Summary
Médicament ciblant les tumeurs du système nerveux central est un défi majeur. Nous décrivons ici un protocole pour produire un imitateur in vitro de la tumeur-barrière hémato-encéphalique à l’aide de cellules murines ou humaines et discuter de leur pertinence pour la prévisibilité du système nerveux central ciblant les tumeurs in vivo.
Abstract
Hautement sélective par nature, la barrière sang - encéphalique (BHE) est essentielle pour l’homéostasie du cerveau dans des conditions physiologiques. Toutefois, dans le cadre des tumeurs cérébrales, la sélectivité moléculaire de BBB protège également les cellules néoplasiques en bloquant la livraison des chimiothérapies périphériquement administrées. Le développement de nouveaux médicaments (y compris des nanoparticules) ciblant les tumeurs cérébrales malignes idéalement nécessite l’utilisation de modèles animaux précliniques pour étudier la transcytose et l’efficacité antitumorale du médicament. Afin de respecter le principe des 3R (affiner, réduire et remplacer) pour réduire le nombre d’animaux de laboratoire en montage expérimental et effectuer le criblage à haut débit d’une grande bibliothèque d’agents antitumoraux, nous avons développé un humain in vitro reproductible et murine imitateur de l’hémato-encéphalique tumeur-barrière (BBTB) à l’aide de cultures de trois couches de cellules endothéliales, astrocytes et sphères de glioblastome dérivé de patient. Pour plus d’évolutivité et de reproductibilité, lignées de cellules commerciales ou cellules immortalisées ont été utilisés dans des conditions adaptées pour permettre la formation d’une barrière qui ressemble à la BHE réelle. Nous décrivons ici un protocole afin d’obtenir un imitateur BBTB en cultivant des cellules endothéliales en contact avec les astrocytes à la densité des cellules spécifiques sur les inserts. Cet imitateur BBTB peut être utilisé, par exemple, pour la quantification et l’imagerie confocale du passage nanoparticule à travers les barrières endothéliales et astrocytes, en plus d’évaluer le ciblage de cellules de tumeur dans la même épreuve. En outre, nous montrons que les données obtenues permet de prédire le comportement des nanoparticules dans les modèles animaux précliniques. Dans une perspective plus large, ce modèle in vitro pourrait être adapté à d’autres maladies neurodégénératives, pour la détermination de l’adoption de nouvelles molécules thérapeutiques à travers la BHE et/ou être additionné de cerveau organoïdes d’évaluer directement l’efficacité de médicaments.
Introduction
L’unité neurovasculaire est composée de neurones, les astrocytes et le BBB, formé par des liens complexes entre la membrane basale associée formant le cerveau système microvasculaire1, cellules endothéliales, péricytes et astrocytes. Cette paroi cellulaire serrée formée par navires continues, nonfenestrated finement réglemente la circulation des ions et molécules (y compris les hormones, substances nutritives ou médicaments), mais également des cellules1en circulation. La transcytose faible notamment à travers la BHE de molécules de poids moléculaire élevé, comme anticorps thérapeutiques, médicaments conjugués ou nanocompounds, limite considérablement les progrès dans la découverte de médicaments pour des maladies neurologiques, notamment malignes 2de gliomes. En effet, les chimiothérapies par voie orale ou intraveineuse livrés atteint le parenchyme du cerveau souvent en mal de faibles concentrations d’induire un effet antitumoral ou sont tout simplement incapables de franchir la BBTB pour atteindre les cellules néoplasiques3. Plusieurs études précliniques et cliniques n’ont pas traité de la question de pénétration BBTB mais ont tenté de perturber la BBTB transitoirement, par exemple en utilisant des ultrasons focalisé4,5, ou pour contourner par le direct sur place livraison de médicaments6. Cependant, aucune de ces techniques ont été en mesure de contrer l’expansion inévitable de tumeur ou de rechute. Donc, lors de l’élaboration de nouveaux traitements antiglioma, la diffusion à travers le BBTB devrait être considérée comme un des aspects essentiels pour la réalisation des agents thérapeutiques7.
En raison de la nature très complexe des interactions cellulaires dans le BBTB, études in vivo chez les animaux de laboratoire semblent être le choix évident lorsque l'on étudie le passage de molécules du sang au cerveau. Cependant, les méthodes in vivo de grande échelle sont relativement complexes à mettre en place et, par conséquent, ne permettent pas le criblage à haut débit de molécules dans un délai raisonnable à un coût raisonnable. Plus important encore, expérimentation animale doit suivre les directives éthiques 3R défini comme i) affiner, réduire les ii) et, de pertinence dans le contexte actuel, iii) remplacer par d’autres protocoles (par exemple, dans les méthodes in vitro/in silico). Par conséquent, recréant la BBTB in vitro apparaît comme une possibilité intéressante et attrayante, mais elle constitue aussi une tâche complexe, contestée par diverses limitations. Beaucoup tente de recréer ce milieu complex avec les cellules primaires ou de lignées cellulaires de canine, porcin, origine murine et même humain ont été publiées (évaluée par Rahman et coll.8 et9de la loi Helms et al.). Ces modèles incluent microfluidique en trois dimensions des systèmes10, BBB-on-a-chip11,12, et une multitude de variantes basées sur les cultures de co classiques en insère des systèmes. Néanmoins, les systèmes actuels de microfluidique et puce sont pas adapté aux drogues-validation rapide et à haut débit études13,14 ou sont actuellement incompatible avec les études de la délivrance de médicaments à des tumeurs au cerveau. En outre, l’examen des 155 modèles publiés à l’aide de cellules primaires, les cellules souches pluripotentes inductible (iPSC) ou lignées de cellules commerciales toutes les insertions ont cultivées sur affichait une tendance de divergence interstudy dans leurs mesures et/ou conclusions8. Ce manque de reproductibilité interlaboratoire pourrait être corrélé avec les conditions de culture i) non normalisée, par exemple avec le revêtement facultatif avec les protéines de la membrane basale matrice dans le récipient de culture cellulaire, ii) un nombre accru de sous-culture et son utilisation sérum contenant des médias, les deux principaux moteurs des modifications génétiques et phénotypiques des cellules lignes15, ou iii) la difficulté de façon reproductible recréer le juste équilibre entre les astroglials et les composants endothéliales dans un plat. Bien que l’utilisation de cellules immortalisées ou cellule commerciale de lignes pour établir un modèle in vitro de BBB manque quelques-unes des propriétés par rapport à des modèles similaires qui utilisent uniquement les cellules primaires, dans la méthode décrite, nous montrons que la bonne combinaison de cellules expositions une très des performances comparables à des études publiées dans d’autres modèles de référence16,17. Finalement, l’absence d’un modèle fiable et reproductible pour étudier le passage de composés thérapeutiques ciblant les tumeurs au cerveau par le biais de la BBTB motivés à développer les méthodes décrites ici.
Puisque l’objectif était d’utiliser le modèle pour prévoir la livraison in vivo des nanoparticules dans les modèles animaux précliniques, nous avons tout d’abord validé le modèle BBTB en utilisant des encarts contenant des cellules endothéliales murines en contact avec les astrocytes murines. En plus de cela, nous avons également optimisé le modèle pour utiliser certaines lignées cellulaires humaines. Une fois stabilisée, les barrières de la cellule sont transférés aux cultures avec glioblastome dérivé de patient sphères ou lignées de cellules de gliome commerciale. Par la suite, la transcytose de nanoparticules et ciblant les cellules tumorales peut être visualisée par microscopie confocale et quantifiée par le prélèvement d’échantillons au fil du temps. Ce qui est important, résultats obtenus à l’aide de l’imite BBTB pourraient prédire de façon fiable le comportement des nanoparticules in vivo, soutenant l’utilisation de l’autorisation de reproduire BBTB la validation préclinique.
Protocol
Les expérimentations animales ont été approuvées par le Comité pour l’expérimentation animale de la District de Finlande méridionale (ESAVI/6285/04.10.07/2014).
1. création de l’imite BBTB
Remarque : Suppléments et milieu de culture cellulaire sont détaillés dans le tableau des matériaux.
- Préparation des astrocytes
Remarque : Les volumes suivants sont adaptés pour un plat de pétri de 10 cm ou un flacon de culture cellulaire T75.- Sous une hotte de culture de cellules stériles, se laver soigneusement les astrocytes cultivés avec 5 mL de sérum physiologique tamponnée au phosphate (PBS). Doucement, jeter les PBS à l’aide d’une pompe à vide et ajouter 2 mL de réactif dissociation cellulaire pendant 5 min (à 37 °C, voir la Table des matières) pour détacher les cellules. Vérifier le détachement des cellules au microscope. Ne dépassez pas 5 min d’incubation pour limiter le stress sur les cellules.
- Ajouter 10 mL de milieu de culture cellulaire stérile astrocyte complet (ABM +) au navire pour inhiber l’activité de la dissociation hématies. Utiliser une pipette stérile sérologique pour transférer les cellules individuelles du navire dans un tube stérile de 15 mL. Centrifuger la suspension cellulaire pendant 3 min à 250 rcf (accélération : 9 rcf/s, décélération : 5 FRC/s) à température ambiante (RT).
- Pendant ce temps, préparer les inserts (voir la Table des matières) : à l’aide d’une pince stérile, placer les inserts avec le côté du cerveau vers le haut (Figure 1 a) sur le couvercle d’une plaque de 6 puits stérile (Figure 1 b). Vérifiez au préalable que la plaque peut être placée à l’envers sur les plaquettes sans toucher ou déplacer les inserts au cours du processus.
Remarque : Le positionnement correct des inserts permet l’encapsulation de la suspension de l’astrocyte entre-deux la membrane et le fond du puits. - Une fois que centrifugé, soigneusement éliminer le surnageant de la suspension cellulaire ; resuspendre le culot astrocyte dans 1 mL de ABM + par resuspendant doucement le culot du tube's mur jusqu'à 5 x. Évitez de pipetage excessive des cellules afin de limiter le stress sur les cellules. Compter les cellules et d’ajuster la densité de suspension cellulaire de 1. 5 x 105 cellules de 400 µL de ABM + / insérer.
- Placez la suspension cellulaire au milieu du cerveau-le côté de l’insert'membrane s (Figure 1 b) et l’étaler très soigneusement, en utilisant la force capillaire avec un embout stérile. Évitez tout contact direct de la membrane étant particulièrement fragile.
- Avec le côté du cerveau des inserts toujours vers le haut, replacez la plaque 6 puits sur les inserts. Cela garantit que la suspension cellulaire est coincée entre la membrane et le fond réel du puits (Figure 1). Éviter les bulles d’air dans la suspension cellulaire, car il évitera la propagation homogène des astrocytes sur la membrane.
- Placer la plaque et les inserts, avec le côté du cerveau vers le haut, dans l’incubateur (à 37 °C et 5 % CO2) pour permettre l’adhérence cellule pendant un minimum de 2 h (astrocytes immortalisées murines) et jusqu'à 6 h (astrocytes primaires humains).
Remarque : Les inserts sont maintenus à l’envers, visualisation de l’adhérence cellulaire n’est pas possible sous un microscope. Il est donc recommandé d’un récipient de culture cellulaire ordinaire séparée des graines et de contrôler l’adhésion cellulaire dans le vaisseau au fil du temps. Attention, manipulation de la membrane est un must car les résultats seront fiables lorsque les membranes sont endommagés. - À la fin de la période d’incubation, vérifier l’absence de fuites de suspension cellulaire à l’extérieur de la zone de semis et jeter les inserts si elles sont perméables. Retourner la plaque 6 puits à son poste régulier, avec des inserts qui aura maintenant du côté de sang vers le haut (Figure 1 a). Ajouter 2,6 mL d’ABM + dans chaque puits. Versez 2,5 mL du milieu de l’astrocyte complète dans chaque insertion et placer la plaque dans l’incubateur (à 37 °C et 5 % CO2).
- Préparation des cellules endothéliales
Remarque : Pour les cerveau murin cellules endothéliales microvasculaires (bEND3), les cellules doivent atteindre 100 % confluence afin d’assurer des contacts maximale cellules déclenchant l’expression de protéines optimal de jonction serrée sur le jour de l’expérience. Ceci ne s’applique pas pour les cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HuAR2T) car la présence d’astrocytes est nécessaire pour une expression de protéines de jonction serrée pour ces cellules.- Procéder comme décrit précédemment pour les astrocytes (points 1.1.1 et 1.1.2.). Une fois que centrifugé, soigneusement éliminer le surnageant ; resuspendre le culot de cellules endothéliales dans 1 mL de milieu de culture de cellules endothéliales complet (EBM +) par pipetage lentement la suspension cellulaire sur le tube's mur jusqu'à 5 x. Évitez de pipetage excessive des cellules afin de limiter le stress sur les cellules. Compter les cellules et ajuster la densité de suspension de cellules à 2 x 105 cellules de 2,5 mL/insérer du milieu de culture de cellules endothéliales dépourvue de sérum (EBM-) et le facteur de croissance endothélial vasculaire-A (VEGF-A).
- Sortez la plaque contenant les inserts, soigneusement jeter le milieu du côté sang et remplacez-le par 2,5 mL de la suspension de cellules endothéliales. Remettez la plaque dans l’incubateur (à 37 °C et 5 % CO2) et le laisser toute la nuit pour les cellules endothéliales à adhérer à la membrane.
- Le lendemain, préparer une plaque 6 puits stérile par le transfert de 3 mL de milieu de préchauffée astrocyte sans sérum (ABM-) dans chaque puits. En gérant les plaquettes avec une pince stérile, soigneusement jeter le milieu complet endothélial du côté sang, placer l’insert dans la nouvelle plaque contenant ABM- et ajouter 2,5 mL de EBM-.
Remarque : L’utilisation de EBM - est essentielle pour la mise en place de la barrière endothéliale (Veuillez vous reporter à la section « discussion »). - Laissez les inserts dans l’incubateur (à 37 °C et 5 % CO2) avec une perturbation physique minimale et les variations de la température pendant 5 jours, permettant la fabrication de la membrane basale endothéliale, astrocyte contacts avec les cellules endothéliales et finalement, la formation de mimiques BBTB. Remplacer la moyenne le jour du transfert sur les cultures de cellules de gliome (Veuillez vous reporter à la section 1.4).
- Mesure de la perméabilité de mimiques BBTB (facultative)
- Une diffusion passive de la sodium colorant fluorescent de faible poids moléculaire-fluorescéine (Na-Fl) au fil du temps, du sang sur le côté du cerveau des inserts permet de calculer les valeurs de perméabilité selon la formule suivante :
Ici, dFbienest la valeur de fluorescence mesurée dans le puits à un certain moment moins la valeur d’autofluorescence de milieu de culture cellulaire, dT est le temps en secondes, A est la surface de la barrière en centimètres carrés et dFinsérer est la valeur de fluorescence mesurée dans l’insert au même temps diminué de la valeur de l’autofluorescence moyen). - Collecter 100 µL de milieu à la fois le sang et les côtés du cerveau de l’imitateur BBTB et chacun d’eux transférer sur une plaque de 96 puits à fond plat, noire séparée pour mesures de fluorescence ultérieures. Utiliser les médias plaines comme le blanc pour corriger l’autofluorescence.
- Préparation de 2,5 mL / puits de la Na-Fl (50 µM) en EBM-. Préchauffer la solution Na-Fl à 37 ° C. Remplacer les médias du côté sang des inserts avec les médias contenant Na-FL. démarrer une minuterie dès que le milieu est remplacé.
- Recueillir soigneusement 100 µL de médias à la fois le sang et le côté du cerveau des inserts à 5, 30, 60 et 120 min. transférer chaque échantillon pour séparer les puits de la plaque de 96 puits noire.
- En conséquence, remplacer les médias collectés depuis les inserts de maintenir l’équilibre de volume entre les deux parties. Replacez les inserts dans l’incubateur entre chaque prélèvement d’échantillons afin de minimiser les variations de température.
- Quantifier la fluorescence des échantillons collectés, à l’aide d’un lecteur avec le filtre défini sur 480/560 nm (excitation et émission, respectivement).
Remarque : Fluorescence de la partie du cerveau est presque indétectable à l’instant de 5 min. Des valeurs élevées par rapport à l’essai à blanc indique une fuite de / endommager à l’insert'membrane de s ou de la barrière ; par conséquent, exclure ces d’approfondir les analyses. Des valeurs de perméabilité Na-Fl prévues pour le BBTB devraient être dans les 10-5 à 10-6 cm/s gamme (tableau 1).
- Une diffusion passive de la sodium colorant fluorescent de faible poids moléculaire-fluorescéine (Na-Fl) au fil du temps, du sang sur le côté du cerveau des inserts permet de calculer les valeurs de perméabilité selon la formule suivante :
- Préparation des cellules de gliome
Remarque : Bien que dérivé de patient glioblastome sphères sont utilisées ici, le protocole suivant peut être facilement adapté pour les cellules de glioblastome adhérentes, disponible dans le commerce tels que U - 87 MG.- Éventuellement, pour l’imagerie de l’immunofluorescence, placer jusqu'à quatre lamelles de borosilicate stérile rond (ø 0,9 cm) / puits dans une plaque de 6 puits contenant 2 mL de poly-D-lysine (0,01 %). Incuber à température ambiante pendant 30 min.
- Pendant ce temps, transvaser avec soin les sphères de la tumeur depuis le récipient de culture de cellules dans un tube stérile de 15 mL à l’aide d’une pipette stérile sérologique. Centrifuger les sphères de la tumeur pendant 3 min à 250 rcf.
- Jeter le surnageant, doucement remettre en suspension les sphères dans 1 mL de bFGF/EGF-gratuit (GBM) gliome cellules moyennes et compter les cellules non vides. Ajuster la densité cellulaire à environ 104 sphères/mL (105 cellules/mL) dans GBM-.
- Jeter la poly-D-lysine des puits et les rincer 3 fois avec du PBS stérile. Graine de la plaque avec 3 mL/puits de la suspension de sphéroïde de tumeur et transférer les inserts avec l’imitateur BBB sur la suspension de cellules de tumeur.
- Incuber pendant la nuit (à 37 °C et 5 % CO2) afin d’autre tumeur de l’essai d’équilibre entre le sang et le cerveau. Le lendemain, remplacer les médias sur le côté de sang avec EBM-additionné de molécules/médicaments/nanoparticules d’intérêt. Les échantillons sont prélevés au fil du temps pour la quantification directe comme décrit dans la section précédente. Les cellules sont fixées à un moment précis pour l’imagerie de fluorescence (Veuillez vous reporter aux sections 2.1 et 2.2).
2. une imagerie confocale de la BBTB
NOTE : 4 % paraformaldéhyde (PFA, pH 7,4, 6 mL par réplicat BBTB) est toujours prête fraîches dans du PBS. Gardez-le sur la glace.
Mise en garde : PFA est cancérigène. Gants en nitrile permet de gérer la PFA et de préparer la solution sous une hotte chimique.
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Expression endothéliale BBTB des protéines de jonction serrée
- Rincer les deux côtés de la membrane avec PBS glacée (3 x 5 min, 2.5 ml/insert, 3 mL/puits). Jetez les PBS et ajouter 3 mL et 2.5 mL de glacé 4 % PFA dans le puits et dans la notice, respectivement. Incuber sur glace pendant 10 min. jetez la PFA (selon l’institution'élimination chimique dangereux s) et rincer 3 fois avec du PBS à ta (2,5 mL/insert, 3 mL/puits).
Remarque : Une fois fixé, échantillons peuvent être conservés dans du PBS (2,5 mL/insert, 3 mL/puits) à 4 °C pendant une semaine. - Utilisez un coton-tige pour essuyer le côté du cerveau de l’insert et supprimer les astrocytes. À l’aide d’un scalpel tranchant, découpez soigneusement la membrane en quatre morceaux égaux par deux découpes perpendiculaires, formant une croix. Ensuite, insérez le scalpel à l’endroit où la membrane est fixée à la paroi de l’insert et faire pivoter le foyer avec l’autre main pour libérer les quatre échantillons. Utilisez des pinces fines, transvaser avec soin chaque échantillon sur une plaque de 24 puits contenant 200 µL de PBS/puits, avec du côté de sang vers le haut dans chaque puits.
- Bloquer les membranes avec 10 % sérum de veau fœtal dans du PBS (pour 30 min à ta, 200 µL/puits). Préparer la solution d’anticorps 1° pour l’immunomarquage de la jonction serrée de protéines (Figure 1) (zonula occludens-1, 5-claudin ; veuillez vous référer à la Table des matières) dans 200 µL de solution/puits de blocage. Éventuellement, les cellules endothéliales identité est vérifiée par l’ajout d’un anticorps dirigé contre la molécule d’adhérence de cellules endothéliales plaquettaire (PECAM1 ou CD31 ; veuillez vous référer à la Table des matières) pour chaque solution d’anticorps de jonction serrée. Jeter la solution de blocage et d’incubation avec l’anticorps primaires' O/N à 4 °C.
- Le lendemain, jeter l’anticorps primaires et rincez-les avec 200 µL de PBS (3 x pendant 5 min à RT). Incuber les anticorps secondaire conjugué à un fluorophore spécifique à l’espèce appropriée (dilution 1/500, 200 µL/puits, dilué dans une solution de blocage, veuillez vous référer à la Table des matières) pendant 2 h à température ambiante.
- Jeter les anticorps secondaires, rincez avec 200 µL de PBS (3 x pendant 5 min à RT). Retirez le PBS et contre-coloration noyaux cellulaires en utilisant un 4', 6-diamidino-2-phénylindole solution de (DAPI) à une concentration finale de 1 µg/mL chez pure distillée H2O (dH2O ; 200 µL/puits ; veuillez vous référer à la Table des matières de ). Incuber pendant 7 min à RT. Remove le DAPI et laver les membranes 3 x avec dH2O (200 µL/puits).
- Déposez une goutte de la milieu de montage (voir la Table des matières) sur une lame de microscope. Utilisez des pinces fines, soigneusement prendre la membrane du puits et le maintien de l’orientation, enlever l’excès de dH2O et placez-le sur la baisse de la milieu de montage. Ajouter une autre goutte de milieu de montage sur le dessus de la membrane et soigneusement le couvrir avec un couvercle en verre borosilicaté. S’assurer qu’il n’y a pas de bulles d’air emprisonné. Conserver les échantillons à 4 °C et à l’abri de la lumière jusqu'à l’observations de microscopie confocale.
Remarque : Astrocyte coloration peut être effectuée en plaçant les morceaux des membranes dans la plaque 24 puits avec la côté du cerveau vers le haut et avec l’utilisation de certains anticorps astrocyte spécifiques (p. ex., dirigés contre la protéine fibrillaire acide gliale [GFAP]) (Figure 1E ).
- Rincer les deux côtés de la membrane avec PBS glacée (3 x 5 min, 2.5 ml/insert, 3 mL/puits). Jetez les PBS et ajouter 3 mL et 2.5 mL de glacé 4 % PFA dans le puits et dans la notice, respectivement. Incuber sur glace pendant 10 min. jetez la PFA (selon l’institution'élimination chimique dangereux s) et rincer 3 fois avec du PBS à ta (2,5 mL/insert, 3 mL/puits).
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Fluorescence BBTB coloration pour détecter les nanoparticules transcytose
- Effectuer le marquage de cellules vivantes lysosome (p. ex., à l’aide de fluorescent sondes [voir la Table des matières]). Diluer le colorant fluorescent lysosome à une concentration de travail de 50 nM de préchauffée EBM - (2,5 mL/insertion) ou de 75 mM dans préchauffée ABM - (3 mL/puits) pour le lysosome étiquetage des cellules endothéliales et des astrocytes, respectivement. Incuber les cellules pendant 45 min (à 37 °C et 5 % CO2) ; Ensuite, rincer 3 fois avec du PBS glacee (2,5 mL/insert, 3 mL/puits).
- Jetez les PBS et ajouter 3 mL et 2.5 mL de glacé 4 % PFA au puits et à l’insertion, respectivement. Les incuber sur glace pendant 10 min. jetez la PFA et rincer les cellules 3 x avec du PBS (à la RT, 2,5 mL/insert, 3 mL/puits).
Remarque : Une fois fixées, les échantillons peuvent être conservés dans du PBS (2,5 mL/insert, 3 mL/puits) à 4 ° C pendant une semaine. - Retirez le PBS et contre-coloration les noyaux des cellules en utilisant une solution DAPI à une concentration finale de 1 µg/mL en dH2O (1 mL/insert, 1 mL/puits). Les incuber pendant 7 minutes à RT. Remove le DAPI et laver les membranes 3 x avec dH2O (2,5 mL/insert, 3 mL/puits).
- Couper la membrane soigneusement, enlever l’excès de dH2O et placez-le sur une goutte de milieu de montage (voir la Table des matières) sur une lame de microscope. Ajouter une autre goutte de milieu de montage de l’autre côté de la membrane et soigneusement le couvrir avec un couvercle en verre borosilicaté. Éviter les bulles d’air piégées. Stocker les échantillons à 4 °C et gardez-les à l’abri de la lumière jusqu'à ce que l’imagerie microscopie confocale.
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Fluorescence de coloration des cellules tumorales
- Utilisez des pinces fines, transvaser avec soin les lamelles couvre-objet rond contenant les sphères de la tumeur à une plaque de 24 puits remplis de PBS glacée. Aller de l’avant avec les cellules vivantes lysosome marquage à l’aide de sondes fluorescentes lysosome à 75 nM de préchauffée GBM - (200 µL/puits). Incuber les échantillons pendant 45 min ; Ensuite, les rincer 3 fois avec du PBS glacee (200 µL/puits).
- Jeter les PBS et ajouter 200 µL de l’IFP glacee / puits. Incuber sur glace pendant 10 min. jetez la PFA et rincer les échantillons 3 x avec du PBS (à la droite).
Remarque : Une fois fixées, les échantillons peuvent être conservés dans du PBS (200 µL) à 4 ° C pendant une semaine. - Retirez le PBS et contre-coloration les noyaux des cellules en utilisant une solution DAPI à une concentration finale de 1 µg/mL en dH2O (200 µL/puits). Les incuber pendant 7 minutes à RT. Remove le DAPI et laver les lamelles 3 x avec dH2O (200 µL/puits).
- Utilisez des pinces fines, retirer la lamelle, enlever l’excès de dH2O et placez-le sur une goutte de milieu de montage (voir la Table des matières) sur une lame de microscope. Éviter d’emprisonner des bulles d’air. Stocker les échantillons à 4 °C et gardez-les à l’abri de la lumière jusqu'à ce que des observations de la microscopie confocale.
3. in Vivo étude Comparative
- Enregistrement in situ de la diffusion de sodium-fluorescéine à travers la BHE
- Préparer 150 µL d’une solution de Na-Fl 50 nM dans une solution physiologique. Conserver la solution à 37 °C à la livraison par voie intraveineuse.
- Anesthésier une souris avec une injection intrapéritonéale d’un kétamine/xylazine cocktail le (300 µL de xylazine kétamine et 10 mg/kg de 100 mg/kg dans du PBS). Une fois établie une anesthésie profonde, placez l’animal sur un coussin chauffant pour maintenir sa température corporelle.
Remarque : Dix semaines Institut de recherche médicale navale (NMRI) nude immunodéprimées souris femelles ont été utilisés pour obtenir les données présentées à la Figure 2. Toutefois, ce protocole est adapté aux souris immunodéprimées qu’immunocompétents. La méthode d’anesthésie/analgésie est le scientifique'discrétion. Cependant, l’anesthésie par inhalation comme l’isoflurane est déconseillé car il augmente considérablement la perméabilité BBB18. - Placez la souris sur un cadre stéréotaxique (voir la Table des matières) et effectuer une incision longitudinale du cuir chevelu avec des ciseaux, suivies de dilacerations douces du tissu conjonctif, à l’aide de pinces fines, pour révéler le crâne. En utilisant des mouvements circulaires avec un fin microforages, supprimer un morceau de crâne selon la circulaire ø 0,3 mm de l’os pariétal gauche ou à droite. Procéder avec une extrême prudence lors du forage et en retirant le morceau de crâne pour ne pas blesser les tissus méningés sous-jacents et les vaisseaux sanguins.
- Déposez une goutte de solution physiologique sur les tissus exposés. À l’aide de deux paires de pinces fine, retirer délicatement le tissu méningée pour accéder le cortex cérébral. Le tissu cérébral ne doit jamais être en contact direct avec l’air.
Remarque : Les hémorragies mineures contre les blessures méningée peuvent être arrêtés à l’aide d’éponges hématologiques (Veuillez vous référer à la Table des matières). - Une fois le tissu méningée est supprimé et le cortex est totalement exposé, piéger une goutte de solution physiologique entre le cortex et une lamelle de borosilicate de 0,5 mm d’ø. Sécuriser la zone d’observation avec une goutte de colle cyanoacrylate (Veuillez vous référer à la Table des matières) réparties autour de la lamelle avec une aiguille. Laissez la colle sécher pendant 1 min.
- Préparer le cathéter implantable pour l’injection dans la veine queue (Figure 2 a). Casser la pointe d’une aiguille 25 G à l’aide de pinces Rochester-Ochsner et introduire l’embout dans un tube polyuréthane de 10 cm de long PE20 (Veuillez vous référer à la Table des matières) (Figure 2 a).
- Introduire le cathéter dans la veine latérale de queue de la souris, à l’aide de pinces de bulldog pour la manipulation du cathéter et l’insertion (Veuillez vous référer à la Table des matières) (Figure 2 b). Fixer l’aiguille insérée avec une goutte de colle cyanoacrylate. Laissez la colle sécher pendant 20 s avant d’enlever la pince bulldog. Soigneusement, branchez l’autre extrémité de la sonde à une aiguille 25 G reliée à une seringue contenant la solution de Na-Fl (Figure 2 b).
- Remarque : Ne pas serrer la queue avec la pince bulldog. Il est uniquement utilisé pour la manipulation du cathéter précis. Insertion du cathéter appropriée peut être confirmée par le reflux de sang dans le tube transparent.
- Placez l’animal sous le stéréomicroscope (voir la Table des matières). À l’aide de l’autofluorescence bas niveau dans le canal vert (480 nm), se concentrer sur une région contenant relativement importante des vaisseaux sanguins (ils apparaissent plus sombres en raison de l’absorption de l’hémoglobine de la lumière à cette longueur d’onde) et les petits capillaires (Figure 2). Démarrer l’acquisition de time-lapse brièvement avant d’injecter le colorant fluorescent pour obtenir une mesure de la fluorescence de fond.
Remarque : Sinon, l’enregistrement time-lapse peut être remplacé par des images de la capture instantanée entre T0 et et de tout autre prédéterminés points dans le temps. - Injecter la solution à un rythme lent et continu, ou vous pouvez également utiliser un système de perfusion automatisée. La fluorescence de Na-Fl détectée dans le sang doit rester stable (demi-vie dans le sang : 286 min), qui permet un enregistrement de la diffusion de BBB à travers la fenêtre crânienne pendant plusieurs minutes. Une fois l’acquisition terminée, avec précaution, retirer le cathéter et euthanasier l’animal par dislocation cervicale.
- Détermination in vivo de la perméabilité BBB
Remarque : Les valeurs sont obtenus à partir de n’importe quel logiciel de traitement d’image, par exemple ImageJ, permettant de mesurer l’intensité de signal de fluorescence à l’intérieur d’une zone personnalisée d’intérêt (ROI).- À l’aide de l’outil d’annotation, dessiner un ROI en forme de rectangle en dehors d’un vaisseau sanguin dans le tissu cérébral, à environ 5 µm distance de tout les vaisseaux sanguins visibles a rempli la Na-FL. Note les dimensions de la ROI et de l’intensité de fluorescence mesuré à T0 à ce ROI, qui est utilisé comme vide pour le tissu's autofluorescence. Sans déplacer le ROI, avancer rapidement pour un temps post-injection point (par exemple, au tout dernier cadre enregistré lorsque la solution entière a été injectée à l’animal) et notez les valeurs précises de temps et de la fluorescence mesurées dans le retour sur investissement (Figure 2).
- Déplacer le ROI sur un bateau de sang visible (Figure 2) et notez la valeur d’autofluorescence T0 du sang. Sans déplacer le ROI, avancez jusqu’au même temps tel que défini à l’étape 3.2.1. et notez la valeur de fluorescence mesuré dans le retour sur investissement (Figure 2).
- Utilisez la formule suivante (adaptée de la section 1.3) pour déterminer la perméabilité BBB :
- Ici, dFcerveau correspond à la valeur d’intensité de fluorescence moins la valeur de T0 vide dans le cerveau, dT est le moment de l’acquisition en quelques secondes, A est la surface approximative de navire, prise dans le domaine ROI en centimètres carrés et dF sang est la valeur d’intensité de fluorescence moins la valeur vide T0 dans le sang.
Remarque : Les valeurs de perméabilité attendus pour la BHE doivent être au niveau 10-6 cm/s (tableau 1).
- Tissus pour la détection des nanoparticules fluorescentes dans le cerveau murin
- Implant glioblastome patient dérivé de sphères (5 x 104 cellules de 5 µL de PBS stérile) dans anesthésiés 6 semaines NMRI nues souris femelles dans le corps calleux. Localiser cette région du cerveau aux coordonnées stéréotaxiques suivantes, à partir du Bregma : antéro-postérieure + 0,5 mm, gauche à droite + 2,5 mm, dorsoventral + 3 mm. permettre la tumeur au cerveau à se développer pendant 2 semaines.
- Injecter par voie intraveineuse des nanoparticules (100 µg dans 100 µL de solution physiologique stérile) et leur permettre de circuler de 8 h. injecter par voie intraveineuse les souris contrôle 100 µL de solution physiologique stérile.
- Euthanasier les souris par dislocation cervicale et recueillir les cerveaux rapidement pour clin d’oeil au point de congélation dans l’isopentane maintenu sur la glace sèche (1 min à-50 °C). Stocker les cerveaux à-80 °C jusqu’au traitement des tissus.
- Coupes coronales cerveau avec un cryomicrotome. Localiser l’implantation intracrânienne par la cicatrice elle faisait sur le cortex et coupes de 9 µm d’épaisseur de cette région sur les lames de microscope approprié (voir la Table des matières).
- Immerger les sections du cerveau qui sont immobilisées sur les diapositives de PBS glacé (2 x 5 min) et, ensuite, fixez-les en glacée 4 % PFA (pendant 5 min). Laver les diapositives dans du PBS (3 x pendant 5 min à RT). Déposer les lames horizontalement et pipette le blocage solution contenant 10 % sérum de veau fœtal dans du PBS sur le tissu des sections couvrant la totalité de la surface (pour 1 h à RT, 500 µL/diapositive). Préparer l’anticorps CD31 (Veuillez vous référer à la Table des matières) dans 250 µL de solution/plaque de blocage. Remplacer la solution de blocage avec l’anticorps et incuber une nuit à 4 °C dans une chambre humidifiée.
- Le lendemain, plonger les lames dans du PBS (3 x pendant 5 min à ta) et les incuber avec le correspondant fluorophore conjugués anticorps secondaire (1/500 à 250 µL de PBS pendant 2 h à RT). Rincer 3 fois dans du PBS (à la droite) et contre-coloration les noyaux des cellules en utilisant une solution DAPI à une concentration finale de 1 µg/mL en dH2O (250 µL/diapositive). Incuber les échantillons pendant 7 min à RT. supprimer la solution DAPI et laver les lames 3 x avec dH2O.
- Sur chaque section de tissu, ajouter une goutte de milieu de montage (Veuillez vous référer à la Table des matières) et fixer les échantillons avec une lamelle. Éviter d’emprisonner des bulles d’air. Stocker les échantillons à 4 °C et gardez-les à l’abri de la lumière jusqu'à ce que des observations de la microscopie confocale.
Representative Results
Imagerie confocale de l’imitateur BBTB murin présente l’expression et la localisation cellulaire de la jonction serrée protéines zonula occludens-1 (ZO-1) et claudin-5 bEND3. Contacts entre les cellules endothéliales et les astrocytes induit clairement la délocalisation de la ZO-1 et claudin-5 pour les contacts de cellules endothéliales par rapport à la monoculture de la bEND3 (Figure 1). À l’aide d’immunofluorescence souillant pour visualiser les astrocytes exprimant l’accord-cadre sur le cerveau-côté de la membrane, il est possible d’observer et d’étudier les processus astrocytaires et fin-pieds communiquant avec les cellules endothéliales à travers la membrane (Figure 1E ). Les contacts de l’astrocyte-endothélial sont connus pour promouvoir et stabiliser le resserrement de la barrière cellulaire et sont associées à des valeurs plus faibles de la perméabilité de la BBB19. Conformément à cela, nous avons observé une diminution substantielle de la perméabilité de l’imitateur BBTB de souris de la Na-Fl de 27,63 (± 3,45) x 10-6 cm/s en cas de monoculture à 6,74 (± 3.01) x 10-6 cm/s lorsque cultivées conjointement avec inductibles par l’hypoxie facteur assommer les astrocytes (HIFko) (tableau 1). Le HuAR2T immortalisées forment des barrières cellulaires hautement perméables (104.92 ± 27,1 x 10-6 cm/s tableau 1). Semblable au modèle murin, nous avons mesuré la perméabilité significativement plus faible de la BBTB Na-FL, nommément 47,4 (± 14.32) x 10-6 cm/s, quand les cellules HuAR2T ont été conjointement cultivés avec les astrocytes humains primaires (tableau 1).
Dans mimics BBTB murins et humains, la présence des sphères dérivé de patient glioblastome induit une légère augmentation des valeurs de perméabilité par rapport aux cellule endothéliale-astrocyte de co-cultures seul (tableau 1). Ce phénomène est observé avec plusieurs, mais pas tous le patient gliome sphère modèles. Ceci peut être dû le VEGF-A qui est sécrétée par certaines de ces cellules dérivées de patient.
Pour comparer les valeurs de perméabilité de l’imite BBTB in vitro avec la BHE in vivo, nous avons photographié la diffusion en temps réel de la Na-Fl à travers une fenêtre crânienne implantée chez la souris nude. À l’aide d’un stéréomicroscope de fluorescence, diffusion de Na-Fl des vaisseaux sanguins capillaires dérivant des pie-mère principal des vaisseaux sanguins a été enregistrée avant, pendant et après l’injection systémique de la sonde (Figure 2). Mesures des valeurs différentielles de fluorescence de la circulation sang et le cerveau du parenchyme cortical au fil du temps nous a permis de calculer les valeurs approximatives de la perméabilité de la souris nue's BBB de Na-Fl (5,57 ± 2,19 x 10-6 cm/s, Tableau 1).
Pour illustrer comment cet imitateur BBTB peut être utilisée pour la visualisation du passage des composés à partir du côté de sang sur le côté du cerveau, nous avons comparé la transcytose d’ø 110 nm (NP110) et ø 350 nm (NP350) nanoparticules ciblant glioblastome dérivé de patient. Résultats obtient in vitro ont ensuite été comparées à la transcytose in vivo. Dans l’exemple présenté, les nanoparticules étaient enduits à la surface avec le peptide de ciblage tumoral CooP20 et chargement avec le colorant fluorescent (FITC) pour faciliter la visualisation. Nous avons marqué les cellules à l’aide de la teinture lysosomale et eosine avec DAPI 24h après l’addition de nanoparticules FITC sur le sang-côté de la BBTB imiter et microscopie confocale à différents niveaux (par exemple, du côté du sang, la membrane, du côté du cerveau, a acquis et les sphères de glioblastome patient) (Figure 3 a). Le signal fluorescent NP110-associated colocalisé avec les lysosomes dans les cellules endothéliales, les astrocytes et les cellules tumorales. En outre, NP110s ont été détecté entre-deux les cellules endothéliales et les astrocytes, en passant par les pores de la membrane de l’insert (Figure 3 a).
Le passage de NP110s a été quantifié par la mesure de la fluorescence provenant d’échantillons prélevés dans le sang et le cerveau de côté. Ces valeurs de perméabilité ont été comparées à celles déterminées pour les nanoparticules de ø 350 nm (NP350). Les résultats montrent que seulement NP110 a réussi à traverser l’imite BBTB (Figure 3 b). NP350 est resté sur le sang-côté de l’imitateur BBTB, qui a abouti à des valeurs plus faibles de la perméabilité de ces nanoparticules.
Afin de souligner la pertinence de l’imite BBTB par rapport aux modèles in vivo, les souris nues ont été injectés par voie intraveineuse avec NP110 ou NP350 de nanoparticules enduits avec le peptide de ciblage tumoral CooP et conjugué avec un colorant fluorescent rouge (TRITC) pour la détection. Les tissus prélevés à plusieurs points dans le temps a révélé qu’après 8 h, nanoparticules BBB-perméable ont extravasé dans le parenchyme du cerveau, tandis que les imperméables, ceux qui sont restés dans la circulation ont été principalement éliminé de la circulation systémique in vivo. C’est pourquoi, nous avons récolté les cerveaux et quantifié le nombre de nanoparticules par millimètre carré post-injection de 8 h. Selon les résultats in vitro, NP110, mais pas NP350, extravasé avec succès dans le parenchyme du cerveau (Figure 3). Imagerie à fort grossissement de l’emplacement de nanoparticules dans le cerveau ont montré que NP110 a été distribuée de façon homogène dans le parenchyme du cerveau en dehors des capillaires sanguins et hébergés avec succès vers les cellules de glioblastome implanté (Figure 3D). Malgré présentant la tumeur même ciblage portion (CooP), NP350 ne put extravasate dans le parenchyme du cerveau et a été détecté seulement au sein du côté luminal de vaisseaux cerveau (Figure 3E), semblables aux résultats obtenus in vitro.
Figure 1 : Description du modèle hémato-encéphalique tumeur-barrière (BBTB). (A) représentation schématique de l’emplacement des différents types de cellules. (B) Illustration du placement sur le couvercle de la plaque 6 puits et la technique de semis pour les astrocytes du côté du cerveau de l’insert'insert membrane s. (C) Illustration de l’emplacement de la plaque 6 puits permettant l’adhérence astrocyte. (D) les micrographies Immunofluorescence de la jonction serrée protéines zonula occludens-1 (rouge, ZO-1, le haut rang) et claudin-5 (rangée inférieure, verte). L’expression de la protéine est comparée aux cerveau murin cellules endothéliales microvasculaires (bEND3) cultivées sur le côté de sang de la BBTB seul comme une monoculture (colonne de gauche) ou avec murin immortalisées HIFko astrocytes (colonne de droite). Noyaux cellulaires sont eosine au DAPI (bleu). (E) à balayage Immunofluorescence montrant la protéine fibrillaire acide gliale (GFAP, rouge) dans les HIFko astrocytes cultivés sur le côté du cerveau de la BBTB. L’image de fort grossissement montre processus astrocyte et fin-pieds (flèches) en communiquant avec les cellules endothéliales à travers la membrane des pores (panneau de droite). L’identité de l’HIFko astrocytes a été vérifiée par immunofluorescence souillant de l’antigène de T gros virus Simien 40 (SV40 grand T, vert) utilisé pour l’immortalisation des cellules. Les cellules endothéliales expriment ni celui-ci, ni le grand T de SV40 et, par conséquent, peuvent être partiellement observées à travers le transparent, en face du côté de la membrane de cellules colorées au DAPI seule (lignes pointillées). Noyaux cellulaires sont eosine au DAPI (bleu). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Intravitale dosage direct de la souris la perméabilité BBB. (A) préparation du cathéter implantable veine caudale. (1) outils et l’équipement sont les suivants : (a) un PE20 tube polyéthylène (b) deux 25 G aiguilles (c) Rochester-Ochsner forceps et (d) un petit bouledogue pince. (2) A 25 G aiguille est enlevé par plusieurs torsions à l’aide de la pincette et (3) soigneusement inséré dans le tube. (4), l’autre côté du tube est connecté à un autre aiguille 25 G. (B) conseils pour l’implantation du cathéter et le positionnement d’infuser la solution de sodium-fluorescéine dans la veine de la queue d’une souris. La zone encerclée indique la zone où une goutte de colle cyanoacrylate est placée pour fixer le cathéter. La pince bulldog est utilisée pour gérer le cathéter et retirée une fois le cathéter est fixé. (C) représentative d’imagerie et de quantification méthode pour déterminer les valeurs de perméabilité sodique-fluorescéine. Avant l’injection de fluorescéine sodique (colonne de gauche), l’autofluorescence/blank est mesuré dans une région d’intérêt (ROI) placée sur le cerveau (rectangle du panneau supérieur, blanc) et les zones de vaisseaux sanguins (rectangle de panneau, rouge de fond). Au cours de la perfusion de sodium-fluorescéine (colonne de droite), l’intensité de la fluorescence est mesurée dans les deux ROIs, ce qui permet le calcul de la perméabilité BBB. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : prédiction de la transcytose intracérébrale de nanoparticules par BBB in vivo par le modèle in vitro de BBTB. (A) représentation graphique de l’essai BBTB avec représentant images confocales obtenus aux différents niveaux du modèle murin BBTB indiquées. Nanoparticules de 110 nm de diamètre (NP110) et conjugué à l’ITCF (vert) ont été ajoutés au sang côté des cellules BBTB ont été marquées avec la sonde lysosomale (LT-99, rouge). (1), endothéliales de cellules, (2), endothéliales transcytose des nanoparticules à travers les pores de la membrane (ligne pointillée blanche), les astrocytes (3), et (4) patient glioblastome sphères sont identifiés sur le graphique et microscopie confocale correspondant (à droite). Encapsulation lysosomale des nanoparticules (flèches) suggère active transcytose à travers les couches endothéliales et astrocytes de la BBTB. (B) Quantification de la perméabilité de la nanoparticule indiquée par le biais de la BBTB in vitro (n = 6). Sections de Quantification (C) de la densité de nanoparticules indiquée dans le tissu cérébral, 8 h après la perfusion de la veine caudale des souris Nudes (n = 3). Microscopie confocale (D) montrant la répartition de l’ø 110 nm nanoparticules (NP110, rouge) dans les sections de tissu de cerveau murin étiqueté avec anticorps anti-souris CD31 (vert). La flèche met en évidence la transcytose nanoparticule (panneau de gauche). Nanoparticules accumulent autour des cellules de tumeur de cerveau (tumeur, panneau de droite) en raison de la peptide ciblage CooP présenté sur leur surface. Aucune domiciliation significative n’est observée dans le tissu cérébral (cerveau). Microscopie confocale (E) montrent la distribution de l’ø 350 nm nanoparticules (NP350, rouge) dans des sections de tissu de cerveau murin étiquetées avec anticorps anti-souris CD31 (vert). Point de pointes de flèches pour les NP350s qui ont été retenus dans la lumière du vaisseau sanguin et qui n’ont pas pu traverser la BHE, probablement en raison de leur plus grand diamètre par rapport au noyau de la cellule NP110s. sont colorées au DAPI (bleu). P < 0,01. P-valeurs ont été calculées à l’aide d’un test U de Mann-Whitney bilatérale, non paramétrique. Les barres d’erreur représentent l’écart-type. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| murine imitateur BBTB | bEND3 | bEND3 + HIFko comme | bEND3 + Go | bEND3 + HIFko comme + Go | In vivo |
| Perméabilité (10-6 cm/s) | 27,63 | 6,74 | 26,8 | 10,83 | 5.57 |
| SD (10-6 cm/s) | 3.45 | 3.01 | 7.99 | 2.65 | 2.19 |
| humain imitateur BBTB | HuAR2T | HuAR2T + hIAs | HuAR2T + Go | HuAR2T + hIAs + Go | |
| Perméabilité (10-6 cm/s) | 104.92 | 47,4 | 89,08 | 48.24 | |
| SD (10-6 cm/s) | 27.1 | 14.32 | 10.21 | 13.07 |
Tableau 1 : valeurs de la perméabilité de sodium-fluorescéine (Na-Fl) (en centimètres par seconde), déterminé en vitro dans les systèmes de co-culture indiquée et in vivo chez la souris nude NMRI. Données d’une expérience représentative (n = 3 souris).
Discussion
L’émergence de la notion de variabilité interpatient tumeur rajeuni la recherche sur le cancer personnalisé médecine21. Cette variabilité est également une caractéristique des tumeurs du système nerveux central. En raison de l’imprévisibilité de la tumeur, réponse à la chimiothérapie ajoute à l’effet d’abri du BBB pour administration de médicaments et au total constitue des défis majeurs dans les soins aux patients,22. Afin de développer des traitements plus efficaces, il est souvent nécessaire de grandes bibliothèques écran de nouvelles molécules. Pour évaluer l’efficacité antitumorale et la capacité des nouvelles pistes thérapeutiques à atteindre le site de la tumeur, la meilleure option est de l’étude préclinique sur des cellules dérivées de patient implanté en vivo dans avatars patients murines. En raison de la pratique (ressources financières, de temps, l’homme et centre) et des raisons éthiques (le principe 3Rs lors de l’utilisation des animaux de laboratoire), l’élaboration d’une telle plate-forme de dépistage in vivo à grande échelle n’est souvent pas possible et par conséquent, les tests basés sur les cellules reste un modèle de choix23. La raison principale de sélection créé des lignées de cellules et éviter les cellules primaires est pour faciliter la reproductibilité et réduire l’utilisation des animaux de laboratoire, qui sont la principale source d’isolement et de mise en place de cultures primaires de murins. Les méthodes présente ici, fermement respectant les 3R, pourraient jeter efficacement des nanoparticules d’une étude préclinique plus loin sur le criterium de leur incapacité à traverser le modèle BBTB. Comme une preuve de principe, nous décrivons les résultats obtenus au cours de l’élaboration et la validation de la BBTB. Nous avons été en mesure de confirmer les résultats in vitro in vivo, par exemple, pour mesurer la diffusion passive d’un 376 Da sodium-fluorescéine.
Le protocole décrit dans le présent document décrit la préparation de cellules endothéliales co-cultivées avec des astrocytes pour former une interface de type tumeur-barrière hémato-encéphalique dans une configuration in vitro. Une fois établi un contact physique entre ces deux types de cellules, la couche de cellules endothéliales présente des similitudes avec le BBB (par exemple, une cellule expression en surface des protéines des jonctions serrées et relativement faible perméabilité). Fait intéressant, l’imitateur BBTB murin semblait fournir des valeurs de perméabilité Na-Fl particulièrement semblables à ceux obtenus avec la souris in vivo BBB perméabilité mensurations24. Par conséquent, les performances de l’imite BBTB vont être directement liée au choix de cellules utilisées pour former la barrière. Les cellules endothéliales bEND3 proviennent du cerveau et sont connus pour être réussie dans la formation de barrières lorsque co-cultivées avec des astrocytes25. Cependant, nous avons utilisé l’immortalisées HIFko astrocytes26 pour générer l’imitateur BBTB. En raison de leur manque de facteurs inductibles par l’hypoxie, ne produisent pas de ces astrocytes VEGF-A, qui est par excellence dans la stabilisation de l’imitateur BBTB décrite ici. Les astrocytes ont été identifiés en tant que modulateurs de la perméabilité BBB, par exemple par le biais de la libération de VEGF-A à la suite de la neuro-inflammation27. Activation des récepteurs de facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGFRs) est un important régulateur de la perméabilité endothéliale/vasculaire en vitro28 et in vivo29. Par conséquent, les suppléments de VEGF-A dans le milieu activent le VEGFR2 sur les cellules endothéliales, qui induit la phosphorylation des protéines des jonctions adherens comme la VE-cadhérine30. La perte de contacts de cellules endothéliales génère la grande perméabilité des vaisseaux sanguins. De même, forte propriété mitogène tant la composition inconnue du fœtale bovine sera utilisé dans les essais de culture de cellules entraînent des problèmes majeurs dans la reproductibilité de stabilisation et de dosage de barrière.
Les cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVEC) sont parfois utilisés pour former le BBB dans vitro31; Cependant, ils diffèrent sensiblement des cellules endothéliales microvasculaires du cerveau, telles que la cellule hCMEC/D3 la ligne32, sur le plan de l’expression génique et formant barrière propriétés. Cependant, la perméabilité relativement plus élevée, les valeurs obtenues avec les cellules de HuAR2T cultivés seuls par rapport à la bEND3 ont été considérablement réduits par leur coculturing avec les astrocytes humains primaires. Bien que les cellules endothéliales sont nécessaires pour former la paroi cellulaire, il est clair que les astrocytes ont un rôle tout aussi important à jouer pour la formation de BBTB et la stabilisation.
Lorsque les sphères gliome dérivé de patient ont été ajoutés à cette équation, l’imitateur BBTB souris récapitule certaines des caractéristiques des xénogreffes murines, tels que la diffusion de la drogue par le biais de la vascularisation cérébrale et le ciblage de cellules de tumeur. L’imite BBTB discuté ici ont, par exemple, réussi à miroir du comportement in vivo, quand nous avons projeté plusieurs nanoparticules avec différents diamètres. Pour illustrer le parallélisme entre les modèles in vitro et in vivo, nous avons utilisé le décrit précédemment mésoporeux silicate nanoparticules33 avec pénétration cellulaire propriétés34 conjugué au peptide ciblage tumoral CooP sur leur surface20. Les maisons des CooP-ciblage du peptide aux cellules de tumeur invasive à la liaison spécifique à l’inhibiteur de croissance mammaire dérivés (BOLOBELE). Plusieurs types de cancers, y compris les gliomes, sont surexprimant BOLOBELE par rapport au tissu normal35, qui rend la cage une portion de ciblage de tumeurs très efficace capable d’augmenter la fourniture d’une charge utile de20. Les nanoparticules utilisées ici ont démontré antérieurement à diffuser dans le parenchyme du cerveau (27547955), et lorsque fonctionnalisés avec Taxol, ces nano-cargos ont réussi à réduire la croissance de gliome dans les modèles précliniques,36. L’ajout de résidus de polyéthylène glycol (PEG) à la surface des nanoparticules ont également maintenu leur charge statique à des valeurs positives (autour de + 4 mV), permettant la meilleure interaction avec les d’unité neurovasculaire37 et aussi d’augmenter leur stabilité en circulation. Dans les données présentées, 3 kDa de PEG est conjugué aux NP110s, tandis que les NP350s ont été recouverts de 10 kDa de PEG. Cependant, a augmenté-molecular-weight PEG a aussi entraîné une augmentation significative du diamètre de la nanoparticule, d'où leurs capacités physiques pour traverser la BHE. Par conséquent, nous avons vérifié si les dimensions physiques des particules ont empêché leur passage à travers la BBTB et savoir si ces observations pourraient être mis en miroir in vivo.
Selon les observations déjà publiées, nous avons observé que NP110s extravasé au moyen de la BBTB in vitro et le BBB des souris porteuses de tumeurs intracrâniennes, tout en NP350s conservé du côté luminal de l’imitateur BBTB et dans les vaisseaux sanguins de la souris. Ces mêmes résultats suggèrent fortement que le modèle BBTB prédit la capacité in vivo des nanoparticules pour traverser la BHE et atteindre le cerveau.
La pertinence des modèles cellulaires de la BHE est souvent discutée, même pour l’administration centrale de nanoparticules38. Nous montrons ici que primaires astrocytes et les cellules endothéliales, tous deux considérés comme les plus importants outils in vitro, peuvent être remplacés par des cellules immortalisées et/ou commercialement disponibles, assurant reproductibilité et une plus grande extensibilité. La prochaine génération de l’imite BBB in vitro pourrait être développée en intégrant les dispositifs microfluidiques, permettant aux unités neurovasculaires magnifiquement formé qui ressemblent structurellement les réelles BBB12,14. Cependant, ces modèles ne conviennent pas actuellement pour le criblage à haut débit de molécules livré à gliomes, en raison de limitations techniques dans le cadre du suivi de la livraison de14. C’est en effet difficile de saisir la complexité physiologique de la BHE dans un plat, et l’éventuelle absence de certains récepteurs/protéines, connues pour être exprimées par le BBB, pourrait compromettre l’interprétation des résultats. Un autre argument concerne la grande variabilité dans l’expression des gènes entre les conditions in vivo et in vitro, ainsi que de la ligne d’une cellule à l’autre, surtout si l'on considère les cellules endothéliales. Toutefois, on pourrait aussi affirmer que l’unité neurovasculaire n’est pas une entité homogène au sein du cerveau39. Recherche scientifique en biologie a atteint une ère sans cruauté où le bien-être des animaux, responsabilité éthique et le coût d’utilisation des vies animales sont toujours considérés avant de concevoir une expérience. Par conséquent, pour prendre en charge le remplacement des animaux, un nombre croissant d’études récentes montre que la prise de conscience des limites des modèles et une sélection rigoureuse des modèles cellulaires d’établir la barrière — en mettant l’accent sur les astrocytes — justifient une correspondance entre les résultats obtenus dans un plat et dans les animaux modèles40. Avec la méthode décrite ici, nous avons un peu plus de la réduction du nombre d’animaux de laboratoire utilisés pour fins de BBB transcytose potentiel thérapeutique de la présélection.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Cette recherche a été financée par des subventions accordées par les organisations du Cancer finlandais, Jane & Aatos Erkko Foundation et Sigrid Juselius Foundation (P.L. et V.L.J.), la Swiss National Science Foundation (Postdoc.Mobility Advanced grant no : P300PB_164732, à S. K.), la fondation de recherche Orion (à S.K.), le Maud Kuistila Memorial Foundation (à S.K.) et l’Académie de Finlande (TERVA 2017, accorder no : 314 498). L’unité d’imagerie Biomedicum (Helsinki) est reconnue pour fournir la microscopie imagerie installation principale.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells | |||
| bEND3 | ATCC | CRL-2299 | Cultured in: DMEM (1g/L glucose) supplemented with 10% FBS, 5 mL L-glutamine and 5 mL penicillin/streptomycin |
| HIFko immortalized mouse astrocytes | Isolated in Dr. Gabriele Bergers Lab | https://doi.org/10.1016/S1535-6108(03)00194-6 | Cultured in: BME-1 supplemented with 5% FBS, 5 mL 1 M HEPES, 5 mL 100 mM sodium pyruvate, 3 g D-glucose and 5 mL penicillin/streptomycin |
| HuAR2T | Isolated in Dr. Dagmar Wirth Lab | https://doi.org/10.1089/ten.tea.2009.0184 | Cultured in: EBM-2 with SupplementMix |
| normal human primary astrocytes | Lonza | CC-2565 | Cultured in: ABM with SingleQuots |
| Material and reagents | |||
| 100 mm x17 mm Dish, Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific | 150350 | |
| 10 mL serological pipet | ThermoFisher Scientific | 170361 | |
| 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339650 | |
| ABM Basal Medium, 500 mL | Lonza | CC-3187 | For primary human astrocytes. ABM+: contains all the additives from the supplement mix. ABM-:all the additives except for rhEGF and FBS |
| Accutase Cell Detachment Solution | Corning | 25-058-CI | |
| AGM SingleQuots Supplements and Growth Factors | Lonza | CC-4123 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | for both GBM + and - medium |
| Basal Medium Eagle | ThermoFisher Scientific | 21010046 | BME-1 |
| Corning Costar TC-Treated 6-Well Plates | Sigma-Aldrich | CLS3506 | |
| Corning Transwell polyester membrane cell culture inserts | Sigma-Aldrich | CLS3452 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | dissolve in 50 mL of BME-1 and sterile filter before adding to the medium |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient F-12 Ham | Gibco | 21331-020 | Specific to the culture of the patient-derived spheres isolated in our lab, may vary for other glioma cell lines |
| EBM-2 growth Medium SupplementMix | PromoCell | c-39216 | EBM+: contains all the additives from the supplement mix. EBM-:all the additives except for VEGF-A and FBS |
| Endothelial Basal Medium 2 (EBM-2) | PromoCell | c-22211 | EBM+: contains all the additives from the supplement mix. EBM-:all the additives except for VEGF-A and FBS |
| Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin | ThermoFisher Scientific | 10500056 | |
| Fluorescein sodium salt | Sigma-Aldrich | F6377 | |
| Greiner CELLSTAR 96 well plates | Sigma-Aldrich | Greiner 655090 | black polystyrene wells flat bottom (with micro-clear bottom) |
| Menzel-Gläser 0.9 cm round borosilicate Cover Slips | Thermo Scientific | 10313573 | |
| PBS tablets | Medicago | 09-9400-100 | one tablet per liter of dH2O, then sterilize the solution by autoclaving |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6407 | |
| Recombinant Human EGF | Peprotech | GMP100-15 | for GBM+ medium |
| Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) | Peprotech | 100-18B | for GBM+ medium |
| Immunofluorescence | |||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| 24 mm x 60 mm microscope slide cover glass | ORSAtec | 0224601-D | |
| AlexaFluor 488 and 594 secondary antibodies | ThermoFisher Scientific | dilution: 1/500 | |
| Anti-Claudin-5 antibody | Abcam | ab15106 | dilution: 1/150 |
| Anti-GFAP antibody clone GF5 | Abcam | ab10062 | dilution: 1/150 |
| Anti-Mouse CD31 antibody Clone MEC 13.3 | BD Biosciences | 550274 | dilution 1/800 |
| Anti-SV40 T-antigen antibody | Abcam | ab16879 | dilution: 1/150 |
| Anti-Zonula Occludens-1 | Abcam | ab96587 | dilution: 1/200 |
| DAPI | TOCRIS | 5748 | |
| Fluoromount Aqueous Mounting Medium | Sigma-Aldrich | F4680 | |
| LysoTracker Red DND-99 | ThermoFisher Scientific | L7528 | |
| Animal procedures | |||
| 10 cm curved dissecting scissors | World Precision Instruments | 14394 | |
| BD Microlance 25 G needles | Becton Dickinson | 300600 | |
| Fine Forceps (12.5 cm) | World Precision Instruments | 503283 | for tissue dissociation |
| Intramedic Polyethylene tubing PE20 | Becton Dickinson | 427406 | |
| Ketaminol vet 50 mg/mL | Intervet | Vnr511485 | Ketamine |
| Mains Powered microdrill | World Precision Instruments | 503599 | |
| Menzel-Gläser 0.5 cm round borosilicate Cover Slips | Thermo Scientific | 11888372 | |
| Micro Bulldog clamp | World Precision Instruments | 14119 | |
| Physiological saline solution | Mustela | Sterile single dose vials 20 x 5 mL / 40 x 5 mL - Medical device class | |
| Rochester-Oschner forceps | World Precision Instruments | 501709 | |
| Rompun vet 20 mg/mL | Intervet | Vnr148999 | Xylazine |
| Stereotaxic adapter | World Precision Instruments | 502063 | |
| Sugi Sponge Points | Kettenbach | 31603 | |
| Equipment | |||
| Axio Zoom.V16 fluorescence stereo zoom microscope | Carl Zeiss | ||
| FLUOstar Omega microplate reader | BMG Labtech | ||
| ORCA-Flash 4.0 digital sCMOS camera | Hamamatsu Photonics | ||
| Universal 320 tabletop centrifuge | Hettich | Cat. No. 1401 | |
| ZEISS LSM 880 with Airyscan confocal microscope | Carl Zeiss |
References
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