Summary
Aqui nós apresentamos um método reprodutível para desenvolver um modelo murino ortotópico de cabeça e pescoço carcinoma de células escamosas. Tumores demonstram clinicamente relevantes características histopatológicas da doença, incluindo necrose, pobre diferenciação, metástases nodais e infiltração imune. Tumor-rolamento ratos desenvolvem sintomas clinicamente relevantes, incluindo disfagia, deslocamento da mandíbula e perda de peso.
Abstract
Cabeça e pescoço carcinoma de células escamosas (HNSCC) é uma doença debilitante e mortal com uma elevada prevalência de recidiva e falha do tratamento. Para desenvolver melhor estratégias terapêuticas, compreensão tumor microenvironmental fatores que contribuem para a resistência de tratamento é importante. Um impedimento importante para compreender os mecanismos da doença e melhorar a terapia tem sido a falta de linhas de celulares murino que se assemelham a natureza agressiva e metastática da HNSCCs humanas. Além disso, a maioria dos modelos murino empregar implantes subcutâneos de tumores que não possuem características fisiológicas importantes da região da cabeça e pescoço, incluindo alta densidade vascular e extensa vascularização linfática residente flora da mucosa. O objetivo deste estudo é desenvolver e caracterizar um modelo ortotópico de HNSCC. Nós empregamos duas linhas de células geneticamente distintas de murino e tumores estabelecidas na mucosa bucal de ratos. Otimizamos a métodos de digestão tumor colagenase-baseado para a recuperação ideal de células únicas de tumores estabelecidas. Os dados aqui apresentados mostram que ratos desenvolvem tumores altamente vascularizados que metastatizam para linfonodos regionais. Análise de citometria de massa Multiparamétrico monocelulares mostra a presença de diversas populações imunes com células mieloides, que representa a maioria de todas as células do sistema imunológico. O modelo proposto neste estudo tem aplicações em biologia do câncer, imunologia de tumor e desenvolvimento pré-clínico da novela terapêutica. A semelhança do modelo ortotópico para características clínicas da doença humana irá fornecer uma ferramenta para tradução melhorada e melhorou os resultados dos pacientes.
Introduction
HNSCC é a quinto mais comum malignidade globalmente, com mais de 600.000 pacientes diagnosticados anualmente1. Apesar do tratamento agressivo, envolvendo quimioterapia e radioterapia (RT), a taxa global de sobrevivência (OS) para pacientes com HNSCC sem infecção pelo papilomavírus humano (HPV) continua a ser inferior a 50% após 5 anos2. Isto é atribuído em grande parte para um microambiente do tumor altamente complexo como tumores podem se originar de vários sítios anatômicos distintos dentro da região de cabeça e pescoço, incluindo a mucosa bucal, língua, assoalho da boca, cavidade nasal, cavidade oral, faringe, orofaringe e hipofaringe. Além disso, a região da cabeça e pescoço é altamente vascularizada e contém quase a metade de todos os nós de linfa no corpo3. A maioria dos estudos investigando a biologia de tumor de cabeça e pescoço contam com modelos de tumor na região do flanco. Tais modelos podem oferecer insights sobre mecanismos intrínsecos tumor, mas a falta do microambiente nativo de cabeça e pescoço pode ter impacto significativamente o potencial translacional de tais achados. Um método que tem sido usado para induzir tumores orais é através da exposição ao carcinógeno 9,10-dimetil-1,2-benzanthracene (DMBA)4. No entanto, este método está associado com um processo demorado, induz tumores em ratos e hamsters, mas não em ratos, e os tumores resultantes não possuem muitas das características histológicas de diferenciada SCCs5,6. A introdução do carcinogen4-nitroquinoleína 1-óxido (4-NQO), um derivado hidrossolúvel quinolona, resultou em tumores orais do rato quando aplicado por via oral, mas também sofria de longos tempos de exposição (16 semanas) e um número limitado tomar taxa dentro e entre lotes de ratos7,8,9. A fim de desenvolver modelos clinicamente relevantes, vários grupos utilizaram modelos geneticamente modificados, que envolve a manipulação dos oncogenes motorista ou genes supressores de tumor, incluindo TP53, TGFB, KRAS, HRAS e SMAD410. Estes modelos podem oferecer insights sobre tumores com genes de motorista conhecido mas não recapitular a complexa heterogeneidade da HNSCCs humanas.
Neste trabalho, vamos demonstrar a viabilidade de realizar uma intramucosal inoculação de células de carcinoma de células escamosas em camundongos. Células inoculadas se desenvolvem em tumores agressivos dentro de 1 semana da injeção. Semelhante a HNSCCs humanas, os tumores metastatizam para os linfonodos regionais. Podemos caracterizar características clínicas e histológicas da doença e fornecer insights sobre o microambiente imune do tumor. Propomos que este modelo ortotópico de HNSCC tem aplicações em biologia do câncer, imunologia de tumor e estudos pré-clínicos. Mecanismos de evasão imune, progressão do tumor, metástases e resistência de tratamento representam áreas de significância clínica que podem ser abordados usando o modelo proposto.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos os procedimentos de animais foram efectuados de acordo com um institucional animal cuidados e uso Comité (IACUC) protocolo aprovado da Universidade de Colorado Denver (protocolo # 00250).
1. cultura de células de tumor
Nota: Linhas de células B4B8 e LY2 foram usadas para gerar tumores HNSCC ortotópico: B4B8 células de tumor foram derivadas de queratinócitos da mucosa cancerígena-transformadas (a partir de camundongos BALB/C)11. As células do tumor LY2 foram derivadas do linfonodo metástase de um queratinócito BALB/C espontaneamente transformado linha (Pam 212)12,13. Ambas as linhas de célula foram gentilmente cedidas pelo Dr. Nadarajah Vigneswaran (UTHealth, Houston, TX, USA).
- Uso Dulbecco modificado, F/12 médio (DMEM da águia) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e reagente antimicrobiana de 1% para a manutenção de linha celular. Manter estas linhas de célula em uma incubadora estéril em 37 ° C e 5% de CO2. Células devem ser usadas para inoculação antes superior a 15 passagens.
- Placa de 2 x 106 a 4 x 106 células em frascos de cultura de células de2 175 cm.
Nota: Garantir que as células são menos de 90% confluente para evitar induzir uma resposta ao estresse. - Quando as células são 70% confluente (~ 48 h), retire o balão da incubadora e lavar as células 3 x com frio fosfato salino (PBS).
- Separe as células do recipiente utilizando tripsina 0,25%, suficiente para cobrir a superfície da placa.
- Para fazer isso, dispense 4 mL de tripsina num balão de2 175 cm contendo 70% confluentes. Incube as celulas com tripsina por 3 – 4 min na incubadora de cultura celular em 37 ° C e 5% de CO2.
- Visualize as células sob um microscópio para garantir o desprendimento de células.
- Adicione 12 mL de DMEM F/12 mídia contendo FBS para neutralizar a atividade da tripsina.
- Aspirar a suspensão de eritrócitos e colocá-lo em um tubo cónico de 50 mL.
- Agitar o tubo contendo as células invertendo-3 x-4 x.
- Opcionalmente, uma alíquota de 10 µ l da suspensão de células se misturam com 10 µ l de Trypan azul em um tubo de microcentrifugadora e contar as células usando um hemocytometer. Determinar a viabilidade celular subtraindo-se o número de células Trypan azul-positivo do número total de células e divida pelo número total de células.
- Centrifugar a suspensão de eritrócitos a 300 x g por 5 min a 4 ° C.
- Ressuspender as células em DMEM livre de soro e antibiótico em um volume adequado para que 1 x 106 células estão presentes em 50 µ l de mídia.
Nota: Baseia a agressividade de linha de células in vivo (determinada empiricamente), 1 x 106 células por injecção por rato foi considerada adequada para células B4B8 e LY2. - Coloque o frasco contendo a suspensão de células no gelo.
- Coloque a matriz previamente descongelado membrana basal no gelo.
Nota: A matriz da membrana basal foi descongelada durante a noite a 4 ° C.
2. célula de injeção em ratos
- Prepare uma mistura de 1:1 da matriz de membrana de células: cave (50 µ l cada).
- Adicionar as células primeiro; Então, gradualmente Pipete a matriz da membrana basal. Evite a introdução de bolhas de ar. Certifique-se de que a mistura é feita imediatamente antes da injeção de animais. Adicionar células à matriz da membrana basal por um longo período de tempo pode resultar em célula, fixando-se na mistura de matriz, o que dificulta a mistura a tremer com rigor. Isso fará com que uma considerável variabilidade no tamanho do tumor entre ratos.
- Misture suavemente. Certifique-se de todas as etapas que envolvem a matriz são executadas no gelo. Membrana basal matriz irá polimerizar à temperatura ambiente.
- Prepare as seringas para inoculação.
- Carrega seringas de insulina 0,5 mL (23 G) com 100 µ l da solução de matriz de membrana celular/porão.
- Mantenha as seringas no gelo para evitar a polimerização de matriz de membrana basal.
- ANESTHETIZE ratos, colocando-os em uma câmara com isoflurano e oxigênio (2,5%).
- Assegure que os ratos são anestesiados profundamente antes de executar a injeção (garantindo uma falta de resposta a uma pitada de dedo do pé).
- Insira a agulha na região bucal da direita ou esquerda. Isto é realizado através dos espaços disponíveis em ambos os lados da boca.
- Certifique-se de que a língua do rato não é da forma.
Nota: É fácil de arrancar a língua, o que resultará em tumores de língua. Mova a língua para o lado oposto, se necessário. - Manter a seringa paralela à região bucal enquanto dentro da cavidade oral.
- Quando estiver pronto para injetar, retirar a seringa e introduza lentamente a seringa em um ângulo de 10°.
- Injetar 100 µ l de suspensão de matriz de membrana celular/porão durante um período de 5 s.
- Segurar a seringa no lugar por um adicional de 5 s para garantir todo o material é injetado.
Nota: Para os ratos nontumor-rolamento de controle, injete uma mistura de mídia livre de soro e matriz (como descrito acima) sem as células do tumor. - Retire a seringa com cuidado.
- Continue o procedimento acima com os ratos restantes.
- Permitir a 1 semana até tumores começam a aparecer grosseiramente (50 – 200 mm3 para células B4B8 e LY2).
3. Mouse monitoramento
- Realize a primeira medição usando pinças em 1 semana após a injeção de células de tumor. Para calcular o volume do tumor utilizando pinças externas, determinar o maior diâmetro longitudinal (comprimento) e o maior diâmetro transversal (largura) e usar a fórmula elipsoidal modificados14,15.
- Continue a realizar medições paquímetro regular para o volume do tumor (x-2 1x por semana em intervalos regulares).
- Medir peso animal para avaliar os efeitos do crescimento do tumor na alimentação.
4. colheita de tumores
- Quando é alcançado o ponto de extremidade experimental, eutanásia dos animais usando medidas adequadas (por exemplo, CO2 asfixia, decapitação ou deslocamento cervical).
Nota: Neste estudo, o ponto de extremidade foi alcançado se os ratos tornou-se moribundo (com perda de peso > 15% de seu peso inicial, a falta de higiene, caquexia) e/ou se o tamanho do tumor chegou a 1.000 mm3. -
Começa dissecando o animal através da criação de uma incisão longa através da linha mediana da região do pescoço.
- Use fórceps contundente para agarrar a pele e afiadas tesouras para cortar a pele.
- Insira uma tesoura suavemente sob a pele que cobre o tumor e criar bolsões de ar empurrando a tesoura do outro lado e na pele.
- Uma vez que a pele é suficientemente separada do tumor, identificar os drenagem dos gânglios linfáticos (DLNs) e impostos especiais de consumo-los para evitar que o tecido do tumor confundido pela presença de gânglios linfáticos.
Nota: Tumores grandes podem atingir e/ou cobrir o DLN. Dependendo do tipo de ensaio a ser realizado, o isolamento dos linfonodos intactos é essencial para evitar derrames de células do sistema imunológico para o tumor, o que resultará em distorcer os resultados do ensaio. - Atravessa as fronteiras do tumor até que todo o volume se desprenda.
5. tumor de processamento para aplicações a jusante
- Para o exame histológico a jusante, coloque tumores em formol a 10% em temperatura ambiente. Para evitar overfixation, substitua o formol com etanol a 70%. Para análise de citometria de fluxo, processa os tumores conforme descrito abaixo.
Nota: O tecido pode ser mantido em formol para 72 h antes de overfixation pode se tornar problemático para certos tipos de coloração. - Corte o tumor em 1-2 mm-tamanho pedaços usando um estéril de lâmina de barbear ou tesoura afiada.
- Coloque as peças do corte do tumor em um tubo cónico de 50 mL com colagenase III (4.250 unidades por exemplo), DNase I (0,1 mg por exemplo) e inibidor de tripsina (1 mg por exemplo).
- Incube a 37 ° C por 30 min com agitação a cada 10 min.
Nota: As amostras podem ser colocadas em um saco resealable, esterilizado com 90% de etanol e colocado em uma incubadora de cultura de células. - Depois de 30 min, adicione 20 mL de Hank está equilibrada solução salina (HBSS) e a centrifugação a 300 x g por 5 min.
Nota: HBSS é composto de cloreto de potássio, cloreto de sódio, bicarbonato de sódio, fosfato de sódio dibásico, fosfato de sódio monobásico e glicose. - Desprezar o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 2-3 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos (RBC). Pipete rigorosamente.
Nota: Tampão de Lise RBC é composto de cloreto de amônio, bicarbonato de sódio e dissódico. - Incube durante 2 min à temperatura ambiente.
Nota: Incubação mais longa pode ser tóxica para outras populações de células. - Adicione 20 mL de HBSS para neutralizar o efeito de Lise.
- Centrifugar a 300 x g por 5 min e descartar o sobrenadante.
- Resuspenda o pellet em 10 mL de HBSS.
- Transferir a solução através de uma retenção de nylon 70 µm e centrifugar x g por 5 min. descartar o sobrenadante.
- Repita as etapas de 5.8 – 5.10 e passar a suspensão de células através de uma retenção de nylon de 40 µm para garantir a que remoção de quaisquer resíduos adicionais da suspensão.
6. célula coloração e aquisição de dados
- Ressuspender as células em 1 mL de HBSS.
- Contar as células usando um hemocytometer ou um contador de célula automatizada, conforme descrito na etapa 1.7
-
Determine o número total de células e a concentração adequada para a coloração.
Nota: a concentração de célula ideal para coloração de citometria de fluxo é de 1 milhão de células. Por exemplo, se a mancha é executada em uma placa de 96 poços e existem 10 milhões de células, resuspenda a amostra em 1 mL e placa 100 µ l para 1 milhão de células por poço. -
Adicione o bloco Fc (CD16/CD32) na concentração de 1: 100 a fim de impedir a ligação de nonantigen específicas das imunoglobulinas aos receptores FcγIII e FcγII. Incube durante 5 min à temperatura ambiente.
- Centrifugue e resuspenda o pellet de células em 100 µ l de pilha de citometria de fluxo tampão de coloração (composto contendo 5% FBS, EDTA de 2% e 1% de solução salina HEPES).
-
Execute a superfície celular, coloração de acordo com instruções fornecido pelo fornecedor (adicionando cada anticorpo na diluição adequada). Incube durante 60 min à temperatura ambiente.
- Centrifugue e ressuspender as células em 100 µ l de HBSS. Repita 2x para se livrar de anticorpo em excesso.
-
Execute amostras em um citômetro de fluxo apropriado.
- Se analisar marcadores intracelulares (por exemplo, foxp3), realize permeabilização celular e coloração de acordo com as instruções do fornecedor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A avaliação in vitro da proliferação celular de LY2 e B4B8 mostrou que ambas as linhas de célula têm tempos de duplicação similares (21h e 23h, respectivamente). In vivo, ambas as linhas de célula formaram uma massa única, visível e palpável dentro de 1 semana de inoculação (figura 1A). Em camundongos com tumores LY2, o maxilar foi deslocado por 3 semanas devido a carga do tumor (figura 1A). Ratos de controle que não recebeu células tumorais não desenvolveu tumores como antecipado. Tumores LY2 cresceram a uma taxa mais elevada em comparação com tumores B4B8. O volume médio de tumor no dia 21 em LY2 tumor-rolamento ratos foi 632 ± 10 mm3 em comparação com 162 ± 4mm3 em tumores B4B8 (figura 1B). Ratos, exibindo o deslocamento da mandíbula rapidamente desenvolveram perda de peso devido à disfagia (Figura 1). Ratos exibem significativa definida como a perda de peso > 15% de seu peso inicial e/ou tendo um volume de tumor de > 1 cm3 foram sacrificados dentro de 1 dia da observação notável. A sobrevida mediana em camundongos LY2 foi 22,5 dias, comparados a 52,0 dias em ratos de tumor-rolamento B4B8 (Figura 1).
Ressonância magnética (RM) de tumor-rolamento ratos mostraram tumores bem demarcadas, estendendo-se para a camada interna da mucosa bucal (Figura 2A). Tumores não invadir para a língua ou outros órgãos nas proximidades (esôfago, brônquios, Timo) como mostrado com avaliação histológica. Heterogeneidade de sinal nas imagens de senhor era representante da presença de aspecto vascularizado (indicado com V) e necrótico hypointense regiões (assinaladas com N) (Figura 2A). Um exame patológico bruto mostrou DLNs alargadas (Figura 2B). Avaliamos ainda mais o volume do tumor com a tomografia computadorizada (CT) para determinar a confiabilidade das medições paquímetro. Tumores foram delineados usando uma imagem digital e comunicações em medicina (DICOM) imagem análise software16. Avaliação do volume do tumor LY2 por pinças e imagem latente de CT mostrou uma excelente correlação entre os dois métodos (R2 = 0.8493; A Figura 2). Isso indica que o crescimento do tumor é principalmente exofíticas e medição da maxila é um método confiável para a avaliação do crescimento do tumor. Exame histológico mostrou que todos os ratos de tumor-rolamento LY2 desenvolvidos mal diferenciado carcinoma de células escamosas (Figura 2D). Nove de nove LY2 tumor-rolamento ratos desenvolveram metástases para os linfonodos do primeiro e segundo escalão. Metástases nodais foram principalmente subcapsular (com sete de nove ratos) e dentro de cavidades (com cinco dos nove ratos), com dois dos nove ratos demonstrando intracapsular invasão. Em contraste, ratos rolamento B4B8 tumores desenvolvidos moderadamente diferenciadas carcinoma de células escamosas (Figura 2E) e não metástase para sites regionais ou distantes, incluindo DLNs. necrose foi avaliada com base em uma três-classe previamente estabelecida escala: 0 = sem necrose visível, 1 = escassa, 2 = moderada e 3 = grave17. Todos os mouses de tumor-rolamento LY2 histologicamente havia confirmado necrose com a maioria (sete em cada dez) demonstrando moderada a grave necrose (Figura 2F). Sem evidência de necrose foi observada em tumores de B4B8.
Enfocamos o modelo de tumor LY2 para caracterização mais do microambiente do tumor-imune. Tumores foram colhidas em 3 semanas após a inoculação do tumor e digerido usando colagenase III, seguido pela coloração da superfície celular e marcadores intracelulares para massa fluxo cytometry (Figura 3A). As amostras foram processadas, usando um citômetro de massa, na Universidade de Colorado Denver Flow Cytometry Shared Resource. Gating e análise de dados foram realizadas utilizando o software comercial de citometria de fluxo. Os dados obtidos mostraram a presença de numerosas populações de células imunes em graus variados. Total de células do sistema imunológico (CD45+) representou 7,3% do total tumor (Figura 3B). Em números absolutos, observamos, em média, 26 CD45+ células (SD = 0,81) por miligrama de tecido do tumor (Figura 3B). Células mieloides (CD11b+) representavam 37,8% do CD45 todos+ células (Figura 3). Células mieloides foram em grande parte compostas de macrófagos (F4 / 80 +, 63,0%), seguido por células supressoras mieloide-derivado (MDSCs) (Gr1 +, 8.51%) e neutrófilos (Ly6G +, 5,87%). As pilhas de T totais composta por 15,9% de CD45 células com CD4 de+ + T células contendo a maioria de todas as células T (79,4%), dos quais 53,4% regulamentar T células (Tregs) (CD4+FoxP3+) (Figura 3D). Células assassinas naturais (NK) composta por 1,75% de CD45 todos+ células. Estes dados destaque a presença de vários imunológico se infiltra em LY2 ortotópico tumores HNSCC que provavelmente desempenham um papel na mediação de progressão do tumor e evasão imune.
Figura 1: monitoramento de ratos rolamento ortotópico tumores HNSCC. (A) imagens representativas dos ratos de tumor-rolamento. O inoculados bucal desenvolve um tumor dentro de 1 semana de inoculação. Em 3 semanas, observa-se o deslocamento da mandíbula. (B) taxa de crescimento do Tumor nos ratos de tumor-rolamento B4B8 e LY2 conforme determinado através de medições paquímetro. (C) alterações no peso corporal de ratos com tumores B4B8 ou LY2. (D) sobrevivência de B4B8 e LY2 ratos de tumor-rolamento. As barras representam o erro padrão da média (SEM) de 7 – 10 ratos por grupo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: características da imagem latente e histológicas de tumores HNSCC murino. (A) coronal MR imagem representativa de um rato de tumor-rolamento LY2. Sítios anatômicos são rotulados. Áreas de sinal hyperintensity representam regiões vascularizadas (denotado por V). Regiões de sinal hypointensity representam áreas de necrose (denotar N). (B) imagem bruta representativa de uma região que contém o tumor dissecada. Setas brancas apontam para nódulos linfáticos drenagem (DLNs). (C) correlação do volume do tumor como avaliado pela medição de maxila versus tomografia computadorizada (CT)-com base em avaliação. Inclinação e coeficiente de correlação (R2) linha de melhor ajuste são mostrados. (D) hematoxilina e eosina (H & E) imagem representativa de tumor LY2. (E) representante H & E imagem de tumor B4B8. (F) quantificação de necrose em tumores LY2, baseado em um H & E quatro da série sistema de pontuação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: análise das populações de imune de base intratumoral usando citometria por tempo-de-voo (CyTOF). Tumores foram transformadas em uma suspensão de célula única usando digestão enzimática com base de colagenase e, em seguida, corados com marcadores de superfície e intracelulares de células. (A) citometria de massa foi realizada utilizando a plataforma CyTOF. (B) absolutos e relativa a avaliação quantitativa das células imunes totais (CD45+). (C) quantificação de subpopulações mieloide-imune. (D) quantificação de subpopulações linfoides de imunes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Uma análise rigorosa e caracterização do microambiente do tumor representam uma importante estratégia para os mecanismos de compreensão do desenvolvimento do tumor, progressão e metástases e para o desenvolvimento de terapias eficazes. Câncer de cabeça e pescoço é uma doença complexa que pode originar-se de vários locais anatômicos dentro da região de cabeça e pescoço. Um impedimento importante para compreender os mecanismos da doença e melhorar a terapia tem sido a falta de linhas de células de rato murino que se assemelham a natureza agressiva e metastática da HNSCCs humanas. Além disso, numerosos modelos murino empregam uma implantação subcutânea de tumores que não possuem características fisiológicas importantes da região da cabeça e pescoço, incluindo uma alta densidade vascular, uma extensa vascularização linfática e residente flora da mucosa.
Neste estudo, caracteriza-se um modelo ortotópico de HNSCC murino. A mucosa bucal como o local da inoculação do tumor para uma série de razões, incluindo o fácil acesso à região sem a necessidade de orientação da imagem, a capacidade de avaliar o crescimento do tumor utilizando pinças, a presença do tumor dentro da flora da mucosa, o presença de vasos linfáticos circundantes e a facilidade de reprodutibilidade. Embora a injeção de células na mucosa bucal é simples, o posicionamento da agulha e a profundidade de penetração são fundamentais para evitar uma punção através da pele e certifique-se de células não são injetadas por via subcutânea. Recomendamos inserir a agulha intraoral, embora seja perfeitamente paralela à região bucal e inclinar em um ângulo não superior a 10 ° quando estiver pronto para injetar.
As linhas de célula usamos eram linhas de células murino, permitindo a sua implantação em camundongos imunocompetentes da estirpe que eles foram derivados. Existem mais 39 linhas de células humanas de HNSCC que têm sido estudadas na literatura, mas não podem ser usadas na presença de um microambiente nativo18. Desenvolvimentos recentes permitidos para a concepção de modelos de rato humanizado que integram humanas quimeras derivado de medula óssea em camundongos de gama NOD scid (também conhecido como ratos NSG), permitindo o desenvolvimento de um sistema imunológico humano que podem interagir com tumores humanos em um imunodeficientes rato modelo19. No entanto, tais modelos são caros, exigem métodos de reprodução laborioso e não recapitular todos os componentes do microambiente do tumor, incluindo células endoteliais, fibroblastos e vasos linfáticos. Os modelos do rato murino que foi utilizada neste estudo recapitular os componentes críticos de HNSCCs humanas, incluindo a presença de várias infiltrações imunes. Para garantir a máxima recuperação de células única viáveis de tumores, o uso de enzimas de digestão é necessário. Enzimas de digestão colagenase-baseado podem ser duras nas células e a otimização da concentração e tipo de colagenase pode ser necessário para tipos diferentes de tumor. Nós comparamos cinco enzimas de digestão antes de determinar a colagenase III, que foi utilizado neste estudo, é o método ideal para a digestão dos tumores de células escamosas.
Os modelos de tumor utilizados neste estudo são particularmente úteis para estudar mecanismos de evasão imune HNSCC e avaliação pré-clínica de várias terapias. Demonstramos anteriormente que tumores tanto B4B8 e LY2 são radioresistant e refratário para o posto de controle imune inibidor anti-PD-L120. Isto é consistente com a maioria dos HNSCCs humanos. Ensaios clínicos recentes mostraram que menos de 15% dos pacientes HNSCC são responsivos à terapia anti-PD-1/PD-L121,22,23,24,25. Além disso, está bem estabelecido que HNSCCs são radioresistant26,27. Como alvo vias responsáveis pela radioresistance em HNSCC é um passo importante para melhorar a resposta do tratamento. O Marco Bonner et al estudo mostrou um benefício significativo na sobrevida global com a adição de cetuximab à RT, em comparação com RT sozinho em localmente avançado HNSCC pacientes28. Dados recentes demonstram que a inibição da sinalização de EphB4-Ephrin-B2 em HNSCCs ortotópico pode melhorar ainda mais a resposta ao RT ou cetuximabe-RT, promovendo a apoptose de tumor e inibe a proliferação de tumor29,30. Além disso, combinar RT com terapias imunes racionais pode aumentar antitumorais respostas imunes e aumentar o controle local do tumor e controle de metástases distantes31. Recentemente demonstramos que direcionamento Tregs em combinação com o bloqueio do posto de controle imune e RT resulta na erradicação do tumor e memória imunológica32. Futuros estudos empregando modelos ortotópico de HNSCC serão melhor informar o desenho de ensaios clínicos e melhorar a compreensão dos mecanismos de evasão imune tumor e tratamento resistência.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Nenhum
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase III | Worthington Biochemical Corp. | LS004183 | |
| DNase I | Worthington Biochemical Corp. | LS006328 | |
| Fc Block (CD16/32) | BD Biosciences | 553141 | Clone 2.4G2 |
| Flow Cytometry Staining Buffer | eBioscience | 00-4222-26 | |
| HBSS | ThermoFisher Scientific | 14175079 | no calcium, no magnesium, no pheno red |
| Helois mass cytometer | Fluidigm | NA | |
| Matrigel membrane matrix | Corning | CB-40234B | |
| MRI Scanner | Bruker | NA | 7.4 Tesla |
| RBC lysis buffer | BioLegend | 420301 | |
| Trypsin inhibitor | Worthington Biochemical Corp. | LS002830 |
References
- Chaturvedi, A. K., et al. Worldwide trends in incidence rates for oral cavity and oropharyngeal cancers. Journal of Clinical Oncology. 31 (36), 4550-4559 (2013).
- Ang, K. K., Sturgis, E. M. Human papillomavirus as a marker of the natural history and response to therapy of head and neck squamous cell carcinoma. Seminars in Radiation Oncology. 22 (2), 128-142 (2012).
- Amin, M. B., et al. The Eighth Edition AJCC Cancer Staging Manual: Continuing to build a bridge from a population-based to a more "personalized" approach to cancer staging. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 67 (2), 93-99 (2017).
- Salley, J. J. Experimental carcinogenesis in the cheek pouch of the Syrian hamster. Journal of Dental Research. 33 (2), 253-262 (1954).
- Morris, A. L. Factors influencing experimental carcinogensis in the hamster cheek pouch. Journal of Dental Research. 40, 3-15 (1961).
- MacDonald, D. G. Comparison of epithelial dysplasia in hamster cheek pouch carcinogenesis and human oral mucosa. Journal of Oral Pathology & Medicine. 10 (3), 186-191 (1981).
- Hawkins, B. L., et al. 4NQO carcinogenesis: a mouse model of oral cavity squamous cell carcinoma. Head & Neck. 16 (5), 424-432 (1994).
- Tang, X. H., Knudsen, B., Bemis, D., Tickoo, S., Gudas, L. J. Oral cavity and esophageal carcinogenesis modeled in carcinogen-treated mice. Clinical Cancer Research. 10 (1 Pt 1), 301-313 (2004).
- Vered, M., Yarom, N., Dayan, D. 4NQO oral carcinogenesis: animal models, molecular markers and future expectations. Oral Oncology. 41 (4), 337-339 (2005).
- Bornstein, S., et al. Smad4 loss in mice causes spontaneous head and neck cancer with increased genomic instability and inflammation. Journal of Clinical Investigation. 119 (11), 3408-3419 (2009).
- Thomas, G. R., Chen, Z., Oechsli, M. N., Hendler, F. J., Van Waes, C. Decreased expression of CD80 is a marker for increased tumorigenicity in a new murine model of oral squamous-cell carcinoma. International Journal of Cancer. 82 (3), 377-384 (1999).
- Yuspa, S. H., Hawley-Nelson, P., Koehler, B., Stanley, J. R. A survey of transformation markers in differentiating epidermal cell lines in culture. Cancer Research. 40 (12), 4694-4703 (1980).
- Chen, Z., Smith, C. W., Kiel, D., Van Waes, C. Metastatic variants derived following in vivo tumor progression of an in vitro transformed squamous cell carcinoma line acquire a differential growth advantage requiring tumor-host interaction. Clinical & Experimental Metastasis. 15 (5), 527-537 (1997).
- Euhus, D. M., Hudd, C., LaRegina, M. C., Johnson, F. E.
- Tomayko, M. M., Reynolds, C. P. Determination of subcutaneous tumor size in athymic (nude) mice. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 24 (3), 148-154 (1989).
- Yushkevich, P. A., et al. User-guided 3D active contour segmentation of anatomical structures: significantly improved efficiency and reliability. NeuroImage. 31 (3), 1116-1128 (2006).
- Dutta, S., et al. The relationship between tumour necrosis, tumour proliferation, local and systemic inflammation, microvessel density and survival in patients undergoing potentially curative resection of oesophageal adenocarcinoma. Britisch Journal of Cancer. 106 (4), 702-710 (2012).
- Li, H., et al. Genomic analysis of head and neck squamous cell carcinoma cell lines and human tumors: a rational approach to preclinical model selection. Molecular Cancer Research. 12 (4), 571-582 (2014).
- Walsh, N. C., et al. Humanized Mouse Models of Clinical Disease. Annual Review of Pathology. 12, 187-215 (2017).
- Oweida, A., et al. Ionizing radiation sensitizes tumors to PD-L1 immune checkpoint blockade in orthotopic murine head and neck squamous cell carcinoma. OncoImmunology. 6 (10), e1356153 (2017).
- Ferris, R., et al. Further evaluations of nivolumab (nivo) versus investigator’s choice (IC) chemotherapy for recurrent or metastatic (R/M) squamous cell carcinoma of the head and neck (SCCHN): CheckMate 141. Journal of Clinical Oncology. 34, (2016).
- Ferris, R. L., et al. Nivolumab for Recurrent Squamous-Cell Carcinoma of the Head and Neck. The New England Journal of Medicine. 375 (19), 1856-1867 (2016).
- Harrington, K. J., et al. Nivolumab versus standard, single-agent therapy of investigator's choice in recurrent or metastatic squamous cell carcinoma of the head and neck (CheckMate 141): health-related quality-of-life results from a randomised, phase 3 trial. The Lancet Oncology. 18 (8), 1104-1115 (2017).
- Kiyota, N., et al. A randomized, open-label, Phase III clinical trial of nivolumab vs. therapy of investigator's choice in recurrent squamous cell carcinoma of the head and neck: A subanalysis of Asian patients versus the global population in checkmate 141. Oral Oncology. 73, 138-146 (2017).
- Ling, D. C., Bakkenist, C. J., Ferris, R. L., Clump, D. A. Role of Immunotherapy in Head and Neck Cancer. Seminars in Radiation Oncology. 28 (1), 12-16 (2018).
- Perri, F., et al. Radioresistance in head and neck squamous cell carcinoma: Biological bases and therapeutic implications. Head & Neck. 37 (5), 763-770 (2015).
- Yamamoto, V. N., Thylur, D. S., Bauschard, M., Schmale, I., Sinha, U. K. Overcoming radioresistance in head and neck squamous cell carcinoma. Oral Oncology. 63, 44-51 (2016).
- Bonner, J. A., et al. Radiotherapy plus cetuximab for locoregionally advanced head and neck cancer: 5-year survival data from a phase 3 randomised trial, and relation between cetuximab-induced rash and survival. The Lancet Oncology. 11 (1), 21-28 (2010).
- Bhatia, S., et al. Inhibition of EphB4-Ephrin-B2 Signaling Enhances Response to Cetuximab-Radiation Therapy in Head and Neck Cancers. Clinical Cancer Research. 24 (18), 4539-4550 (2018).
- Bhatia, S., et al. Enhancing radiosensitization in EphB4 receptor-expressing Head and Neck Squamous Cell Carcinomas. Scientific Reports. 6, 38792 (2016).
- Tang, C., et al. Combining radiation and immunotherapy: a new systemic therapy for solid tumors? Cancer Immunology Research. 2 (9), 831-838 (2014).
- Oweida, A., et al. Resistance to radiotherapy and PD-L1 blockade is mediated by TIM-3 upregulation and regulatory T-cell infiltration. Clinical Cancer Research. , (2018).
