Summary
Qui presentiamo un metodo riproducibile per lo sviluppo di un modello murino ortotopico di carcinoma di cellule squamous testa e del collo. I tumori dimostrano clinicamente rilevanti caratteristiche istopatologiche della malattia, compreso necrosi, differenziazione difficile, le metastasi nodali e infiltrazione immune. Topi del tumore-cuscinetto sviluppano sintomi clinicamente rilevanti tra cui disfagia, spostamento mascella e la perdita di peso.
Abstract
Carcinoma di cellule squamous di testa e del collo (HNSCC) è una malattia debilitante e mortale con un'alta prevalenza di ricorrenza e di guasto di trattamento. Per sviluppare meglio le strategie terapeutiche, fattori microambientali del tumore di comprensione che contribuiscono alla resistenza del trattamento è importante. Dei principali ostacoli alla comprensione dei meccanismi di malattia e migliorare la terapia è stata una mancanza di linee murine che ricordano la natura aggressiva e metastatica della HNSCCs umana. Inoltre, una maggioranza di modelli murini impiegano impianti sottocutanei di tumori che mancano importanti caratteristiche fisiologiche della regione testa e collo, compreso alta densità vascolare, vasto sistema vascolare linfatico e flora residente della mucosa. Lo scopo di questo studio è di sviluppare e caratterizzare un modello ortotopico di HNSCC. Ci avvaliamo di due linee cellulari murine geneticamente distinte e tumori stabiliti nel mucosa orale dei topi. Ottimizziamo i metodi di digestione tumore collagenosi-basato per il recupero ottimo delle singole cellule dai tumori stabiliti. I dati presentati qui indicano che i topi sviluppano tumori altamente vascularized che riprodurrsi per metastasi ai linfonodi regionali. Massa di citometria multiparametrica unicellulare dimostra la presenza di diverse popolazioni immunitarie con cellule mieloidi che rappresentano la maggioranza di tutte le cellule immunitarie. Il modello proposto in questo studio ha applicazioni nella biologia del cancro, immunologia dei tumori e sviluppo preclinico di approcci terapeutici. La somiglianza del modello ortotopico alle caratteristiche cliniche della malattia umana fornirà uno strumento per la traduzione avanzata e migliorare i risultati pazienti.
Introduction
HNSCC è la malignità quinto più comune a livello mondiale, con oltre 600.000 pazienti diagnosticati ogni anno1. Malgrado il trattamento aggressivo che coinvolgono la chemioterapia e la radioterapia (RT), la sopravvivenza globale (OS) per i pazienti HNSCC senza infezione umana di papillomavirus (HPV) rimane inferiore al 50% dopo 5 anni2. Questo è in gran parte attribuito a un microambiente tumorale altamente complesse come i tumori possono provenire da diverse sedi anatomiche distinte all'interno della regione testa e del collo, tra cui la mucosa orale, lingua, pavimento della bocca, cavità nasale, cavità orale, faringe, orofaringe e ipofaringe. Inoltre, la regione del collo e della testa è altamente vascolarizzata e contiene quasi la metà di tutti i linfonodi nel corpo3. Maggior parte degli studi che studiano la biologia dei tumori testa e collo si basano su modelli di tumore della regione di fianco. Tali modelli in grado di offrire comprensione nei meccanismi intrinseci del tumore, ma la mancanza del microenvironment del nativo di testa e del collo possa influenzare notevolmente il potenziale traslazionale di tali risultati. Un metodo che è stato utilizzato per indurre tumori orali è attraverso l'esposizione all'agente cancerogeno 9,10-dimetil-1,2-benzanthracene (DMBA)4. Tuttavia, questo metodo è associato con un processo lungo, induce i tumori in ratti e criceti, ma non nei topi, e i tumori risultanti non possiedono molte delle caratteristiche istologiche di differenziata SCCs5,6. L'introduzione del carcinogen4-nitroquinoline 1-ossido (4-NQO), un derivato chinolonico solubile in acqua, ha provocato tumori orali del mouse quando applicato per via orale, ma anche sofferto di lunghi tempi di esposizione (16 settimane) e un numero limitato di prendere tasso all'interno e tra i lotti di topi7,8,9. Al fine di sviluppare modelli clinicamente rilevanti, diversi gruppi utilizzati modelli geneticamente ingegnerizzati che coinvolgono la manipolazione dei driver oncogeni o geni soppressori del tumore, tra cui TP53, TGFB, KRAS, HRA e SMAD410. Questi modelli possono offrire comprensione nei tumori con geni noti driver ma non ricapitolare la complessa eterogeneità di HNSCCs umano.
In questo lavoro, dimostriamo la possibilità di effettuazione di un'inoculazione intramucosal delle cellule di carcinoma di cellule squamous nei topi. Cellule inoculate sviluppano in tumori aggressivi entro 1 settimana dall'iniezione. Simile a HNSCCs umana, i tumori riprodurrsi per metastasi ai linfonodi regionali. Ci caratterizzano le caratteristiche istologiche e cliniche della malattia e consentono di comprendere il microambiente tumorale immuni. Proponiamo che questo modello ortotopico di HNSCC ha applicazioni nella biologia del cancro, immunologia dei tumori e studi preclinici. Meccanismi di evasione immune, progressione del tumore, resistenza al trattamento e le metastasi rappresentano aree di rilevanza clinica che possono essere affrontate utilizzando il modello proposto.
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Protocol
Animale tutte le procedure sono state eseguite in conformità con un approvato istituzionale animale cura e uso Comitato (IACUC) protocollo della University of Colorado Denver (protocollo n. 00250).
1. tumore coltura cellulare
Nota: B4B8 e LY2 linee cellulari sono state utilizzate per generare tumori HNSCC ortotopico: B4B8 cellule del tumore sono stata derivate da cheratinociti della mucosa cancerogeno-trasformate (da topi BALB/C)11. LY2 cellule del tumore sono state derivate dalle metastasi di linfonodo di un12,di linea (Pam 212) del keratinocyte spontaneamente trasformata BALB/C13. Entrambe le linee cellulari sono state gentilmente concesse da Dr. Nadarajah Vigneswaran (UTHealth, Houston, TX, USA).
- Uso Dulbecco per volta medium (DMEM) F/12 di Eagle completato con 10% siero bovino fetale (FBS) e 1% reagente antimicrobica per la manutenzione di linea cellulare. Mantenere queste linee cellulari in una sterile incubatore a 37 ° C e 5% CO2. Le cellule devono essere utilizzate per l'inoculazione prima superiore a 15 passaggi.
- Piastra di 2 x 106 a 4 x 106 cellule in matracci di cultura cellulare2 175 cm.
Nota: Garantire le cellule sono meno di 90% confluenti per evitare di indurre una risposta allo stress. - Quando le cellule sono 70% confluenti (~ 48 h), togliere il matraccio dall'incubatrice e lavare le cellule 3 x con freddo tampone fosfato salino (PBS).
- Staccare le cellule dal pallone utilizzando 0,25% tripsina, abbastanza per coprire la superficie della piastra.
- Per effettuare questa operazione, dispensare 4 mL di tripsina in un pallone da2 175 cm contenente il 70% di cellule confluenti. Incubare le cellule con tripsina per 3 – 4 minuti nell'incubatrice di coltura cellulare a 37 ° C e 5% CO2.
- Visualizzare le cellule al microscopio per garantire il distacco delle cellule.
- Aggiungere 12 mL di DMEM F/12 supporti contenenti FBS per neutralizzare l'attività della tripsina.
- Aspirare la sospensione cellulare e metterlo in una provetta conica da 50 mL.
- Agitare la provetta contenente le cellule capovolgendo la x-4 3 x.
- Facoltativamente, mescolare un'aliquota di 10 µ l di sospensione cellulare con 10 µ l di tripan blu in una provetta da microcentrifuga e contare le celle utilizzando un emocitometro. Determinare la vitalità cellulare sottraendo il numero di celle di Trypan-blu-positivo dal numero totale delle cellule e dividere per il numero totale di cellule.
- Centrifugare la sospensione cellulare a 300 x g per 5 min a 4 ° C.
- Risospendere le cellule in DMEM privo di siero e senza antibiotico ad un volume adatto affinché 1 x 106 cellule sono presenti in 50 µ l di media.
Nota: Basato sull'aggressività di linea cellulare in vivo (determinato empiricamente), 1 x 106 cellule per sito di inoculo per topo è stato ritenuto appropriato per le cellule B4B8 e LY2. - Collocare il flaconcino contenente la sospensione cellulare su ghiaccio.
- Inserire la matrice della membrana basale pre-scongelati sul ghiaccio.
Nota: La matrice della membrana basale è stata scongelata durante la notte a 4 ° C.
2. cellula iniezione nei topi
- Preparare una miscela 1:1 della matrice della membrana di cellule: seminterrato (50 µ l).
- Aggiungere le celle prima; poi, gradualmente dispensare la matrice della membrana basale. Evitare di introdurre bolle d'aria. Assicurare che la miscela è fatta immediatamente prima dell'iniezione degli animali. Aggiunta di cellule alla matrice della membrana basale per un periodo prolungato di tempo può comportare nella cella ambientando la miscela di matrice, che rende la miscela difficile da scuotere rigorosamente. Ciò causerà una considerevole variabilità nel formato di tumore fra i topi.
- Mescolare delicatamente. Garantire tutti i passaggi che coinvolgono matrice vengono eseguiti sul ghiaccio. Matrice della membrana basale polimerizzerà a temperatura ambiente.
- Preparare siringhe per inoculazione.
- Caricare siringhe da insulina 0,5 mL (23 G) con 100 µ l della soluzione di matrice di membrana cellulare/seminterrato.
- Tenere le siringhe sul ghiaccio per evitare una polimerizzazione di matrice della membrana dello scantinato.
- Anestetizzare topi inserendoli in una camera con isoflurano e ossigeno (2,5%).
- Assicurarsi che i topi sono anestetizzati prima di eseguire l'iniezione (assicurando una mancanza di risposta a un pizzico di punta).
- Inserire l'ago nella regione buccale destra o sinistra. Questo avviene attraverso lo spazio aperto disponibile su entrambi i lati della bocca.
- Accertarsi che la linguetta del mouse non è nel modo.
Nota: È facile a ficcare la lingua, che si tradurrà in tumori di lingua. Se necessario, spostare la linguetta sul lato opposto. - Tenere la siringa parallelo alla regione buccale mentre all'interno della cavità orale.
- Quando si è pronti a iniettare, tirare indietro la siringa e inserire lentamente la siringa con un'angolazione di 10°.
- Iniettare 100 µ l della sospensione di matrice di membrana cellulare/seminterrato per un periodo di 5 s.
- Tenere la siringa in posizione per un ulteriore 5 s affinché tutto il materiale viene iniettato.
Nota: Per topi di controllo nontumor-cuscinetto, iniettare una miscela dei media privo di siero e matrice (come descritto sopra) senza le cellule del tumore. - Estrarre delicatamente la siringa.
- Continuare la procedura di cui sopra con i topi restanti.
- Consentire per 1 settimana fino a quando i tumori cominciano ad apparire grossolanamente (50 – 200 mm3 per le cellule B4B8 e LY2).
3. Mouse monitoraggio
- Eseguire la prima misurazione utilizzando pinze a 1 settimana dopo l'iniezione di cellule del tumore. Al fine di calcolare il volume del tumore usando pinze esterne, determinare il più grande diametro longitudinale (lunghezza) e il più grande diametro trasversa (larghezza) e utilizzare le modificate in formula ellissoidali14,15.
- Continuare a eseguire misurazioni regolari pinza per volume del tumore (x-2 1x a settimana a intervalli regolari).
- Misurare il peso dell'animale per valutare gli effetti della crescita del tumore sull'alimentazione.
4. tumori di raccolta
- Quando viene raggiunto l'endpoint sperimentale, eutanasia degli animali mediante misure adeguate (ad es., CO2 asfissia, decapitazione o dislocazione cervicale).
Nota: In questo studio, l'endpoint è stato raggiunto se i topi divennero moribondi (con una perdita di peso > 15% del loro peso iniziale, una mancanza di governare, cachessia) e/o se le dimensioni del tumore ha raggiunto 1.000 mm3. -
Iniziare la dissezione animale creando una lunga incisione attraverso la linea mediana nella regione del collo.
- Utilizzare forcipe smussato per afferrare la pelle e forbici per tagliare la pelle affilate.
- Inserire le forbici delicatamente sotto la pelle che copre il tumore e creare sacche d'aria spingendo le forbici attraverso e nella pelle.
- Una volta che la pelle è sufficientemente distaccata dal tumore, identificare il linfonodo drenante (DLNs) ed asportare loro per evitare che il tessuto del tumore confuso dalla presenza di linfonodi.
Nota: Tumori di grandi dimensioni possono raggiungere e/o coprire il DLN. A seconda del tipo di analisi viene eseguita, l'isolamento dei linfonodi intatti è essenziale per evitare gli schizzi delle cellule immunitarie nel tumore, che si tradurrà in distorsione dei risultati di analisi. - Tagliare i bordi del tumore fino a quando si stacca l'intero volume.
5. tumore elaborazione per applicazioni a valle
- Per l'esame istologico a valle, è possibile posizionare i tumori in formalina al 10% a temperatura ambiente. Per evitare overfixation, sostituire la formalina con etanolo al 70%. Per l'analisi di citometria a flusso, è necessario elaborare i tumori come descritto di seguito.
Nota: Il tessuto può essere mantenuto in formalina per 72 h prima overfixation può diventare problematico per alcuni tipi di colorazione. - Tagliare il tumore in 1-2 mm-dimensioni pezzi usando una lama di rasoio sterile o forbici affilate.
- Mettere i pezzi di taglio del tumore in una provetta conica da 50 mL con collagenasi III (4.250 unità per esempio), dnasi I (0,1 mg / campione) e inibitore della tripsina (1 mg per campione).
- Incubare a 37 ° C per 30 min con agitazione ogni 10 min.
Nota: I campioni possono essere inseriti in un sacchetto richiudibile, sterilizzati con 90% di etanolo e collocato in un'incubatrice di coltura cellulare. - Dopo 30 min, aggiungere 20 mL di Hank equilibrata soluzione salina (HBSS) e spin a 300 x g per 5 min.
Nota: HBSS è composto di cloruro di potassio, cloruro di sodio, bicarbonato di sodio, sodio fosfato bibasico, sodio fosfato monobasico e glucosio. - Eliminare il supernatante e risospendere il pellet in 2 – 3 mL di tampone di lisi di globuli rossi (RBC). Pipettare rigorosamente.
Nota: Buffer di lisi RBC è composto di cloruro di ammonio, bicarbonato di sodio e disodico. - Incubare per 2 min a temperatura ambiente.
Nota: Incubazione più lungo può essere tossico per altre popolazioni cellulari. - Aggiungere 20 mL di HBSS per neutralizzare l'effetto di tampone di lisi.
- Centrifugare a 300 x g per 5 min e scartare il surnatante.
- Risospendere il pellet in 10 mL di HBSS.
- Filtrare la soluzione attraverso un restrainer di nylon 70 µm e centrifugare a 300 x g per 5 min, scartare il surnatante.
- Ripetere i passaggi da 5,8 – 5,10 e passare la sospensione cellulare attraverso un dispositivo di ritenuta nylon 40 µm per garantire che eventuali detriti aggiuntivo viene rimosso dalla sospensione.
6. cella macchiatura e acquisizione dati
- Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di HBSS.
- Contare le celle utilizzando un emocitometro o un contatore di cellule automatizzato, come descritto al punto 1.7
-
Determinare il numero totale delle cellule e la concentrazione appropriata per la colorazione.
Nota: la concentrazione cellulare ideale per la colorazione di citometria a flusso è 1 milione di cellule. Ad esempio, se la colorazione viene eseguita in una piastra a 96 pozzetti e ci sono 10 milioni di cellule, risospendere il campione in 1 mL e piastra 100 µ l per 1 milione cellule per pozzetto. -
Aggiungere blocco Fc (CD16/CD32) ad una concentrazione di 1: 100 per impedire il legame di nonantigen specifico delle immunoglobuline ai recettori FcγIII e FcγII. Incubare per 5 min a temperatura ambiente.
- Centrifugare e risospendere il pellet cellulare in 100 µ l di tampone di colorazione cellulare di citometria a flusso (composto contenente 5% FBS, EDTA 2% e 1% di soluzione salina HEPES).
-
Eseguire la superficie cellulare colorazione secondo le istruzioni fornite dal fornitore (aggiungendo ogni anticorpo la diluizione appropriata). Incubare per 60 min a temperatura ambiente.
- Centrifugare e risospendere il pellet cellulare in 100 µ l di HBSS. Ripetere 2x per sbarazzarsi dell'anticorpo in eccesso.
-
Eseguire gli esempi su un citometro a flusso appropriato.
- Se l'analisi di marcatori intracellulari (ad es., foxp3), eseguire permeabilizzazione delle cellule e la macchiatura secondo le istruzioni del fornitore.
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Representative Results
La valutazione in vitro di proliferazione delle cellule LY2 e B4B8 hanno dimostrato che entrambe le linee cellulari hanno simili tempi di raddoppiamento (21 e 23 h, rispettivamente). In vivo, entrambe le linee cellulari formano una massa unica, visibile e palpabile entro 1 settimana dall'inoculazione (Figura 1A). In topi che sopportano i tumori LY2, la mascella è stata spostata da 3 settimane a causa del carico del tumore (Figura 1A). I topi di controllo che non hanno ricevuto le cellule del tumore non hanno sviluppato i tumori come anticipato. LY2 tumori è cresciuta ad un tasso più elevato rispetto ai tumori di B4B8. Il volume medio del tumore il giorno 21 in LY2 topi del tumore-cuscinetto era 632 ± 10 mm3 rispetto a 162 ± 4 mm3 nei tumori B4B8 (Figura 1B). Topi espositrici spostamento mascella rapidamente hanno sviluppato la perdita di peso a causa di disfagia (Figura 1). Topi che esibiscono significativo peso perdita definita come > 15% del loro peso iniziale e/o aventi un volume del tumore di > 1 cm3 sono stati eutanasizzati entro 1 giorno dell'osservazione noto. La sopravvivenza mediana in topi LY2 era 22,5 giorni, rispetto ai giorni 52,0 nei topi del tumore-cuscinetto di B4B8 (Figura 1).
La formazione immagine a risonanza magnetica (MRI) di topi del tumore-cuscinetto ha mostrato i tumori bene-delimitati che si estende nello strato interno della mucosa orale (Figura 2A). I tumori non hanno invaso in lingua o altri organi vicini (esofago, Bronco, timo), come illustrato con la valutazione istologica. Eterogeneità di segnale sulle immagini di MR era rappresentante della presenza di regioni del hyperintense vascularized (indicate con V) e hypointense necrotico (indicata con N) (Figura 2A). Un esame patologico lordo ha mostrato DLNs allargata (Figura 2B). Abbiamo valutato ulteriormente il volume del tumore con tomografia computata (CT) per stabilire l'affidabilità delle misurazioni pinza. I tumori sono stati delineati utilizzando un digital imaging e comunicazione in medicina (DICOM) immagine analisi software16. Valutazione del volume del tumore LY2 di pinze e formazione immagine di CT ha mostrato un'ottima correlazione tra i due metodi (R2 = 0.8493; Figura 2). Questo indica che la crescita del tumore è principalmente exophytic e pinza misura è un metodo affidabile per la valutazione della crescita del tumore. L'esame istologico ha mostrato che tutti i topi del tumore-cuscinetto LY2 sviluppati scarsamente differenziano carcinoma di cellule squamous (Figura 2D). Nove su nove LY2 topi del tumore-cuscinetto sviluppati metastasi ai linfonodi echelon di primo e secondo. Le metastasi nodali erano principalmente subcapsulare (con sette dei nove topi) e all'interno dei seni (con cinque dei nove topi), con due su nove topi intracapsular'invasione. Al contrario, topi che sopportano i tumori B4B8 sviluppati moderatamente differenziano carcinoma di cellule squamous (Figura 2E) e non ha fatto riprodurrsi per metastasi ai siti regionali o distanti, compresi DLNs. necrosi è stata valutata basato su un precedentemente stabilito tre gradi Scala: 0 non = nessuna necrosi visibile, 1 = scarso, 2 = moderato e 3 = grave17. Tutti i topi del tumore-cuscinetto LY2 avevano confermato istologicamente necrosi con la maggioranza (sette su dieci) dimostrando da moderata a grave necrosi (Figura 2F). Nessuna prova di necrosi è stata osservata nei tumori di B4B8.
Ci siamo concentrati sul modello del tumore LY2 per ulteriore caratterizzazione del microambiente del tumore-immunitario. I tumori sono state raccolte a 3 settimane dopo l'inoculazione del tumore e digerito usando collagenosi III, seguita dalla colorazione della superficie delle cellule e marcatori intracellulare per massa/flusso cytometry (Figura 3A). I campioni sono stati trattati, utilizzando un citometro a massa, presso la University of Colorado Denver flusso Cytometry Shared Resource. Gating e analisi dei dati sono state effettuate utilizzando il software commerciale di citometria a flusso. I dati ottenuti hanno mostrato la presenza di numerose popolazioni di cellule immuni a vari gradi. Totale di cellule del sistema immunitario (CD45+) hanno rappresentato il 7,3% del tumore totale (Figura 3B). In termini assoluti, abbiamo osservato, in media, 26 CD45+ cellule (SD = 0,81) per milligrammo di tessuto tumorale (Figura 3B). Le cellule mieloidi (CD11b+) rappresentato 37,8% di CD45 tutte le cellule di+ (Figura 3). Le cellule mieloidi erano in gran parte composto da macrofagi (F4 / 80 +, 63,0%), seguita da cellule mieloidi-derivato del soppressore (MDSC) (Gr1 +, 8,51%) e neutrofili (Ly6G +, 5.87%). Cellule di T totali composto da 15,9% di CD45 le con CD4 cellule+ + T le cellule che compongono la maggioranza di tutte le cellule di T (79,4%), di cui 53,4% erano normativo (Treg) di cellule di T (CD4+FoxP3+) (Figura 3D). Cellule natural killer (NK) composto da 1,75% di tutti i CD45+ cellule. Questi dati evidenziare la presenza di vari immunitario si infiltra in LY2 orthotopic tumori HNSCC che probabilmente svolgono un ruolo nel mediare la progressione del tumore ed evasione immune.
Figura 1: monitoraggio topi cuscinetto ortotopico HNSCC tumori. (A) immagini rappresentative dei topi del tumore-cuscinetto. L'inoculato buccale si sviluppa un tumore entro 1 settimana dall'inoculazione. A 3 settimane, spostamento della mascella è osservato. (B) Tasso di crescita del tumore in B4B8 e LY2 topi del tumore-cuscinetto come determinato tramite le misure di pinza. (C) cambiamenti nel peso corporeo dei topi che sopportano i tumori B4B8 o LY2. (D) sopravvivenza di B4B8 e LY2 topi del tumore-cuscinetto. Le barre rappresentano l'errore standard della media (SEM) dei topi di 7 – 10 per ogni gruppo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: caratteristiche di Imaging ed istologiche dei tumori murini HNSCC. (A) immagine rappresentativa della corona signor mouse LY2 del tumore-cuscinetto. Le sedi anatomiche sono etichettate. Aree di iperintensità di segnale rappresentano regioni vascolarizzate (indicato con V). Regioni di ipointensità di segnale rappresentano zone necrotiche (indicare N). (B) immagine lordo rappresentativa di una regione dissecata tumore-contenente. Frecce bianche scegliere ingrossamento dei linfonodi drenanti (DLNs). (C) correlazione del volume del tumore come valutata tramite la misura della pinza contro la tomografia computata (CT)-ha basato la valutazione. Slope, coefficiente di correlazione (R2) e la retta di regressione sono mostrati. (D) ematossilina ed eosina (H & E) immagine rappresentativa del tumore LY2. (E) rappresentante H & E immagine del tumore B4B8. (F) quantificazione di necrosi nei tumori LY2, basato su un H & E quattro-grado sistema di punteggio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: analisi delle popolazioni immuni di baseline intratumoral usando cytometry di tempo di volo (CyTOF). Tumori sono stati trasformati in una cella singola sospensione tramite digestione enzimatica basata su collagenosi e, quindi, macchiati con marcatori di superficie e intracellulari di cella. (A) citometria a massa è stato effettuato usando la piattaforma di CyTOF. (B) assoluta e relativa valutazione quantitativa delle cellule immuni totale (CD45+). (C) quantificazione delle sottopopolazioni mieloidi-immunitario. (D) quantificazione delle sottopopolazioni immuni linfoide. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Rigorosa analisi e caratterizzazione del microambiente tumorale rappresentano una strategia importante per comprendere i meccanismi di sviluppo del tumore, la progressione e la metastasi e per lo sviluppo di terapie efficaci. Cancro del collo e della testa è una malattia complessa che può avere origine da sedi anatomiche multiple all'interno della regione del collo e della testa. Dei principali ostacoli alla comprensione dei meccanismi di malattia e migliorare la terapia è stata una mancanza di linee cellulari murine del mouse che ricordano la natura aggressiva e metastatica della HNSCCs umana. Inoltre, numerosi modelli murini impiegano un impianto sottocutaneo dei tumori che mancano importanti caratteristiche fisiologiche della regione testa e del collo, tra cui un'alta densità vascolare, un vasto sistema vascolare linfatico e flora residente della mucosa.
In questo studio, abbiamo caratterizzato un modello ortotopico di HNSCC murino. Abbiamo scelto il mucosa orale come il sito di inoculazione del tumore per una serie di motivi, compreso l'accesso facile alla regione senza la necessità di Consiglio di immagine, la capacità di valutare la crescita del tumore usando pinze, la presenza del tumore all'interno della flora della mucosa, la presenza di vasi linfatici circostanti e la facilità di riproducibilità. Anche se l'iniezione di cellule nella mucosa orale è semplice, il posizionamento dell'ago e la profondità di penetrazione sono fondamentali per evitare la puntura attraverso la pelle e garantire le cellule non sono iniettate per via sottocutanea. Si consiglia di inserire l'ago per via intra-orale mentre è perfettamente parallelo alla regione buccale e inclinazione ad un angolo non supera a 10 ° quando si è pronti a iniettare.
Le linee cellulari che abbiamo utilizzato erano linee murine permettendo loro l'impianto in topi immunocompetenti del ceppo da che sono stati derivati. Ci sono oltre 39 linee cellulari umane di HNSCC che sono stati studiati nella letteratura, ma non possono essere utilizzati in presenza di un microambiente nativo18. Recenti sviluppi ammessi per la progettazione di modelli murini umanizzati che integrano chimere di osso-zucchino-derivate umane in topi NOD scid gamma (noto anche come topi NSG), permettendo lo sviluppo di un sistema immunitario umano che possono interagire con tumori umani in un del mouse immunodeficienti modello19. Tuttavia, tali modelli sono costosi, richiedono metodi di allevamento laborioso e non ricapitolare tutte le componenti del microambiente tumorale, tra cui vasi linfatici, fibroblasti e cellule endoteliali. I modelli murini del mouse che abbiamo impiegato in questo studio ricapitolano componenti critici della HNSCCs umana, compresa la presenza di vari immuni si infiltra in. Per garantire il massimo recupero di singole cellule vitali da tumori, l'uso degli enzimi di digestione è necessario. Gli enzimi di digestione della collagenosi-basato possono essere duri sulle cellule e l'ottimizzazione della concentrazione e tipo di collagenasi può essere necessaria per i tipi differenti del tumore. Abbiamo confrontato cinque enzimi di digestione prima di determinare che collagenosi III, che è stato usato in questo studio, è il metodo ottimo per la digestione dei tumori a cellule squamose.
I modelli di tumore utilizzati in questo studio sono particolarmente utili per studiare meccanismi di evasione immune HNSCC e valutazione preclinica di varie terapie. Abbiamo precedentemente dimostrato che sia B4B8 e LY2 tumori sono radioresistenti e refrattario al checkpoint immuni inibitore anti-PD-L120. Ciò è coerente con la maggior parte delle HNSCCs umane. Recenti studi clinici hanno dimostrato che meno del 15% dei pazienti HNSCC rispondono alla terapia anti-PD-1/PD-L121,22,23,24,25. Inoltre, è assodato che HNSCCs sono radioresistenti26,27. Targeting per vie responsabili radioresistenza in HNSCC è un passo importante per migliorare la risposta al trattamento. Il punto di riferimento Bonner et al., lo studio ha mostrato un beneficio significativo nella sopravvivenza globale con l'aggiunta di cetuximab rispetto al solo localmente avanzato HNSCC pazienti28RT RT. Dati recenti dimostrano che l'inibizione di EphB4-Efrina-B2 segnalazione in orthotopic HNSCCs può ulteriormente migliorare la risposta a RT o cetuximab-RT promuovendo l'apoptosi tumore ed inibendo la proliferazione del tumore29,30. Inoltre, combinando RT con terapie immunitarie razionale può aumentare le risposte immunitarie antitumorali e migliorare il controllo locale del tumore e il controllo di metastasi distanti31. Recentemente abbiamo dimostrato che targeting Treg in combinazione con blocco checkpoint immuni e RT provoca estirpazione del tumore e memoria immunologica32. Gli studi futuri che impiegano modelli ortotopici di HNSCC meglio informare la progettazione di studi clinici e migliorare la comprensione dei meccanismi di evasione immune tumore e resistenza al trattamento.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Nessuno
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase III | Worthington Biochemical Corp. | LS004183 | |
| DNase I | Worthington Biochemical Corp. | LS006328 | |
| Fc Block (CD16/32) | BD Biosciences | 553141 | Clone 2.4G2 |
| Flow Cytometry Staining Buffer | eBioscience | 00-4222-26 | |
| HBSS | ThermoFisher Scientific | 14175079 | no calcium, no magnesium, no pheno red |
| Helois mass cytometer | Fluidigm | NA | |
| Matrigel membrane matrix | Corning | CB-40234B | |
| MRI Scanner | Bruker | NA | 7.4 Tesla |
| RBC lysis buffer | BioLegend | 420301 | |
| Trypsin inhibitor | Worthington Biochemical Corp. | LS002830 |
References
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