Summary
Uyuşturucu merkezi sinir sistemi tümörleri için hedefleme büyük bir sorun olduğunu. Burada kan-beyin tümör-bariyer fare ve/veya insan hücreleri kullanarak bir tüp bebek taklit üretmek ve onların ilgi merkezi sinir sistemi tümörü içinde vivo hedefleme öngörülebilirliği için tartışmak için bir protokol açıklayın.
Abstract
Doğası gereği çok seçici, kan - beyin bariyerini (BBB) fizyolojik şartlarda beyin homeostazı için esastır. Ancak, Beyin Tümörleri bağlamında, BBB moleküler seçicilik de neoplastik hücrelerin periferik yönetilen chemotherapies teslimini engelleyerek kalkanlar. Kötü huylu beyin tümörü ideal hedefleme geliştirme (dahil nano tanecikleri) roman ilaçların ilaç transcytosis ve antitümör etkinliği çalışmaya preklinik hayvan modelleri kullanılmasını gerektirir. 3R İlkesi ile uygun davranmak için (rafine, azaltmak ve eski yerine koymak) bir tekrarlanabilir tüp bebek insan geliştirdiğimiz laboratuvar hayvanlarının deneysel kurulumunda sayısını azaltmak ve antitümör aracıları büyük bir kütüphanesi yüksek üretilen iş tarama gerçekleştirmek için ve üç katmanlı kültürleri endotel hücreleri, astrocytes ve hasta kaynaklı glioblastoma küreler kullanarak fare taklit kan-beyin tümör-bariyer (BBTB). Daha yüksek ölçeklenebilirlik ve tekrarlanabilirlik için ticari hücre hatları veya ölümsüzleştirdi hücreleri özel koşullarda gerçek BBB benzeyen bir bariyer oluşumunu sağlamak için kullanılmaktadır. Burada bir BBTB taklit astrocytes, ekler üzerinde belirli hücre yoğunluğu ile temas endotel hücreleri kültür tarafından elde etmek için bir protokol açıklayın. Bu BBTB mimik, örneğin, miktar ve tümör hücre içinde aynı tahlil hedefleme değerlendirilmesi yanı sıra endotel ve astrositik engelleri nanopartikül geçitle confocal görüntüleme için kullanılabilir. Ayrıca, elde edilen verileri nano tanecikleri preklinik hayvan modellerinde davranışını tahmin etmek için kullanılabileceğini göstermektedir. Daha geniş bir perspektif içinde tüp bebek bu model diğer nörodejeneratif hastalıklar geçit BBB yoluyla yeni tedavi moleküllerin belirlenmesi için adapte olabilir ve/veya doğrudan etkinliğini değerlendirmek için beyin organoids ile takıma uyuşturucu.
Introduction
Nöronlar, astrocytes ve perisitlerden, astrocytes, endotel hücreleri ve beyin microvasculature1şekillendirme ilişkili membran arasındaki karmaşık bağlantıları tarafından kurulan BBB, nörovasküler birim oluşmaktadır. Bu sıkı hücresel duvar tarafından sürekli, nonfenestrated gemiler ince oluşan iyonlar ve moleküllerin (hormonlar, besin veya uyuşturucu gibi) aynı zamanda hücreleri1dolaşan hareket düzenlemektedir. Özellikle düşük transcytosis terapötik antikorlar, uyuşturucu conjugates veya nanocompounds, gibi yüksek molekül ağırlıklı molekülleri BBB yoluyla önemli ölçüde Malign dahil olmak üzere nörolojik hastalıklar için ilaç keşif gelişmeler kısıtlar gliomas2. Gerçekten de, oral veya intravenöz teslim edilen chemotherapies bir antitümör Etkisi ikna etmek için sık sık yeterli ölçüde düşük konsantrasyonlarda, beyin parankimi ulaşmak veya neoplastik hücrelerin3ulaşmak için BBTB geçmeye sadece mümkün değildir. Birkaç preklinik ve klinik çalışmalar BBTB penetrasyon sorunu ile ele değil ama geçici, örneğin odaklanmış ultrasonlardan4,5, kullanarak BBTB bozmaya veya direkt in situ olarak tarafından aşmak için teşebbüs var. uyuşturucu6dır. Ancak, bu teknikleri hiçbiri kaçınılmaz Tümör Genişleme karşı koymak veya nüks başardık. Bu nedenle, roman antiglioma tedaviler geliştirirken, difüzyon yoluyla BBTB bir terapötik ajanlar7başarılı teslim etmek için kritik yönleri olarak düşünülmelidir.
BBTB içinde hücre etkileşimleri çok karmaşık yapısı nedeniyle, laboratuvar hayvanlarının içinde vivo çalışmalarda seçimdi beyin kan molekülleri geçiş okurken gibi görünmektedir. Ancak, yüksek ölçekli içinde vivo yöntemler için oldukça karmaşık kurmak ve bu nedenle, molekülleri yüksek üretilen iş tarama makul bir süre içinde makul bir maliyetle izin vermez. Daha da önemlisi, hayvan testleri İyileştir i) tanımlanan 3R etik kılavuz izleyin, II) azaltmak ve geçerli içerik alaka düzeyi, III) (örneğin, In vitro/içinde silis yöntemleri) alternatif iletişim kuralları tarafından değiştirmek vardır. Bu nedenle, BBTB tüp bebek eğlence ilginç ve çekici bir olasılık olarak görünür, ancak aynı zamanda çeşitli sınırlamalar tarafından meydan karmaşık bir görev teşkil eder. Çok kültürlü Primer hücre veya hücre satırlarından köpek, domuz, fare ve insan bile kökenli yayınlanmıştır (Rahman ve ark.8 ve Helms ve ark.9tarafından gözden gibi) ile karmaşık bu bölümü yeniden oluşturmak çalışır. Klasik co kültürlerde göre değişik multitudes ekler sistemleri ve üç boyutlu mikrosıvısal sistemleri10, BBB-on-a-chip11,12, bu modelleri içerir. Yine de, şu anki mikrosıvısal çip olmayan durumda hızlı, yüksek-den geçerek uyuşturucu doğrulama çalışmaları13,14 ya da şu anda çalışmalar ile uyumsuz Beyin Tümörleri uyuşturucu teslimat için uygundur. Buna ek olarak, 155 yayımlanmış modeller Primer hücre, indüklenebilir pluripotent kök hücreler (IPSC) veya ticari hücre hatları kullanarak gözden tüm ortak olarak kültürlü ekler onların ölçümleri ve/veya sonuçlar8' interstudy tutarsızlık için bir eğilim gösterdi. Bu eksikliği interlaboratory tekrarlanabilirlik i) nonnormalized kültür koşullarla, örneğin ile isteğe bağlı kat membran matris proteinler hücre kültür gemisi, II) artan sayıda alt kültür ve kullanımı ile ilişkili serum içeren medya, her iki büyük sürücü genetik ve fenotipik değişiklikler hücre hatları15veya III) zorluk tekrarlanarak astroglial ve bir tabak içinde endotel bileşenleri arasındaki doğru dengeyi yeniden oluşturun. Her ne kadar bir tüp bebek BBB modeli yoksun bazı Primer hücre yalnızca kullanan benzer modellerle karşılaştırıldığında özelliklerini kurmak için ölümsüzleştirdi hücreleri veya ticari hücre hatları, açıklanan yöntemde biz sağ kombinasyonu sergiler hücreleri göstermek bir çok karşılaştırılabilir performans için başvuru16,17diğer modellerinde çalışmaları yayınlandı. Sonunda, Beyin Tümörleri BBTB aracılığıyla hedefleme terapötik bileşiklerin geçit çalışmaya bir sağlam ve tekrarlanabilir model eksikliği bizi burada açıklanan yöntemleri geliştirmek için motive.
Kalenin içinde vivo Preklinik hayvan modellerinde nano tanecikleri teslimini tahmin etmek için modeli kullanmak üzere olduğu için biz ilk BBTB model fare astrocytes ile temas halinde fare endotel hücreleri içeren ekler kullanarak geçerliliği. Buna ek olarak, biz de bazı insan hücre hatları kullanılacak modelini optimize. Bir kez stabilize, hücre engelleri kültürleri hasta kaynaklı glioblastoma küreler veya ticari gliyom hücre hatları ile aktarılır. Bundan sonra transcytosis nano tanecikleri ve tümör hücre hedefleme tarafından confocal mikroskobu görüntülenir ve zaman içinde örnekleri toplayarak sayılabilir. Önemlisi, BBTB taklit eder kullanarak elde edilen sonuçlar güvenilir içinde BBTB kopyalama izni kullanımını destekleyen vivo, nano tanecikleri davranışını preklinik doğrulama tahmin olabilir.
Protocol
Hayvan deneyleri hayvan deneyleri, bölge, Güney Finlandiya (ESAVI/6285/04.10.07/2014) için Komitesi tarafından kabul edildi.
1. BBTB taklit eder kurulması
Not: Hücre kültür orta ve takviyeleri tablo malzemelerinayrıntılı olarak açıklanmıştır.
- Astrocytes hazırlanması
Not: Aşağıdaki birimler 10 cm Petri kabına veya bir T75 hücre kültür şişesi için uygundur.- Steril hücre kültür başlık altında dikkatle kültürlü astrocytes 5 mL steril fosfat tamponlu tuz (PBS) ile yıkayın. Yavaşça bir vakum pompası kullanarak PBS atmak ve hücre ayrılma reaktif 5 min için 2 mL ekleyin (37 °C, Malzemeler tablogörmek) hücreleri ayırmak için. Mikroskop altında hücre dekolmanı denetleyin. 5 dk, kuluçka hücreleri üzerinde stres sınırlamak için fazla olamaz.
- 10 mL steril tam astrocyte hücre kültür orta (ABM +) hücre ayrılma reaktif aktivitesini inhibe gemi ekleyin. Steril serolojik damlalıklı müstakil hücreleri gemiden bir steril 15 mL tüp aktarmak için kullanın. Hücre süspansiyon 250 rcf adlı 3 dk santrifüj kapasitesi (hızlanma: 9 rcf/s, yavaşlama: 5 rcf/s), oda sıcaklığında (RT).
- Bu arada, (bkz: Malzemeler tablo) ekler hazırlamak: steril forseps kullanarak, ekler (şekil 1A) kadar beyin tarafı ile steril 6-şey plaka (şekil 1B) kapağını yerleştirin. Önceden plaka baş aşağı ekler üzerinde dokunmadan veya ekler işlemi sırasında taşımadan yerleştirilebilir doğrulayın.
Not: Ekler uygun yerleşim membran ve kuyunun astrocyte süspansiyon tuzak arasında sağlayan. - Bir kez centrifuged, dikkatle süpernatant hücre süspansiyon üzerinden atmak; astrocyte Pelet resuspend s duvar 5 x 1 ml ABM + yavaşça Pelet tüp'resuspending tarafından. Aşırı stres hücrelerde sınırlamak için hücrelerin pipetting kaçının. Hücreleri saymak ve 1.5 x 400 µL ABM 105 hücrelerde hücre süspansiyon yoğunluk ayarlamak +/ yerleştirin.
- Hücre süspansiyon beyin tarafı ucun'ortasında yer s membran (şekil 1B) ve çok dikkatli bir şekilde steril damlalıklı ucu ile kılcal kuvvet kullanarak yayıldı. Membran özellikle kırılgan olduğu gibi doğrudan temastan kaçının.
- Ekler beyin tarafı ile hala yukarı, 6-şey plaka geri ekler üzerinde yerleştirin. Bu hücre süspansiyon membran ve gerçek kuyunun (şekil 1 c) arasında sıkışıp sağlar. Astrocytes membran üzerinde homojen yayılmasını engeller gibi hava kabarcıkları hücre süspansiyon kaçının.
- Plaka ve ekler, beyin yüzü yukarı da kuluçka makinesine yerleştirin (37 °C % 5 ile CO2) hücre adezyon (insan birincil astrocytes) en az 2 h (fare ölümsüzleştirdi astrocytes) ve en fazla 6 s izin vermek için.
Not: Ekler baş aşağı tutulur, hücre adezyon görselleştirme mikroskop altında mümkün değildir. Bu nedenle, bir ayrı normal hücre kültür gemi tohum ve hücre adezyon gemi içinde zamanla kontrol etmek için tavsiye edilir. Dikkatli zaman membranlar zarar sonuçları güvenilmez olduğu gibi membran manipülasyon şarttır. - Kuluçka süresi sonunda, hücre süspansiyon sızıntıları tohumlama alanı dışında yokluğu doğrulayın ve ekler sızan olmaları durumunda atın. 6-şey plaka (şekil 1A) kan tarafa şimdi olacak ekler ile normal konumuna döner. ABM + 2.6 mL her şey için ekleyin. Tam astrocyte orta 2.5 mL her sokmak içine dökün ve plaka da kuluçka makinesine koyun (37 °C % 5 ile CO2).
- Endotel hücreleri hazırlanması
Not: Fare beyin mikrovasküler endotel hücreleri için (bEND3), hücrelerin en iyi sıkı kavşak protein ifade deneme günü tetikleme maksimal hücre-hücre kişiler sağlamak için % 100 izdiham ulaşmalıdır. Astrocytes varlığı için sıkı kavşak protein ifadesi bu hücreler için gerekli olduğu gibi bu insan göbek damar endotel hücreleri (HuAR2T) için geçerli değildir.- Daha önce astrocytes (Adım 1.1.1 ve 1.1.2.) için açıklandığı gibi devam edin. Bir kez centrifuged, dikkatle süpernatant atmak; endotel hücre Pelet resuspend s duvar 5 x 1 ml tam endotel hücre kültür orta yavaş yavaş hücre süspansiyon Tube'pipetting tarafından (EBM +). Aşırı stres hücrelerde sınırlamak için hücrelerin pipetting kaçının. Hücreleri saymak ve hücre süspansiyon yoğunluk 2.5 ml 2 x 105 hücrelere ayarlamak/serum (EBM-) ve vasküler endotelyal büyüme faktörü yoksun endotel hücre kültür ortamının insert-A (VEGF-A).
- Ekler içeren plaka almak, dikkatli bir şekilde kan yan ortamından atmak ve endotel hücre süspansiyon 2.5 mL ile değiştirin. Plaka da kuluçka için dönmek (37 °C % 5 ile CO2) ve gecede endotel hücre membran için uymaları için bırakın.
- Ertesi gün, her şey için prewarmed serum-Alerjik astrocyte orta (ABM-) 3 mL aktararak steril bir 6-şey tabak hazırlamak. Ekler steril Forseps ile işleme tarafından dikkatle endotel tam orta kan yakasından atmak, INSERT ABM-içeren yeni plaka yerleştirin ve EBM - 2.5 mL ekleyin.
Not: EBM - endotel bariyer kurulması için kritik kullanmaktır (Lütfen tartışma bölümüne bakın). - Ekler da kuluçka makinesine bırakın (37 °C % 5 ile CO2) en az fiziksel rahatsızlık ve endotel membran, üretimi sağlayan ısı farklılıkları 5 gün ile astrocyte kişiler ile endotel hücreleri ve sonunda, BBTB formasyonu taklit. Tümörü hücre kültürleri transferinde gün orta yerine (lütfen 1.4 bölümüne bakın).
- (İsteğe bağlı) BBTB kopyalama geçirgenliği ölçümü
- Küçük molekül ağırlıklı floresan boya sodyum floresein (Na-Fl) pasif Difüzyon ekler beyin tarafına kandan zamanla geçirgenlik değerleri aşağıdaki formüle göre hesaplanması sağlar:
Burada, dFdeiyi hücre kültür orta autofluorescence değeri eksi belirli bir zaman noktasında ölçülen Floresans değeri dT süreyi saniye olarak, A kare santimetre ve bariyer yüzeydir dFEkle floresan değeri eksi orta autofluorescence değeri aynı zamanda noktada eklemek içinde ölçülür). - Orta 100 µL kan ve BBTB taklit beyin kenarlarında toplamak ve her biri sonraki Floresans ölçümler için ayrı bir düz oturaklı, siyah 96-şey plaka transfer. Düz medya boş autofluorescence düzeltmek için kullanın.
- Na-Fl kuyu başına 2.5 mL hazırlamak (50 µM) EBM. Na-Fl çözüm ile 37 ° c prewarm Ortamı ekler kan tarafındaki orta yerine en kısa zamanda Na-FL başlatmak ve sayaç içeren medya ile değiştirin.
- Dikkatli bir şekilde medya 100 µL kan ve 5, 30, 60 adresindeki ekler beyin tarafında toplamak ve 120 dk. Transfer siyah 96-şey plaka kuyu ayırmak için her örnek.
- Buna göre her iki taraf arasında güç dengesini korumak için ekler üzerinden toplanan ortamı değiştirin. Ekler İnkübatör arasındaki ısı farklılıkları en aza indirmek için her örnek koleksiyon geri koyun.
- Floresans 480/560 ayarla filtresi ile plaka okuyucu kullanarak toplanan örnekleri üzerinden ölçmek nm (uyarma ve emisyon, sırasıyla).
Not: Floresans beyin tarafından gelen 5 dk zaman noktada neredeyse mümkün değildir. Yüksek değerler için boş göre bir sızıntı belirtmek / zarar Ekle's membran veya bariyer; Bu nedenle, daha fazla analizleri bunlardan hariç. BBTB için beklenen Na-Fl geçirgenlik değerleri 10-6 cm/s aralığı (Tablo 1) için 10-5 olmalıdır.
- Küçük molekül ağırlıklı floresan boya sodyum floresein (Na-Fl) pasif Difüzyon ekler beyin tarafına kandan zamanla geçirgenlik değerleri aşağıdaki formüle göre hesaplanması sağlar:
- Tümörü hücreleri hazırlanması
Not: Hasta kaynaklı glioblastoma küreler burada kullanılmasına rağmen aşağıdaki iletişim kuralı yapışık, piyasada bulunan glioblastoma hücreler gibi U - 87 MG için kolayca adapte edilebilir.- İsteğe bağlı olarak, dört yuvarlak steril borosilikat coverslips ayirt görüntüleme için yer (ø 0.9 cm) 2 mL Poli-D-lizin (% 0.01) içeren bir 6-şey plaka kuyuda başına. 30 dk için oda sıcaklığında kuluçkaya.
- Bu arada, dikkatli bir şekilde tümör küreler bir 15 mL steril tüp steril serolojik damlalıklı kullanarak hücre kültür gemiden aktarın. Tümör küreler 250 rcf adlı 3 dk santrifüj kapasitesi.
- Süpernatant atmak, yavaşça küreler 1 mL bFGF/EGF-ücretsiz (GBM) gliyom hücre ve orta resuspend ve hücreleri saymak. Yaklaşık 104 küre/ml (105 hücre/mL) GBM-hücre yoğunluğu ayarlayın.
- Poli-D-lizin kuyulardan atmak ve yıka steril PBS ile 3 x. Plaka 3 mL/de tümör küresel süspansiyon, tohum ve ekler BBB taklit ile tümör hücre süspansiyon üzerinde transfer.
- Gecede kuluçkaya (37 °C % 5 ile CO2) tümör iki testin kan ve beyin arasındaki denge sağlamak için. Ertesi gün, kan yan medyada EBM-molekülleri/uyuşturucu/nano tanecikleri ile ilgi takıma değiştirin. Önceki bölümde açıklandığı gibi örnekleri doğrudan miktar için zaman içinde toplanır. Hücreleri floresan görüntüleme için kesin zaman noktada sabit (2,1 ve 2,2 bölümlerine bakınız).
2. yüksek çözünürlüklü Confocal görüntüleme BBTB
Not: %4 paraformaldehyde (PFA, pH 7.4, BBTB REPLICATE başına 6 mL) her zaman PBS taze hazırlanır. Buz üstünde tutun.
Uyarı: İngiltere'de yılın kanserojen. Nitril eldiven kimyasal duman başlık altında çözüm hazırlamak ve İngiltere'de yılın işlemek için kullanın.
-
Sıkı kavşak proteinlerin BBTB endotel ifade
- Durulama zar buz gibi PBS ile her iki (3 x 5 dk, 2.5 mL için/INSERT, 3 mL/de). PBS atmak ve 3 mL ve buz gibi %4 2.5 mL ekleyin PFA kuyu ve INSERT, anılan sıraya göre. 10 dk. atma ise buz üzerinde kuluçkaya (kurum'göre s tehlikeli kimyasal elden çıkarma) ve RT (2.5 mL/INSERT, 3 mL/da) 3 x PBS ile durulayın.
Not: Bir kez sabit, örnekleri PBS (2.5 mL/INSERT, 3 mL/da) bir hafta boyunca 4 °C depolanabilir. - Bir pamuklu çubukla ekleme beyin yüzeyini silin ve astrocytes kaldırmak için kullanın. Keskin bir neşter kullanarak dikkatle membran dört eşit parçalar halinde kesilmiş bir haç oluşturan iki dikey kesim yaparak. Ardından, neşteri nerede membran Ekle duvarına bitişik yere ekleyin ve dört örnekleri kurtarmak için diğer el ile ekleme döndürün. İyi cımbız kullanarak, dikkatle her örnek PBS/iyi, 200 µL kan tarafı yukarı her iyi ile içeren bir 24-şey plaka aktarın.
- Membranlar ile % 10 fetal sığır serum PBS içinde (için 30 dk, RT, 200 µL/iyi) engelleyin. 1° antikor çözüm sıkı kavşak immunostaining için proteinler (şekil 1 d) hazırlamak (zonula occludens-1, claudin-5; Malzemeler tabloiçin bakınız) çözüm/iyi engelleme 200 µL içinde. İsteğe bağlı olarak, trombosit endotel hücre adezyon molekülü (PECAM1 ya da CD31; Malzemeler tabloiçin bakınız) karşı her sıkı kavşak antikor çözüm için yükseltilmiş bir antikor ekleyerek endotel hücre kimliği doğrulanır. Engelleme çözüm atmak ve birincil antikorlar' O/N 4 °c ile kuluçkaya
- Ertesi gün, birincil antikorlar atmak ve PBS 200 µL ile yıka (RT, 5 min için 3 x). Onları uygun species-specific fluorophore Birleşik ikincil antikorlar ile kuluçkaya (1:500 seyreltme, 200 µL/iyi, engelleme çözümde seyreltilmiş; Malzemeler tabloiçin bakınız) için 2 h RT.
- İkincil antikorlar atmak, durulama PBS 200 µL ile (3 x 5 dk RT az için). PBS kaldırmak ve bir 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) çözüm 1 µg/mL saf distile H2O (dH2O; 200 µL/iyi malzemeler tablo için bakınız; son bir konsantrasyon kullanarak hücre çekirdeği counterstain ). 7 dk RT. Kaldır, DAPI kuluçkaya ve membranlar 3 yıkama x dH2O ile (200 µL/de).
- Bir damla montaj orta yerleştirin (bkz. Tablo reçetesi) cam mikroskop Slayt üzerindeki. İyi cımbız kullanarak, dikkatle membran kuyudan al ve yönlendirmesini tutmak, dH2O fazlalığı çıkarın ve montaj orta teslimi yerleştirin. Montaj orta membran üstüne başka bir damla ekleyin ve dikkatli bir borosilikat cam ile kaplayın. Hapsolmuş hava hava kabarcığı yok olduğundan emin olun. 4 °C ve ışıktan uzak örnekleri confocal mikroskobu gözlemler kadar saklayın.
Not: Astrocyte boyama yapılabilir beyin tarafı yukarı ile seçilen astrocyte özgü antikor kullanımı ile 24-şey plaka membranlar parçaları koyarak (örneğin, gliyal fibrillary asit protein [GFAP'nin] karşı yönetmen) (şekil 1E ).
- Durulama zar buz gibi PBS ile her iki (3 x 5 dk, 2.5 mL için/INSERT, 3 mL/de). PBS atmak ve 3 mL ve buz gibi %4 2.5 mL ekleyin PFA kuyu ve INSERT, anılan sıraya göre. 10 dk. atma ise buz üzerinde kuluçkaya (kurum'göre s tehlikeli kimyasal elden çıkarma) ve RT (2.5 mL/INSERT, 3 mL/da) 3 x PBS ile durulayın.
-
BBTB floresan nanopartikül transcytosis algılamak için boyama
- Canlı hücre lysosome etiketleme gerçekleştirmek (örneğin, floresan kullanarak probları [ Tablo reçetesigörmek]). Lysosome floresan boya çalışma konsantrasyonu 50, seyreltik prewarmed EBM-nM (2.5 mL/Ekle) veya prewarmed ABM - 75 mm (3 mL/de) lysosome için etiketleme endotel hücreleri ve astrocytes, anılan sıraya göre. 45 dk için hücreleri kuluçkaya (37 °C % 5 ile CO2); sonra 3 x buz gibi PBS (2.5 mL/INSERT, 3 mL/da) ile yıkayın.
- PBS atmak ve 3 mL ve buz gibi %4 2.5 mL ekleyin PFA kuyu ve INSERT, anılan sıraya göre. Onları ise 10 dk. atma için buz üzerinde kuluçkaya ve hücreleri 3 durulama x PBS (at RT, 2.5 mL/INSERT, 3 mL/da) ile.
Not: Bir kez sabit örnekleri PBS (2.5 mL/INSERT, 3 mL/da) bir hafta boyunca 4 ° C'de depolanabilir. - PBS kaldırmak ve bir son konsantrasyonu dH2O 1 µg/ml (1 mL/INSERT, 1 mL/da) bir DAPI çözüm kullanarak hücre çekirdeği counterstain. Onları 7 dk RT. Kaldır, DAPI kuluçkaya ve membranlar 3 yıkama x dH2O (2.5 mL/INSERT, 3 mL/da) ile.
- Dikkatle membran kesmek, dH2O fazlalığı çıkarın ve montaj orta bir damla üzerinde yerleştirin (bkz. Tablo reçetesi) cam mikroskop Slayt üzerindeki. Membran öbür ucunda montaj orta başka bir damla ekleyin ve dikkatle bir borosilikat cam ile kaplayın. Hapsolmuş hava kabarcıkları kaçının. 4 °C de örnekleri depolamak ve ışıktan confocal mikroskobu görüntüleme kadar korumalı tutun.
-
Tümör hücreleri floresan boyama
- İyi cımbız kullanarak, tümör küreler buz gibi PBS ile dolu bir 24-şey plaka içeren yuvarlak coverslips dikkatli bir şekilde aktarın. Floresan lysosome sondalar 75 at kullanarak etiketleme canlı hücre lysosome devam prewarmed GBM-nM (200 µL/de). Örnekleri için 45 dk kuluçkaya; o zaman, yıka buz gibi PBS ile 3 x (200 µL/de).
- PBS atmak ve buz gibi İngiltere'de yılın iyi başına 200 µL ekleyin. 10 dk. atma ise buz üzerinde kuluçkaya ve durulama örnekleri 3 x (RT) adlı PBS ile.
Not: Kez sabit örnekleri-ebilmek var olmak stok içinde PBS (200 µL) bir hafta boyunca 4 ° C'de. - PBS kaldırmak ve hücre çekirdeği 1 µg/ml dH2O son bir konsantrasyon, DAPI çözüm kullanarak counterstain (200 µL/de). Onları 7 dk RT. Kaldır, DAPI kuluçkaya ve coverslips 3 yıkama x dH2O ile (200 µL/de).
- İyi cımbız kullanarak, coverslip alın, dH2O fazlalığı kaldırmak ve montaj orta bir damla üzerinde yerleştirin (bkz. Tablo reçetesi) cam mikroskop Slayt üzerindeki. Herhangi bir hava kabarcıkları entrapping kaçının. 4 °C de örnekleri depolamak ve ışıktan confocal mikroskobu gözlemler kadar korumalı tutun.
3. in Vivo karşılaştırmalı çalışma
- Sodyum floresein Difüzyon BBB yoluyla in situ kayıt
- Fizyolojik bir çözümde 50 nM Na-Fl çözümünün 150 µL hazırlayın. Çözüm 37 °C intravenöz teslimat üzerine tutun.
- Bir fare bir ketamin/xylazine kokteyl (100 mg/kg ketamin ve 10 mg/kg xylazine PBS içinde 300 µL) mayi enjeksiyonu ile anestezi. Derin anestezi kurulduktan sonra hayvan, vücut ısısını korumak için Isıtma yastığını yerleştirin.
Not: On-hafta-yaşlı kadın deniz Tıbbi Araştırma Enstitüsü (NMRI) çıplak immün fare Şekil 2' de sunulan verileri elde etmek için kullanılmaktadır. Ancak, bu iletişim kuralını immün ve immün fareler için adapte olduğunu. 'Bilim adamı anestezi/analjezi yöntemdir s takdirine bağlı olarak. Ancak, önemli ölçüde BBB geçirgenliği18arttıkça inhalasyon anestezi isoflurane gibi tavsiye edilmez. - Stereotaksik bir çerçeve üzerinde fareyi getirin ( Tablo reçetesigörmek) ve bağ doku, kafatası ortaya çıkarmak için iyi cımbız kullanarak nazik dilacerations tarafından takip iyi makas ile kafa derisi boyuna bir kesi gerçekleştirmek. Dairesel hareketler ile iyi bir microdrill kullanarak, ø 0.3 mm dairesel parça kafatasının sol veya sağ parietal kemik kaldırın. Aşırı sondaj sırasında ve temel meninjeal doku ve kan damarları zarar önlemek için kafatası parçası kaldırma sırasında dikkatli olun.
- Fizyolojik çözüm maruz doku üzerinde bir damla bir yer. İki çift iyi forseps kullanarak, beyin korteksi erişmek için meninjeal doku dikkatli bir şekilde çıkarın. Beyin dokusu hiç hava ile doğrudan temas halinde olmalıdır.
Not: Meninjeal yaralanmalara karşı küçük kanama durdu hematolojik sünger kullanarak ( Malzemeler tabloiçin bakınız). - Bir kez meninjeal doku kaldırılır ve korteks tamamen maruz, korteks ve ø 0,5 mm borosilikat coverslip arasında fizyolojik çözüm bir damla tuzağa. Cyanoacrylate tutkal bir damla ile gözlem alanı güvenli ( Malzemeler tabloiçin bakınız) coverslip bir iğne ile yayıldı. İzin için 1 dk kuru tutkal.
- İmplante edilebilir kateter kuyruk ven enjeksiyon (şekil 2A) için hazır olun. Rochester Ochsner forseps kullanarak 25 G iğne ucu break ve ucu bir 10 cm uzunluğundaki PE20 poliüretan tüpü yerleştirin ( Malzemeler tabloiçin bakınız) (şekil 2A).
- Bulldog kelepçeleri kateter manipülasyonu ve ekleme için kullanarak fare, yanal kuyruk ven kateteri yerleştirin ( Malzemeler tabloiçin bakınız) (şekil 2B). Eklenen iğne cyanoacrylate tutkal bir damla ile güvenli. İzin için 20 kuru tutkal bulldog kelepçe kaldırmadan önce s. Dikkatle Na-Fl solüsyon (şekil 2B) içeren bir şırınga bağlı 25 G iğne kateterin diğer ucunu bağlayın.
- Not: Kuyruk ile bulldog kelepçe kelepçe değil; yalnızca hassas kateter işleme için kullanılır. Uygun kateter ekleme içine saydam tüp kan reflü tarafından onaylanabilir.
- Hayvan stereomicroscope altında yerleştirin (bkz. Tablo malzeme). Alt düzey autofluorescence yeşil kanal kullanarak (480 nm), odak nispeten büyük kan damarları (göründükleri bu dalga boyu ışıkta hemoglobin emilimini nedeniyle daha koyu) ve daha küçük kılcal damarlar (şekil 2C) içeren bir bölge. Kısa bir süre önce arka plan floresan bir ölçüm için floresan boya hızlandırılmış edinme başlatın.
Not: Alternatif olarak, hızlandırılmış kayıt T0 anlık görüntü resimleri tarafından değiştirilebilir ve herhangi bir diğer zaman Puan önceden belirlenmiş. - Yavaş ve sürekli bir hızda çözüm enjekte veya alternatif olarak, bir otomatik infüzyon sistemi kullanın. Kanda tespit Na-Fl Floresans istikrarlı kalmalıdır (half-life kan: 286 dk), birkaç dakika kafatası pencereden BBB Difüzyon kaydı sağlar. Satın alma işlemi tamamlandıktan sonra dikkatle kateter kaldırmak ve hayvan tarafından servikal çıkığı ötenazi.
- İn vivo BBB geçirgenliği belirlenmesi
Not: Değerleri ImageJ gibi herhangi bir görüntü işleme yazılımı Floresans sinyal yoğunluğu ölçümü faiz (ROI) özel bir bölge içinde sağlar elde edilir.- Ek açıklama aracını kullanarak bir dikdörtgen şeklinde yatırım Getirisi bir kan damarı dışında beyin dokusunda çizmek, yaklaşık 5 mikron görünür herhangi bir kan damarları mesafeden Na-FL Not ile yatırım Getirisi ve T0 ki ROI içinde ölçülen Floresans yoğunlukta boyutları dolu olan boş doku'için kullanılan s autofluorescence. Postinjection vakit (tüm çözüm hayvana enjekte edildiğinde Örneğin, son kaydedilen çerçeve) üzerine gelin ve Not ROI (şekil 2C) içinde ölçülen kesin zaman ve floresan değerler için yatırım Getirisi yerinden olmadan, Hızlı ileri sarmak.
- ROI görünür kan damarı (şekil 2C) hareket ve kandan T0 autofluorescence değerini not alın. ROI yerinden olmadan, aynı saat noktasına 3.2.1. adımda tanımlanan ileri sar. ve ROI (şekil 2C) içinde ölçülen Floresans değeri not.
- BBB geçirgenliği belirlemek için (1.3 bölümünden uyarlanmış) aşağıdaki formülü kullanın:
- Burada, dFbeyin Floresans yoğunluk değeri eksi T0 boş değeri beyinde, dT Alım süresi noktası saniyede, A olduğunu YG alanı kare santimetre ve olarak alınan yaklaşık gemi yüzey alanı dF kan kan T0 boş değeri eksi floresan yoğunluğu değerdir.
Not: BBB için beklenen geçirgenlik değerleri 10-6 cm/s aralığı (Tablo 1) olması gerekir.
- Fare beynindeki floresan nano tanecikleri tespiti için işleme doku
- Hasta kaynaklı glioblastoma küreler (5 x 104 hücreleri steril PBS 5 µL) imzalat 6-hafta-yaşlı kadın NMRI çıplak fareler corpus callosum implant. Bu beyin bölgesi Bregma başlayarak aşağıdaki stereotaksik koordinatları bulun: hastanın + 0,5 mm, sol sağa + 2.5 mm, dorsoventral + 3 mm. izin vermek için 2 hafta büyümeye beyin tümörü.
- Nano tanecikleri intravenöz enjekte (100 µL steril fizyolojik çözüm içinde 100 µg) ve 8 h. enjekte için denetim fareler intravenöz steril fizyolojik çözüm 100 µL ile dolaşmaya izin.
- Fareler tarafından servikal çıkığı ötenazi ve hızla isopentane kuru buz (1dk-50 °C) üzerinde muhafaza içinde ek-dondurma için beyin toplamak. -80 °C de beyin doku işleme kadar saklayın.
- Koronal beyin bölümleri ile bir cryomicrotome kesin. Kafa içi implantasyon korteks üzerinde kurulan ve 9 µm kalınlığında bölüm ( Tablo reçetesigörmek) uygun mikroskop slayta alandaki durdur yara bulun.
- Buz gibi PBS slaytları üzerinde immobilize beyin bölümleri bırakın (2 x 5 min için) ve sonra buz gibi %4 oranında tamir PFA (5 dk için). Slaytları PBS içinde yıkayın (3 x 5 dk RT az için). Slaytları yatay konuma getirin ve damlalıklı engelleme çözüm içeren % 10 fetal sığır serum PBS içinde doku (RT, 500 µL/Slayt 1 h için) tüm yüzeyini örten bölümleri. CD31 antikor hazırlamak ( Malzemeler tabloiçin bakınız) çözüm/slayt engelleme 250 µL içinde. Engelleme çözüm antikor ile değiştirin ve gecede kuluçkaya 4 °C oksijen odasında.
- Ertesi gün, PBS slaytları bırakın (RT, 5 min için 3 x) ve onlara karşılık gelen fluorophore Birleşik ikincil antikor (PBS 250 µL RT, 2 h, 1:500) ile kuluçkaya. PBS (RT), 3 x durulama ve hücre çekirdeği 1 µg/ml dH2O son bir konsantrasyon, DAPI çözüm kullanarak counterstain (250 µL/slayt). Örnekleri RT. Kaldır DAPI çözüm, 7 dk için kuluçkaya ve slaytlar 3 yıkama x dH2O.
- Her doku bölüm üzerinde bir damla montaj orta Ekle ( Malzemeler tabloiçin bakınız) ve örnekleri bir coverslip ile güvenli. Hava kabarcıkları entrapping kaçının. 4 °C de örnekleri depolamak ve ışıktan confocal mikroskobu gözlemler kadar korumalı tutun.
Representative Results
Fare BBTB taklit confocal görüntüleme bEND3 içinde ifade ve sıkı kavşak proteinler zonula occludens-1 (ZO-1) ve claudin-5 Hücrede yerleşimi gösterir. Kişiler endotel hücreleri ve astrocytes arasında açıkça ZO-1 ve claudin-5 bEND3 monocultures (şekil 1 d) göre endotel hücre-hücre kişilere tehcir indüklenen. GFAP'nin ifade astrocytes membran beyin tarafındaki görselleştirmek için boyama ayirt kullanarak, gözlemlemek ve astrositik işlemleri ve son-feet (şekil 1E membran ile endotel hücreleri başvurarak çalışma olanağı vardır ). Astrocyte endotel hücre rehber teşvik ve hücresel bariyer sıkma için bilinen ve BBB19daha düşük geçirgenlik değerleri ile ilişkili. Bu uygun olarak, biz 6.74 (± 3.01) x 10-6 cm/s için Na Fl 27.63 (± 3,45) x 10-6 cm/s monocultures durumunda üzerinden fare BBTB taklit geçirgenliği önemli bir düşüş gözlenen zaman hipoksi-indüklenebilir ile birlikte kültürlü faktör knock out (HIFko) astrocytes (Tablo 1). Ölümsüzleştirdi HuAR2T formu yüksek geçirgen hücresel engelleri (104.92 ± 27,1 x 10-6 cm/sn, Tablo 1). HuAR2T hücreleri insan birincil astrocytes (Tablo 1) ile birlikte kültürlü yaşındayken fare modeline benzer, önemli ölçüde daha düşük BBTB Na-FL, yani 47.4 (± 14.32) x 10-6 cm/s, geçirgenliği şiddetindeydi.
Fare ve insan BBTB taklit eder, hasta kaynaklı glioblastoma küreler varlığı endotel hücre-astrocyte ortak kültürler yalnız için karşılaştırıldığında geçirgenlik değerleri (Tablo 1) hafif bir artış indüklenen. Bu olay birkaç ile görülmektedir ancak tüm hasta gliyom modelleri küre. Bu VEGF-A bu bazı bu hasta kaynaklı hücreler tarafından salgılanan nedeniyle olabilir.
Tüp Bebek BBTB taklit eder içinde vivo BBB ile geçirgenlik değeri karşılaştırmak için Na-Fl çıplak fareler implante kafatası penceresinden gerçek zamanlı Difüzyon görüntüsü. Floresan stereomicroscope kullanarak, Na-Fl Difüzyon ana pial kan damarları türetme damar kılcal dan önce sırasında ve sonrasında sonda (şekil 2C) Sistemik enjeksiyon kaydedildi. Zaman içinde dolaşan kan ve beyin beyin parankimi fark Floresans değerleri ölçümler bize çıplak fare'yaklaşık geçirgenlik değerlerini hesaplamak izin s BBB Na-Fl (5,57 ± 2.19 x 10-6 cm/sn, için Tablo 1).
Bu BBTB taklit bileşikleri kan tarafa geçiş beyin yanına görselleştirme için nasıl kullanılabileceğini göstermek için ø 110 nm (NP110) ve ø 350 nm (NP350) nano tanecikleri hedefleme hasta kaynaklı glioblastoma küreler transcytosis karşılaştırıldığında. Sonuçlar elde tüp bebek o zaman içinde vivo transcytosis karşılaştırıldı. Sunulan örnekte, nano tanecikleri tümör hedefleme peptid ile CooP20 kaplı yüzey ve floresan boya (görselleştirme kolaylaştırmak için FITC) ile yüklü. Biz lizozomal boya kullanarak hücreleri etiketli ve BBTB kan tarafında FITC nano tanecikleri taklit ve confocal Filmler (örneğin, kan yan, membran, beyin yan, farklı düzeylerde kazanılmış sonra DAPI 24 s counterstained ve hasta glioblastoma küreler) (şekil 3A). Organellerin endotel hücreleri, astrocytes ve tümör hücreleri ile colocalized NP110 ilişkili floresan sinyali. Buna ek olarak, NP110s tespit edilen ikisinin arasında olduğunu endotel hücreleri ve Ekle (şekil 3A) membran gözenekler geçen astrocytes.
NP110s geçirilmesi Floresans kan ve beyin taraftan toplanan örnekleri üzerinden ölçerek sayısal. Bu nano tanecikleri için belirlenen bu geçirgenlik değerleri karşılaştırıldı ø 350 nm (NP350). Sonuçlar yalnızca NP110 BBTB taklit eder (şekil 3B) geçmek mümkün olduğunu gösterir. NP350 daha düşük geçirgenlik değerleri için bu nano tanecikleri sonuçlandı BBTB taklit kan tarafında kaldı.
İçinde vivo modellerle karşılaştırıldığında BBTB taklit eder alaka vurgulamak için çıplak fareler intravenöz tümör hedefleme peptid ile CooP kaplı ve algılama için kırmızı floresan boya (TRITC) ile Birleşik NP110 veya NP350 nano tanecikleri ile enjekte edildi. Birkaç saat noktalarda toplanan doku 8 h sonra dolaşımda kaldı olanlar ağırlıklı olarak sistemik dolaşım içinde vivo silinmesinden geçirgen ise beyin parankimi içine BBB-geçirgen nano tanecikleri extravasated saptandı. Bu nedenle, beyin toplanan ve nano tanecikleri milimetre kare 8 h postinjection başına sayısı sayılabilir. Tüp Bebek bulgular, NP110 ama değil NP350 uygun olarak, başarılı bir şekilde (şekil 3 c) beyin parankimi extravasated. Yüksek büyütme görüntüleme beyin nanopartikül konumunun NP110 homojen beyin parankimi dışında kan kılcal dağıtılan ve başarılı bir şekilde (şekil 3D) implante glioblastoma hücrelere bağlantılı gösterdi. Yan (CooP) hedefleme aynı tümör sergilenmesi rağmen NP350 beyin parankimi extravasate açamadı ve sadece beyin kan damarları (şekil 3E), tüp bebek. elde edilen sonuçlar benzer luminal tarafına içinde algılandı
Şekil 1: kan-beyin tümör-bariyer (BBTB) modelinin açıklaması. (A)farklı hücre tipleri yerlerini şematik gösterimi. 6-şey plaka kapak ve tohumlama tekniği için astrocytes Ekle'beyin tarafındaki Ekle yerleştirme (B) örnek s membran. (C) astrocyte yapışma sağlayan 6-şey plaka yerleşim Illustration. (D) ayirt Filmler sıkı kavşak proteinler zonula occludens-1 (ZO-1, üst satır, kırmızı) ve claudin-5 (alt satır, yeşil). Protein ifade bir Monokültür (sol sütun) olarak veya fare ölümsüzleştirdi HIFko astrocytes (sağ sütun) ile yalnız BBTB kan tarafında kültürlü fare beyin mikrovasküler endotel hücreleri (bEND3) karşılaştırılır. Hücre çekirdeği DAPI (mavi) ile counterstained. (E) HIFko astrocytes BBTB beyin yanında kültürlü gliyal fibrillary asidik protein (GFAP'nin, kırmızı) gösteren ayirt test. Yüksek büyütme resim astrocyte işlemleri gösterir ve son-feet (oklar) membran ile endotel hücreleri temas (doğru kapı aynası) gözenekleri. HIFko astrocytes kimliği hücreleri əbadoləşdirmək için kullanılan simian virüs 40 büyük T antijen (SV40 büyük T, yeşil) ayirt boyama tarafından doğrulandı. Endotel hücreleri ne GFAP'nin ne de SV40 büyük T hızlı ve bu nedenle, kısmen saydam, karşı tarafında salt DAPI lekeli hücreler (kesikli çizgiler) olarak membran aracılığıyla görülebilir. Hücre çekirdeği DAPI (mavi) ile counterstained. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: Canlı belirlenmesi intravital: fare BBB geçirgenliği. (A)implante edilebilir Kaudal ven kateteri hazırlanması. (1) alet ve ekipmanlar şunlardır: (bir) bir PE20 polietilen boru (b) iki 25 G iğneler (c) Rochester Ochsner forseps ve (d) küçük bir bulldog kelepçe. (2) A 25 G iğne tarafından birkaç torsion kaldırılır forseps ve (3) dikkatli bir şekilde kullanarak tüp takılı. (4) tüp diğer tarafında başka bir 25 G iğneye bağlı. (B) rehberlik kateter implantasyon ve konumlandırma için bir fare kuyruğu ven ile sodyum floresein çözüme demleyin. Daire içinde alan cyanoacrylate tutkal bir damla kateter güvenliğini sağlamak için yerleştirildiği alanı gösterir. Bulldog kelepçe kateter işlemek için kullanılan ve kateter güvenli bir kez kaldırıldı. Sodyum floresein geçirgenlik değerleri belirlemek için (C) temsilcisi görüntüleme ve miktar yöntemi. Sodyum floresein infüzyon (sol sütun) önce autofluorescence/boş beyin (üst panel, beyaz dikdörtgen) ve damar alanları (alt paneli, kırmızı dikdörtgen) üzerine yerleştirilmiş bir bölgesi (ROI) ilgi içinde ölçülür. Sodyum floresein infüzyon sırasında (sağ sütun) floresan yoğunluğu BBB geçirgenliği hesaplama sağlayan her iki ROIs içinde ölçülür. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: nano tanecikleri BBB içinde tüp bebek BBTB modelini kullanarak vivo aracılığıyla intraserebral transcytosis değerlendirilmesinde. (A)temsilcisi confocal görüntülerle fare BBTB modeli belirtilen farklı düzeylerde elde BBTB tahlil grafik gösterimi. Nano tanecikleri 110 nm çapında (NP110) ve konjuge FITC (yeşil) için eklenen kan yan BBTB hücrelerinin lizozomal sonda (LT-99, kırmızı) ile etiketli. (1) Endothelial hücre, (2) Endothelial transcytosis nano tanecikleri membran (beyaz Kesikli çizgi), (3) astrocytes, gözenekler yoluyla, ve (4) hasta glioblastoma küreler grafiğin üzerinde tanımlanır ve karşılık gelen confocal Filmler (sağda). Lizozomal encapsulation (oklar) nano tanecikleri etkin transcytosis BBTB endotel ve astrocyte katmanları öneriyor. Tüp Bebek BBTB ile belirtilen nanopartikül geçirgenliği (B) miktar (n = 6). (C) miktar beyin dokusu içinde belirtilen nanopartikül yoğunluğu bölümleri, çıplak fareler Kaudal ven infüzyonu sonra 8 h (n = 3). (D) Confocal Filmler fare beyin doku bölümlerde 110 nm nano tanecikleri (NP110, kırmızı) ø dağılımını gösteren bir anti-fare CD31 antikor (yeşil) ile Etiketlenmiş. Oku nanopartikül transcytosis (sol panelde) vurgulamaktadır. Nano tanecikleri sayesinde onların yüzey üzerinde sunulan CooP hedefleme peptid Beyin tümör hücreleri (tümör, doğru kapı aynası) etrafında birikmiş. Hiçbir önemli posta beyin dokusunda (beyin) görülmektedir. (E) Confocal Filmler fare beyin doku bölümlerde bir anti-fare CD31 antikor (yeşil) etiketli 350 nm nano tanecikleri (NP350, kırmızı) ø dağılımı gösterir. Kan damarı Lümen muhafaza ve muhtemelen onların daha büyük çap NP110s. hücre çekirdeği karşılaştırıldığında nedeniyle BBB çapraz koyamadık NP350s noktasına ok uçları DAPI (mavi) ile counterstained. P < 0,01. P-değerleri hesaplanan iki uçlu, parametrik olmayan Mann-Whitney U testi kullanma. Hata çubukları standart sapmayı temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| fare BBTB taklit | bEND3 | bEND3 + HIFko olarak | bEND3 + GB | bEND3 + HIFko olarak + GB | İn vivo |
| Geçirgenliği (10-6 cm/s) | 27.63 | 6.74 | 26,8 | 10.83 | 5,57 |
| SD (10-6 cm/s) | 3,45 | 3.01 | 7,99 | 2,65 | 2.19 |
| insan BBTB taklit | HuAR2T | HuAR2T + hIAs | HuAR2T + GB | HuAR2T + hIAs + GB | |
| Geçirgenliği (10-6 cm/s) | 104.92 | 47.4 | 89.08 | 48.24 | |
| SD (10-6 cm/s) | 27,1 | 14.32 | 10.21 | 13.07 |
Tablo 1: in vitro belirlenen sodyum floresein (Na-Fl) geçirgenliği (cm / sn) cinsinden değerleri belirtilen ortak kültür sistemlerindeki ve içinde vivo NMRI çıplak farelerde. Veri temsili bir deneme (n = 3 fareler).
Discussion
İnterpatient tümör değişkenlik kavramı yükselişi kişiselleştirilmiş kanser ilaç21üzerinde araştırma yenilendi. Bu değişkenlik de merkezi sinir sistemi neoplazmlar bir özelliğidir. Tahmin edilemezlik tümör nedeniyle yanıt-e doğru kemoterapi BBB için ilaç dağıtım askerlerinden etkisini ekler ve tamamen hasta bakımı22büyük zorlukları kabul ettiğiniz anlamına gelir. Daha etkili tedaviler geliştirmek için genellikle ekran büyük yeni moleküller kitaplıklarına gereklidir. Antitümör etkinlik ve tümör sitesine ulaşmak için yeni tedavi yol yeteneği değerlendirmek için en iyi seçenek hasta elde edilen hücrelerde vivo içinde fare hasta avatars implante preklinik çalışmadır. Pratik (mali, zaman, insan ve tesis kaynakları) ve etik nedenlerle (laboratuvar hayvanlarının kullanırken 3Rs İlkesi) nedeniyle, böyle bir büyük ölçekli içinde vivo tarama platformu geliştirilmesi mümkün ve bu nedenle, hücre tabanlı deneyleri değil kez bir model seçim23kalır. Hücre satırları seçmek için asıl nedeni kurulan ve Primer hücre kaçınarak tekrarlanabilirlik kolaylaştırmak ve yalıtım ve birincil fare kültürler kurulması için ana kaynağı laboratuvar hayvanlarının kullanımı azaltmak etmektir. Burada, sunma yöntemleri sıkıca uymak 3Rs ile verimli bir şekilde nano tanecikleri bir ek preklinik araştırmaların kriter üzerinde modeli BBTB çapraz için kendi yetersizlik üzerinden atmak. Bir kanıtı-of-ilke olarak, biz burada geliştirme ve BBTB doğrulama sırasında elde edilen bulgular tarif. Örneğin ne zaman ölçme bir 376 Da sodyum floresein pasif Difüzyon tüp bebek bulgular içinde vivo onaylamak başardık.
Bu yazıda belirtilen iletişim kuralı endotel hücreleri ile astrocytes cocultured hazırlanması bir tüp bebek Kur kan-beyin tümörü bariyer gibi arabiriminde oluşturmak için açıklar. Bu iki hücre tipleri arasında fiziksel bir temas kurulduktan sonra endotel hücre katmanı BBB (örneğin, bir hücre yüzey ifade sıkı kavşak proteinlerin ve nispeten düşük geçirgenlik) ile benzerlikler sergiler. İlginçtir, fare BBTB taklit özellikle benzer Na-Fl geçirgenlik değerleri bu içinde vivo fare BBB geçirgenliği ölçüm24ile elde sağlamak için görünüyordu. Bu nedenle, BBTB taklit eder performansını doğrudan seçtiğiniz bir bariyer oluşturmak için kullanılan hücrelere bağlantılı olur. BEND3 endotel hücreleri ve beyinden köken astrocytes25ile cocultured zaman engelleri oluşturan başarılı olduğu bilinmektedir. Ancak, ölümsüzleştirdi HIFko astrocytes26 BBTB taklit oluşturmak için kullanıyoruz. Hipoksi-indüklenebilir faktör onların eksikliği nedeniyle, bu astrocytes üretmek VEGF-A, burada açıklanan BBTB taklit'ın istikrar içinde özetin özeti olduğu. Astrocytes örneğin VEGF-bir yanıt neuroinflammation27olarak sürümü ile BBB geçirgenliği modülatörler olarak tespit edilmiştir. Harekete geçirmek-vasküler endotelyal büyüme faktörü reseptörü (VEGFRs) in vitro28 ve içinde vivo29hem de endotel/vasküler geçirgenliği anahtar bir düzenleyicisidir. Bu nedenle, VEGF-A takviyeleri orta VE-cadherin30gibi adherens junction proteinlerin fosforilasyon neden olmaktadır VEGFR2 endotel hücreleri üzerinde etkinleştirin. Endotel hücre-hücre kişiler kaybı yüksek geçirgen kan damarları oluşturur. Benzer şekilde, güçlü mitogenic özelliği ve hücre kültürü deneyleri içinde kullanılan fetal sığır sera bilinmeyen kompozisyon önemli konular bariyer istikrar ve tahlil tekrarlanabilirlik neden.
İnsan göbek damar endotel hücreleri (HUVECs) bazen vitro31' BBB oluşturmak için kullanılır; hCMEC/D3 hücre satır32, gen ekspresyonu ve bariyer şekillendirme açısından gibi Ancak, onlar önemli ölçüde beyin mikrovasküler endotel hücreleri, farklı özellikleri. Ancak, bEND3 için yalnız yetiştirilen HuAR2T hücreleri ile elde edilen değerler karşılaştırıldığında nispeten daha yüksek geçirgenliği büyük ölçüde azalır ile insan birincil astrocytes coculturing tarafından. Endotel hücreleri hücresel duvar oluşturmak için gerekli olmasına rağmen astrocytes BBTB oluşumu ve istikrar için eşit derecede önemli bir rolü olduğu açık görülüyor.
Hasta kaynaklı gliyom küreler bu denkleme eklendiğinde, fare BBTB taklit bazı beyin damarlara ve tümör hücre hedefleme yoluyla uyuşturucu Difüzyon gibi fare xenografts özellikleri recapitulated. Burada tartışılan BBTB taklit eder örneğin, ne zaman biz farklı çaplarda birkaç nano tanecikleri ekranlı içinde vivo davranış ikizlemede başarılı oldu. Tüp Bebek ve içinde vivo modelleri arasında paralellik göstermek için biz yukarıda açıklanan mesoporous silikat nano tanecikleri33 34 hücre delici özellikleri üzerinde tümör hedefleme peptid CooP Birleşik ile kullanılan onların surface20. CooP hedefleme peptid evleri meme kaynaklı büyüme inhibitörü (MDGI) için özel bağlayıcı ile invaziv tümör hücreleri için. Birkaç kanserleri gliomas, dahil olmak üzere, hangi kümes çok verimli bir tümör hedefleme yan artan yükü20teslimini yetenekli kılan normal doku35' e, karşılaştırıldığında MDGI overexpressing. Burada kullanılan nano tanecikleri daha önce beyin parankimi (27547955) yaygın gösterilmiştir ve Taxol ile functionalized, bu nano-yükler preklinik modelleri36tümörü büyümesi azaltılmasında başarılı olmuştur. Polietilen glikol (PEG) artıkları nano tanecikleri yüzeyde ilavesi de onların statik şarj pozitif değerler için tutulan (çevresinde + 4 mV), nörovasküler birim37 ile daha iyi etkileşim sağlayan ve aynı zamanda onların istikrar artan dolaşımda. NP350s PEG 10 kDa ile kaplı iken sunulan veri, NP110s için PEG, 3 kDa Birleşik. Ancak, artan molekül ağırlıklı PEG da nanopartikül çapı, bu nedenle önemli bir artış BBB geçmeye fiziksel yeteneklerini sonuçlandı. Bu nedenle, ister parçacıkların fiziksel boyutları BBTB onların geçitle engelledi ve olup bu gözlemler içinde vivo yansıtılması kontrol ettik.
Daha önce yayımlanmış gözlemler uygun olarak, biz NP110s tüp bebek BBTB ve NP350s BBTB taklit ve kan damarlarının luminal tarafında muhafaza ederken İntrakraniyal tümörler taşıyan fareler BBB yoluyla extravasated gözlenen fareler. Bu benzer sonuçlar BBTB modeli BBB çapraz ve beyin ulaşmak için nano tanecikleri içinde vivo yeteneğini öngörülen şiddetle tavsiye ederim.
BBB hücresel modelleri alaka sık sık, hatta nano tanecikleri38Merkez teslime ele alınmıştır. Burada birincil astrocytes ve endotel hücreleri, hem en alakalı tüp bebek araçları olarak kabul ölümsüzleştirdi ve/veya piyasada bulunan hücreleri tarafından değiştirilebilir olduğunu daha fazla ölçeklenebilirlik ve tekrarlanabilirlik sağlanması gösteriyoruz. Tüp Bebek BBB taklit eder yeni nesil yapısal olarak gerçek BBB12,14benzer güzel biçimlendirilmiş nörovasküler birimleri izin mikrosıvısal cihazlar dahil ederek geliştirilebilir. Ancak, şu anda teslim14takip teknik sınırlamalar nedeniyle gliomas teslim molekülleri yüksek üretilen iş taranması için uygun olmayan bu tür modellerdir. Gerçekten de bir tabak içinde BBB fizyolojik karmaşıklığı yakalamak zordur ve bazı reseptörleri/BBB tarafından ifade edilmesi için bilinen proteinler, olası eksikliği sonuçların yorumlanması tehlikeye atabilir. Başka bir bağımsız değişken gen ifadesinin içinde vivo ve in vitro içinde koşullar arasında yanı sıra başka bir, özellikle dikkate endotel hücreleri tek bir hücrede satırından büyük değişkenlik ilgilendiriyor. Ancak, aynı zamanda nörovasküler birimi içinde beyin39Tekdüzen bir varlık değil söylenebilir. Biyoloji bilimsel araştırma nerede hayvan refahı, etik sorumluluk ve hayvan hayat kullanma maliyetini her zaman bir deney tasarlamadan önce kabul edilir bir insana ilişkin dönem ulaştı. Bu nedenle, hayvanlar değiştirme desteklemek için son yıllarda yapılan çalışmalarda giderek artan sayıda göstermek bu modellerin sınırlarını ve bariyer kurmak için hücresel modellerin dikkatli seçimi bilincini — astrocytes üzerine vurgu ile — garanti bir maç sonuçları arasında bir tabak içinde elde edilen ve hayvan40modelleri. Burada açıklanan yöntemi ile biz BBB transcytosis için potansiyel tedavi amacı eleme için deneysel hayvan sayısını azaltmak için bir adım daha yakın olsun.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu araştırma hibe Fin kanser kuruluşları, Jane & fotograf Erkko Vakfı ve Sigrid Juselius Vakfı (için P.L. ve V.L.J.), İsviçre Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenmiştir (Gelişmiş Postdoc.Mobility vermek no: P300PB_164732, S. için K.), Orion Araştırma Vakfı (için spor kulübü), Maud Kuistila Anıtı Vakfı (için spor kulübü) ve Finlandiya Akademisi (TERVA 2017 vermek no: 314 498). Biomedicum görüntüleme ünitesi (Helsinki) çekirdek tesis Imaging mikroskobu sağlamak için kabul edilmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells | |||
| bEND3 | ATCC | CRL-2299 | Cultured in: DMEM (1g/L glucose) supplemented with 10% FBS, 5 mL L-glutamine and 5 mL penicillin/streptomycin |
| HIFko immortalized mouse astrocytes | Isolated in Dr. Gabriele Bergers Lab | https://doi.org/10.1016/S1535-6108(03)00194-6 | Cultured in: BME-1 supplemented with 5% FBS, 5 mL 1 M HEPES, 5 mL 100 mM sodium pyruvate, 3 g D-glucose and 5 mL penicillin/streptomycin |
| HuAR2T | Isolated in Dr. Dagmar Wirth Lab | https://doi.org/10.1089/ten.tea.2009.0184 | Cultured in: EBM-2 with SupplementMix |
| normal human primary astrocytes | Lonza | CC-2565 | Cultured in: ABM with SingleQuots |
| Material and reagents | |||
| 100 mm x17 mm Dish, Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific | 150350 | |
| 10 mL serological pipet | ThermoFisher Scientific | 170361 | |
| 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339650 | |
| ABM Basal Medium, 500 mL | Lonza | CC-3187 | For primary human astrocytes. ABM+: contains all the additives from the supplement mix. ABM-:all the additives except for rhEGF and FBS |
| Accutase Cell Detachment Solution | Corning | 25-058-CI | |
| AGM SingleQuots Supplements and Growth Factors | Lonza | CC-4123 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | for both GBM + and - medium |
| Basal Medium Eagle | ThermoFisher Scientific | 21010046 | BME-1 |
| Corning Costar TC-Treated 6-Well Plates | Sigma-Aldrich | CLS3506 | |
| Corning Transwell polyester membrane cell culture inserts | Sigma-Aldrich | CLS3452 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | dissolve in 50 mL of BME-1 and sterile filter before adding to the medium |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient F-12 Ham | Gibco | 21331-020 | Specific to the culture of the patient-derived spheres isolated in our lab, may vary for other glioma cell lines |
| EBM-2 growth Medium SupplementMix | PromoCell | c-39216 | EBM+: contains all the additives from the supplement mix. EBM-:all the additives except for VEGF-A and FBS |
| Endothelial Basal Medium 2 (EBM-2) | PromoCell | c-22211 | EBM+: contains all the additives from the supplement mix. EBM-:all the additives except for VEGF-A and FBS |
| Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin | ThermoFisher Scientific | 10500056 | |
| Fluorescein sodium salt | Sigma-Aldrich | F6377 | |
| Greiner CELLSTAR 96 well plates | Sigma-Aldrich | Greiner 655090 | black polystyrene wells flat bottom (with micro-clear bottom) |
| Menzel-Gläser 0.9 cm round borosilicate Cover Slips | Thermo Scientific | 10313573 | |
| PBS tablets | Medicago | 09-9400-100 | one tablet per liter of dH2O, then sterilize the solution by autoclaving |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6407 | |
| Recombinant Human EGF | Peprotech | GMP100-15 | for GBM+ medium |
| Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) | Peprotech | 100-18B | for GBM+ medium |
| Immunofluorescence | |||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| 24 mm x 60 mm microscope slide cover glass | ORSAtec | 0224601-D | |
| AlexaFluor 488 and 594 secondary antibodies | ThermoFisher Scientific | dilution: 1/500 | |
| Anti-Claudin-5 antibody | Abcam | ab15106 | dilution: 1/150 |
| Anti-GFAP antibody clone GF5 | Abcam | ab10062 | dilution: 1/150 |
| Anti-Mouse CD31 antibody Clone MEC 13.3 | BD Biosciences | 550274 | dilution 1/800 |
| Anti-SV40 T-antigen antibody | Abcam | ab16879 | dilution: 1/150 |
| Anti-Zonula Occludens-1 | Abcam | ab96587 | dilution: 1/200 |
| DAPI | TOCRIS | 5748 | |
| Fluoromount Aqueous Mounting Medium | Sigma-Aldrich | F4680 | |
| LysoTracker Red DND-99 | ThermoFisher Scientific | L7528 | |
| Animal procedures | |||
| 10 cm curved dissecting scissors | World Precision Instruments | 14394 | |
| BD Microlance 25 G needles | Becton Dickinson | 300600 | |
| Fine Forceps (12.5 cm) | World Precision Instruments | 503283 | for tissue dissociation |
| Intramedic Polyethylene tubing PE20 | Becton Dickinson | 427406 | |
| Ketaminol vet 50 mg/mL | Intervet | Vnr511485 | Ketamine |
| Mains Powered microdrill | World Precision Instruments | 503599 | |
| Menzel-Gläser 0.5 cm round borosilicate Cover Slips | Thermo Scientific | 11888372 | |
| Micro Bulldog clamp | World Precision Instruments | 14119 | |
| Physiological saline solution | Mustela | Sterile single dose vials 20 x 5 mL / 40 x 5 mL - Medical device class | |
| Rochester-Oschner forceps | World Precision Instruments | 501709 | |
| Rompun vet 20 mg/mL | Intervet | Vnr148999 | Xylazine |
| Stereotaxic adapter | World Precision Instruments | 502063 | |
| Sugi Sponge Points | Kettenbach | 31603 | |
| Equipment | |||
| Axio Zoom.V16 fluorescence stereo zoom microscope | Carl Zeiss | ||
| FLUOstar Omega microplate reader | BMG Labtech | ||
| ORCA-Flash 4.0 digital sCMOS camera | Hamamatsu Photonics | ||
| Universal 320 tabletop centrifuge | Hettich | Cat. No. 1401 | |
| ZEISS LSM 880 with Airyscan confocal microscope | Carl Zeiss |
References
- Daneman, R., Prat, A.
- Quail, D. F., Joyce, J. A.
- Wang, Z., Sun, H., Yakisich, J. S. Overcoming the blood-brain barrier for chemotherapy: limitations, challenges and rising problems. Anticancer Agents in Medicinal Chemistry. 14 (8), 1085-1093 (2014).
- Alkins, R. D., Brodersen, P. M., Sodhi, R. N., Hynynen, K. Enhancing drug delivery for boron neutron capture therapy of brain tumors with focused ultrasound. Neuro Oncology. 15 (9), 1225-1235 (2013).
- Alli, S., et al. Brainstem blood brain barrier disruption using focused ultrasound: A demonstration of feasibility and enhanced doxorubicin delivery. Journal of Controlled Release. 281, 29-41 (2018).
- Ashby, L. S., Smith, K. A., Stea, B. Gliadel wafer implantation combined with standard radiotherapy and concurrent followed by adjuvant temozolomide for treatment of newly diagnosed high-grade glioma: a systematic literature review. World Journal of Surgical Oncology. 14 (1), 225 (2016).
- Guishard, A. F., Yakisich, J. S., Azad, N., Iyer, A. K. V. Translational gap in ongoing clinical trials for glioma. Journal of Clinical Neurosciences. 47, 28-42 (2018).
- Rahman, N. A., et al. Immortalized endothelial cell lines for in vitro blood-brain barrier models: A systematic review. Brain Research. 1642, 532-545 (2016).
- Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).
- Wang, J. D., Khafagy, el-S., Khanafer, K., Takayama, S., ElSayed, M. E. Organization of Endothelial Cells, Pericytes, and Astrocytes into a 3D Microfluidic in Vitro Model of the Blood-Brain Barrier. Molecular Pharmaceutics. 13 (3), 895-906 (2016).
- Phan, D. T., et al. Blood-brain barrier-on-a-chip: Microphysiological systems that capture the complexity of the blood-central nervous system interface. Experimental Biology and Medicine (Maywood). 242 (17), 1669-1678 (2017).
- Bang, S., et al. A Low Permeability Microfluidic Blood-Brain Barrier Platform with Direct Contact between Perfusable Vascular Network and Astrocytes. Scientific Reports. 7 (1), 8083 (2017).
- Wilhelm, I., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier for the study of drug delivery to the brain. Molecular Pharmacology. 11 (7), 1949-1963 (2014).
- Campisi, M., et al. 3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes. Biomaterials. 180, 117-129 (2018).
- Pirsko, V., et al. An Effect of Culture Media on Epithelial Differentiation Markers in Breast Cancer Cell Lines MCF7, MDA-MB-436 and SkBr3. Medicina (Kaunas). 54 (2), (2018).
- Stebbins, M. J., et al. Differentiation and characterization of human pluripotent stem cell-derived brain microvascular endothelial cells. Methods. 101, 93-102 (2016).
- Canfield, S. G., et al. An isogenic blood-brain barrier model comprising brain endothelial cells, astrocytes, and neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Journal of Neurochemistry. 140 (6), 874-888 (2017).
- Cao, Y., et al. Hypoxia-inducible factor-1alpha is involved in isoflurane-induced blood-brain barrier disruption in aged rats model of POCD. Behavioural Brain Research. 339, 39-46 (2018).
- Abbott, N. J. Astrocyte-endothelial interactions and blood-brain barrier permeability. Journal of Anatomy. 200 (6), 629-638 (2002).
- Kinnari, P. J., et al. Tumour homing peptide-functionalized porous silicon nanovectors for cancer therapy. Biomaterials. 34 (36), 9134-9141 (2013).
- Levin, V. A.
- Weathers, S. S., Gilbert, M. R. Toward Personalized Targeted Therapeutics: An Overview. Neurotherapeutics. 14 (2), 256-264 (2017).
- O'Duibhir, E., Carragher, N. O., Pollard, S. M. Accelerating glioblastoma drug discovery: Convergence of patient-derived models, genome editing and phenotypic screening. Molecular and Cellular Neuroscience. 80, 198-207 (2017).
- Kaya, M., Ahishali, B. Assessment of permeability in barrier type of endothelium in brain using tracers: Evans blue, sodium fluorescein, and horseradish peroxidase. Methods in Molecular Biology. 763, 369-382 (2011).
- Yang, S., et al. Identification of two immortalized cell lines, ECV304 and bEnd3, for in vitro permeability studies of blood-brain barrier. PLoS One. 12 (10), e0187017 (2017).
- Blouw, B., et al. The hypoxic response of tumors is dependent on their microenvironment. Cancer Cell. 4 (2), 133-146 (2003).
- Argaw, A. T., et al. Astrocyte-derived VEGF-A drives blood-brain barrier disruption in CNS inflammatory disease. Journal of Clinical Investigation. 122 (7), 2454-2468 (2012).
- Miao, Z., et al. VEGF increases paracellular permeability in brain endothelial cells via upregulation of EphA2. The Anatomical Record (Hoboken). 297 (5), 964-972 (2014).
- Heinolainen, K., et al. VEGFR3 Modulates Vascular Permeability by Controlling VEGF/VEGFR2 Signaling. Circulation Research. 120 (9), 1414-1425 (2017).
- Claesson-Welsh, L.
- Adriani, G., Ma, D., Pavesi, A., Goh, E. L., Kamm, R. D. Modeling the Blood-Brain Barrier in a 3D triple co-culture microfluidic system. Conference Proceedings - IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 2015, 338-341 (2015).
- Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids and Barriers of the CNS. 10 (1), 16 (2013).
- Paatero, I., et al. Analyses in zebrafish embryos reveal that nanotoxicity profiles are dependent on surface-functionalization controlled penetrance of biological membranes. Scientific Reports. 7 (1), 8423 (2017).
- Prabhakar, N., et al. Stimuli-responsive hybrid nanocarriers developed by controllable integration of hyperbranched PEI with mesoporous silica nanoparticles for sustained intracellular siRNA delivery. International Journal of Nanomedicine. 11, 6591-6608 (2016).
- Hyvonen, M., et al. Novel target for peptide-based imaging and treatment of brain tumors. Molecular Cancer Therapeutics. 13 (4), 996-1007 (2014).
- Feng, X., et al. Mammary-Derived Growth Inhibitor Targeting Peptide-Modified PEG-PLA Nanoparticles for Enhanced Targeted Glioblastoma Therapy. Bioconjugate Chemistry. 26 (8), 1850-1861 (2015).
- Nance, E. A., et al. A dense poly(ethylene glycol) coating improves penetration of large polymeric nanoparticles within brain tissue. Science Translational Medicine. 4 (149), 149rA119 (2012).
- Berg, C. Quantitative analysis of nanoparticle transport through in vitro blood-brain barrier models. Tissue Barriers. 4 (1), e1143545 (2016).
- Noumbissi, M. E., Galasso, B., Stins, M. F. Brain vascular heterogeneity: implications for disease pathogenesis and design of in vitro blood-brain barrier models. Fluids and Barriers of the CNS. 15 (1), 12 (2018).
- Heymans, M., Sevin, E., Gosselet, F., Lundquist, S., Culot, M. Mimicking brain tissue binding in an in vitro model of the blood-brain barrier illustrates differences between in vitro and in vivo methods for assessing the rate of brain penetration. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 127, 453-461 (2018).
