Summary
In vitro fertilisering er en almindeligt anvendt teknik med en række model organismer til at opretholde Lab populationer og producere synkroniserede embryoner til downstream-applikationer. Her præsenterer vi en protokol, der implementerer denne teknik til forskellige populationer af den mexicanske Tetra fisk, Astyanax mexicanus.
Abstract
Astyanax mexicanus er ved at dukke op som en model organisme for en række forskningsområder inden for biologisk videnskab. En del af den nylige succes med denne teleost fiskearter er, at det besidder interfertile hule og flod-bolig populationer. Dette muliggør genetisk kortlægning af arvelige træk, der blev fastsat under tilpasningen til de forskellige miljøer af disse populationer. Mens denne art kan opretholdes og opdrættes i laboratoriet, er det udfordrende at både få embryoner i dagtimerne og skabe hybrid embryoner mellem stammer. In vitro fertilisering (IVF) har været anvendt med en række forskellige model organismer til succes og gentagne gange opdrætte dyr i laboratoriet. I denne protokol viser vi hvordan, ved at akklimatisisere A. mexicanus til forskellige lyscyklusser kombineret med ændringer i vandtemperaturen, kan vi skifte avls cyklusser til et valgt tidspunkt på dagen. Efterfølgende viser vi, hvordan man identificerer egnede FORÆLDREFISK, indsamler sunde kønsceller fra mænd og kvinder og producerer levedygtige afkom ved hjælp af IVF. Dette gør det muligt at finde relaterede procedurer såsom injektion af genetiske konstruktioner eller udviklingsanalyse i normal arbejdstid. Desuden kan denne teknik bruges til at skabe hybrider mellem hulen og overflade-bolig populationer, og dermed gøre det muligt at studere den genetiske basis for fænotypiske tilpasninger til forskellige miljøer.
Introduction
I de seneste år, Astyanax mexicanus er blevet en model organisme i forskellige områder såsom udviklingsmæssige biologi, evolutionær biologi, adfærdsmæssige biologi, og fysiologi1,2,3,4 . Det unikke ved dette system kommer fra denne art, der har flere morfotyper, der har tilpasset til meget forskellige miljøer. Overfladen bolig morfotype bor i floder, hvor der er høj biodiversitet og masser af fødevarer kilder til fisken. I modsætning hertil, hulen morfotyper af A. mexicanus, cavefish, bor i huler, hvor biodiversitet, fødekilder, og ilt er drastisk formindsket1. Cavefish adskiller sig fra overfladen fisk i en række af fænotyper såsom fravær af øjne og pigmentering, insulinresistens, og evnen til at opbevare fedt2,3,4. Men overflade fisk og hule fisk tilhører stadig de samme arter og er derfor forstyrrende.
For begge morfotyper er der defineret et sæt betingelser, der muliggør rutinemæssig vedligeholdelse og avl under laboratorieforhold5,6. Imidlertid er genetiske modifikationer, egentlige embryonale udviklingsstudier og skabelse af hybrider stadig udfordrende af flere årsager. A. mexicanus Spawn primært i nattetimerne, hvilket er ubelejligt for efterfølgende eksperimenter på tidlige embryonale stadier såsom injektion af genetiske konstruktioner eller overvågning af tidlige embryonale udviklingsmæssige processer. Desuden er generering af overflade-og hule hybrider udfordrende ved hjælp af naturlig gydning, da hulen morfotyperne har en ændret døgnrytme7 , som i sidste ende påvirker produktionen af levedygtige æg. Vellykkede, men invasive, IVF procedurer er blevet beskrevet for andre Astyanax arter, hvor gamet produktion og gyde adfærd blev primet ved hjælp af hormonelle injektioner8,9. Mindre invasive IVF-procedurer (dvs. opnåelse af gameter fra manuel gydning uden injektion af hormonelle præparater) er blevet beskrevet, men mener ikke, at forskellene i gyde cyklussen mellem hule og overflade morfotyper af A. mexicanus 6.
Andre fisk model organismer, såsom zebrafish, kan nemt blive genetisk modificeret og undersøgt på et foster niveau, fordi de ovenfor anførte forhindringer er blevet løst. Gennemførelse af standardiserede avlsteknikker, in vitro befrugtning, og sperm kryopræservering har alle skubbet Zebra frem og solidificeret modellens anvendelse i biologisk videnskab10. Derfor, udvide disse teknikker til en. mexicanus vil yderligere styrke det som et model system.
Her præsenterer vi en detaljeret protokol for IVF, der vil bidrage til at gøre en. mexicanus mere tilgængelig. Vi vil præsentere en avl setup, der gør det muligt at flytte lysets cykler af fiskene fra dagtimerne til natten, så levedygtige æg kan opnås i løbet af dagen timer uden injektion af hormonelle præparater. Vi giver derefter en detaljeret beskrivelse af, hvordan man får de æg og milt, der anvendes til IVF. Denne metode vil gøre det muligt at fremstille embryoner i normal arbejdstid og gøre yderligere downstream-anvendelser mere gennemførlige sammenlignet med anvendelse af embryoner fra naturlig gyde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder, der er beskrevet her, er blevet godkendt af Udvalget for institutionel dyrepasning og-anvendelse (IACUC) for Stowers Institute for Medical Research.
1. let cyklus manipulation
- Sæt Fisketanke i et uigennemsigtigt, fuldt lukket (lysbeskyttelse), gennemstrømnings-akvakultur system, der indeholder flere rækker af tanke (figur 1).
Bemærk: gennemstrømnings systemet, som vist i figur 1 , bruger system vand til at skylle affald gennem den bageste stå rør af hver tank og strømmer ind i en sump, der tømmer ind i en sanitære afløb. I dette eksperiment, en vand vekselkurs på en gallon (US) per time gennem en dryp emitter blev brugt. - Bevar temperaturen af hver tank med et uafhængigt varmeelement, der bruges til manuelt at ændre temperaturen under priming processen.
- Konfigurer individuelle rækker på en måde for at aktivere separate lysperioder i hver. Installer dørene på hver række, der kan lukkes for at forhindre lys i at trænge ind eller ud.
Bemærk: den automatiserede controller kan aktivere manipulation af alle lysperioder med mindst forstyrrelse af fisken. - Udstyre stativet med en rød Arbejdslampe og mørklægningsgardiner for adgang i mørke timer.
2. justering af fotoperioden og priming fisk til gamet kollektion
- Fjern den ønskede fisk (figur 2a) fra generelle system stativer og Placer dem i avls stativer for at muliggøre justering af foto operioden 14 dage før priming.
Bemærk: Dette gør det muligt for fiskene at akklimatisere til et nyt miljø. - Opbevar fisken ved 22,8 °C (73 °F) i denne periode ved hjælp af det installerede vand varmesystem. Den normale fotoperiode er fra 6 a.m. til 8 p.m. lys og 8 p.m. til 6 a.m. mørkt. For lyscykel stativet, Skift foto operioden til 10 PM til 12 p.m. lys og 12 p.m. til 10 p.m. mørk ved at justere timeren, der tænder lyset i stativet.
Bemærk: hanner og hunner er anbragt i samme tank for at give mulighed for naturlig priming adfærd at finde sted. Mens Gydningen kan finde sted i tanken, fisk kan stadig bruges til in vitro-befrugtning, da kønsceller frigives i etaper11. - Når fiskene er akklimatiseret, skal du begynde at prikke dyrene til gyde5 som beskrevet i trin 2.3.1 til 2.3.5.
Bemærk: denne procedure tager seks dage i alt. I løbet af denne tid, ændre temperaturen til Prime OVA produktion ved hjælp af en installeret vand varmesystem. Ved hjælp af 50W vandvarmere (Se tabel over materialer), indstille varmelegeme direkte til temperaturen (skala på varmelegeme er i Fahrenheit) givet i protokollen på hvert trin. Afhængigt af størrelsen af tanken og gennemstrømningshastigheden af vandet, kan tidspunktet for temperatur justering variere. I dette eksperiment blev temperaturen justeret ved middagstid, og temperaturligevægt overtog de næste 18 timer.- På dag 1, hæve temperaturen fra 22,8 °C (73 °F) til 24,4 °C (76 °F).
- På dag 2, hæve temperaturen fra 24,4 °C (76 °F) til 26,1 °C (79 °F).
- På dag 3 og 4 skal temperaturen holdes ved 26,1 °C (79 °F). Fisk vil være klar til at gyde i løbet af dagen og IVF kan udføres.
Bemærk: afhængigt af den enkelte fisk kan hunnerne spawne på dag 3 og/eller dag 4. Vi anbefaler at forsøge at få OVA på dag 3 og/eller dag 4 afhængigt af succesen med OVA-kollektionen. - På dag 5, Sænk temperaturen fra 26,1 °C (79 °F) til 24,4 °C (76 °F).
- På dag 6 sænkes temperaturen fra 24,4 °C (76 °F) til 22,8 °C (73 °F).
Bemærk: Giv en 7-dages kløft, før du gentager denne temperaturcyklus. Det anbefales at fortsætte med at holde fiskene i denne fotoperiode, da dette vil reducere den samlede tid, som fiskene har brug for at tilpasse sig denne ændrede lyscyklus.
3. kvindelig gamet kollektion
- Begynd med at indsætte en fugtet vævs serviet i en Petri skål og luk skålen for at oprette et befugtet kammer, og undgå, at æg tørrer ud under indsamlingsprocessen.
- Vælg derefter en kvindelig til indsamling. Gravid fisk med store, fremspringende mave vil sandsynligvis være det bedste valg for denne procedure (figur 2a).
Bemærk: for at skelne mellem mænd og kvinder af voksne A. mexicanus, bomuld kugle metoden blev brugt12. - Immobilize en kvinde ved hjælp af kølet vand og placere hende i liggende position i en fugtet svamp dyr holder. Gøre det ved at placere fisken i 4 °c system vand i mindst 30 s eller indtil fiskene er immobiliseret (dvs. tab af Gill bevægelse, se Ross og Ross13 for detaljer).
Bemærk: Arbejd hurtigt og prøv at undgå at varme fiskene, indtil proceduren er afsluttet. Dette kan omfatte periodisk dyppe de dykkede spidser af fingrene i koldt vand eller tilbyde supplerende anæstesi. Andre anæstesi metoder (f. eks., MS-22213) kan også anvendes. I henhold til IACUC-retningslinjerne fra Stowers Institute for Medical Research betragtes manuel opsamling af æg som en ikke-invasiv procedure, som ikke kræver fuldstændig anæstesi (f. eks. gennem MS-222). - Når den er placeret, skal du blot fjerne den ventrale side af fisken med en delikat vævs serviet, da kontakt med vand vil få OVA til at aktivere.
- Hold kvinden mellem tommelfingeren og pegefingeren. Klem forsigtigt mod de laterale sider af det coelomic hulrum i retning af urogenitale åbningen, mens du ruller fingrene lidt. Saml den udtrykte æg ved hjælp af en engangs spatel.
- Overfør disse æg til den befugtede Petri skål.
Bemærk: flere koblinger af æg kan kombineres i samme skål, hvis der ikke er behov for specifikke slægtskab-data. Æg kan opbevares ved 24 °C og er bedst, når de anvendes til IVF inden for 30-60 min efter opsamling. - Efter indsamling, forsigtigt returnere fisken til en nyttiggørelse tank fyldt med system vand.
Bemærk: Placer fiskene tilbage i mørkt kabinet til fremtidig Ova-kollektion, når det er nødvendigt.
4. mandlig gamet kollektion
- Vælg en mandlig til indsamling.
Bemærk: der er ingen udadtil synlige tegn på mandlig gamet kvalitet. Men, fisk bør fremstå sundt i udseende før brug i denne procedure. At skelne mellem mænd og kvinder af voksne A. mexicanus, bomuld bolden metode blev brugt12. - Immobilize en mandlig ved hjælp af kølet vand og placere ham i liggende stilling i en fugtet svamp dyr holder. Immobilize ved at placere fisken i 4 °C system vand i mindst 30 sekunder eller indtil fiskene er immobiliseret (dvs. tab af Gill bevægelse, se Ross og Ross13 for detaljer).
Bemærk: Arbejd hurtigt og prøv at undgå at varme fiskene, indtil proceduren er afsluttet. Dette kan omfatte periodisk dyppe de dykkede spidser af fingrene i koldt vand eller tilbyde supplerende anæstesi. Andre anæstesi metoder (f. eks., MS-22213) kan også anvendes her. I henhold til IACUC retningslinjerne for Stowers Institute for Medical Research, manuel indsamling af sædceller betragtes som en ikke-invasiv procedure, som ikke kræver fuldstændig anæstesi (f. eks, gennem MS-222). - Blottet den ventrale side af fisken med en delikat væv tørre som kontakt med vand vil aktivere milt.
- Placer forsigtigt enden af et kapillar rør ved den urogenitale åbning.
- Expel milt ved at anvende forsigtigt Tryk på siderne af fisken med tommel-og pegefinger. Start distale til gællerne, bevæger sig mod den urogenitale åbning.
- Saml den milt i slutningen af et kapillar rør. Blid sugning kan være nødvendig ved brug af et indsugnings rør. Undgå afføring, der kan udvises med milt.
- Lad milt løbe ud i et tomt 1,5 mL centrifugeglas, og fortynd med dobbelt så stort som sperm Extender E400 (Se tabel over materialer). Hold på is.
Bemærk: milt fra flere hanner kan samles sammen, hvis der ikke er behov for specifikke slægtskab-data. Dette trin kan bruges til at forlænge arbejdstiden for milt i flere timer, men det er ikke nødvendigt for øjeblikkelig befrugtning. - Efter indsamling, forsigtigt returnere fisken til en nyttiggørelse tank fyldt med system vand.
Bemærk: Placer fiskene tilbage i mørkt kabinet til fremtidig sædindsamling, når det er nødvendigt.
5. in vitro-befrugtning
- Ved hjælp af en ny pipette for hver bestand, bland sædcellerne ved pipettering og/eller agiterer siden af røret, før gødelse som sperm i milt kan bosætte sig i E400 løsning over tid.
- Hæld milt eller forlænget milt-opløsning i den friskindsamlede æg.
- Tilsæt hurtigt 1 mL system vand til koblingen for at aktivere sperm og æg til befrugtning. Undgå at blande eller agitere skålen indhold og tillade 2 min for befrugtning at forekomme.
Bemærk: blande og omrøring i høj grad reducerer gødskning satser og bør derfor undgås14. - Tilføj E2 embryo medier til at fylde skålen 2/3Rd fuld.
Bemærk: afhængigt af den efterfølgende procedure kan embryoner enten anvendes med det samme (f. eks. til injektion af genetiske konstruktioner som beskrevet før15), eller embryoer kan inkuberes i E2-embryon medier ved 23 °c, indtil de når 5 DPF. På dette tidspunkt overføre embryoner til de vigtigste recirkulerende boliger system ved hjælp af system vand.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den protokol, der præsenteres her, er hovedsagelig baseret på en tidligere offentliggjort protokol6. Men da A. mexicanus gyder i nattetimerne, designede vi et rack til opdræt af fisk, der kan ændre fotoperioden uafhængigt af arbejdstid (figur 1). Fiske lysets cyklus ændres inden for et fuldt lukket, gennemstrømnings-akvakultur system, der indeholder tre rækker af tanke (figur 1). Hver tank indeholder et uafhængigt varmeelement, der bruges til manuelt at øge temperaturen under priming processen. Individuelle hylder kan sættes på separate lysperioder og kan lukkes for at forhindre lys i at trænge ind eller undslippe. Alle lysperioder kan manipuleres ved en automatiseret controller placeret på siden af lyscykel stativet. For adgang i mørke timer er stativet udstyret med et rødt arbejds lys og mørklægningsgardiner. A. mexicanus gyder efter en temperaturstigning fra 23-26 °c med en tilvækst på 1,5 °c pr. dag16. For at opnå dette i vores mørke kabinetter brugte vi dykkede akvarie varmere i hver tank (figur 1).
Den vigtigste faktor for en vellykket IVF-procedure i a. mexicanus er kvaliteten af de indsamlede æg. Gravid, kvindelige fisk med store, fremspringende mave er mest tilbøjelige til at frigive levedygtige æg, som synes klart og endda i udseende (figur 2a-d). Tilsætning af de indsamlede milt til sådanne æg resultater i udviklingen af befrugtede embryoner normalt inden for 20-30 min (figur 2E). Levedygtige befrugtede embryoner vil blive lidt mere gennemsigtige, før de kommer ind i den ene celle fase af udviklingscyklussen, mens ubefrugtede æg vil fremstå mere ujævne og uigennemsigtige (figur 2E). Resulterende embryoner holdes i Petri skåle i ZIRC E2 embryo medier og inkuberet ved 23 °C i en 14/10 lys/mørk cyklus. Embryonerne overføres derefter til det primære recirkulerende boligsystem på 5 dage efter befrugtning til opdræt.
For at demonstrere vigtigheden af teknikken viser vi, hvordan fænotypebestemmelse af Hybriderne til specifikke træk såsom øjen størrelse og krops pigmentering kan hjælpe med at dechifrere deres genetiske grundlag. Cavefish adskiller sig klart fra overflade fisk i deres øjen størrelse og krops pigmentering. For at forstå det genetiske grundlag for disse træk, krydsede vi overflade og cavefish (F0) og genererede hybrid F1 og F2 populationer ved hjælp af IVF at observere fænotypiske variation opnået (figur 3). Størrelsen af øjnene er mindre i F1-generationen, hvilket indikerer, at tilstedeværelsen af øjne er en delvist dominerende egenskab (figur 3). I overflade-Cave F2 hybrider, vi får en bred vifte af øjen størrelser, hvilket indikerer, at flere loci at kontrollere øjen størrelse i a. mexicanus, hvilket gør det en kvantitativ træk (figur 3). Et andet eksempel er pigmentering. Observation af F1 hybrid af overflade og hule fisk, kan det konk ges, at krop pigmentering er en dominerende egenskab, da fiskene er fuldt pigmenteret (figur 3). I F2-generationen peger variationen i krops pigmentering igen i retning af et kvantitativt træk. Kombinationen af disse fænotypiske data med sekvensering data kan afsløre underliggende genetisk loci ansvarlig for disse fænotyper. Disse F2-populationer er en god ressource til at forstå det genetiske grundlag for forskellige træk, og sådanne populationer er tidligere blevet brugt til at studere disse træk17,18,19. En standardiseret IVF teknik kan i høj grad strømline genereringen af hybrider, der muliggør genetisk kortlægning af loci kontrol af sådanne træk og hjælpe os med at forstå, hvordan visse fænotyper er ufordelagtige i nogle habitater og adaptiv i andre.
Figur 1 : Design af stativer til Skift dag/nat cyklusser af A. mexicanus. (a) den generelle opsætning af dette racksystem gør det muligt at manipulere med fotoperioden, hvilket giver en simulering af natten i løbet af dagen, når dørene lukkes, og hylde lysene slukkes. (b) priming fiskene for at stimulere æg modning opnås ved hjælp af dykkede varmeapparater (Se tabel over materialer) installeret i individuelle tanke, der kan justeres separat (røde pile). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Eksempler på egnede hunner til opsamling af æg og repræsentativ illustration af levedygtige og urentable æg. (a) gravid, kvindelige fisk med store, fremspringende mave er mere egnet til manuel OVA samling end (b) hunner med en strømlinet formet mave. c) levedygtige æg (dvs. æg, der producerer levedygtige embryoner, når de befrugtede) kan identificeres ved deres klare, selv udseende, mens urentable æg (dvs. æg, der ikke producerer levedygtige embryoner, når de befrugtede), som vist i (d), har en uklar, ujævn Udseende. (e) efter vellykket befrugtning bliver levedygtige embryoner mere gennemsigtige og kommer ind i et celle stadie, mens ubefrugtede æg (røde pile) langsomt vil henfalde. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Genetisk analyse af øjen størrelse og krops Pigmenterings egenskaber. Stamtavle viser billeder af forældre (F0) overflade fisk (øverst til venstre) og cavefish (øverst til højre), F1 hybrider (anden række) og F2 hybrider. F1 fisk har mellemliggende øjen størrelse og er fuldt pigmenteret, mens F2 fisk viser en bred variation i de to morfologiske træk: øjen størrelse og pigmentering. Alle oprindelige data underliggende dette tal kan tilgås fra Stowers oprindelige data repository på http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1365. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mens IVF er en standardiseret metode til mange forskellige model organismer såsom zebrafish, eksisterende protokoller for a. mexicanus tager ikke hensyn til, at denne art naturligt gyder i løbet af natten timer6. I betragtning af at cavefish og overflade fisk afviger ganske drastisk i deres døgnrytme, varierer modnings cyklussen af æg også mellem hulen og overfladen morfotypes. Mens de midlertidige temperaturer og tider for overflade A. mexicanus er godt undersøgt12, cavefish kan afvige i deres gyde adfærd og modning cyklus. Konventionelle metoder til hybrid produktion er derfor meget udfordrende og usikre på grund af tabet af døgnrytme i hulen morphotype af A. mexicanus7, hvilket resulterer i ændrede gyde tider af disse fisk. Ved at flytte fotoperioden kan vi levere tidsspecifikke hybrid embryoner uden at skulle stole på sjældne naturlige gyde hændelser mellem de to morfotyper. At holde hulen og overfladen fisk adskilt forhindrer også aggressive overflade morfer fra at have en negativ virkning på avl.
Nogle begrænsninger findes med denne metode, såsom variationer i OVA kvalitet. Identifikation af en kvindelig (overflade eller cavefish) med modne æg er ikke trivielt og kræver omhyggelig observation af fisk adfærd. Generelt, gravid kvinder klar til gydning har større mave og vil gentagne gange børste mod den nederste tank overflade eller embryo samling fælde20.
Vi bemærkede, at kvaliteten af sperm er konsistent i hele dag/nat cyklus. Det kritiske trin i succesfulde IVF (succes med hensyn til at generere befrugtede embryoner) er at opnå en god kvalitet, levedygtige æg. Derfor er det yderst vigtigt at indsamle æg fra fisk, der er ved at gyde naturligt (figur 2a). Når æg er indsamlet, kan de observeres under et dissektion mikroskop for at undersøge kvaliteten. Indsamlingen af levedygtige æg i løbet af natten, dog, er ubelejligt og udfordrende for forskeren. Opsætningen, som vi præsenterer her, giver mulighed for at flytte den modnings cyklus af æg, så IVF kan bruges til at generere synkroniserede embryoner til downstream ansøgning i normal arbejdstid.
Med udviklingen af kryopræservering af milt (f. eks, som det er beskrevet i Zebra21), IVF vil blive et effektivt redskab til at etablere og vedligeholde genetiske linjer for den nye model system a. mexicanus. I kombination med metoder til genetisk modifikation15 og morpholino-baseret Knockdown17, vil disse procedurer give metodologisk platform til at studere den genetiske og udviklingsmæssige funda-tion af tilpasninger til forskellige habitater i A. mexicanus.
Sammenfattende vil den protokol, der præsenteres her, gøre det muligt at fremstilling af synkroniserede embryoner af A. mexicanus til andre downstream-anvendelser, såsom injektion af genetiske konstruktioner eller studier af tidlige embryologiske fænotyper. Den største styrke af protokollen er, at det giver mulighed for effektiv produktion af overflade-hule hybrider kan bruges til genetisk kort fænotypiske forskelle mellem overflade fisk og cavefish gennem qtl (kvantitativ træk loci) analyse. Taget sammen, opnå levedygtige æg i dagtimerne for IVF er en kraftfuld teknik, der vil være gavnlig for en række fremtidige undersøgelser inden for forskellige områder af biologisk videnskab.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Philippe Noguera og Kimberly Bland for deres støtte på video produktion. Forfatterne vil også gerne anerkende hele Aquatics-teamet i Stowers-instituttet for husdyrhold. Dette arbejde blev støttet af institutionel støtte til DPB og NR. NR blev støttet af Edward Mallinckrodt Foundation og JDRF. RP fik støtte fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (PE 2807/1-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Centrifuge Tube | Eppendorf | #22364111 | |
| 100 mm Petri Dishes | VWR International | #25384-302 | |
| Aspirator Tube | Drummond | #2-000-000 | |
| Calibrated 1-5 µL Capillary Tubes | Drummond | #2-000-001 | |
| Dispolable Spatulas | VWR International | #80081-188 | |
| HMA-50S 50W Aquatic Heaters | Finnex | HMA-50S | |
| P1000 Pipette | Eppendorf | #3123000063 | |
| P1000 Pipette Tips | Thermo Scientific | #2079E | |
| Sanyo MIR-554 incubator | Panasonic Health Care | MIR-554-PA | |
| Sperm Extender E400 | 130 mM KCl, 50 mM NaCl, 2 mM CaCl2 (2H2O), 1 mM MgSO4 (7H2O), 10 mM D (+)-Glucose, 30 mM HEPES Adjust to pH 7.9 with 5M KOH and filter sterilize. Solution can be stored at 4 ?C for up to 6 months. |
||
| Sponge Animal Holder | Made from scrap foam | ||
| System Water | Deionized water supplemented with Instant Ocean Sea Salt [Blacksburg, VA] to reach a specific conductance of 800 µS/cm. Water quality parameters are maintained within safe limits (Upper limit of total ammonia nitrogen range, 1 mg/L; upper limit of nitrite range, 0.5 mg/L; upper limit of nitrate range, 60 mg/L; temperature, 22 °C; pH, 7.65; dissolved oxygen 100 %) | ||
| Tissue Wipes | Kimberly-Clark Professional | #21905-026 | |
| ZIRC E2 Embryo Media | 15 mM NaCl, 0.5 mM KCl, 1.0 mM MgSO4, 150 µM KH2PO4, 50 µM Na2HPO4, 1.0 mM CaCl2, 0.7 mM NaHCO3. Adjust pH to 7.2 to 7.4 using 2 N hydrochloric acid. Filter sterilize. Stored at room temperature for a maximum of two weeks. |
References
- Jeffery, W. R.
- Gross, J. B., Borowsky, R., Tabin, C. J. A novel role for Mc1r in the parallel evolution of depigmentation in independent populations of the cavefish Astyanax mexicanus. PLoS Genetics. 5, e1000326 (2009).
- Riddle, M. R., et al. Insulin resistance in cavefish as an adaptation to a nutrient-limited environment. Nature. 555, 647-651 (2018).
- Xiong, S., Krishnan, J., Peuß, R., Rohner, N. Early adipogenesis contributes to excess fat accumulation in cave populations of Astyanax mexicanus. Developmental Biology. 441 (2), 297-304 (2018).
- Borowsky, R. Breeding Astyanax mexicanus through Natural Spawning. COLD SPRING HARBOR Protocols. , (2008).
- Borowsky, R. In Vitro Fertilization of Astyanax mexicanus. COLD SPRING HARBOR Protocols. , (2008).
- Beale, A., et al. Circadian rhythms in Mexican blind cavefish Astyanax mexicanus in the lab and in the field. Nature Communications. 4, 2769 (2013).
- Sato, Y., Sampaio, E. V., Fenerich-Verani, N., Verani, J. R. Reproductive biology and induced breeding of two Characidae species (Osteichthyes, Characiformes) from the São Francisco River basin, Minas Gerais, Brazil. Revista Brasileira Zoology. 23 (1), 267-273 (2006).
- Yasui, G. S., et al. Improvement of gamete quality and its short-term storage: an approach for biotechnology in laboratory fish. Animal. 9 (3), 464-470 (2015).
- Westerfield, M. The zebrafish book : a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. (2000).
- Simon, V., Hyacinthe, C., Retaux, S. Breeding behavior in the blind Mexican cavefish and its river-dwelling conspecific. PLoS One. 14 (2), e0212591 (2019).
- Borowsky, R. Determining the Sex of Adult Astyanax mexicanus. COLD SPRING HARBOR Protocols. , (2008).
- Ross, L. G., Ross, B. Anaesthetic and Sedative Techniques for Aquatic Animals. , 3rd edn, Wiley-Blackwell. (2008).
- Matthews, J. L., et al. Changes to Extender, Cryoprotective Medium, and In Vitro Fertilization Improve Zebrafish Sperm Cryopreservation. Zebrafish. 15 (3), 279-290 (2018).
- Stahl, B. A., et al. Stable transgenesis in Astyanax mexicanus using the Tol2 transposase system. Developmental Dynamics. , 1-9 (2019).
- Elipot, Y., Legendre, L., Pere, S., Sohm, F., Retaux, S. Astyanax transgenesis and husbandry: how cavefish enters the laboratory. Zebrafish. 11, 291-299 (2014).
- Gross, J. B., Borowsky, R., Tabin, C. J. A novel role for Mc1r in the parallel evolution of depigmentation in independent populations of the cavefish Astyanax mexicanus. PLoS Genetics. 5 (1), e1000326 (2009).
- Jeffery, W. R. Chapter 8. Evolution and development in the cavefish Astyanax. Current Topics in Developmental Biology. 86, 191-221 (2009).
- Protas, M., Conrad, M., Gross, J. B., Tabin, C., Borowsky, R. Regressive evolution in the Mexican cave tetra, Astyanax mexicanus. Current Biology. 17 (5), 452-454 (2007).
- Hinaux, H., et al. A developmental staging table for Astyanax mexicanus surface fish and Pachon cavefish. Zebrafish. 8, 155-165 (2011).
- Draper, B. W., Moens, C. B. A high-throughput method for zebrafish sperm cryopreservation and in vitro fertilization. Journal of Visualized Experiment. (29), (2009).
