Summary
סמים המיקוד גידולים במערכת העצבים המרכזית היא אתגר גדול. כאן נתאר פרוטוקול לייצר לחקות במבחנה של דם-מוח הגידול-המכשול באמצעות תאים מאתר ו/או האדם, לדון את הרלוונטיות שלהם עבור מהמכונית של מערכת העצבים המרכזית הגידול מיקוד ויוו.
Abstract
סלקטיבי מאוד על ידי הטבע, מחסום הדם - מוח (BBB) הוא חיוני עבור הומאוסטזיס המוח בתנאים פיזיולוגיים. עם זאת, בהקשר של גידולים במוח, מידת הבררנות מולקולרית של BBB גם מגן התאים אמצעים על-ידי חסימת מסירת chemotherapies מנוהלת באופן עקיף. פיתוח תרופות חדישות (כולל חלקיקים) מיקוד גידולים ממאירים במוח באופן אידיאלי מחייב השימוש במודלים בבעלי חיים פרה ללמוד transcytosis של התרופה והיעילות antitumor. על מנת לעלות בקנה אחד עם העיקרון 3R (צמצום, להפחית ולהחליף) כדי להפחית את מספר חיות מעבדה בהגדרת הניסוי ולבצע ההקרנה תפוקה גבוהה של ספריה גדולה של סוכנים antitumor, פיתחנו אדם במבחנה לשחזור, לחקות מאתר של דם-מוח הגידול-המכשול (BBTB) באמצעות שכבות 3 תרביות של תאי אנדותל, האסטרוציטים ספירות נגזר החולה גליובלסטומה. מדרגיות גבוהה יותר, הפארמצבטית, שורות תאים מסחרי או תאים מונצחים שימשו בתנאים מותאמים אישית כדי לאפשר היווצרות של מחסום דמוי BBB בפועל. כאן נתאר פרוטוקול להשיג לחקות BBTB על ידי culturing תאי אנדותל בקשר עם האסטרוציטים ב תאים מסוים הצפיפויות בחלק מוסיף. לחקות BBTB הזה יכול לשמש, למשל, כימות והדימות קונאפוקלית של המעבר ננו-חלקיק דרך המחסומים אנדותל, astrocytic, בנוסף הערכת פילוח תא הגידול בתוך אותו וזמינותו. יתר על כן, אנו מראים כי נתונים המתקבלים יכולים לשמש כדי לחזות את ההתנהגות של חלקיקים במודלים של בעלי חיים פרה. פרספקטיבה רחבה, המודל במבחנה זה יכול להיות מותאם כדי מחלות ניווניות אחרות מצפני המעבר של מולקולות טיפוליות חדשות דרך BBB ו/או להיות בתוספת organoids המוח כדי ישירות להעריך את היעילות של . סמים.
Introduction
יחידת נוירו-וסקולריים מורכב נוירונים האסטרוציטים, BBB, שהוקמה על ידי חיבורים מסובכים בין pericytes, האסטרוציטים, תאי אנדותל קרום המרתף המשויך ויוצרים את המוח microvasculature1. הקיר הסלולר צר שנוצר על ידי כלי רציף, nonfenestrated דק מסדיר את התנועה של יונים ומולקולות (כולל הורמונים, חומרים מזינים או תרופות), אלא גם של מחזורי תאים1. Transcytosis נמוך בעיקר דרך BBB של מולקולות גבוהה משקל מולקולרי, כגון נוגדנים טיפולית, סמים conjugates או nanocompounds, מגביל באופן דרמטי את ההתקדמות גילוי תרופות למחלות נוירולוגיות, כולל ממאיר gliomas2. אכן, דרך הפה או דרך הווריד ונמסרו chemotherapies להגיע parenchyma המוח בדרך כלל בריכוזים נמוכים כראוי כדי ליצור אפקט antitumor או בכלל לא יכול לחצות את BBTB כדי להגיע את התאים אמצעים3. מספר מחקרים קליניות לא התמודדו עם הבעיה של BBTB חדירה אבל ניסו לשבש את BBTB transiently, למשל על-ידי שימוש סאונד ממוקד4,5, או לעקוף אותו על ידי ישירה בחיי עיר משלוח של סמים6. עם זאת, אף אחת משיטות אלה הצליחו לנטרל את התפשטות הגידול הבלתי נמנע או נסיגה. לכן, בעת פיתוח טיפולים antiglioma, פעפוע דרך BBTB צריכה להיחשב אחד ההיבטים הקריטיים עבור שילוח מוצלח של סוכני טיפולית7.
בשל אופיו מאוד מורכב של אינטראקציות תא בתוך BBTB, אין ויוו מחקרים בחיות מעבדה נראה הבחירה הברורה כשלומדים את המעבר של מולקולות מן הדם אל המוח. עם זאת, שיטות ויוו גבוהה-סולם מורכבים יחסית כדי להקים ו, לכן, אל תאפשר ההקרנה תפוקה גבוהה של מולקולות בתוך זמן סביר במחיר סביר. . וחשוב מכך, ניסויים בבעלי חיים חייב לעקוב אחר המנחה אתית 3R כהגדרתו i) מקד, ii) להפחית ולהחליף, רלוונטיות להקשר הנוכחי, השלישי) פרוטוקולים אלטרנטיביים (למשל, בשיטות חוץ גופית/ב silico). לכן, יצירה מחדש של BBTB במבחנה מופיעה אפשרות מעניינת ומושכת, אך הוא מהווה גם משימה מורכבת על ידי מגבלות שונות. רבים מנסה ליצור מחדש את התא מורכבת עם תאים בתרבית הראשי או שורות תאים של כלב, חזירי, מאתר, ומקור בכלל אנושית פורסמו (כפי שנסקרו על ידי רחמן ואח8 ו הלמס ואח9). מודלים אלה כוללים מערכות תלת מימדי microfluidic10,11,BBB-על-שבב12, ומוסיף שהתקהלו משתנים בהתבסס על תרבויות קלאסית שיתוף מערכות. עם זאת, מערכות microfluidic ו שבב הנוכחי הם או לא מתאים מהירה, תפוקה גבוהה סמים-אימות מחקרים13,14 או נמצאים כיום עולה בקנה אחד עם מחקרים של משלוח סמים. גידולים במוח. בנוסף, הסקירה של 155 מודלים שפורסמו באמצעות ראשי תאים, תאי גזע inducible pluripotent (iPSC) או שורות תאים מסחרי מוסיף תרבותי משותף על כל הראו מגמה interstudy חוסר התיאום שלהם מדידות ו/או מסקנות8. חוסר הפארמצבטית interlaboratory יכול בקורלציה עם תרבות nonnormalized i) תנאים, למשל עם הציפוי אופציונלי עם קרום המרתף חלבונים מטריקס בתוך הכלי התרבות תאים, ii) מספר רב יותר של תת-תרבות ושימוש של סרום המכיל במדיה, שני המנועים העיקריים של שינויים גנטיים, פנוטיפי של שורות תאים15או השלישי) הקושי reproducibly לשחזר את האיזון הנכון בין astroglial לבין רכיבים אנדותל בקערה. למרות השימוש מונצחים תאים או תא מסחרי קווים להקים מודל BBB במבחנה חסרה כמה תכונות לעומת דגמים דומים המשתמשים רק ראשי תאים, בשיטה המתוארת אנו מראים כי השילוב הנכון של תאים המוצגים מאוד ביצועים דומים ל פרסם מחקרים במודלים אחרים של הפניה16,17. בסופו של דבר, העדר מודל לשחזור ועמיד ללמוד את המעבר של תרכובות טיפולית מיקוד גידולים במוח דרך BBTB המניע אותנו לפתח בשיטות המתוארות כאן.
שכן המטרה היא להשתמש במודל לחזות את המסירה ויוו של חלקיקים במודלים של בעלי חיים פרה, אנחנו לאמת תחילה המודל BBTB על-ידי ניצול מוסיף המכיל תאי אנדותל מאתר בקשר עם האסטרוציטים מאתר. בנוסף לכך, אנחנו גם אופטימיזציה המודל לשימוש מסוים שורות תאים אנושיים. לאחר מתייצב, המחסומים תא מועברים לתרבויות עם גליובלסטומה נגזר החולה הספירות או שורות תאים glioma מסחרי. לאחר מכן, transcytosis של חלקיקים והיעדים תא הגידול יכול להיות דמיינו ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית, לכמת על ידי איסוף דגימות לאורך זמן. חשוב, התוצאות המתקבלות באמצעות מחקה את BBTB הצליח בצורה אמינה לחזות ההתנהגות של חלקיקים ויוו, התומך בשימוש המנזר מחקים BBTB האימות פרה.
Protocol
הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה לניסויים בבעלי חיים של מחוז של דרום פינלנד (ESAVI/6285/04.10.07/2014).
1. הקמת מחקה BBTB
הערה: תא תרבות בינוני ותוספי מפורטים בטבלה של חומרים.
- הכנת האסטרוציטים
הערה: אמצעי האחסון הבאים מתאימים צלחת פטרי 10 ס מ או בקבוקון תרבות T75 התא.- ברדס תרבות תא סטרילי, בזהירות לשטוף את האסטרוציטים בתרבית 5 מ ל תמיסת סטרילית באגירה פוספט (PBS). בעדינות למחוק את PBS באמצעות משאבה ואקום ולהוסיף 2 מיליליטר דיסוציאציה תא הכימית במשך 5 דקות (על 37 °C, ראה את הטבלה של חומרים) כדי לנתק את התאים. בדוק הניתוק תא מתחת למיקרוסקופ. לא יעלה על 5 דקות של דגירה להגביל את הלחץ על התאים.
- להוסיף 10 מ ל סטרילי אסטרוציט מלאה תא תרבות בינוני (ABM +) הכלי כדי לעכב את הפעילות של התא דיסוציאציה הכימית. השתמש pipet סרולוגית סטרילי כדי להעביר את התאים מנותק מכלי הקיבול צינור סטרילי 15 מ"ל. Centrifuge התליה תא למשך 3 דקות ב 250 rcf (האצה: 9 rcf/s, ההאטה: rcf 5/s) בטמפרטורת החדר (RT).
- . בינתיים, מכינים את התוספות (ראה את הטבלה של חומרים): באמצעות מלקחיים סטרילי, למקם את הכיסויים עם הצד המוח למעלה (איור 1 א') על המכסה של צלחת 6-ובכן סטרילי (איור 1B). לוודא מראש כי הצלחת ניתן להניח במהופך על התוספות בלי לגעת או הזזת את הכיסויים בתהליך.
הערה: המיקום הנכון של התוספות מאפשר מלכודת של ההשעיה אסטרוציט שביניהם הקרום בתחתית הבאר. - ברגע centrifuged, למחוק היטב את תגובת שיקוע של התליה תא; resuspend בגדר אסטרוציט ב 1 מ"ל של ABM + מאת בעדינות resuspending בגדר ברכבת התחתית's קיר x עד 5. להימנע pipetting יתר של תאים כדי להגביל את הלחץ על התאים. לספור את התאים ולהתאים הצפיפות התליה תא של 1.5 x5 10, בתאים µL 400 של ABM / להוסיף.
- מקום התליה תא באמצע המוח-לצד תותב's ממברנה (איור 1B), בזהירות רבה, להפיץ את זה באמצעות נימי כוח עם טיפ pipet סטרילי. הימנע ממגע ישיר כמו הקרום שביר במיוחד.
- עם הצד המוח של התוספות עדיין למעלה, במקום את הצלחת 6-ובכן בחזרה על התוספות. פעולה זו מבטיחה כי התליה תא לכוד בין הקרום בתחתית הבאר (איור 1C) בפועל. הימנע בועות אוויר ההשעיה תא, כמו זה ימנע את התפשטות האסטרוציטים על הקרום הומוגנית.
- מניחים צלחת והוספות, עם הצד המוח, בחממה (ב- 37 °C עם 5% CO2) כדי לאפשר את הידבקות תאים למשך תקופה מינימלית של 2 h (האסטרוציטים מונצחים מאתר) ועד 6 h (האסטרוציטים העיקרי אנושי).
הערה: כל התוספות נשמרים במהופך, ויזואליזציה של הידבקות תאים אינה אפשרית תחת מיקרוסקופ. לכן, מומלץ זרע כלי תרבות נפרדת תא רגיל ולשלוט את הידבקות תאים בתוך הכלי לאורך זמן. זהירות על מניפולציה של הקרום, ומומלץ התוצאות יהיו לא אמין כאשר ממברנות פגומים. - בסוף זמן הדגירה, לוודא העדר של תאים דליפות השעיה מחוץ לאזור זריעה, ולמחוק את התוספות אם הם דולפים. החזר את הצלחת 6-ובכן למצבה הרגיל, עם מוסיף כי עכשיו יהיה הצד דם למעלה (איור 1 א'). להוסיף מ 2.6 ל ABM + כל טוב. שופכים 2.5 מ של מדיום אסטרוציט מלאה לתוך כל הוספה ולמקם את הצלחת בחממה (ב- 37 °C עם 5% CO2).
- הכנה של תאי אנדותל
הערה: עבור מאתר microvascular אנדותל תאי המוח (bEND3), התאים צריך להגיע למפגש 100% כדי להבטיח מקסימלי תא תא אנשי קשר מפעילה את הביטוי חלבון אופטימלי צומת חזק ביום של הניסוי. זו לא תחול על תאי אנדותל יפתור (HuAR2T) כמו הנוכחות של האסטרוציטים נדרש עבור ביטוי חלבון צומת חזק עבור תאים אלה.- המשך כאמור המתואר לשם האסטרוציטים (שלבים 1.1.1 ו 1.1.2.). ברגע centrifuged, למחוק היטב את תגובת שיקוע; resuspend בגדר תא אנדותל ב 1 מ"ל של תאי אנדותל מלאה תרבות בינוני (EBM +) על ידי לאט pipetting התליה תא ברכבת התחתית's קיר x עד 5. להימנע pipetting יתר של תאים כדי להגביל את הלחץ על התאים. לספור את התאים וכן להתאים את צפיפות ההשעיה התא לתאים5 2 x 10 מ"ל 2.5/הוספה של תאי אנדותל בינוני תרבות ללא סרום (נולד ב- EBM) ואת כלי הדם צמיחה אנדותל-(VEGF-A).
- להוציא לצלחת המכילה את התוספות, בזהירות למחוק את המדיום מהצד דם, ולהחליף אותו עם 2.5 מ של התליה תא אנדותל. להחזיר את הצלחת החממה (ב- 37 °C עם 5% CO2) ולהשאיר את זה בן לילה על תאי אנדותל לדבוק הקרום.
- למחרת, להכין צלחת 6-ובכן סטרילי על-ידי העברת 3 מ"ל של מדיום אסטרוציט ללא סרום prewarmed (ABM-) כל טוב. ע י טיפול את הכיסויים עם מלקחיים סטרילי, בזהירות למחוק את המדיום מלאה אנדותל מהצד דם, למקם את תותב הלוח החדש המכיל ABM- ולהוסיף 2.5 מ של EBM.
הערה: השימוש EBM - הוא קריטי עבור הקמת המכשול אנדותל (עיין במקטע דיון). - להשאיר את הכיסויים בחממה (ב- 37 °C עם 5% CO2) עם הפרעה גופנית מינימלית ווריאציות הטמפרטורה במשך 5 ימים, המאפשר הייצור של קרום המרתף אנדותל, אסטרוציט יוצר קשר עם תאי אנדותל, בסופו של דבר, היווצרות מחקים BBTB. להחליף את המדיום ביום העברת הכספים על תרביות תאים glioma (עיין בסעיף 1.4).
- מדידה של חדירות מחקים BBTB (אופציונלי)
- דיפוזיה פסיבית של הפלורסנט קטן משקל מולקולרי הנתרן fluorescein (Na-Fl) לאורך זמן מהדם לצד המוח של התוספות מאפשר חישוב הערכים חדירות על פי הנוסחה הבאה:
כאן, dF,ובכןהוא הערך פלורסצנטיות נמדד הבאר בשלב זמן מסוים פחות הערך autofluorescence תא תרבות בינוני, dT זה הזמן בשניות, A הוא השטח של המכשול סנטימטרים רבועים, dFלהוסיף הערך פלורסצנטיות נמדד את תותב בנקודת זמן באותו הערך autofluorescence בינוני מינוס). - לאסוף 100 µL של המדיום הדם והן את צידי המוח החיקוי BBTB, להעביר כל אחד מהם שהונעו, שחור 96-ובכן לוח נפרד למדידות קרינה פלואורסצנטית עוקבות. השתמש במדיה רגיל כמו הריק כדי לתקן את autofluorescence.
- להכין 2.5 מ לכל טוב של Na-חליל (50 מיקרומטר) EBM. Prewarm הפתרון Na-Fl 37 מעלות צלזיוס. החלף את התקשורת מהצד דם של התוספות שהמדיה המכילה Na-קומה להפעיל טיימר ברגע המדיום מוחלף.
- בזהירות לאסוף 100 µL של מדיה מן הדם והן בצד המוח של התוספות ב 5, 30, 60, 120 דקות להעביר כל מדגם להפרדת בארות של צלחת 96-ובכן שחור.
- בהתאם לכך, החלף את התקשורת שנאספו מן השרוול כדי לשמור על האיזון נפח בין הצדדים. מקם את הכיסויים בחזרה בחממה בין כל אוסף דגימה כדי למזער את הבדלי הטמפרטורות.
- לכמת את פלורסצנטיות מן הדגימות שנאספו, שימוש בקורא צלחת עם המסנן על 480/560 nm (עירור, פליטה, בהתאמה).
הערה: מן הצד המוח הוא כמעט בלתי מורגשת בנקודת זמן 5 דקות. ערכים גבוהים בהשוואה הריק מצביעים על דליפה של / נזק תותב's ממברנה או המכשול; לכן, אל תכלול אלה מניתוחי עוד יותר. ערכי חדירות Na-Fl הצפוי BBTB צריך להיות 10-5 -6 10 ס"מ/s לטווח (טבלה 1).
- דיפוזיה פסיבית של הפלורסנט קטן משקל מולקולרי הנתרן fluorescein (Na-Fl) לאורך זמן מהדם לצד המוח של התוספות מאפשר חישוב הערכים חדירות על פי הנוסחה הבאה:
- הכנה של תאים glioma
הערה: למרות ספירות נגזר החולה גליובלסטומה משמשים כאן, פרוטוקול הבאים ניתן להתאים בקלות עבור תאים חסיד, זמינים מסחרית גליובלסטומה כגון U - 87 מ"ג.- לחלופין, עבור הדמיה immunofluorescence, מקום coverslips בורוסיליקט סטרילי עגול עד ארבע (ø 0.9 ס מ) לכל טוב בצלחת 6-ובכן המכיל 2 מ של פולי-D-ליזין (0.01%). דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
- בינתיים, בזהירות להעביר את הכדורים הגידול מכלי הקיבול תרבות תא צינור סטרילי 15 מ"ל באמצעות של pipet סרולוגית סטרילי. Centrifuge את הכדורים הגידול למשך 3 דקות ב 250 rcf.
- למחוק את תגובת שיקוע, ברכות resuspend את הכדורים ב- 1 מ"ל של bFGF/EGF-חינם (GBM) glioma תא בינוני, לספור את התאים. התאם את צפיפות התאים עד כ 104 כדורים/מ"ל (105 תאים/מ"ל) ב- GBM-.
- למחוק את פולי-D-ליזין מן הבארות ולשטוף אותם 3 x עם PBS סטרילי. זרע את הצלחת עם 3 מ ל/טוב של ההשעיה ספרואיד הגידול ולהעביר את הכיסויים עם החיקוי BBB על ההשעיה תאים סרטניים.
- דגירה בין לילה (ב- 37 °C עם 5% CO2) כדי לאפשר איזון בין הדם לבין המוח גידול צידי וזמינותו. ביום הבא, החלף את המדיה בצד דם EBM-בתוספת המולקולות/הסמים/חלקיקים עניין. הדגימות ייאספו לאורך זמן על כימות ישירה כפי שתואר בסעיף הקודם. התאים הם קבועים בנקודת זמן מדויק עבור הדמיה קרינה פלואורסצנטית (עיין בסעיפים 2.1 ו- 2.2).
2. רזולוציה גבוהה הדמיה קונאפוקלית של BBTB
הערה: 4% paraformaldehyde (PFA, pH 7.4, 6 מ לכל BBTB שכפול) תמיד מוכן טרי ב- PBS. . לשמור את זה על קרח.
התראה: כדורגלן הוא מסרטנים. השתמש nitrile כפפות כדי להתמודד עם כדורגלן ולהכין את הפתרון ברדס fume כימי.
-
BBTB ביטוי אנדותל של חלבונים צומת חזק
- לשטוף את שני הצדדים של הקרום עם PBS קר כקרח (3 x במשך 5 דקות, 2.5 מ ל/להוסיף, 3 מ ל/טוב). למחוק את PBS ולהוסיף 3 מ"ל 2.5 מ של 4% קר כקרח PFA הבאר, את תותב, בהתאמה. דגירה על קרח במשך 10 דקות להשליך כדורגלן (לפי המוסד'סילוק כימיים מסוכנים s) ולשטוף 3 x עם PBS ב RT (2.5 מ ל/הוספה, 3 מ ל/טוב).
הערה: ברגע קבוע, דוגמאות ניתן לאחסן ב- PBS (2.5 מ ל/הוספה, mL/טוב 3) ב 4 °C במשך שבוע. - השתמש ספוגית כותנה נגב את הצד המוח של הקדמי ולהסיר את האסטרוציטים. שימוש באזמל חד, לחתוך בזהירות את הקרום לארבע חתיכות שוות על-ידי הפיכת שני חתכים בניצב, ויוצרים צלב. לאחר מכן, להוסיף את האזמל בנקודה שבה הקרום מוצמד לקיר הוספה וסובב את תותב עם היד השנייה כדי לשחרר את הארבעה. באמצעות פינצטה בסדר, העבר בזהירות כל מדגם צלחת 24-ובכן המכיל 200 µL של PBS/טוב, עם הצד דם למעלה כל היטב.
- לחסום את הקרומים עם 10% עוברית שור סרום ב- PBS (למשך 30 דקות ב- RT, µL 200/טוב). להכין הפתרון נוגדן 1° immunostaining של הצומת חזק חלבונים (איור 1D) (zonula occludens-1, claudin-5; עיין טבלה של חומרים) ב- µL 200 של חסימת פתרון/טוב. באופן אופציונלי, תאי אנדותל זהות מאומתת על-ידי הוספת נוגדן נגד טסיות תא אנדותל אדהזיה המולקולה (PECAM1 או CD31; עיין טבלה של חומרים) בחזקת כל פתרון נוגדן צומת חזק. לבטל את הפתרון חסימה, דגירה עם נוגדנים ראשי' O/N ב- 4 °C.
- ביום הבא, למחוק את הנוגדנים העיקרי ולשטוף אותם עם µL 200 ל- PBS (3 x עבור 5 דקות ב RT). דגירה אותם עם המתאים ספציפית fluorophore מצומדת משני נוגדנים (דילול שבערך, 200 µL/טוב, מדולל בפתרון חסימה; עיין טבלה של חומרים) עבור 2 h-RT.
- למחוק את הנוגדנים משני, לשטוף עם µL 200 ל- PBS (3 x עבור 5 דקות ב RT). להסיר את PBS, counterstain גרעינים תא על-ידי שימוש של 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) פתרון הסופי ריכוז 1 ממוצעg/mL טהור מזוקק H2O (dH2O; 200 µL/טוב; עיין הטבלה של חומרים ). תקופת דגירה של 7 דקות-RT. להסיר את דאפי. ולשטוף את הקרומים 3 x עם dH2O (200 µL טוב).
- מקום טיפה של המדיום הרכבה (ראה את הטבלה של חומרים) על משטח זכוכית מיקרוסקופ. באמצעות פינצטה בסדר, בזהירות קח את הקרום מהבאר, שמירה על הכיוון, להסיר את עודף של dH2O ומניחים אותו על הירידה של המדיום הרכבה. להוסיף עוד טיפת הרכבה בינונית על גבי הקרום, בזהירות לכסות את זה עם כיסוי זכוכית בורוסיליקט. ודא כי ישנם אין בועות אוויר כלואה. לאחסן את הדגימות-4 °C, והרחק אור עד מיקרוסקופיה קונפוקלית תצפיות.
הערה: אסטרוציט מכתים יכול להתבצע על ידי הצבת את חלקי בקרום בצלחת 24-ובכן עם הצד המוח למעלה, עם השימוש של נוגדנים ספציפיים אסטרוציט הנבחר (למשל, מכוונת נגד החלבון חומצה fibrillary גליה [GFAP]) (איור 1E ).
- לשטוף את שני הצדדים של הקרום עם PBS קר כקרח (3 x במשך 5 דקות, 2.5 מ ל/להוסיף, 3 מ ל/טוב). למחוק את PBS ולהוסיף 3 מ"ל 2.5 מ של 4% קר כקרח PFA הבאר, את תותב, בהתאמה. דגירה על קרח במשך 10 דקות להשליך כדורגלן (לפי המוסד'סילוק כימיים מסוכנים s) ולשטוף 3 x עם PBS ב RT (2.5 מ ל/הוספה, 3 מ ל/טוב).
-
זריחה BBTB מכתים לזהות transcytosis ננו-חלקיק
- לבצע תיוג לחיות תאים ליזוזום (למשל, באמצעות פלורסנט רגשים [ראה את הטבלה של חומרים]). לדלל את ליזוזום הפלורסנט-ריכוז העבודה של 50 ננומטר EBM prewarmed-(2.5 מ ל/insert) או של 75 מ מ ABM prewarmed - (3 מ ל/טוב) עבור ליזוזום תיוג של תאי אנדותל, האסטרוציטים, בהתאמה. דגירה התאים למשך 45 דקות (ב- 37 °C עם 5% CO2); לאחר מכן, לשטוף 3 x עם PBS קר כקרח (2.5 מ ל/הוספה, 3 מ ל/טוב).
- למחוק את PBS ולהוסיף 3 מ"ל 2.5 מ של 4% קר כקרח מחברים אל הבאר, את הכנס, בהתאמה. דגירה אותם על קרח במשך 10 דקות להשליך את כדורגלן ולשטוף את התאים 3 x עם PBS (ב RT, 2.5 מ ל/הוספה, 3 מ ל/טוב).
הערה: ברגע קבוע, הדגימות ניתן לאחסן ב- PBS (2.5 מ ל/הוספה, 3 מ ל/טוב) ב 4 מעלות צלזיוס למשך שבוע. - הסר את PBS, counterstain את גרעין התא ריכוז הסופי של µg/mL 1 dH2O (1 מ"ל/הוספה, 1 mL/טוב), באמצעות פתרון דאפי. דגירה אותם במשך 7 דקות-RT. להסיר את דאפי. ולשטוף את הקרומים 3 x עם dH2O (2.5 מ ל/הוספה, 3 מ ל/טוב).
- בזהירות לחתוך את הקרום, להסיר את עודף של dH2O, ומניחים אותו על טיפה של הרכבה בינונית (ראה את הטבלה של חומרים) על משטח זכוכית מיקרוסקופ. להוסיף עוד טיפת הרכבה בינונית בצד השני של הקרום, בזהירות לכסות את זה עם כיסוי זכוכית בורוסיליקט. להימנע בועות אוויר כלואה. לאחסן את הדגימות-4 °C ולשמור אותם מוגן מפני אור עד מיקרוסקופיה קונפוקלית הדמיה.
-
קרינה פלואורסצנטית מכתים של תאים סרטניים
- באמצעות פינצטה בסדר, העבר בקפידה על coverslips עגול המכיל את הגידול לספירות צלחת 24-ובכן מלא עם PBS קר כקרח. להמשיך לחיות תאים ליזוזום תיוג באמצעות ליזוזום פלורסנט הגששים ב-75 nM ב- GBM prewarmed - (200 µL טוב). דגירה בדגימות למשך 45 דקות; לאחר מכן, לשטוף אותם 3 x עם PBS קר כקרח (200 µL טוב).
- למחוק את PBS ולהוסיף 200 µL של כדורגלן כקרח לכל טוב. דגירה על קרח במשך 10 דקות להשליך כדורגלן ולשטוף את הדגימות 3 x עם PBS (ב RT).
הערה: ברגע קבוע, ניתן לאחסן את הדגימות PBS (200 µL) ב 4 מעלות צלזיוס למשך שבוע. - להסיר את PBS, counterstain את גרעין התא ריכוז הסופי של µg/mL 1 dH2O, באמצעות פתרון דאפי (200 µL טוב). דגירה אותם במשך 7 דקות-RT. להסיר את דאפי. ולשטוף את coverslips 3 x עם dH2O (200 µL טוב).
- באמצעות פינצטה בסדר, תוציא את coverslip, להסיר את עודף של dH2O, ומניחים אותו על טיפה של הרכבה בינונית (ראה את הטבלה של חומרים) על משטח זכוכית מיקרוסקופ. להימנע entrapping בועות אוויר. לאחסן את הדגימות-4 °C ולשמור אותם מוגן מפני אור עד מיקרוסקופיה קונפוקלית תצפיות.
3-in Vivo מחקר השוואתי
- הקלטה באתרו של נתרן-fluorescein דיפוזיה דרך BBB
- להכין µL 150 של פתרון Na-Fl 50 ננומטר בתמיסה פיזיולוגית. שמור את הפתרון ב 37 °C במסירה תוך ורידי.
- עזים ומתנגד עכבר עם זריקה בקרום הבטן של קטמין/חריגות השירותים הווטרינריים קוקטייל (300 µL של 100 מ"ג/ק"ג קטמין ו- 10 מ"ג/ק"ג חריגות השירותים הווטרינריים ב- PBS). לאחר הרדמה עמוקה הוא הוקם, במקום החיה על כרית החימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף שלה.
הערה: בן 10 בשבוע הנשי הימי רפואי מחקר מכון (NMRI) עירום immunocompromised עכברים שימשו כדי לקבל את הנתונים המוצגים באיור2. עם זאת, פרוטוקול זה הוא מותאם immunocompetent והן immunocompromised עכברים. שיטת הרדמה/כאבים היא-המדען's שיקול דעת. עם זאת, שאיפת הרדמה כגון איזופלוריין לא מומלץ כי זה מגדיל באופן משמעותי את חדירות BBB18. - הנח את העכבר על מסגרת stereotaxic (ראה טבלה של חומרים) לבצע חתך האורך של הקרקפת עם מספריים בסדר, ואחריו dilacerations עדין של רקמת חיבור, באמצעות פינצטה בסדר, כדי לחשוף את הגולגולת. באמצעות תנועות סיבוביות עם microdrill בסדר, הסר ø 0.3 מ מ מעגלית פיסת הגולגולת עצם הקודקוד שמאלה או ימינה. בזהירות במהלך קידוח, בעת הסרת את פיסת הגולגולת כדי למנוע פציעה של רקמות הבסיסית של קרום המוח וכלי הדם.
- במקום טיפת פיזיולוגית על הרקמה חשופה. באמצעות שני זוגות של מלקחיים בסדר, הסר בזהירות את רקמת קרום המוח כדי לגשת קליפת המוח. רקמת המוח להיות בקשר ישיר עם אוויר.
הערה: שטפי דם קלים מפציעה סיבוך ניתן לעצור בעזרת ספוגים המטולוגיות (עיין טבלה של חומרים). - לאחר הסרת הרקמה של קרום המוח, קליפת המוח נחשף במלואו, אומללותו טיפה של פתרון פיזיולוגי בין קליפת המוח coverslip בורוסיליקט 0.5 מ מ ø. אבטחו את האזור תצפית עם טיפה של דבק מגע דבק (עיין טבלה של חומרים) לפזר את coverslip עם מחט. תן הדבק להתייבש במשך 1 דקה.
- להכין את הצנתר מושתלת הזריקה וריד הזנב (איור 2 א). . שבור את הקצה של מחט 25 גרם באמצעות מלקחיים רוצ'סטר-Ochsner והכנס את הקצה 10 ס מ באורך PE20 צינור פוליאוריתן (עיין טבלה של חומרים) (איור 2 א).
- להוסיף את הצנתר לתוך וריד הזנב לרוחב העכבר, באמצעות מלחציים הבולדוג של קטטר מניפולציה ואת ההכנסה (עיין טבלה של חומרים) (איור 2B). אבטח את המחט שנוספו עם טיפה של דבק מגע דבק. תן הדבק להתייבש במשך 20 s לפני הסרת את המלחציים בולדוג. בזהירות חבר את הקצה השני של הקטטר מחט 25 גרם מחובר המזרק המכיל את הפתרון Na-Fl (איור 2B).
- הערה: לא תהדק את הזנב עם המלחציים בולדוג; הוא משמש רק עבור טיפול מדויק קטטר. הכניסה קטטר תקין יכול לאשר ריפלוקס דם לתוך לאורך צינור שקוף.
- מקם את החיה תחת stereomicroscope (ראה את הטבלה של חומרים). שימוש autofluorescence ברמה נמוכה של הערוץ הירוק (480 ננומטר), להתמקד אזור המכילה כלי דם גדול יחסית (הם מופיעים כהה עקב המוגלובין קליטת אור באורך גל), נימים קטנים יותר (איור 2C). התחל את רכישת זמן לשגות בקצרה לפני הזרקת של הפלורסנט לקבל מידה של קרינה פלואורסצנטית הרקע.
הערה: לחלופין, ההקלטה זמן לשגות יכולים להיות מוחלפים על-ידי תמונה תמונות מ- T0, מכל אחד אחר מראש נקודות זמן. - להזריק את הפתרון בקצב איטי ומתמשך, או לחלופין, להשתמש מערכת אוטומטית אינפוזיה. ידי קרינה פלואורסצנטית Na-Fl מזוהה בדם צריכה להישאר יציב (half-life בדם: 286 min), מה שמאפשר הקלטה של BBB פעפוע דרך החלון הגולגולת למשך מספר דקות. לאחר השלמת הרכישה, בזהירות להסיר את הצנתר, להרדימו על ידי נקע בצוואר הרחם.
- קביעת in vivo החדירות BBB
הערה: הערכים מתקבלים מן תוכנות עיבוד תמונה, כגון ImageJ, המאפשר את המדידה של עוצמת האות פלורסצנטיות בתוך אזור מותאם אישית של עניין (ROI).- באמצעות הכלי ביאור, צייר רועי בצורת מלבן מחוץ לכלי דם, בתוך רקמת המוח, ב בסביבות 5 מיקרומטר מרחק כל כלי דם גלוי מלא הערה נה-קומה את הממדים של רועי לבין עוצמת קרינה פלואורסצנטית נמדד ב- T0 את רועי, אשר כמו ריק משמש את הרקמה's autofluorescence. בלי ועקרו מבתיהם רועי, תריץ את זמן postinjection הצבע (למשל, למסגרת האחרונה מוקלטת, כאשר הפתרון כל שהוחדרו אל החיה) ושים לב הערכים פלורסצנטיות וזמן מדויק נמדד בתוך רועי (איור 2C).
- הלאה רועי כלי דם גלוי (איור 2C) ורשום את הערך autofluorescence T0 ממחזור הדם. בלי ועקרו מבתיהם רועי, להריץ קדימה לאותה נקודה בזמן כפי שהוגדרו בשלב 3.2.1. הערה הערך פלורסצנטיות נמדד בתוך רועי (איור 2C).
- השתמש בנוסחה הבאה (חיבור מקורי סעיף 1.3) כדי לקבוע את החדירות BBB:
- . הנה, dFהמוח הוא הערך עוצמת קרינה פלואורסצנטית מינוס T0 הערך ריק במוח, dT היא נקודת זמן רכישה תוך שניות, A הוא שטח כלי הקיבול בקירוב, נלקח כאזור רועי סנטימטרים רבועים, dF דם הוא הערך עוצמת קרינה פלואורסצנטית פחות הערך ריק T0 בדם.
הערה: ערכי חדירות הצפוי עבור BBB להיות בטווח שבין 10-6 ס"מ/s (טבלה 1).
- עיבוד איתור חלקיקים פלורסנט במוח מאתר רקמה
- שתל ספירות נגזר החולה glioblastoma (5 x 104 תאים ב- µL 5 ל- PBS סטרילי) בעכברים ומורדמת בת שבוע 6 הנשי NMRI עירום ב כפיס המוח. לאתר אזור זה במוח בקואורדינטות stereotaxic הבאות, החל מ- Bregma: anteroposterior + 0.5 מ מ, שמאל ימין + 2.5 מ מ, dorsoventral + 3 מ מ. מאפשר הגידול במוח לגדול 2 שבועות.
- מזריקים לווריד חלקיקים (100 µg ב µL 100 של פתרון סטרילי פיזיולוגיים), ולתת להם לזרום עבור ה 8 להזריק העכברים שליטה דרך הווריד µL 100 של פתרון סטרילי פיזיולוגיים.
- המתת חסד העכברים מאת נקע בצוואר הרחם, לאסוף את המוח במהירות עבור הצמד-לקפוא בתוך איזופנטאן המתוחזקים על קרח יבש (1 דקות ב-50 °C). לאחסן את המוח ב- 80 °C עד ברקמה.
- חותכים חלקים במוח הילתית עם cryomicrotome. אתר ההשתלה תוך-גולגולתי מאת הצלקת זה נוצרו על הקליפה ולחתוך מקטעים מיקרומטר בעובי 9 מאזור זה על גבי שקופיות מיקרוסקופ המתאים (ראה את הטבלה של חומרים).
- לטבול את המקטעים המוח הם ותשמרו על השקופיות PBS קר כקרח (2 x עבור 5 דקות), לאחר מכן, לתקנם תוך קר כקרח 4% מחברים (עבור 5 דקות). לשטוף את השקופיות ב- PBS (3 x עבור 5 דקות ב RT). הנח את השקופיות אופקית, pipet חסימה פתרון המכיל 10% עוברית שור הסרום ב- PBS על הרקמה סעיפים כיסוי השטח כולו (עבור 1h-RT, µL 500/שקופיות). להכין נוגדן CD31 (עיין טבלה של חומרים) ב- µL 250 של חסימת פתרון/שקופית. החלף את הפתרון חסימה הנוגדן, דגירה בין לילה ב 4 °C בתוך תא humidified.
- למחרת, לטבול את השקופיות ב- PBS (3 x עבור 5 דקות ב RT) דגירה אותם עם המקביל fluorophore מצומדת משני הנוגדן (שבערך ב µL 250 ל- PBS עבור 2 h ב- RT). לשטוף 3 x ב- PBS (ב RT), counterstain את גרעין התא ריכוז הסופי של µg/mL 1 dH2O, באמצעות פתרון דאפי (µL 250/שקופיות). דגירה הדגימות במשך 7 דקות-RT. להסיר הפתרון דאפי. ולשטוף את השקופיות 3 x עם dH2O.
- על כל קטע רקמה, הוסף טיפה אחת של הרכבה בינונית (עיין טבלה של חומרים) ולאבטח את הדגימות עם coverslip. להימנע entrapping בועות אוויר. לאחסן את הדגימות-4 °C ולשמור אותם מוגן מפני אור עד מיקרוסקופיה קונפוקלית תצפיות.
Representative Results
הדמיה קונאפוקלית של החיקוי BBTB מאתר מציג את הביטוי ולוקליזציה הסלולר של צומת חזק חלבונים zonula occludens-1 (זואי-1) ו- claudin-5 bEND3. הקשר בין תאי אנדותל האסטרוציטים המושרה בבירור המעבר של זואי-1 ו- claudin-5 לאנשי הקשר תא אנדותל-תא בהשוואה monocultures bEND3 (איור 1D). שימוש immunofluorescence מכתים להמחיש את האסטרוציטים לבטא GFAP המוח-בצד של הקרום, זה אפשרי לצפות וללמוד את התהליכים astrocytic והרגליים סוף-פנייה אל תאי אנדותל דרך הקרום (איור 1E ). המגעים תא אנדותל-אסטרוציט ידועים כדי לקדם ולייצב את הידוק של המכשול הסלולר והן משויכות ערכים נמוכים יותר חדירות של BBB19. לפי זה, הבחנו בירידה משמעותית החדירות של החיקוי BBTB העכבר לחליל Na-מ 27.63 (± 3.45) x 10-6 ס"מ/s במקרה של monocultures כדי 6.74 (± 3.01) x 10-6 ס"מ/s כאשר תרבותי משותף עם היפוקסיה inducible מדהימה פקטור האסטרוציטים (HIFko) (טבלה 1). HuAR2T immortalized בצורת מחסומים הסלולר חדיר מאוד (104.92 ± 27.1 x 10-6 ס"מ/s, טבלה 1). בדומה למודל מאתר, מדדנו החדירות נמוך משמעותית של BBTB ל נה-Fl, כלומר 47.4 (± 14.32) x 10-6 ס"מ/s, כאשר התאים HuAR2T היו בתרבית במשותף עם האסטרוציטים העיקרי אנושי (טבלה 1).
במחקה BBTB מאתר והן אנושית, הנוכחות של מרחבי גליובלסטומה נגזר החולה המושרה עלייה קלה בערכי חדירות לעומת התרבויות שיתוף תא אנדותל-אסטרוציט לבד (טבלה 1). תופעה זו נצפית עם כמה, אבל לא כל glioma החולה כדור מודלים. זה יכול להיות בגלל ה VEGF-A המופרש על ידי כמה תאים אלה נגזר החולה.
כדי להשוות בין ערכי חדירות מחקה BBTB במבחנה עם BBB ויוו, אנחנו עם תמונה בזמן אמת פעפוע של Na-Fl דרך חלון הגולגולת שהושתלו בעכברים עירום. שימוש stereomicroscope על-ידי קרינה פלואורסצנטית, Na-Fl דיפוזיה של הנימים כלי דם הנובעת כלי הדם pial הראשי הוקלט לפני, במהלך, ואחרי הזרקה מערכתית של המכשיר (איור 2C). מדידות של ערכי פלורסצנטיות דיפרנציאלית parenchyma קורטיקלית הדם והמוח מחזורי לאורך זמן מאפשרת לנו לחשב את הערכים חדירות משוער של העכבר עירום's BBB בשביל Na-חליל (5.57 ± 2.19 x 10-6 ס מ בשנייה, טבלה 1).
כדי להמחיש איך לחקות BBTB הזה יכול לשמש עבור ויזואליזציה של המעבר של תרכובות לצד דם בצד המוח, השווינו את transcytosis ø 110 nm (NP110), ø 350 nm (NP350) חלקיקים מיקוד גליובלסטומה נגזר החולה הספירות. התוצאות שהושגו במבחנה ואז, לעומת את transcytosis ויוו. בדוגמה שהוצגו, חלקיקים היו מצופים משטח עם פפטיד פילוח הגידול קופ20 , עמוסה הפלורסנט (FITC) כדי להקל על הפריט החזותי. אנחנו שכותרתו התאים באמצעות לצבוע lysosomal ואת counterstained עם דאפי 24 שעות לאחר התוספת של חלקיקים FITC על הצד-הדם של BBTB לחקות ואף רכשה micrographs קונאפוקלית ברמות שונות (למשל, דם בצד, הקרום, בצד המוח, את הכדורים גליובלסטומה החולה) (איור 3 א). NP110-הקשורים ניאון האות colocalized עם lysosomes תאי אנדותל, האסטרוציטים, וכן תאים סרטניים. בנוסף, NP110s היו באמצע זיהה תאי אנדותל ואת האסטרוציטים, עובר דרך הנקבוביות ממברנה של הקדמי (איור 3 א).
המעבר של NP110s הייתה לכמת על ידי מדידה של זריחה מן הדגימות שנאספו מהצד הדם ואת המוח. ערכים אלה חדירות הושוו לאלה שנקבע על חלקיקים של ø 350 nm (NP350). התוצאות הראה כי רק NP110 היה מסוגל לחצות את מחקה BBTB (איור 3B). NP350 נשאר בצד-הדם של החיקוי BBTB, אשר הביא ערכים נמוכים יותר חדירות עבור חלקיקים אלה.
כדי להבליט את הרלוונטיות של מחקה BBTB לעומת הדגמים ויוו, עכברים עירום הוזרקו לווריד חלקיקים NP110 או NP350 מצופה של פפטיד פילוח הגידול קופ, מצומדת עם צבע אדום פלואורסצנטי (TRITC) עבור הזיהוי. רקמות שנאספו במספר נקודות זמן גילה כי לאחר 8 שעות, חלקיקים BBB-חדיר יש extravasated אל parenchyma המוח, בעוד nonpermeable אלה שנשארו במחזור בעיקר נוקתה מכל הלב מחזור מערכתי ויוו. לכן, אנו נאספים המוח, לכמת את מספר חלקיקים לכל מילימטר מרובע 8 שעות postinjection. על פי הממצאים במבחנה, NP110, אבל לא NP350, בהצלחה extravasated אל parenchyma המוח (איור 3C). ההגדלה גבוהה הדמיה של המיקום nanoparticle במוח הראה כי NP110 היה homogeneously מופץ ב- parenchyma המוח מחוץ הנימים דם ולא בהצלחה שני חיבורים לתאים גליובלסטומה מושתל (דמות תלת-ממד). למרות המציגות את הגידול באותו מיקוד moiety (קופ), NP350 לא היתה אפשרות בורחת אל parenchyma המוח, התגלתה רק בתוך בצד luminal של המוח כלי הדם (איור 3E), הדומה התוצאות המתקבלות במבחנה.
איור 1: תיאור מודל הגידול-מכשול (BBTB) דם-מוח. (א) ייצוג סכמטי של המיקומים של סוגי תאים שונים. (B) איור של המיקום הוספה על הכיסוי של 6-. ובכן, את טכניקת זריעה האסטרוציטים בצד המוח של תותב's ממברנה. איור (C) של צלחת 6-ובכן מיקום המאפשר הדבקה אסטרוציט. (ד) Immunofluorescence micrographs של צומת חזק חלבונים zonula occludens-1 (שורה זו-1, העליון, אדום) ו- claudin-5 (שורה התחתונה, ירוק). הביטוי חלבון מושווה מאתר microvascular אנדותל תאי המוח (bEND3) תרבותי בצד דם של BBTB לבד כמו גידולי תעשייה (עמודה שמאלית) או עם מאתר מונצחים HIFko האסטרוציטים (בעמודה הימנית). גרעין התא counterstained עם דאפי (כחול). (E) מציג החלבון חומצי fibrillary גליה (GFAP, אדום) ב- HIFko האסטרוציטים תרבותי בצד המוח של BBTB micrograph Immunofluorescence. התמונה גבוהה ההגדלה מציגה אסטרוציט תהליכים, סוף-רגל (חיצים) פנייה אל תאי אנדותל דרך הקרום נקבוביות (לוח נכון). זהותו של האסטרוציטים HIFko אומתה על ידי immunofluorescence מכתים של וירוס קופיים 40 גדול T אנטיגן (SV40 גדול T, ירוק) המשמש את immortalization של התאים. תאי אנדותל לבטא את GFAP וגם את T גדול של SV40 ו, לכן, יכול להיות חלקית שנצפו דרך שקופים, בצד הנגדי של הקרום כמו תאים מוכתם, דאפי בלבד (קווים מקווקווים). גרעין התא counterstained עם דאפי (כחול). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: Intravital נחישות בשידור חי של העכבר חדירות BBB. (א) הכנת הצנתר מושתלת וריד סימטרית. ציוד וכלים (1) הן הבאות: צינור פוליאתילן () PE20 (b) שני 25 גרם נידלס מלקחיים (c) רוצ'סטר-Ochsner, (ד) קטן בולדוג קלאמפ. (2) א 25 * G המחט יוסר על ידי מספר torsions באמצעות מלקחיים (3) בזהירות מוכנס הצינור. (4) לצד השני של הצינור מחובר עוד מחט 25 גרם. (B) הדרכה עבור השתלה קטטר ומיקום כדי להשרות את הפתרון סודיום-fluorescein דרך וריד הזנב עכבר. חגו באזור מציינת את האזור בו טיפה של דבק מגע, דבק הוא ממוקם מימין מאובטחים הצנתר. המלחציים בולדוג התעסקנו עם הצנתר, כשנקבל הצנתר מאובטחת. (ג) נציג הדמיה כימות שיטת כדי לקבוע את הערכים חדירות של נתרן-fluorescein. לפני החדרת סודיום-fluorescein (עמודה שמאלית), autofluorescence/הריק נמדד בתוך אזור בעל עניין (ROI) מניחים על המוח (מלבן החלונית העליונה, לבן) ואת כלי הדם באזורים (המלבן לוח, האדום התחתון). במהלך החדרת סודיום-fluorescein (בעמודה הימנית), עוצמת קרינה פלואורסצנטית נמדד בשני ROIs, המאפשר חישוב החדירות BBB. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: חיזוי של transcytosis גרם של חלקיקים באמצעות BBB ויוו באמצעות מודל BBTB במבחנה. (א) ייצוג גרפי של וזמינותו BBTB להחליפן בתמונות קונאפוקלית שהושג ברמות שונות המצוין של המודל מאתר BBTB. חלקיקי של 110 nm קוטר (NP110) ואת מצומדת כדי FITC (ירוק) נוספו הדם היו בצד של התאים BBTB בלוחיות החללית lysosomal (LT-99, אדום). (1) Endothelial תאים, transcytosis (2) Endothelial של חלקיקים דרך הנקבוביות של הקרום (לבן קו מקווקו), (3) האסטרוציטים, הספירות גליובלסטומה החולה (4) מזוהים על פריט הגרפיקה ולאחר המקביל micrographs קונאפוקלית (מימין). Lysosomal ומגעים חלקיקים (חיצים) מציע transcytosis פעיל דרך שכבות אנדותל, אסטרוציט של BBTB. כימות החדירות nanoparticle המצוין באמצעות הפריה BBTB (B) (n = 6). (ג) כימות של צפיפות nanoparticle המצוין בתוך רקמת המוח סעיפים, 8 שעות לאחר העירוי וריד סימטרית של העכברים עירום (n = 3). (ד) micrographs קונאפוקלית מציג את ההתפלגות של ø nm 110 חלקיקים (NP110, אדום) בסעיפים רקמת המוח מאתר בתווית עם נוגדן CD31 אנטי-עכבר (ירוק). החץ מסמן את transcytosis ננו-חלקיק (החלונית הימנית). חלקיקים שהצטברו סביב גידול תאי המוח (גידול, לוח נכון) בשל פפטיד פילוח קופ המוצגות על פני השטח שלהם. אין יונת משמעותי הוא ציין ברקמת המוח (המוח). Micrographs קונאפוקלית (E) מראים חלוקת ø 350 nm חלקיקים (NP350, אדום) רקמת המוח מאתר למקטעים הנקרא עם נוגדן CD31 אנטי-עכבר (ירוק). ראשי החץ לנקודת NP350s היו נשמרים בלומן כלי דם, לא הצליחו לעבור BBB, כנראה בגלל שלהם בקוטר גדול יותר בהשוואה גרעינים תא NP110s. הן counterstained עם דאפי (כחול). P < 0.01. P-ערכים חושבו באמצעות מבחן מאן-ויטני U-זנבית, nonparametric. קווי השגיאה מייצגים את סטיית התקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| מאתר BBTB לחקות | bEND3 | bEND3 + HIFko כמו | bEND3 + ג'יגה-בתים | bEND3 + HIFko כמו + ג'יגה-בתים | אין ויוו |
| חדירות (10-6 ס"מ/s) | 27.63 | 6.74 | 26.8 | 10.83 | 5.57 מקצועית |
| SD (10-6 ס"מ/s) | 3.45 | 3.01 | 7.99 | 2.65 | 2.19 |
| האדם לחקות BBTB | HuAR2T | HuAR2T + hIAs | HuAR2T + GB | HuAR2T + hIAs + ג'יגה-בתים | |
| חדירות (10-6 ס"מ/s) | 104.92 | 47.4 | 89.08 | 48.24 | |
| SD (10-6 ס"מ/s) | 27.1 | 14.32 | 10.21 | 13.07 |
טבלה 1: ערכים של החדירות נתרן-fluorescein (Na-Fl) (בסנטימטרים לשניה) נקבע במבחנה במערכות המצוין תרבות משותפת, אין ויוו בעכברים עירום NMRI. נתונים מניסוי נציג (n = 3 עכברים).
Discussion
עלייתו של המושג השתנות הגידול interpatient נעורי את המחקר על סרטן אישית רפואה21. ההשתנות מהווה סימן היכר של מערכת העצבים המרכזית neoplasms. בשל הוודאות של הגידול, בתגובה כימותרפיה מוסיף השפעת BBB למשלוח סמים sheltering, ומהווה לגמרי האתגרים העיקריים בחולה22. כדי לפתח טיפולים יעילים יותר, יש לעיתים קרובות צורך ספריות מסך גדול של מולקולות חדשות. כדי להעריך את היעילות antitumor והיכולת של ההפניות טיפולית חדשה כדי להגיע לאתר הגידול, האפשרות הטובה ביותר היא מחקר קליני בתאי נגזר החולה מושתל ויוו לתוך מאתר avatars החולה. בשל מעשי (, זמן, אנושי, ולא מתקן משאבים כספיים) סיבות אתיות (3Rs העיקרון בעת שימוש חיות מעבדה), התפתחות כזו פלטפורמה ההקרנה ויוו בקנה מידה גדול הוא לעתים קרובות לא אפשרי, ומכאן גם את מבחני מבוססת-תא נשארים מודל של הבחירה23. הסיבה העיקרית לבחירת הוקמה שורות תאים, הימנעות ראשי התאים היא להקל את הפארמצבטית ולצמצם את השימוש של חיות מעבדה, אשר הם המקור העיקרי של בידוד והקמת תרבויות מאתר ראשי. השיטות מציגים כאן, ציות בחוזקה 3Rs, יכול ביעילות להתעלם חלקיקים מן נוסף פרה חקירה על criterium של היכולת לחצות את מודל BBTB. בתור הוכחה-של-עיקרון, נתאר כאן שהתקבל במהלך פיתוח, אימות של BBTB הממצאים. הצלחנו לאשר ממצאים במבחנה ויוו, למשל כאשר מדידת פעפוע פסיבי של נתרן-fluorescein Da 376.
פרוטוקול המתוארים במאמר זה מתאר את הכנת תאי אנדותל cocultured עם האסטרוציטים כדי ליצור ממשק דמויי גידול מחסום דם-מוח לפי התקנה במבחנה. לאחר איש קשר פיזי בין סוגי תאים שני אלה הוא הוקם, השכבה תא אנדותל מוצגים קווי דמיון עם BBB (למשל, תא השטח ביטוי של חלבונים צומת חזק, חדירות נמוכה יחסית). מעניין, החיקוי BBTB מאתר נראה לספק ערכי חדירות Na-Fl במיוחד דומים לאלו שהושגו עם העכבר ויוו BBB-חדירות-מידות-24. לכן, הביצועים של מחקה BBTB תקושר ישירות על הבחירה של התאים השתמשו בידיות המכשול. תאי אנדותל bEND3 מקורן במוח, ידועים כדי להיות מוצלחת ויוצרים מחסומים כאשר cocultured האסטרוציטים25. עם זאת, אנחנו כבר משתמש האסטרוציטים HIFko immortalized26 ליצירת לחקות את BBTB. בשל חוסר פקטור היפוקסיה-inducible שלהם, אלה האסטרוציטים אינם מייצרים VEGF-A, שהוא התגלמות בייצוב של החיקוי BBTB המתוארים כאן. האסטרוציטים זוהו מאפננים של החדירות BBB, למשל דרך שחרורו של VEGF-A בתגובה neuroinflammation27. הפעלה של קולטני צמיחה אנדותל כלי הדם (VEGFRs) היא מווסת מפתח של החדירות אנדותל/כלי הדם הן חוץ גופית28 והן ויוו29. לכן, VEGF-A תוספי במדיום להפעיל את VEGFR2 על תאי אנדותל, אשר גורם זירחון של חלבונים צומת adherens כגון VE-קדהרין30. האובדן של תאי אנדותל-תא אנשי קשר יוצר כלי הדם חדיר מאוד. באופן דומה, המאפיין mitogenic חזקה והן הרכב לא ידוע של sera שור העובר המשמשים את מבחני תרבות תא לגרום הנושאים העיקריים הפארמצבטית מייצב ואת וזמינותו מכשול ההפרדה.
הוא יפתור תאי אנדותל (HUVECs) משמשות לעתים בצורה BBB חוץ גופית31; עם זאת, הם באופן משמעותי שונים מתאי המוח microvascular אנדותל, כגון התא hCMEC/D3 קו32, במונחים של ביטוי גנים ויוצרים מחסום מאפיינים. עם זאת, החדירות גבוהים יחסית הערכים שהתקבלו עם תאי HuAR2T גדל לבד לעומת bEND3 היו מאוד מופחת מאת coculturing אותם עם האנושי האסטרוציטים העיקרי. למרות תאי אנדותל נדרשים כדי ליצור הקיר הסלולר, ברור שיש האסטרוציטים תפקיד לא פחות חשוב כדי להפוך את היווצרות BBTB מייצב.
כאשר החולה-derived glioma הספירות נוספו המשוואה הזו, החיקוי BBTB העכבר recapitulated כמה מן התכונות של מאתר xenografts, כגון תרופות פעפוע דרך להערכת את המוח ואת הגידול תא הפגיעה המכוונת. מחקה BBTB שנדונו כאן היו, למשל, מוצלח שיקוף ההתנהגות ויוו כאשר הוקרנו מספר חלקיקים עם קטרים שונים. כדי להמחיש את ההקבלה בין הדגמים במבחנה, ויוו, השתמשנו mesoporous שתואר לעיל סיליקט חלקיקים33 עם חודר לתא מאפיינים34 מצומדת כדי פפטיד פילוח הגידול קופ על שלהם surface20. פילוח קופ פפטיד הבתים תאים גידול פולשני דרך האיגוד ספציפית לחומר המדכא החלב נגזר צמיחה (MDGI). סרטן מספר, כולל gliomas, הן overexpressing MDGI לעומת את הרקמות35, מה שהופך קופ moiety פילוח הגידול יעילה מאוד מסוגל להגדיל את מסירת המטען20. חלקיקים המשמש כאן בעבר הוכחו לפזר אל parenchyma המוח (27547955), כאשר functionalized עם טקסול, הננו-מטענים אלה הוכתרו בהפחתת גידול glioma במודלים פרה36. התוספת של שאריות פוליאתילן גליקול (PEG) על פני השטח של חלקיקים נשמר גם תשלום סטטי שלהם ערכים חיוביים (סביב + 4 mV), המאפשר אינטראקציה טובה יותר עם יחידת נוירו-וסקולריים37 וגם להגדיל את היציבות שלהם במחזור. הנתונים שהוצגו, kDa 3 של פג היה מצומדת כדי NP110s, בעוד NP350s היו מצופים kDa 10 של פג. עם זאת, גדל משקל מולקולרי פג גם הביא לעליה משמעותית הקוטר ננו-חלקיק, ומכאן יכולותיו הפיזיות שלהם לעבור BBB. לכן, בדקנו אם הממדים הפיזיים של חלקיקי מנעו מעבר שלהם דרך BBTB, אם תצפיות אלה יכול להיות שיקוף ויוו.
לפי תצפיות שפורסמו בעבר, הבחנו כי NP110s extravasated דרך BBTB את המבחנה והן BBB של עכברים הנושאת גידולים תוך גולגולתי, בעוד NP350s שמרו על הצד luminal של החיקוי BBTB, בכלי הדם של עכברים. אלה תוצאות דומות ממליצים כי המודל BBTB ניבא את היכולת ויוו של חלקיקים חוצה BBB ולהגיע המוח.
הרלוונטיות של דגמי הסלולר של BBB נדון פעמים רבות, אפילו למסירה המרכזי של חלקיקים38. אנו מראים פה כי האסטרוציטים העיקרי ותאי אנדותל, שניהם נחשב כלי במבחנה הרלוונטי ביותר, יכול להיות מוחלף על ידי תאים מונצח ו/או זמינים מסחרית, מדרגיות רבה יותר של הפארמצבטית. ניתן לפתח את הדור הבא של מחקה-BBB במבחנה על-ידי שילוב המכשירים microfluidic, המאפשר יחידות בנוי להפליא נוירו-וסקולריים הדומות מבחינה מבנית בפועל BBB12,14. עם זאת, מודלים כאלה הזדהמו כעת להקרנה תפוקה גבוהה של מולקולות נמסר gliomas, עקב מגבלות טכניות ההמשך של משלוח14. זה אכן קשה ללכוד את המורכבות הפיזיולוגית של BBB בקערה, היעדר רצפטורים/חלבונים מסוימים, הידועים לבוא לידי ביטוי על ידי BBB, אפשרי עלול לסכן את הפרשנות של התוצאות. טיעון נוסף נוגע ההשתנות נהדר בביטוי הגנים בין ויוו ותנאי במבחנה, כמו גם משורת מתא אחד למשנהו, במיוחד בהתחשב תאי אנדותל. עם זאת, זה יכול להיות גרס כי יחידת נוירו-וסקולריים אינה ישות אחידה בתוך המוח39. המחקר המדעי בביולוגיה הגיע עידן אנושי שבו את רווחת אחריות מוסרית, העלות של שימוש בבעלי חיים חיים תמיד נחשבים לפני תכנון הניסוי. לכן, כדי לתמוך ההחלפה של בעלי חיים, מספר גדל והולך של מחקרים שנעשו לאחרונה מראים כי המודעות של המגבלות של הדגמים ומבחר בזהירות דגמי הסלולר להקים מכשול ההפרדה – עם דגש על האסטרוציטים — צו התאמה בין התוצאות שהושגו בקערה, של בעל חיים מודלים40. עם המתודולוגיה המתוארת כאן, אנחנו מקבלים צעד אחד קרוב יותר כדי להפחית את מספר חיות ניסוי המשמש לסינון למטרות של BBB transcytosis עבור פוטנציאל הרפוי.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי מענקים הארגונים סרטן פינית, ג'יין & Aatos Erkko קרן, סיגריד Juselius קרן (פ. ל ו- V.L.J.), הקרן הלאומית למדע שוויצרי (Postdoc.Mobility מתקדם הענק לא: P300PB_164732, ל S. ק') קרן מחקר אוריון (ל. ס. ק), קרן ההנצחה Kuistila מוד (ל. ס. ק), האקדמיה של פינלנד (TERVA 2017, גרנט לא: 314 498). יחידת דימות (הלסינקי) Biomedicum הוא הודה למתן את מיקרוסקופ הדמיה מתקן הליבה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells | |||
| bEND3 | ATCC | CRL-2299 | Cultured in: DMEM (1g/L glucose) supplemented with 10% FBS, 5 mL L-glutamine and 5 mL penicillin/streptomycin |
| HIFko immortalized mouse astrocytes | Isolated in Dr. Gabriele Bergers Lab | https://doi.org/10.1016/S1535-6108(03)00194-6 | Cultured in: BME-1 supplemented with 5% FBS, 5 mL 1 M HEPES, 5 mL 100 mM sodium pyruvate, 3 g D-glucose and 5 mL penicillin/streptomycin |
| HuAR2T | Isolated in Dr. Dagmar Wirth Lab | https://doi.org/10.1089/ten.tea.2009.0184 | Cultured in: EBM-2 with SupplementMix |
| normal human primary astrocytes | Lonza | CC-2565 | Cultured in: ABM with SingleQuots |
| Material and reagents | |||
| 100 mm x17 mm Dish, Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific | 150350 | |
| 10 mL serological pipet | ThermoFisher Scientific | 170361 | |
| 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339650 | |
| ABM Basal Medium, 500 mL | Lonza | CC-3187 | For primary human astrocytes. ABM+: contains all the additives from the supplement mix. ABM-:all the additives except for rhEGF and FBS |
| Accutase Cell Detachment Solution | Corning | 25-058-CI | |
| AGM SingleQuots Supplements and Growth Factors | Lonza | CC-4123 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | for both GBM + and - medium |
| Basal Medium Eagle | ThermoFisher Scientific | 21010046 | BME-1 |
| Corning Costar TC-Treated 6-Well Plates | Sigma-Aldrich | CLS3506 | |
| Corning Transwell polyester membrane cell culture inserts | Sigma-Aldrich | CLS3452 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | dissolve in 50 mL of BME-1 and sterile filter before adding to the medium |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient F-12 Ham | Gibco | 21331-020 | Specific to the culture of the patient-derived spheres isolated in our lab, may vary for other glioma cell lines |
| EBM-2 growth Medium SupplementMix | PromoCell | c-39216 | EBM+: contains all the additives from the supplement mix. EBM-:all the additives except for VEGF-A and FBS |
| Endothelial Basal Medium 2 (EBM-2) | PromoCell | c-22211 | EBM+: contains all the additives from the supplement mix. EBM-:all the additives except for VEGF-A and FBS |
| Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin | ThermoFisher Scientific | 10500056 | |
| Fluorescein sodium salt | Sigma-Aldrich | F6377 | |
| Greiner CELLSTAR 96 well plates | Sigma-Aldrich | Greiner 655090 | black polystyrene wells flat bottom (with micro-clear bottom) |
| Menzel-Gläser 0.9 cm round borosilicate Cover Slips | Thermo Scientific | 10313573 | |
| PBS tablets | Medicago | 09-9400-100 | one tablet per liter of dH2O, then sterilize the solution by autoclaving |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6407 | |
| Recombinant Human EGF | Peprotech | GMP100-15 | for GBM+ medium |
| Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) | Peprotech | 100-18B | for GBM+ medium |
| Immunofluorescence | |||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| 24 mm x 60 mm microscope slide cover glass | ORSAtec | 0224601-D | |
| AlexaFluor 488 and 594 secondary antibodies | ThermoFisher Scientific | dilution: 1/500 | |
| Anti-Claudin-5 antibody | Abcam | ab15106 | dilution: 1/150 |
| Anti-GFAP antibody clone GF5 | Abcam | ab10062 | dilution: 1/150 |
| Anti-Mouse CD31 antibody Clone MEC 13.3 | BD Biosciences | 550274 | dilution 1/800 |
| Anti-SV40 T-antigen antibody | Abcam | ab16879 | dilution: 1/150 |
| Anti-Zonula Occludens-1 | Abcam | ab96587 | dilution: 1/200 |
| DAPI | TOCRIS | 5748 | |
| Fluoromount Aqueous Mounting Medium | Sigma-Aldrich | F4680 | |
| LysoTracker Red DND-99 | ThermoFisher Scientific | L7528 | |
| Animal procedures | |||
| 10 cm curved dissecting scissors | World Precision Instruments | 14394 | |
| BD Microlance 25 G needles | Becton Dickinson | 300600 | |
| Fine Forceps (12.5 cm) | World Precision Instruments | 503283 | for tissue dissociation |
| Intramedic Polyethylene tubing PE20 | Becton Dickinson | 427406 | |
| Ketaminol vet 50 mg/mL | Intervet | Vnr511485 | Ketamine |
| Mains Powered microdrill | World Precision Instruments | 503599 | |
| Menzel-Gläser 0.5 cm round borosilicate Cover Slips | Thermo Scientific | 11888372 | |
| Micro Bulldog clamp | World Precision Instruments | 14119 | |
| Physiological saline solution | Mustela | Sterile single dose vials 20 x 5 mL / 40 x 5 mL - Medical device class | |
| Rochester-Oschner forceps | World Precision Instruments | 501709 | |
| Rompun vet 20 mg/mL | Intervet | Vnr148999 | Xylazine |
| Stereotaxic adapter | World Precision Instruments | 502063 | |
| Sugi Sponge Points | Kettenbach | 31603 | |
| Equipment | |||
| Axio Zoom.V16 fluorescence stereo zoom microscope | Carl Zeiss | ||
| FLUOstar Omega microplate reader | BMG Labtech | ||
| ORCA-Flash 4.0 digital sCMOS camera | Hamamatsu Photonics | ||
| Universal 320 tabletop centrifuge | Hettich | Cat. No. 1401 | |
| ZEISS LSM 880 with Airyscan confocal microscope | Carl Zeiss |
References
- Daneman, R., Prat, A.
- Quail, D. F., Joyce, J. A.
- Wang, Z., Sun, H., Yakisich, J. S. Overcoming the blood-brain barrier for chemotherapy: limitations, challenges and rising problems. Anticancer Agents in Medicinal Chemistry. 14 (8), 1085-1093 (2014).
- Alkins, R. D., Brodersen, P. M., Sodhi, R. N., Hynynen, K. Enhancing drug delivery for boron neutron capture therapy of brain tumors with focused ultrasound. Neuro Oncology. 15 (9), 1225-1235 (2013).
- Alli, S., et al. Brainstem blood brain barrier disruption using focused ultrasound: A demonstration of feasibility and enhanced doxorubicin delivery. Journal of Controlled Release. 281, 29-41 (2018).
- Ashby, L. S., Smith, K. A., Stea, B. Gliadel wafer implantation combined with standard radiotherapy and concurrent followed by adjuvant temozolomide for treatment of newly diagnosed high-grade glioma: a systematic literature review. World Journal of Surgical Oncology. 14 (1), 225 (2016).
- Guishard, A. F., Yakisich, J. S., Azad, N., Iyer, A. K. V. Translational gap in ongoing clinical trials for glioma. Journal of Clinical Neurosciences. 47, 28-42 (2018).
- Rahman, N. A., et al. Immortalized endothelial cell lines for in vitro blood-brain barrier models: A systematic review. Brain Research. 1642, 532-545 (2016).
- Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).
- Wang, J. D., Khafagy, el-S., Khanafer, K., Takayama, S., ElSayed, M. E. Organization of Endothelial Cells, Pericytes, and Astrocytes into a 3D Microfluidic in Vitro Model of the Blood-Brain Barrier. Molecular Pharmaceutics. 13 (3), 895-906 (2016).
- Phan, D. T., et al. Blood-brain barrier-on-a-chip: Microphysiological systems that capture the complexity of the blood-central nervous system interface. Experimental Biology and Medicine (Maywood). 242 (17), 1669-1678 (2017).
- Bang, S., et al. A Low Permeability Microfluidic Blood-Brain Barrier Platform with Direct Contact between Perfusable Vascular Network and Astrocytes. Scientific Reports. 7 (1), 8083 (2017).
- Wilhelm, I., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier for the study of drug delivery to the brain. Molecular Pharmacology. 11 (7), 1949-1963 (2014).
- Campisi, M., et al. 3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes. Biomaterials. 180, 117-129 (2018).
- Pirsko, V., et al. An Effect of Culture Media on Epithelial Differentiation Markers in Breast Cancer Cell Lines MCF7, MDA-MB-436 and SkBr3. Medicina (Kaunas). 54 (2), (2018).
- Stebbins, M. J., et al. Differentiation and characterization of human pluripotent stem cell-derived brain microvascular endothelial cells. Methods. 101, 93-102 (2016).
- Canfield, S. G., et al. An isogenic blood-brain barrier model comprising brain endothelial cells, astrocytes, and neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Journal of Neurochemistry. 140 (6), 874-888 (2017).
- Cao, Y., et al. Hypoxia-inducible factor-1alpha is involved in isoflurane-induced blood-brain barrier disruption in aged rats model of POCD. Behavioural Brain Research. 339, 39-46 (2018).
- Abbott, N. J. Astrocyte-endothelial interactions and blood-brain barrier permeability. Journal of Anatomy. 200 (6), 629-638 (2002).
- Kinnari, P. J., et al. Tumour homing peptide-functionalized porous silicon nanovectors for cancer therapy. Biomaterials. 34 (36), 9134-9141 (2013).
- Levin, V. A.
- Weathers, S. S., Gilbert, M. R. Toward Personalized Targeted Therapeutics: An Overview. Neurotherapeutics. 14 (2), 256-264 (2017).
- O'Duibhir, E., Carragher, N. O., Pollard, S. M. Accelerating glioblastoma drug discovery: Convergence of patient-derived models, genome editing and phenotypic screening. Molecular and Cellular Neuroscience. 80, 198-207 (2017).
- Kaya, M., Ahishali, B. Assessment of permeability in barrier type of endothelium in brain using tracers: Evans blue, sodium fluorescein, and horseradish peroxidase. Methods in Molecular Biology. 763, 369-382 (2011).
- Yang, S., et al. Identification of two immortalized cell lines, ECV304 and bEnd3, for in vitro permeability studies of blood-brain barrier. PLoS One. 12 (10), e0187017 (2017).
- Blouw, B., et al. The hypoxic response of tumors is dependent on their microenvironment. Cancer Cell. 4 (2), 133-146 (2003).
- Argaw, A. T., et al. Astrocyte-derived VEGF-A drives blood-brain barrier disruption in CNS inflammatory disease. Journal of Clinical Investigation. 122 (7), 2454-2468 (2012).
- Miao, Z., et al. VEGF increases paracellular permeability in brain endothelial cells via upregulation of EphA2. The Anatomical Record (Hoboken). 297 (5), 964-972 (2014).
- Heinolainen, K., et al. VEGFR3 Modulates Vascular Permeability by Controlling VEGF/VEGFR2 Signaling. Circulation Research. 120 (9), 1414-1425 (2017).
- Claesson-Welsh, L.
- Adriani, G., Ma, D., Pavesi, A., Goh, E. L., Kamm, R. D. Modeling the Blood-Brain Barrier in a 3D triple co-culture microfluidic system. Conference Proceedings - IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 2015, 338-341 (2015).
- Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids and Barriers of the CNS. 10 (1), 16 (2013).
- Paatero, I., et al. Analyses in zebrafish embryos reveal that nanotoxicity profiles are dependent on surface-functionalization controlled penetrance of biological membranes. Scientific Reports. 7 (1), 8423 (2017).
- Prabhakar, N., et al. Stimuli-responsive hybrid nanocarriers developed by controllable integration of hyperbranched PEI with mesoporous silica nanoparticles for sustained intracellular siRNA delivery. International Journal of Nanomedicine. 11, 6591-6608 (2016).
- Hyvonen, M., et al. Novel target for peptide-based imaging and treatment of brain tumors. Molecular Cancer Therapeutics. 13 (4), 996-1007 (2014).
- Feng, X., et al. Mammary-Derived Growth Inhibitor Targeting Peptide-Modified PEG-PLA Nanoparticles for Enhanced Targeted Glioblastoma Therapy. Bioconjugate Chemistry. 26 (8), 1850-1861 (2015).
- Nance, E. A., et al. A dense poly(ethylene glycol) coating improves penetration of large polymeric nanoparticles within brain tissue. Science Translational Medicine. 4 (149), 149rA119 (2012).
- Berg, C. Quantitative analysis of nanoparticle transport through in vitro blood-brain barrier models. Tissue Barriers. 4 (1), e1143545 (2016).
- Noumbissi, M. E., Galasso, B., Stins, M. F. Brain vascular heterogeneity: implications for disease pathogenesis and design of in vitro blood-brain barrier models. Fluids and Barriers of the CNS. 15 (1), 12 (2018).
- Heymans, M., Sevin, E., Gosselet, F., Lundquist, S., Culot, M. Mimicking brain tissue binding in an in vitro model of the blood-brain barrier illustrates differences between in vitro and in vivo methods for assessing the rate of brain penetration. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 127, 453-461 (2018).
