראלי העכבר בעת החלת דרך הפה אבל גם סבלה הרבה פעמים חשיפה (16 שבועות) ומוגבל לקחת שיעור בתוך ובין אצוות של עכברים7,8,9. כדי לפתח מודלים הרלוונטית קלינית, מספר קבוצות מנוצל מודלים מהונדס גנטית מעורבים המניפולציה של נהג oncogenes או גנים משתיק קול של גידול, כולל TP53, TGFB, קראס, HRAS ו SMAD410. מודלים אלה יכולים להציע תובנה גידולים עם הגנים הנהג ידועה אך לא מסכם את הדברים של הטרוגניות מורכבים של האדם HNSCCs.
בעבודה זאת, נדגים את הכדאיות של ביצוע חיסון intramucosal של קרצינומה של תאים קשקשיים התאים בעכברים. תאים חוסנו להתפתח גידולים אגרסיביים בתוך שבוע אחד של הזרקת. בדומה HNSCCs האנושי, הגידולים גרורות לבלוטות הלימפה האזוריות. לאפיין תכונות היסטולוגית וקלינית של המחלה ואנו מספקים תובנה microenvironment המערכת החיסונית הגידול. אנו מציעים כי מודל זה orthotopic של HNSCC יש יישומים וביולוגיה של סרטן, הגידול אימונולוגיה, ולימודים פרה. מנגנונים של התחמקות המערכת החיסונית, התקדמות הגידול, טיפול ההתנגדות גרורות מייצגים תחומי משמעות קלינית שיכול הליות ממוען באמצעות המודל המוצע.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו בהתאם שאושרו מוסדיים בעלי חיים טיפול ושימוש הוועדה (IACUC) פרוטוקול דנבר אוניברסיטת קולורדו (פרוטוקול # 00250).
1. גידול תרבית תאים
הערה: שורות תאים B4B8 ו- LY2 שימשו ליצירת גידולים HNSCC orthotopic: תאים סרטניים B4B8 נגזר הפך גורם מסרטן keratinocytes הרירית (מתוך עכברים BALB/C)11. תאים סרטניים LY2 נגזר גרורות הצומת לימפה באופן ספונטני טרנספורמציה BALB/C תקין קו (פאם 212)12,13. שני הקווים תא נמסרו באדיבות על ידי ד ר Nadarajah Vigneswaran (UTHealth, יוסטון, TX, ארצות הברית).
- השתמש F/12 (DMEM) בינוני הנשר של Dulbecco ששונה בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS) ו- 1% ריאגנט מיקרוביאלית לתחזוקת קו תא. לשמור על השורות האלה תא חממה סטרילי-CO 37 ° C ו-5%2. תאים אמור לשמש עבור חיסון לפני העולה על 15 קטעים.
- לוחית רישוי 2 x 106 4 x 10 תאים6 ב-175 ס מ2 תא תרבות מבחנות.
הערה: ודא שהתאים פחות מ- 90% confluent כדי למנוע גרימת תגובת הלחץ. - כאשר התאים הם 70% confluent (~ 48 h), הסר את הבקבוקון של החממה ולשטוף את התאים 3 x עם קרות באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS).
- ניתוק תאים מן הבקבוק באמצעות 0.25% טריפסין, מספיק כדי לכסות את המשטח של הצלחת.
- כדי לעשות זאת, לוותר על 4 מ של טריפסין בבקבוקון2 -175 ס מ המכיל 70% תאים confluent. דגירה התאים עם טריפסין למשך 3-4 דקות בחממה התרבות התא-CO 37 ° C ו-5%2.
- דמיינו את התאים במיקרוסקופ כדי להבטיח ניתוק התא.
- להוסיף 12 מ של המדיה DMEM F/12 המכילה FBS לנטרל טריפסין פעילות.
- האחות התליה תא ולמקם אותו לתוך צינור חרוטי 50 מ.
- לנער את שפופרת המכילה התאים על-ידי היפוך זה 3 x-4 x.
- באופן אופציונלי, לערבב aliquot 10 µL של השעיה תא עם 10 µL של Trypan blue צינור microcentrifuge, לספור את התאים באמצעות hemocytometer. קבע הכדאיות תא על-ידי הפחתת מספר תאים Trypan blue-חיובי מן המספר הכולל של תאים, מתחלק המספר הכולל של תאים.
- Centrifuge התליה תא ב x 300 גרם במשך 5 דקות ב 4 º C.
- Resuspend התאים DMEM ללא סרום, תרופתיים בווליום המתאים כך עונה 1 פרק 106 תאים נמצאים ב- µL 50 של מדיה.
הערה: בהתבסס על התוקפנות קו תא ויוו (שנקבע מדעית), עונה 1 פרק 106 תאים לכל אתר הזרקת לכל העכבר הוערך המתאים עבור תאים B4B8 ו- LY2. - מניחים את הצנצנת המכילה התליה תא על קרח.
- במקום המטריקס קרום המרתף המופשרים מראש על קרח.
הערה: המטריקס קרום המרתף היה הקרת בן לילה ב 4 º C.
2. התא הזרקה לתוך עכברים
- להכין תערובת של 1:1 של מטריקס קרום תאים: המרתף (50 µL כל אחד).
- להוסיף את התאים תחילה; ואז, בהדרגה pipette המטריקס קרום המרתף. הימנע היכרות עם בועות אוויר. ודא כי התערובת מורכב מיד לפני הזריקה בעלי חיים. הוספת תאים קרום המרתף מטריקס לתקופה ממושכת של זמן יכולה לגרום תא מתמקמת היטב את התערובת מטריקס, מה שהופך את התערובת קשה לנער בקפדנות. זה יגרום השתנות משמעותית בגודל הגידול בין עכברים.
- מערבבים בעדינות. ודא כל השלבים הכרוכים מטריקס מבוצעות על קרח. מטריקס קרום המרתף פולימריזציה בטמפרטורת החדר.
- היכונו מזרקים חיסון.
- לטעון מזרקים אינסולין 0.5 mL (23 גרם) עם µL 100 של הפתרון מטריצה של קרום התא/מרתף.
- לשמור את? המזרקים על קרח כדי למנוע קרום המרתף מטריקס הפילמור.
- עזים ומתנגד עכברים על-ידי הצבתם בחדר עם איזופלוריין וחמצן (2.5%).
- ודא שהעכברים הם מרדימים עמוק לפני ביצוע ההזרקה (על-ידי הבטחת חוסר התגובה קמצוץ הבוהן).
- הכנס את המחט לתוך האזור buccal ימינה או שמאלה. זה מתבצע באמצעות המרחב הפתוח זמינה משני צידי הפה.
- ודא כי הלשון של העכבר אינה הדרך.
הערה: קל לתקוע את הלשון, אשר תגרום בגידולים הלשון. להעביר את הלשון לצד הנגדי במידת הצורך. - שמור את המזרק במקביל האזור buccal בזמן בתוך חלל הפה.
- מוכנים להזריק, למשוך בחזרה את המזרק ולהוסיף לאט לאט את המזרק בזווית של 10°.
- מזריקים µL 100 של קרום התא/מרתף מטריקס התליה על פני תקופה של 5 s.
- להחזיק את המזרק במקום 5 נוספים s כדי להבטיח כל החומר מוזרק.
הערה: עבור פקד nontumor מניבי עכברים, להזריק תערובת של מטריקס ומדיה ללא סרום (כמתואר לעיל) ללא תאים סרטניים. - למשוך בעדינות את המזרק.
- להמשיך את ההליך הנ עם העכברים הנותרים.
- לאפשר במשך שבוע עד גידולים להתחיל להופיע בגסות (50 – 200 מ מ3 עבור תאים B4B8 ו- LY2).
3. פיקוח על העכבר
- לבצע את המדידה הראשונה באמצעות מחוגה ב 1 שבוע לאחר הזריקה תאים סרטניים. על מנת לחשב את נפח הגידול באמצעות מחוגה חיצוני, לקבוע את הקוטר האורך הגדול (אורך) ואת הקוטר רוחבי הגדול ביותר (רוחב) ולהשתמש ששונה אליפסואידי נוסחה14,ה-15.
- המשך לבצע מדידות קליבר רגיל עבור נפח הגידול (1 x-2 x לשבוע במרווחי זמן קבועים).
- מודדים משקל בעלי חיים כדי להעריך את ההשפעות של הגידול על האכלה.
4. קצירת גידולים
- כאשר נקודת הקצה ניסיוני, המתת חסד החיות באמצעות האמצעים המתאימים (למשל, CO2 חנק, עריפת ראש או צוואר הרחם פריקה).
הערה: במחקר זה, נקודת הקצה הגיעה אם העכברים הפך אדעך (עם איבוד משקל > 15% ממשקל הראשונית, חוסר הטיפוח, cachexia) ו/או אם גודל הגידול הגיעו 1,000 מ מ3. -
מתחילים לנתח את החיה על-ידי יצירת חתך ארוך דרך האמצע באזור הצוואר.
- להשתמש מלקחיים בוטה כדי לתפוס את העור, מספריים לחתוך את העור.
- הכנס מספריים בעדינות מתחת לעור שמכסה את הגידול וליצור כיסי אוויר על ידי דחיפת המספריים לרוחב ולאורך לתוך העור.
- לאחר העור מספיק מנותק מן הגידול, לזהות את ניקוז הלימפה (DLNs), לסלק אותם כדי להימנע מהצורך רקמת הגידול ארור על ידי הנוכחות של בלוטות הלימפה.
הערה: גידולים גדולים עשויים להגיע ו/או לכסות את DLN. בהתאם לסוג assay המבוצעת, הבידוד של בלוטות הלימפה שלם הוא חיוני כדי למנוע דליפה של תאים חיסוניים לתוך הגידול, אשר תגרום הטיית התוצאות וזמינותו. - לחתוך הגבולות של הגידול עד האחסון כולו מנותק.
5. גידול עיבוד עבור יישומים במורד הזרם
- לבדיקה היסטולוגית במורד הזרם, למקם גידולים בפורמלין 10% בטמפרטורת החדר. כדי להימנע overfixation, החלף את פורמלין 70% אתנול. לניתוח cytometry זרימה, תהליך הגידולים כמתואר להלן.
הערה: ניתן לשמור את הרקמה בפורמלין במשך 72 h לפני overfixation יכול להיות בעייתי עבור סוגים מסוימים של כתמים. - חותכים את הגידול 1 – 2 מ מבגודל חתיכות שימוש סטרילי גילוח או מספריים חדות.
- הכנס את הגידול לחתוך החתיכות צינור חרוטי 50 מ עם collagenase השלישי (4,250 יחידות עבור דגימה), DNase (0.1 מ"ג עבור דגימה), מעכבי טריפסין (1 מ ג לכל דגימה).
- דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ברעידות כל 10 דקות.
הערה: ניתן להציב את הדגימות בשקית לסגירה חוזרת, עיקור עם 90% אתנול, וממוקם בתוך חממה תרבות התא. - לאחר 30 דקות, להוסיף 20 מיליליטר של האנק מאוזנת תמיסת מלח (HBSS) ו ספין-x 300 גרם במשך 5 דקות.
הערה: HBSS מורכב של אשלגן כלורי, מלח בישול, סודיום ביקרבונט, סודיום פוספט dibasic, סודיום פוספט monobasic גלוקוז. - למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב- 2-3 מ"ל של מאגר פירוק תאי הדם האדומים (RBC). פיפטה בקפדנות.
הערה: RBC פירוק מאגר מורכבת אמוניום כלוריד סודיום ביקרבונט, ניתרן. - תקופת דגירה של 2 דקות בטמפרטורת החדר.
הערה: הדגירה ארוך יכול להיות רעיל אוכלוסיות תאים אחרים. - הוסף 20 מ של HBSS כדי לנטרל את ההשפעה של פירוק מאגר.
- צנטריפוגה ב x 300 גרם במשך 5 דקות וזורקים את תגובת שיקוע.
- Resuspend בגדר ב 10 מ"ל של HBSS.
- להעביר את הפתרון באמצעות restrainer ניילון 70 מיקרומטר וזורקים צנטריפוגה ב x 300 גרם במשך 5 דק את תגובת שיקוע.
- חזור על שלבים 5.8-5.10 ולהעביר התליה תא דרך restrainer ניילון 40 µm כדי להבטיח שכל פסולת נוספים יוסר ההשעיה.
6. תא מכתים, חדרי קירור והקפאה
- Resuspend בגדר תא ב 1 מ"ל של HBSS.
- לספור את התאים באמצעות hemocytometer או מונה הניתן תא אוטומטיות, כפי שמתואר בשלב 1.7
-
לקבוע את מספר הטלפון הנייד הכולל ואת הריכוז המתאים עבור מכתים.
הערה: הריכוז תא אידיאלי עבור צביעת cytometry זרימה הוא 1-2 מיליון תאים. לדוגמה, אם צביעת מתבצע על צלחת 96-ובכן, יש 10 מיליון תאים resuspend הדגימה ב µL 100 מ ל 1 וצלחת עבור 1 מיליון תאים לכל טוב. -
להוסיף Fc בלוק (CD16/CD32) ריכוז של בטחונות כדי למנוע nonantigen הספציפי הכריכה של immunoglobulins לקולטנים FcγIII ו- FcγII. תקופת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- צנטריפוגה, resuspend בגדר תא ב- 100 µL של התא cytometry זרימה מכתים מאגר (המורכבת של תמיסת מלח המכיל 5% FBS EDTA 2%, 1% HEPES).
-
לבצע משטח תאים מכתים בהתאם להוראות שסופקו על-ידי הספק (הוספת כל נוגדן-דילול המתאים). תקופת דגירה של 60 דקות בטמפרטורת החדר.
- צנטריפוגה, resuspend בגדר תא ב- 100 µL של HBSS. חזור על x 2 כדי להיפטר עודף נוגדן.
-
הרץ דגימות cytometer הזרימה המתאימה.
- אם ניתוח סמני תאיים (למשל, foxp3), לבצע תא permeabilization, צביעת בהתאם להוראות של הספק.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ההערכה במבחנה של התפשטות תאים LY2 ו- B4B8 הראו שיש שתי שורות תאים דומים פעמים ההכפלה (21 h ו- 23 h, בהתאמה). In vivo, שתי שורות תאים יצרו מסה יחידה, גלוי, מוחשי בתוך שבוע אחד של חיסון (איור 1 א'). בעכברים הנושאת LY2 גידולים, הלסת היה שנעקרו על ידי 3 שבועות עקב גידול הנטל (איור 1 א'). בקרת עכברים שלא קיבלו תאים סרטניים לא לפתח גידולים כמו הצפויה. גידולים LY2 גדל בקצב גבוה יותר בהשוואה גידולים B4B8. אמצעי האחסון הגידול הממוצע ביום 21 LY2 נושאות עכברים היה 632 ± 10 מ מ3 לעומת 162 4 מ מ ±3 גידולים B4B8 (איור 1B). עכברים מפגין הלסת הזחה במהירות פיתח הרזיה בשל בבליעה (איור 1C). עכברים מפגין משמעותי הרזיה כהגדרתו > 15% מן המשקל ההתחלתי שלהם ו/או בעל נפח הגידול של > 1 ס מ3 היו מורדמים בתוך יום 1 התצפית ציין. חציון ההישרדות בעכברים LY2 היה 22.5 הימים, בהשוואה לימים 52.0 בעכברים נושאות B4B8 (איור 1D).
דימות תהודה מגנטית (MRI) של עכברים נושאות הראה היטב במתחם גידולים גרורות לכיוון השכבה הפנימית של רירית buccal (איור 2 א). גידולים לא לפלוש לתוך הלשון או אחרים איברים סמוכים (ושט, סמפון, התימוס) כפי שמוצג עם הערכה היסטולוגית. האות הטרוגניות בתמונות מר היה נציגם של הנוכחות של אזורים vascularized hyperintense (מסומן עם V) ואזורים hypointense נמק (מסומן ב- N) (איור 2 א). בדיקה פתולוגית גולמי הראה DLNs מוגדלת (איור 2B). אנחנו עוד יותר העריך נפח הגידול עם טומוגרפיה (CT) כדי לקבוע את מהימנות המדידות caliper. גידולים היו מאפשרת שימוש של הדמיה דיגיטלית ותקשורת ב- תוכנת ניתוח התמונה רפואה (DICOM)16. הערכה של LY2 נפח הגידול על ידי מחוגה ו CT הדמיה הראו קורלציה מצוינת של בין שתי השיטות (R2 = 0.8493; איור 2C). אפשרות זו מציינת כי הגידול הוא בעיקר exophytic וכי caliper המדידה היא שיטה אמינה להערכה של הגידול. בבדיקה היסטולוגית הראה כי כל LY2 נושאות עכברים פיתח לקוי הבדיל קרצינומה של תאים קשקשיים (איור דו-ממדי). 9 מתוך 9 LY2 נושאות העכברים פיתחו גרורות לבלוטות הלימפה הדרג הראשון והשני. גרורות קטרי היו בעיקר subcapsular (עם עכברים 7 מתוך 9) ובתוך הסינוסים (עם עכברים 5 מתוך 9), עם עכברים 2 מתוך 9 הממחיש את הפלישה intracapsular. לעומת זאת, עכברים הנושאת גידולים B4B8 מפותח למדי הבדיל קרצינומה של תאים קשקשיים (איור 2E), גרורות לא לאתרים מקומיים או מרוחקים, כולל DLNs. נמק הוערכה בהתבסס על שלוש-ציון שנקבעו קודם קנה מידה: 0 = אין נמק גלוי, 1 = scant, 2 = בינוני ו- 3 = חמור17. כל LY2 נושאות עכברים בהיסטולוגיה אישרו נמק עם הרוב (שבעה מתוך עשרה) הממחיש בינונית עד חמורה נמק (2F איור). אין עדות נמק נצפתה גידולים B4B8.
התמקדנו על הדגם גידול LY2 נוסף פלואורסנציה microenvironment הגידול-החיסון. גידולים נבצרו ב- 3 שבועות לאחר חיסון הגידול, מתעכל באמצעות collagenase III, ואחריו ההכתמה של פני השטח של התא, תאיים סמנים עבור זרימה/מסה cytometry (איור 3 א). דוגמאות עובדו, באמצעות cytometer מסה, ב אוניברסיטת קולורדו בדנוור לזרום Cytometry משותפים משאבים. Gating וניתוח נתונים בוצעו באמצעות תוכנה מסחרית של cytometry זרימה. הנתונים שהתקבלו הראו הנוכחות של אוכלוסיות רבות תא החיסון בדרגות. סה כ תאי המערכת החיסונית (CD45+) ייצגו 7.3% הגידול הכולל (איור 3B). במספרים מוחלטים, הבחנו, בממוצע, 26 CD45+ תאים (SD = 0.81) לכל מיליגרם של רקמת הגידול (איור 3B). התאים מיאלואידית (CD11b+) ייצגו 37.8% של כל CD45+ תאים (איור 3C). התאים מיאלואידית היו המורכב ברובו מקרופאגים (F4 / 80 +, 63.0%), שהופעלו על ידי התאים מיאלואידית נגזר משתיק קול (MDSCs) (Gr1. +, 8.51%) נויטרופילים (Ly6G. +, 5.87%). סה כ תאי T כללה כ- 15.9% של CD45+ תאים עם CD4+ T תאים המרכיבים את רוב תאי T כל (79.4%), אילו 53.4% היו תקינה T תאים (Tregs) (CD4+FoxP3+) (דמות תלת-ממד). תאים הרוצח הטבעיים (NK) מורכבת 1.75% של כל CD45+ תאים. אלה האר נתוני הנוכחות של החיסון שונים מחלחל ב- LY2 orthotopic גידולים HNSCC אשר עשוי לשחק תפקיד תיווכה התקדמות הגידול והתחמקות המערכת החיסונית.
איור 1: ניטור עכברים הנושאת orthotopic גידולים HNSCC. (א) להחליפן בתמונות של עכברים נושאות. חוסנו buccal מפתחת גידול בתוך שבוע אחד של חיסון. ב- 3 שבועות, תזוזה של הלסת הוא ציין. (B) הגידול שיעור הצמיחה בעכברים נושאות B4B8 ו- LY2 כפי שנקבע על ידי מדידות caliper. (ג) שינויים במשקל הגוף של עכברים הנושאת גידולים B4B8 או LY2. עכברים נושאות הישרדות (D) של B4B8 ו- LY2. העמודות מסמנות את שגיאת התקן של הממוצע (SEM) של 7-10 עכברים לכל קבוצה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: תכונות הדמיה היסטולוגיים של מאתר גידולים HNSCC. (א) מר נציג תמונה הילתית של העכבר נושאות LY2. אתרי אנטומיים מסומנות. אזורים של האות hyperintensity מייצגים אזורים vascularized (מסומן V). מחוזות אות hypointensity מייצגים אזורים עם נמק (מציינות N). (B) תמונה דוחה נציג של אזור הגידול המכילות גזור. החצים הלבנים הצבע ניקוז לימפה מוגדלות (DLNs). (ג) המתאם נפח הגידול כפי מוערך על ידי מדידה caliper לעומת טומוגרפיה (CT)-המבוסס על הערכה. מדרון, מקדם המתאם (R2) וקו של מיטבית מוצגים. (ד) נציג hematoxylin ואאוזין (H & E) תמונה של גידול LY2. (E) נציג H & E תמונה של גידול B4B8. כימות (F) של נמק בגידולים LY2, מבוסס ב- H & E ארבע-כיתה שיטת הניקוד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: ניתוח של אוכלוסיות intratumoral בסיסית המערכת החיסונית באמצעות cytometry לפי זמן-של-טיסה (CyTOF). גידולים היו להשעיה תא בודד באמצעות מבוססי collagenase עיכול אנזימטי מעובדים, ואז, מוכתם תא סמני פני השטח, תאיים. (א) מסה cytometry בוצעה באמצעות פלטפורמת CyTOF. (B) מוחלטים ויחסיים הערכה כמותית של תאים חיסוניים הכולל (CD45+). (ג) כימות מיאלואידית-החיסון subpopulations. (ד) כימות של הלימפה subpopulations המערכת החיסונית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הניתוח הקפדני, אפיון microenvironment הגידול מייצגים לאסטרטגיה חשובה ההבנה מנגנוני התפתחות גידולים, התקדמות, גרורות ועבור ההתפתחות של טיפולים יעילים. סרטן הראש והצוואר היא מחלה מורכבת יכולה שמקורן באתרים אנטומי מרובים באזור הראש והצוואר. מכשול מרכזי להבנת מנגנוני מחלות, שיפור טיפול כבר מחסור של שורות תאים העכבר מאתר הדומות הטבע אגרסיבי ולא גרורתי של האדם HNSCCs. יתר על כן, מודלים מאתר רבים מעסיקים של השתלה תת עורית של גידולים אשר חסר תכונות פיזיולוגיות החשובים של אזור הראש והצוואר, לרבות צפיפות כלי דם גבוהה, להערכת הלימפה מקיף ו פלורה הרירית תושב.
במחקר זה, אנחנו מאופיין מודל orthotopic של HNSCC מאתר. בחרנו את רירית buccal כמו האתר של הגידול חיסון עבור מספר סיבות, לרבות גישה נוחה לאזור ללא צורך תמונה הדרכה, היכולת להעריך את הגידול באמצעות מחוגה, הנוכחות של הגידול בתוך הפלורה הרירית, נוכחות של lymphatics שמסביב, להקל על הפארמצבטית. ההזרקה של תאים לתוך רירית buccal אמנם פשוטה, מיקום המחט ואת העומק של חדירה הם קריטיים כדי למנוע חדירה דרך העור ולהבטיח תאים לא מוזרקים subcutaneously. אנו ממליצים החדרת המחט דרך intra-הפה בעוד הוא מקביל לחלוטין האזור buccal הטיית בזווית לא יותר מ 10 ° כאשר מוכנים להזריק.
הקווים תא השתמשנו היו שורות תאים מאתר ומאפשר ההשרשה שלהם בעכברים immunocompetent של המתח שהם נגזרו. ישנם מעל 39 שורות תאים אנושיים HNSCC נחקרו בספרות, אך אינו יכול לשמש בנוכחות יליד microenvironment18. ההתפתחויות האחרונות איפשרה את העיצוב של העכבר humanized דגמים המשלבים כימרות עצם מח-נגזר אנושי בעכברים scid הנהון גמא (הידוע גם בשם NSG עכברים), המאפשר הפיתוח של מערכת החיסון האנושית, יכול לקיים אינטראקציה עם גידולים אנושיים דגם העכבר immunodeficient19. עם זאת, מודלים כאלה יקרים, דורשים שיטות רבייה מפרך, לא לסכם את כל הרכיבים של microenvironment הגידול, לרבות תאי אנדותל, fibroblasts lymphatics. הדגמים העכבר מאתר שאנחנו מועסקים במחקר זה מסכם את הדברים רכיבים קריטיים HNSCCs האנושי, כולל הנוכחות של תסנין חיסוניים שונים. כדי להבטיח מקסימום אחזור של תאים בודדים קיימא של גידולים, הכרחי השימוש של אנזימי עיכול. אנזימי עיכול מבוסס-collagenase יכול להיות אכזרי על תאים, אופטימיזציה של הריכוז, סוג של collagenase עשוי להיות נחוץ עבור סוגי גידולים שונים. השווינו אנזימי עיכול חמש לפני שתקבעו את collagenase השלישי, אשר שימש במחקר זה, היא השיטה אופטימלית לעיכול של תאים קשקשיים גידולים.
הדגמים הגידול נעשה שימוש במחקר זה הם שימושיים במיוחד עבור לימוד מנגנוני התחמקות המערכת החיסונית HNSCC והערכה פרה של טיפולים שונים. אנחנו בעבר הראו כי גידולים גם B4B8 וגם LY2 הם radioresistant, חסיני אש, אנטי-PD-L1 מעכב מחסום המערכת החיסונית20. . זה עקבי עם הרוב המכריע של האדם HNSCCs. האחרונות מחקרים קליניים הראו כי פחות מ 15% מהחולים HNSCC מגיבים לטיפול אנטי-PD-1/PD-L121,22,23,24,25. בנוסף, היא מבוססת היטב כי HNSCCs הם26,radioresistant27. מסלולים אחראי על העמידות בפני קרינה ב HNSCC הוא צעד חשוב לשיפור התגובה לטיפול. הציון בונר et al. המחקר הראה יתרון משמעותי בהישרדות הכוללת עם התוספת של ארביטוקס RT בהשוואה ל- RT בבית חולים מקומי מתקדם HNSCC28לבד. נתונים עדכניים מדגימים כי עיכוב של EphB4-Ephrin-B2 איתות ב- orthotopic HNSCCs יכול לשפר עוד יותר את התגובה RT או ארביטוקס-RT על ידי קידום הגידול אפופטוזיס מעכבים גידול תפוצת29,30. בנוסף, שילוב של RT עם טיפולים חיסוניים רציונלי יכול להגדיל את תגובות מערכת החיסון antitumor ולשפר הן הגידול המקומי שליטה ובקרה של גרורות מרוחקות31. לאחרונה הראו כי מיקוד Tregs בשילוב עם המערכת החיסונית מחסום המצור RT התוצאה גידול חיסול זיכרון אוטואימונית32. מחקרים עתידיים העסקת מודלים orthotopic של HNSCC כדאי ליידע את העיצוב של ניסויים קליניים ולשפר את ההבנה של מנגנונים של הגידול התחמקות החיסון ועמידות לטיפול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אף אחד
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase III | Worthington Biochemical Corp. | LS004183 | |
| DNase I | Worthington Biochemical Corp. | LS006328 | |
| Fc Block (CD16/32) | BD Biosciences | 553141 | Clone 2.4G2 |
| Flow Cytometry Staining Buffer | eBioscience | 00-4222-26 | |
| HBSS | ThermoFisher Scientific | 14175079 | no calcium, no magnesium, no pheno red |
| Helois mass cytometer | Fluidigm | NA | |
| Matrigel membrane matrix | Corning | CB-40234B | |
| MRI Scanner | Bruker | NA | 7.4 Tesla |
| RBC lysis buffer | BioLegend | 420301 | |
| Trypsin inhibitor | Worthington Biochemical Corp. | LS002830 |
References
- Chaturvedi, A. K., et al. Worldwide trends in incidence rates for oral cavity and oropharyngeal cancers. Journal of Clinical Oncology. 31 (36), 4550-4559 (2013).
- Ang, K. K., Sturgis, E. M. Human papillomavirus as a marker of the natural history and response to therapy of head and neck squamous cell carcinoma. Seminars in Radiation Oncology. 22 (2), 128-142 (2012).
- Amin, M. B., et al. The Eighth Edition AJCC Cancer Staging Manual: Continuing to build a bridge from a population-based to a more "personalized" approach to cancer staging. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 67 (2), 93-99 (2017).
- Salley, J. J. Experimental carcinogenesis in the cheek pouch of the Syrian hamster. Journal of Dental Research. 33 (2), 253-262 (1954).
- Morris, A. L. Factors influencing experimental carcinogensis in the hamster cheek pouch. Journal of Dental Research. 40, 3-15 (1961).
- MacDonald, D. G. Comparison of epithelial dysplasia in hamster cheek pouch carcinogenesis and human oral mucosa. Journal of Oral Pathology & Medicine. 10 (3), 186-191 (1981).
- Hawkins, B. L., et al. 4NQO carcinogenesis: a mouse model of oral cavity squamous cell carcinoma. Head & Neck. 16 (5), 424-432 (1994).
- Tang, X. H., Knudsen, B., Bemis, D., Tickoo, S., Gudas, L. J. Oral cavity and esophageal carcinogenesis modeled in carcinogen-treated mice. Clinical Cancer Research. 10 (1 Pt 1), 301-313 (2004).
- Vered, M., Yarom, N., Dayan, D. 4NQO oral carcinogenesis: animal models, molecular markers and future expectations. Oral Oncology. 41 (4), 337-339 (2005).
- Bornstein, S., et al. Smad4 loss in mice causes spontaneous head and neck cancer with increased genomic instability and inflammation. Journal of Clinical Investigation. 119 (11), 3408-3419 (2009).
- Thomas, G. R., Chen, Z., Oechsli, M. N., Hendler, F. J., Van Waes, C. Decreased expression of CD80 is a marker for increased tumorigenicity in a new murine model of oral squamous-cell carcinoma. International Journal of Cancer. 82 (3), 377-384 (1999).
- Yuspa, S. H., Hawley-Nelson, P., Koehler, B., Stanley, J. R. A survey of transformation markers in differentiating epidermal cell lines in culture. Cancer Research. 40 (12), 4694-4703 (1980).
- Chen, Z., Smith, C. W., Kiel, D., Van Waes, C. Metastatic variants derived following in vivo tumor progression of an in vitro transformed squamous cell carcinoma line acquire a differential growth advantage requiring tumor-host interaction. Clinical & Experimental Metastasis. 15 (5), 527-537 (1997).
- Euhus, D. M., Hudd, C., LaRegina, M. C., Johnson, F. E.
- Tomayko, M. M., Reynolds, C. P. Determination of subcutaneous tumor size in athymic (nude) mice. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 24 (3), 148-154 (1989).
- Yushkevich, P. A., et al. User-guided 3D active contour segmentation of anatomical structures: significantly improved efficiency and reliability. NeuroImage. 31 (3), 1116-1128 (2006).
- Dutta, S., et al. The relationship between tumour necrosis, tumour proliferation, local and systemic inflammation, microvessel density and survival in patients undergoing potentially curative resection of oesophageal adenocarcinoma. Britisch Journal of Cancer. 106 (4), 702-710 (2012).
- Li, H., et al. Genomic analysis of head and neck squamous cell carcinoma cell lines and human tumors: a rational approach to preclinical model selection. Molecular Cancer Research. 12 (4), 571-582 (2014).
- Walsh, N. C., et al. Humanized Mouse Models of Clinical Disease. Annual Review of Pathology. 12, 187-215 (2017).
- Oweida, A., et al. Ionizing radiation sensitizes tumors to PD-L1 immune checkpoint blockade in orthotopic murine head and neck squamous cell carcinoma. OncoImmunology. 6 (10), e1356153 (2017).
- Ferris, R., et al. Further evaluations of nivolumab (nivo) versus investigator’s choice (IC) chemotherapy for recurrent or metastatic (R/M) squamous cell carcinoma of the head and neck (SCCHN): CheckMate 141. Journal of Clinical Oncology. 34, (2016).
- Ferris, R. L., et al. Nivolumab for Recurrent Squamous-Cell Carcinoma of the Head and Neck. The New England Journal of Medicine. 375 (19), 1856-1867 (2016).
- Harrington, K. J., et al. Nivolumab versus standard, single-agent therapy of investigator's choice in recurrent or metastatic squamous cell carcinoma of the head and neck (CheckMate 141): health-related quality-of-life results from a randomised, phase 3 trial. The Lancet Oncology. 18 (8), 1104-1115 (2017).
- Kiyota, N., et al. A randomized, open-label, Phase III clinical trial of nivolumab vs. therapy of investigator's choice in recurrent squamous cell carcinoma of the head and neck: A subanalysis of Asian patients versus the global population in checkmate 141. Oral Oncology. 73, 138-146 (2017).
- Ling, D. C., Bakkenist, C. J., Ferris, R. L., Clump, D. A. Role of Immunotherapy in Head and Neck Cancer. Seminars in Radiation Oncology. 28 (1), 12-16 (2018).
- Perri, F., et al. Radioresistance in head and neck squamous cell carcinoma: Biological bases and therapeutic implications. Head & Neck. 37 (5), 763-770 (2015).
- Yamamoto, V. N., Thylur, D. S., Bauschard, M., Schmale, I., Sinha, U. K. Overcoming radioresistance in head and neck squamous cell carcinoma. Oral Oncology. 63, 44-51 (2016).
- Bonner, J. A., et al. Radiotherapy plus cetuximab for locoregionally advanced head and neck cancer: 5-year survival data from a phase 3 randomised trial, and relation between cetuximab-induced rash and survival. The Lancet Oncology. 11 (1), 21-28 (2010).
- Bhatia, S., et al. Inhibition of EphB4-Ephrin-B2 Signaling Enhances Response to Cetuximab-Radiation Therapy in Head and Neck Cancers. Clinical Cancer Research. 24 (18), 4539-4550 (2018).
- Bhatia, S., et al. Enhancing radiosensitization in EphB4 receptor-expressing Head and Neck Squamous Cell Carcinomas. Scientific Reports. 6, 38792 (2016).
- Tang, C., et al. Combining radiation and immunotherapy: a new systemic therapy for solid tumors? Cancer Immunology Research. 2 (9), 831-838 (2014).
- Oweida, A., et al. Resistance to radiotherapy and PD-L1 blockade is mediated by TIM-3 upregulation and regulatory T-cell infiltration. Clinical Cancer Research. , (2018).
