Summary
Препарат против опухолей центральной нервной системы является серьезной проблемой. Здесь мы описываем протокол производить в пробирке имитировать крови мозг барьер опухоли с помощью мышиных или человеческих клеток и обсудить их актуальности для предсказуемости центральной нервной системы опухоли ориентации в естественных условиях.
Abstract
Весьма селективный характер, гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) имеет важное значение для мозга гомеостаза в физиологических условиях. Однако в контексте опухолей головного мозга, молекулярные избирательность BBB также щиты неопластических клеток, блокируя доставку периферически управляемой химиотерапии. Разработка роман наркотиков (включая наночастиц) ориентации мозг злокачественных опухолей идеально требует использования доклинических животных моделей для изучения Трансцитоз и противоопухолевая эффективность препарата. Для того, чтобы соблюдать принцип 3R (уточнить, сократить и заменить) уменьшить количество лабораторных животных в экспериментальной установки и выполнения высокопроизводительного скрининга большой библиотеки противоопухолевых агентов, мы разработали воспроизводимые в пробирке человека и мышиных имитируют гематоэнцефалический барьер опухоли (BBTB) с помощью трехслойное культур эндотелиальных клеток, астроциты и пациент производные глиобластома сферах. Для более высокой масштабируемости и воспроизводимости коммерческие клеточных линий или увековечен клетки были использованы с учетом условий разрешить формирования барьера, напоминающих фактических BBB. Здесь мы описываем протокол для получения BBTB имитируют путем культивирования эндотелиальных клеток при контакте с астроциты на конкретные ячейки плотности на вставок. Это имитировать BBTB может использоваться, например, для количественной оценки и конфокальная томография наночастиц прохода через эндотелиальные и Астроцитарная барьеры, помимо оценки ориентации клетки опухоли в пределах же assay. Кроме того мы показываем, что полученные данные могут использоваться для прогнозирования поведения наночастиц в доклинических моделях животных. В более широкой перспективе эта модель в пробирке могут быть адаптированы для других нейродегенеративных заболеваний для определения прохождения новые терапевтические молекулы через BBB и/или дополнить мозга organoids непосредственно оценить эффективность наркотики.
Introduction
Нервно-сосудистого единица состоит из нейронов, астроциты и BBB, образованный сложные соединения между pericytes, астроциты, эндотелиальных клеток и связанные базальной мембраны, формирование мозга microvasculature1. Этот жесткой клеточной стенки, образованное непрерывного, nonfenestrated судов мелко регулирует движение ионов и молекул (включая гормоны, питательных веществ или наркотики), но и циркулирующих клеток1. Особенно низкая Трансцитоз через BBB высокий молекулярный вес молекул, например терапевтических антител, конъюгаты наркотиков или nanocompounds, резко ограничивает прогресс в лекарственных препаратах для неврологических заболеваний, в том числе злокачественных глиомы2. Действительно устной или внутривенно поставленный химиотерапии достичь паренхимы мозга часто в неадекватно низких концентрациях побудить противоопухолевый эффект или просто не в состоянии пересечь BBTB достичь неопластических клеток3. Несколько доклинических и клинических исследований не рассматривали вопрос о BBTB проникновения, но пытались сорвать BBTB, временно, например с помощью целенаправленной УЗИ4,5, или обойти его, непосредственно на месте поставка препаратов6. Однако ни один из этих методов имели возможность противодействовать экспансии неизбежным опухоли или рецидив. Поэтому при разработке Роман antiglioma терапии, диффузии через BBTB следует считать одним из важнейших аспектов успешной доставки терапевтических агентов7.
Из-за весьма сложный характер взаимодействия клеток внутри BBTB в-vivo исследований в лабораторных животных, как представляется, быть очевидным выбором при изучении прохождения молекул из крови в мозг. Однако, в естественных условиях крупномасштабных методы являются относительно сложными для установления и, следовательно, не позволяют высокопроизводительного скрининга молекул в разумный период времени по разумной цене. Даже более важно испытания на животных должен следовать 3R этические рекомендации, определяется как i) уточнить, ii) уменьшить и, отношение к текущему контексту, iii) заменить альтернативных протоколов (например, в пробирке в silico методы). Таким образом воссоздавая в пробирке BBTB появляется как интересные и привлекательные возможности, но она также представляет сложную задачу, оспаривается различные ограничения. Многие попытки воссоздать этот комплекс отсек с культивируемых клеток первичной или клеточных линий от собак, свинину, мышиных и даже человеческого происхождения были опубликованы (как рассмотрено Рахман et al.8 и9Хелмса и др.). Эти модели включают трехмерной microfluidic систем10, BBB-на чипе11,12, и множество вариантов, основанный на классическом совместного культур в вставляет систем. Тем не менее, нынешние системы microfluidic и чип, либо не подходят для быстрой и высок объём наркотиков проверки исследования13,14 или являются в настоящее время несовместимы с исследования доставки наркотиков в опухоли головного мозга. Кроме того обзор 155 опубликованных моделей с использованием первичных элементов, индуцибельной плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) или коммерческих клеточных линий все совместно культивируемых на вставки показан тенденция для interstudy несоответствия в их измерения и/или выводы8. Это отсутствие межлабораторных воспроизводимости может соотноситься с i) ненормализованной культуры условий, например с Факультативным покрытием с белками матрицы базальной мембраны клетки культуры судна, ii) увеличение числа субкультуры и использования Сыворотка-содержащих СМИ, обе основные драйверы генетических и фенотипические изменения клеток линии15, или iii) трудно можно воспроизвести заново право равновесия между астроглиальных и эндотелиальных компонентов в блюдо. Хотя использование увековечен ячейки или ячейки, коммерческих линий создать модель в пробирке BBB не хватает некоторых свойств по сравнению с аналогичными моделями, только использующие главные ячейки, в методе описанных мы покажем, что правильное сочетание клетки экспонаты очень сопоставимые показатели опубликованные исследования в других моделях ссылка16,17. В конечном итоге отсутствие надежной и воспроизводимые модели для изучения прохождение лечебных соединений, ориентация опухоли головного мозга через BBTB побудило нас к разработке методов, описанных здесь.
Поскольку цель заключается в том, чтобы использовать модели для прогнозирования в естественных условиях доставки наночастиц в доклинических моделях животных, мы сначала подтверждены BBTB модель использования вставок, содержащие мышиных эндотелиальных клеток при контакте с мышиных астроциты. В дополнение к этому мы также оптимизировали модель для использования определенных линий клеток человека. После стабилизации, барьеры ячейки передаются культур с пациента производные глиобластома сферах или коммерческих глиомы клеточных линий. После этого Трансцитоз наночастиц и ориентации клетки опухоли могут быть визуализированы confocal микроскопии и количественно, собирая образцы с течением времени. Важно отметить, что результаты, полученные с помощью BBTB имитирует надежно может предсказать поведение наночастиц в естественных условиях, поддерживая использование мимических предварительного BBTB доклинических проверки.
Protocol
Эксперименты на животных были утверждены Комитетом для экспериментов животных из района Южной Финляндии (ESAVI/6285/04.10.07/2014).
1. Создание BBTB имитирует
Примечание: Клетки питательной среды и добавки подробно изложены в таблице материалов.
- Подготовка астроциты
Примечание: Следующие тома подходят для чашку Петри 10 см или T75 колбу культуры клеток.- Под капотом культуры стерильных клеток тщательно вымойте культивировали астроциты с 5 мл стерильной фосфат амортизированное saline (PBS). Аккуратно отменить PBS с помощью вакуумного насоса и добавить 2 mL реагента диссоциации клеток для 5 минут (при 37 °C, см. Таблицу материалов) для отсоединения клетки. Проверьте ячейки отряд под микроскопом. Не превышать 5 минут инкубации ограничить нагрузку на клетки.
- Добавьте 10 мл стерильной полный экзоцитоз клеток питательной среды (про +) судна для подавления активности реагента диссоциации клеток. Используйте стерильные Пипетки серологические передать отдельные клетки от судна стерильные 15 мл. Центрифуга суспензию клеток на 3 мин на 250 РПРС (ускорение: 9 РПРС/s, замедления: 5 РПРС/s) при комнатной температуре (RT).
- Тем временем подготовить вставки (см. Таблицу материалы): использование стерильный пинцет, место вставки с мозга стороной вверх (рис. 1A) на крышке стерильным 6-ну пластины (рис. 1B). Убедитесь заранее, что пластины могут быть перевернутым размещены на вставки без прикосновения или перемещения вставки во время процесса.
Примечание: Правильное размещение вставок позволяет захвата экзоцитоз подвеска in-between мембраны и в нижней части скважины. - После центрифугирования, тщательно удалить супернатант из суспензии клеток; Ресуспензируйте экзоцитоз Пелле в 1 мл, нежно resuspending гранул на трубе'про + s стены до 5 x. Избегайте чрезмерного закупорить клетки, чтобы ограничить нагрузку на клетки. Подсчитать количество ячеек и корректировать плотность подвески клеток до 1,5 x 105 клеток в 400 мкл про +/ вставить.
- Место суспензию клеток в середине мозга стороне пластины's мембраны (рис. 1B) и очень осторожно, развернул его, используя капиллярные силы с наконечником стерильные пипетки. Избегайте прямого контакта, как мембрана особенно хрупок.
- С сторона мозга вставок по-прежнему вверх, место пластину 6-Ну обратно на вставки. Это гарантирует, что суспензию клеток в ловушке между мембраной и фактической дно колодца (рис. 1 c). Избегайте пузырьков воздуха в суспензии клеток, как это будет препятствовать однородное распространение астроциты на мембране.
- Место пластину и вставок, с мозга стороной вверх, в инкубатор (при 37 °C с 5% CO2) чтобы разрешить клеточной адгезии для минимум 2 ч (мышиных увековечен астроциты) и до 6 часов (человека первичной астроциты).
Примечание: Как вставки сохраняются вверх ногами, визуализации клеточной адгезии невозможно под микроскопом. Он таким образом, рекомендуется семян отдельный регулярные клетки культуры судна и контроль времени клеточной адгезии в скороварке. Тщательное манипуляции мембраны является обязательным, как результаты будут недостоверными, при повреждении мембран. - В конце инкубации время проверьте отсутствие утечек подвеска клеток вне области посевной и отбросить вставки, если они являются Дырявый. Вернуться пластину 6-Ну его штатные должности, с вставками, которые теперь будут иметь крови стороной вверх (рис. 1A). Добавьте 2,6 мл про + в каждой скважине. Влить 2,5 мл полного экзоцитоз среды в каждой вставки и место пластину в инкубатор (при 37 °C с 5% CO2).
- Подготовка эндотелиальных клеток
Примечание: Для мышиных микрососудистой эндотелиальные клетки мозга (bEND3) клетки должны достичь 100% слияния для обеспечения максимальной ячеек контактов, вызывая выражение протеина оптимальный жесткой перехода на день эксперимента. Это не применяется для человека пупочную вену эндотелиальных клеток (HuAR2T) как для выражения протеина жесткие соединения для этих ячеек требуется присутствие астроциты.- Продолжать, как описано для астроциты (шаги 1.1.1 и 1.1.2.). После центрифугирования, тщательно удалить супернатант; Ресуспензируйте Пелле эндотелиальных клеток в 1 мл питательной среды полной эндотелиальных клеток (EBM +), медленно закупорить суспензию клеток на трубе's стены до 5 x. Избегайте чрезмерного закупорить клетки, чтобы ограничить нагрузку на клетки. Подсчитать количество ячеек и регулировать плотность подвески клеток до 2 x 105 клеток в 2,5 мл/вставлять эндотелиальные клетки культуры средних лишенный сыворотки (EBM-) и Сосудистый эндотелиальный фактор роста-(VEGF-A).
- Вынуть пластину, содержащий вставки, тщательно удалить носитель со стороны крови и заменить его с 2,5 мл суспензии эндотелиальных клеток. Возвращение пластину в инкубатор (при 37 °C с 5% CO2) и оставить его на ночь для присоединиться к мембране эндотелиальных клеток.
- Следующий день, подготовьте стерильные плита 6-ну путем передачи 3 мл среды подогретую экзоцитоз сыворотки бесплатно (про-) для каждой скважины. Путем обработки вставки стерильным пинцетом, тщательно отбросить эндотелиальной полного среднего со стороны крови, место вставки в новой пластинкой, содержащие про- и добавить 2,5 мл дм-.
Примечание: Использование EBM - имеет решающее значение для создания эндотелиальный барьер (обратитесь к разделу обсуждения). - Оставьте вставок в инкубатор (при 37 °C с 5% CO2) с минимальными физические нарушения и колебания температуры на 5 дней, позволяя производство эндотелиальной базальной мембраны, экзоцитоз контакты с эндотелиальные клетки и в конечном итоге, формирования мимических BBTB. Заменить средство в день передачи на культурах клеток глиомы (обратитесь к разделу 1.4).
- Измерение BBTB мимических проницаемости (опционально)
- Пассивной диффузии натрия флуоресцеин Люминесцентную краску малого молекулярного веса (Na-Fl) со временем из крови в мозг сторону вставок позволяет вычисления значений проницаемости по следующей формуле:
Здесь, dFхорошофлуоресценции значение измеряется в скважине на определенный момент времени минус значение ячейки аутофлюоресценция питательной среды, dT представляет время в секундах, A это поверхности барьера в квадратных сантиметров и dF,Вставить флуоресценции значение измеряется в Вставка в той же точке время минус значение среднего аутофлюоресценция). - Сбор 100 мкл среды как крови, так и стороны мозга BBTB имитируют и передача каждого из них отдельный плоскодонной, черный 96-луночных пластины для последующих флуоресценции измерений. Для исправления аутофлюоресценция используйте простые средства массовой информации как пустые.
- Подготовить 2,5 мл на хорошо Na-FL (50 мкм) в дм-. Prewarm Na-Fl решение 37 ° C. Замените СМИ со стороны крови вставок с носителя, содержащего начало Na-эт таймер как только средство заменяется.
- Тщательно собирать 100 мкл СМИ как крови, так и на стороне мозга вставок на 5, 30, 60 и 120 мин передачи каждого образца для отдельных скважин черный 96-луночных пластины.
- Соответственно замените собранных средств массовой информации от вставки поддерживать баланс громкости между обеими сторонами. Место вставки обратно в инкубаторе между каждой коллекции образцов для сведения к минимуму изменения температуры.
- Количественно флуоресценции из собранных образцов, используя читателя пластины с фильтром, установленным на 480/560 Нм (возбуждения и выбросов, соответственно).
Примечание: Флуоресценции со стороны мозг почти обнаружить в момент времени 5 мин. Высокие значения по сравнению с пустым указывают утечка / повреждения вставить's мембраны или барьер; Таким образом исключите из дальнейшего анализа. Ожидаемые значения проницаемости Na-Fl для BBTB должна быть в 10-5 до 10-6 см/сек диапазона (Таблица 1).
- Пассивной диффузии натрия флуоресцеин Люминесцентную краску малого молекулярного веса (Na-Fl) со временем из крови в мозг сторону вставок позволяет вычисления значений проницаемости по следующей формуле:
- Подготовка клеток глиомы
Примечание: Хотя пациент производные глиобластома сферах используются здесь, следующий протокол может быть легко адаптирована для адэрентных, коммерчески доступных глиобластома клетки как U - 87 мг.- При необходимости, для изображений иммунофлюоресценции, место до четырех coverslips раунд бесплодных боросиликатное (ø 0,9 см) на скважину в 6-ну пластины, содержащих 2 мл поли D-Лизин (0,01%). Инкубации при комнатной температуре за 30 мин.
- Тем временем тщательно передать сферах опухоли с судна культуры клеток 15 мл стерильной пробирке с использованием стерильных Серологические Пипетки. Центрифуга опухоли сферах за 3 мин на 250 РПРС.
- Отменить супернатанта, нежно ресуспензируйте сфер в 1 мл bFGF/EGF-бесплатно (GBM) глиомы клеток средних и подсчитать количество ячеек. Отрегулируйте плотность ячеек примерно 104 сферы/мл (105 клеток/мл) в GBM-.
- Отменить поли D-лизина из скважин и промойте их 3 x с стерильных PBS. Семян пластину с 3 мл/хорошо подвеска сфероида опухоли и передача вставок с BBB имитировать на суспензию опухолевых клеток.
- Инкубируйте на ночь (при 37 °C с 5% CO2) чтобы разрешить равновесия между кровью и мозг опухоль стороны assay. На следующий день замените СМИ в сторону крови EBM-дополнена молекул/препараты/наночастиц интерес. Со временем для прямой количественной собраны образцы, как описано в предыдущем разделе. Клетки фиксируются в точное время точкой для флуоресценции изображений (см. в разделах 2.1 и 2.2).
2. с высоким разрешением конфокальная томография BBTB
Примечание: параформальдегида 4% (ПФА, рН 7,4, 6 мл / репликацию BBTB) всегда готов свежий в PBS. Держите его на льду.
ОСТОРОЖНОСТЬЮ: PFA канцерогенами. Используйте перчатки нитриловые для обработки ППД и подготовить решение под химических зонта.
-
BBTB эндотелиальная экспрессию белков сжатые соединения
- Промыть обе стороны мембраны с ледяной PBS (3 x 5 мин, 2,5 мл/Вставка, 3 мл/хорошо). Отменить PBS и добавить 3 мл и 2,5 мл ледяной 4% ПФА в колодец и вставки, соответственно. Инкубируйте на льду на 10 мин отклонения PFA (согласно учреждение's опасных химических утилизации) и промойте 3 x с PBS на RT (2,5 мл/Вставка, 3 мл/а).
Примечание: После того, как фиксированной, образцы могут храниться в PBS (2,5 мл/Вставка, 3 мл/а) при 4 °C на неделю. - Используйте ватный тампон, чтобы стереть стороне мозга вставки и удаления астроциты. Используя острый скальпель, тщательно вырежьте мембраны на четыре равные части, сделав два перпендикулярных разрезов, образуя крест. Затем вставьте скальпель в точке, где мембрана крепится к стене вставки и поверните вставка с другой стороны освободить четырех образцов. С помощью тонкой пинцета, тщательно переводить каждый образец 24-ну пластины, содержащие 200 мкл PBS/хорошо, с крови стороной вверх в каждой скважине.
- Блокировать мембраны с 10% плода бычьим сывороточным в PBS (за 30 мин на RT, 200 мкл/хорошо). Подготовить раствор антител 1° для иммуноокрашивания перекрестка туго белков (рис. 1 d) (zonula occludens-1, Клаудин-5; обратитесь к Таблице материалы) в 200 мкл блокирования решения/хорошо. При необходимости эндотелиальных клеток подлинность проверяется путем добавления антитело, выставленными молекулы адгезии тромбоцитов эндотелиальных клеток (PECAM1 или CD31; обратитесь к Таблице материалы) для каждой жесткой перехода раствор антител. Отказаться от блокирования решения и проинкубируйте с первичных антител' O/N на 4 °C.
- На следующий день, отказаться от первичных антител и промойте их 200 мкл PBS (3 x 5 мин на RT). Инкубировать их с соответствующим вегетационных конъюгированных Флюорофор вторичные антитела (разбавления 1: 500, 200 мкл/Ну, разбавленный блокирования решения; обратитесь к Таблице материалы) за 2 ч на RT.
- Отбросить вторичные антитела, промыть 200 мкл PBS (3 x 5 мин на RT). Удаление PBS и counterstain клеточных ядер с помощью 4', 6-diamidino-2-phenylindole решение (DAPI) в конечной концентрации 1 µг/мл чистой дистиллированной H2O (dH2O; 200 мкл/колодец; обратитесь к таблица материалов ). Инкубируйте 7 мин на RT. Remove DAPI и мыть мембраны 3 x с dH2O (200 мкл/хорошо).
- Место падение среднего монтажа (см. Таблицу материалы) на стекло микроскопа. С помощью тонкой пинцета, тщательно взять мембраны из скважины и сохраняя ориентацию, удалите избыток dH2O и поместите его на падение среднего монтажа. Добавьте еще падения средних крепления верхней части мембраны и тщательно покройте его боросиликатного стекла крышка. Убедитесь, что существует не зависшие воздушных пузырьков. Храните образцы на 4 °C и от света до confocal микроскопии наблюдений.
Примечание: Экзоцитоз окрашивания могут быть выполнены путем размещения части мембраны в 24-ну пластины с мозга стороной вверх и с использованием выбранного экзоцитоз специфических антител (например, направленных против глиальных фибриллово кислоты белка [СВМС]) (Рисунок 1E ).
- Промыть обе стороны мембраны с ледяной PBS (3 x 5 мин, 2,5 мл/Вставка, 3 мл/хорошо). Отменить PBS и добавить 3 мл и 2,5 мл ледяной 4% ПФА в колодец и вставки, соответственно. Инкубируйте на льду на 10 мин отклонения PFA (согласно учреждение's опасных химических утилизации) и промойте 3 x с PBS на RT (2,5 мл/Вставка, 3 мл/а).
-
BBTB флуоресценции окрашивания для обнаружения наночастиц Трансцитоз
- Выполнять жить клеточной Лизосома маркировки (например, с использованием флуоресцентных зондов, [см. Таблицу материалов]). Разбавить Лизосома Люминесцентную краску на рабочей концентрации 50 Нм в подогретую EBM - (2,5 мл/вставить) или 75 мм в подогретую про - (3 мл/ну) для Лизосома маркировки эндотелиальных клеток и астроциты, соответственно. Инкубировать клетки для 45 мин (при 37 °C с 5% CO2); затем промойте 3 x с ледяной PBS (2,5 мл/Вставка, 3 мл/а).
- Отменить PBS и добавить 3 мл и 2,5 мл ледяной 4% PFA колодец и вставки, соответственно. Инкубировать их на льду на 10 мин отклонения ППД и промойте клетки 3 x с PBS (на RT, 2,5 мл/Вставка, 3 мл/хорошо).
Примечание: После того, как фиксированной, образцы могут храниться в PBS (2,5 мл/Вставка, 3 мл/а) при 4 ° C на неделю. - Удаление PBS и counterstain клеточных ядер с помощью решения DAPI в конечной концентрации 1 мкг/мл в dH2O (1 мл/Вставка, 1 мл/а). Инкубируйте 7 мин на RT. Remove DAPI и мыть мембраны 3 x с dH2O (2,5 мл/Вставка, 3 мл/а).
- Тщательно вырезать мембраны, удалите избыток dH2O и поместите его на падение среднего монтажа (см. Таблицу материалы) на стекло микроскопа. Добавьте еще падения средних монтажа на другой стороне мембраны и тщательно покройте его боросиликатного стекла крышка. Избегайте зависшие воздушных пузырьков. Хранить образцы на 4 °C и держать их защиту от света до confocal микроскопии изображений.
-
Флуоресценции окрашивание опухолевых клеток
- С помощью тонкой пинцета, тщательно передачи раунда coverslips, содержащих опухоль сфер к пластине 24-хорошо наполненный ледяной PBS. Продолжить с живой клетки Лизосома маркировки с помощью флуоресцентных Лизосома зондов в 75 Нм в подогретую GBM - (200 мкл/хорошо). Проинкубируйте образцы для 45 мин; затем промойте их 3 x с ледяной PBS (200 мкл/хорошо).
- Отменить PBS и 200 мкл ледяной ПФА в колодец. Инкубируйте на льду на 10 мин отклонения ППД и промойте образцы 3 x с PBS (на RT).
Примечание: После того, как фиксированной, образцы могут быть сохранены в PBS (200 мкл) при 4 ° C на неделю. - Удаление PBS и counterstain клеточных ядер с помощью решения DAPI в конечной концентрации 1 мкг/мл в dH2O (200 мкл/хорошо). Инкубируйте 7 мин на RT. Remove DAPI и мыть coverslips 3 x с dH2O (200 мкл/хорошо).
- С помощью тонкой пинцета, вынуть coverslip, удалите избыток dH2O и поместите его на падение среднего монтажа (см. Таблицу материалы) на стекло микроскопа. Избегайте улавливания воздушные пузыри. Хранить образцы на 4 °C и держать их защиту от света до confocal микроскопии наблюдений.
3. in Vivo сравнительное исследование
- На месте запись флуоресцеин натрия диффузии через BBB
- Подготовка 150 мкл раствора Na-Fl 50 Нм в физиологическом растворе. Держите решение при 37 °C после внутривенного доставки.
- Анестезировать мышь с внутрибрюшинного введения кетамин/Ксилазина коктейль (300 мкл концентрированного препарата кетамин и 10 мг/кг Ксилазина 100 мг/кг в PBS). После глубокого наркоза, поместите животное на грелку для поддержания ее температуры тела.
Примечание: 10 недельных женского ню ослабленным мышей военно-морской институт медицинских исследований (ВММНИИ) были использованы для получения данных, представленных на рисунке 2. Однако этот протокол приспособлен для мышей иммунокомпетентных и ослабленным. Метод анестезии/обезболивание не ученый's усмотрению. Однако ингаляционной анестезии как изофлюрановая не рекомендуется, как она значительно увеличивает проницаемость BBB18. - Поместите указатель мыши на стереотаксической рамы (см. Таблицу материалы) и выполняют продольный разрез кожи головы с тонкой ножницы, следуют нежный разрывов соединительной ткани, с помощью тонкой пинцета, выявить черепа. Используя круговые движения с тонкой microdrill, удалите ø 0,3 мм круглые часть черепа от левой или правой теменной кости. Действовать с крайней осторожностью во время бурения и при удалении череп кусок, чтобы избежать, ранив основной менингеальные ткани и кровеносных сосудов.
- Место падения физиологического раствора на подвергаются ткани. С помощью двух пар тонкой щипцов, осторожно удалите менингеальные ткани для доступа к коре головного мозга. Ткани мозга никогда не должно быть в прямом контакте с воздухом.
Примечание: Мелкие кровоизлияния из менингеальные травмы могут быть остановлены с помощью гематологические губки (пожалуйста, обратитесь к Таблице материалы). - После того, как менингеальные ткань удаляется и коры полностью разоблачил, завлечь капля физиологического раствора между корой и coverslip боросиликатное 0,5 мм ø. Безопасного района наблюдения с капелькой Цианакрилатный клей (пожалуйста, обратитесь к Таблице материалы) распространились по всему coverslip с иглой. Пусть клей сухой за 1 мин.
- Подготовьте имплантируемые катетер для инъекции Вену хвост (рис. 2A). Разорвать кончик иглы 25 G, с помощью щипцов Рочестер-Ошснер и вставьте наконечник в 10 см Лонг PE20 полиуретановые трубки (см. Таблицу материалы) (рис. 2A).
- Вставить катетер в Вену боковой хвост мыши, используя бульдог зажимы для манипуляции катетера и вставки (см. Таблицу материалы) (рис. 2B). Закрепите вставленной иглы с капелькой Цианакрилатный клей. Пусть клей сухой для 20 s перед удалением бульдог зажим. Тщательно Подключите другой конец катетера для иглы 25 G подключен к шприцу, содержащая решение Na-Fl (рис. 2B).
- Примечание: Не зажимайте хвост с зажимом бульдог; Он используется только для обработки точных катетера. Надлежащего катетер вставки могут быть подтверждены рефлюкс крови в прозрачной трубке.
- Поместите животное под стереомикроскопом (см. Таблицу материалов). Использование низкого уровня аутофлюоресценция в зелёном канале (480 Нм), сосредоточить внимание на регионе, содержащих относительно крупных кровеносных сосудов (они темнее вследствие поглощения гемоглобина света в этой длине волны) и мелких капилляров (рис. 2 c). Начало промежуток времени приобретения кратко перед инъекцией Люминесцентную краску, чтобы получить измерения флуоресценции фона.
Примечание: Кроме того покадровой записи могут быть заменены фотографии снимок от T0 и от любых других заранее моменты времени. - Раствор в темпе медленной и постоянной, или альтернативно, используйте автоматизированные инфузионные системы. Na-Fl флуоресценции, обнаружены в крови должны оставаться стабильными (период полураспада в крови: 286 мин), который позволяет записывать BBB диффузии через окно черепа в течение нескольких минут. После завершения приобретения тщательно удалить катетер и усыпить животных на шейки матки дислокации.
- В естественных условиях определения проницаемости BBB
Примечание: Значения получаются из любого программного обеспечения обработки изображений, таких как ImageJ, позволяя измерения интенсивности флуоресценции сигнала внутри пользовательской области интереса (ROI).- С помощью аннотации инструмента, нарисуйте прямоугольник образный ROI за пределами кровеносный сосуд, в ткани мозга, в около 5 мкм расстояние от любых видимых кровеносных сосудов заполнены с Na-Fl. Примечание размеры рентабельности и интенсивности измерений флуоресценции в T0 в что ROI, который используется как пустой для ткани's аутофлюоресценция. Без вытесняя ROI, перемотка вперед постинъекционные время (например, до очень последнего записанного кадра когда весь раствор был вставлен для животного) и отметить точное время и флуоресценции, измеренные в ROI (рис. 2 c).
- Переместить ROI на видимый кровеносный сосуд (рис. 2 c) и обратите внимание на значение T0 аутофлюоресценция из крови. Без вытесняя ROI, Быстрая перемотка вперед на один и тот же момент времени, определенный на шаге 3.2.1. и к сведению флуоресценции значение измеряется в пределах ROI (рис. 2 c).
- Используйте следующую формулу (адаптировано из раздела 1.3) для определения проницаемости BBB:
- Здесь, dFмозг является значение интенсивности флуоресценции минус T0 пустое значение в головном мозге, dT точка приобретение время в секундах, A — площадь поверхности приблизительное судна, в качестве области ROI в квадратных сантиметров и dF кровь значение интенсивности флуоресценции минус T0 пустое значение в крови.
Примечание: Значения ожидаемой проницаемость для BBB должно быть в диапазоне от 10-6 см/сек (Таблица 1).
- Ткани, обработка для обнаружения флуоресцентные наночастиц в мышиных мозга
- Имплантат пациент производные глиобластома сферах (5 х 104 клетки в 5 мкл стерильных PBS) в наркотизированных 6 week-old самок ВММНИИ обнаженной мышей в мозолистого. Найдите этот регион мозга по следующим координатам стереотаксического, начиная от Bregma: переднезаднем + 0,5 мм, слева направо dorsoventral, 2,5 мм + 3 мм. позволяют опухоли головного мозга расти на 2 недели.
- Внутривенно вводить наночастиц (100 мкг в 100 мкл стерильного физиологического раствора) и позволит им распространить за 8 ч. внедрить элемент управления мыши внутривенно с 100 мкл стерильного физиологического раствора.
- Усыпить мышей, вывих шейного и собирать мозги быстро для оснастки замораживания в изопентан, поддерживается на сухой лед (1 мин при-50 °C). Храните мозги-80 °C до обработки ткани.
- Стрижки корональных мозга с cryomicrotome. Найдите внутричерепных имплантации, шрам, он формируется на коре и вырезать 9 мкм толстые разделов из этого района на соответствующие Микроскоп слайды (см. Таблицу материалов).
- Погружать мозга разделах иммобилизованных на слайды в ледяной PBS (2 x 5 мин) и, затем, исправить их в ледяной 4% PFA (за 5 мин). Вымойте слайды в PBS (3 x 5 мин на RT). Место слайды по горизонтали и пипетки блокирования решения содержащий 10% плода бычьим сывороточным в PBS на ткани разделов, охватывающих всю поверхность (за 1 час на RT, 500 мкл/слайд). Подготовка антител CD31 (пожалуйста, обратитесь к Таблице материалы) в 250 мкл блокирования решения/слайд. Блокирующие решение заменить антитела и инкубировать на ночь при 4 °C в камере увлажненной.
- Следующий день погружать слайды в PBS (3 x 5 мин на RT) и инкубировать их с соответствующим конъюгированных Флюорофор вторичное антитело (1: 500 в 250 мкл PBS на 2 ч в RT). Промыть 3 x в PBS (на RT) и counterstain клеточных ядер с помощью решения DAPI в конечной концентрации 1 мкг/мл в dH2O (250 мкл/слайд). Проинкубируйте образцы для 7 мин на RT. Remove DAPI решения и мыть слайды 3 x с dH2O.
- На каждом разделе ткани, добавьте одну каплю монтажа средних (пожалуйста, обратитесь к Таблице материалы) и зафиксируйте образцы с coverslip. Избегайте улавливания пузырьков воздуха. Хранить образцы на 4 °C и держать их защиту от света до confocal микроскопии наблюдений.
Representative Results
Конфокальная томография мышиных имитировать BBTB показывает выражение и клеточной локализации туго Джанкшен белки zonula occludens-1 (ZO-1) и Клаудин-5 в bEND3. Контакты между эндотелиальных клеток и астроциты четко индуцированной переводе ZO-1 и Клаудин-5 контактов эндотелиальных клеток, по сравнению с bEND3 монокультур (рис. 1 d). Использование иммунофлюоресценции, окрашивание визуализировать СВМС выражая астроциты на мозг стороне мембраны, это возможно для наблюдения и исследования Астроцитарная процессов и конец ноги связаться эндотелиальных клеток через мембрану (Рисунок 1E ). Контакты экзоцитоз эндотелиальные клетки известны поощрять и стабилизировать ужесточения сотовой барьера и связаны с более низкие значения проницаемости BBB19. В соответствии с этим, мы наблюдали значительное снижение проницаемости имитировать BBTB мыши для Na-ФЗ от 27.63 (± 3.45) x 10-6 см/с в случае монокультур для 6.74 (± 3.01) x 10-6 см/сек при совместно культивируемых с гипоксией индуцибильный фактор выбить астроциты (HIFko) (Таблица 1). Увековечен HuAR2T образуют повышенную проницаемость клеточных барьеров (104.92 ± 27,1 х 10-6 см/с, Таблица 1). Подобно мышиных модели, мы измерили значительно ниже проницаемости BBTB на Na-Fl, а именно: 47,4 (± 14.32) x 10-6 см/сек, когда HuAR2T клетки были совместно культивируемых с человека первичной астроциты (Таблица 1).
В мышиных и человека BBTB мимики присутствие пациента производные глиобластома сфер индуцированной небольшое увеличение проницаемости значения по сравнению с эндотелиальных клеток экзоцитоз Сопредседатель культур только (Таблица 1). Это явление наблюдается с некоторыми, но не все из пациента глиомы области модели. Это может быть связано VEGF-A, который секретируется некоторых из этих клеток пациента производные.
Чтобы сравнить значения проницаемости в пробирке имитирует BBTB с в-vivo BBB, мы образ реального времени диффузии Na-Fl через окно черепной, имплантированные в обнаженной мышей. С помощью флуоресценции стереомикроскопом, Na-Fl диффузии из капилляров кровеносного сосуда, вытекающих из основных сетчаточных кровеносных сосудов был записан до, во время и после системного введения зонда (рис. 2 c). Измерения значений дифференциального флуоресценции из циркулирующей крови и мозг кортикальной паренхимы со временем позволило нам рассчитать приблизительную проницаемости значения обнаженной мыши's BBB для Na-Fl (5.57 ± 2,19 x 10-6 см/с, Таблица 1).
Чтобы проиллюстрировать, как это имитировать BBTB может использоваться для визуализации прохода соединений от крови стороне в сторону мозга, мы сравнили Трансцитоз ø 110 Нм (NP110) и ø 350 Нм (NP350) наночастицы таргетинга пациента производные глиобластома сферах. Результаты, полученные в лабораторных условиях были затем по сравнению с в-vivo Трансцитоз. В примере представлены наночастиц были поверхность покрыта опухоль таргетинг пептид курятник20 и загружен с флуоресцентных красителей (FITC) для облегчения визуализации. Мы меткой ячейки, используя лизосомальных краска и counterstained с DAPI 24 ч после добавления FITC наночастиц на стороне крови BBTB имитируют и приобрела конфокальной микроскопии на разных уровнях (например, на стороне крови, мембраны, стороне мозга, и сферах пациента глиобластома) (рис. 3A). Colocalized NP110-связанные флуоресцентного сигнала с лизосом в эндотелиальных клеток, астроциты и опухолевые клетки. Кроме того, NP110s были обнаружены между эндотелиальных клеток и астроциты, проходя через поры мембраны пластины (рис. 3A).
Прохождение NP110s была количественно оценена путем измерения флуоресценции от пробах как крови, так и мозга. Эти значения проницаемости были по сравнению с тех, которые определены для наночастиц ø 350 Нм (NP350). Результаты показывают, что только NP110 удалось пересечь BBTB имитирует (рисунок 3B). NP350 остались на стороне крови BBTB имитировать, что привело к более низкие значения проницаемости для этих наночастиц.
Чтобы подчеркнуть актуальность имитирует BBTB, по сравнению с моделями в естественных условиях, обнаженная мышей внутривенно вводили с NP110 или NP350 наночастицами покрытием с опухоль таргетинг пептид курятник и сопряженных с красной флуоресцентной краской (TRITC) для обнаружения. Тканей, собранные в нескольких точках времени показали, что после 8 h, BBB-проницаемой наночастицы extravasated в паренхимы мозга, в то время как nonpermeable, что те, которые оставались в обращении были главным образом очищены от кровообращения в естественных условиях. Таким образом мы собрали мозги и количественно количество наночастиц на квадратный миллиметр 8 h postinjection. В соответствии с в пробирке выводы, NP110, но не NP350 успешно extravasated в паренхиме мозга (рис. 3 c). Высокого увеличения изображений местоположения наночастиц в мозге показал, что NP110 был однородно распределяется в паренхимы мозга вне проницаемость капилляров и успешно размещенных на имплантированный глиобластома ячейки (рис. 3D). Несмотря на выставке же опухоль ориентации остаток (CooP), NP350 смог extravasate в паренхимы мозга и было обнаружено только в пределах Люминал стороне мозга кровеносных сосудов (Рисунок 3E), аналогичные результаты, полученные в пробирке.
Рисунок 1: описание модели гематоэнцефалический барьер опухоли (BBTB). (A) схематическое представление расположения различных типов клеток. (B) Иллюстрация размещения Вставка на крышку плита 6-Ну и посевной техники для астроциты на стороне мозга вставка's мембраны. (C) иллюстрация 6-ну пластины размещения, позволяя экзоцитоз адгезии. (D) микроскопии иммунофлуоресценции туго Джанкшен белки zonula occludens-1 (ZO-1, верхняя строка, красный) и Клаудин-5 (нижний ряд, зеленый). Выражение протеина сравнивается с мышиных микрососудистой эндотелиальные клетки мозга (bEND3) выращиваются на стороне крови BBTB только как монокультуры (левая колонка) или с мышиных увековечен астроциты HIFko (правая колонка). Клеточных ядер counterstained с DAPI (синий). (E) иммунофлюоресценции Микрофотография показаны глиальных фибриллово кислой белка (СВМС, красный) в HIFko астроциты, культивируемых на стороне мозга BBTB. Изображение высокого увеличения показывает экзоцитоз процессы и конец футов (стрелки) связаться с эндотелиальных клеток через мембрану поры (правая панель). Личность HIFko астроциты была проверена путем пятнать иммунофлюоресценции Обезьяний вирус 40 больших T антигена (SV40 большой T, зеленый) для увековечении клеток. Эндотелиальные клетки Экспресс СВМС ни SV40 большой T и, поэтому, может быть частично наблюдается через прозрачный, противоположной стороне мембраны как DAPI-только окрашенные клетки (пунктирные линии). Клеточных ядер counterstained с DAPI (синий). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Прижизненной живой определение мыши BBB проницаемость. (A) подготовка имплантируемые хвостового вен катетера. (1) Инструменты и оборудование являются следующие: () PE20 полиэтиленовых труб (b) два 25 G иглы (c) Рочестер-Ошснер щипцы и (d) небольшой бульдог зажим. (2) 25 G иглы удаляется несколько скручиваний с помощью щипцов и (3) тщательно вставляется в трубе. (4) другой стороне трубки подключен к другой 25 G иглы. (B) руководство для имплантации катетера и позиционирования на настаиваться флуоресцеин натрия раствор через Вену хвост мыши. Кружил области указывает на области, где капля Цианакрилатный клей помещается для обеспечения катетер. Бульдог зажим используется для обработки катетера и удалены, как только будет обеспечено катетер. (C) представитель изображений и количественной оценки метод для определения значений проницаемости флуоресцеин натрия. До инфузии натрия флюоресцеином (левая колонка) бланк аутофлюоресценция измеряется в пределах региона интерес (ROI) размещены на области мозга (верхней панели, белый прямоугольник) и кровеносных сосудов (Нижняя панель, красный прямоугольник). Во время инфузии натрия флюоресцеином (правая колонка) интенсивность флуоресценции измеряется в обоих трансформирования, позволяя расчет BBB проницаемости. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: прогнозирование внутримозговых Трансцитоз наночастиц через BBB в естественных условиях, с использованием модели в пробирке BBTB. (A) графическое изображение BBTB пробу с представителем конфокальный изображений, полученных на различных уровнях указанной murine модели BBTB. Наночастицы 110 Нм в диаметре (NP110) и конъюгированных FITC (зеленый) были добавлены в кровь стороне BBTB клетки были помечены лизосомальных зонд (LT-99, красный). Клетки (1) Endothelial, (2) Endothelial Трансцитоз наночастиц через поры мембраны (белая пунктирная линия), (3) астроциты, и сферах пациента глиобластома (4) определяются на графический и соответствующие конфокальной микроскопии (справа). Лизосомальных инкапсуляции наночастиц (стрелки) предполагает активное Трансцитоз через эндотелиальные и экзоцитоз слои BBTB. (B) количественная оценка проницаемости указанные наночастицы через BBTB в пробирке (n = 6). (C) количественная оценка плотности указанные наночастицы в ткани мозга участки, 8 ч после хвостового вен настой обнаженной мышей (n = 3). (D) Confocal микроскопии, показывающий распределение ø 110 Нм наночастиц (NP110, красный) в разделах ткани мозга мышиных помечены анти мыши CD31 антитела (зеленый). Стрелку подчеркивает Трансцитоз наночастиц (левая панель). Наночастицы накопил вокруг клетки мозга опухоли (опухоли, правая панель) вследствие ориентации курятник пептид, представленные на их поверхности. Без существенных самонаведения наблюдается в мозговой ткани (мозг). (E) Confocal микроскопии показывают распределение ø 350 Нм наночастиц (NP350, красный) в разделах ткани мозга мышиных помечены анти мыши CD31 антитела (зеленый). Стрелки указывают на NP350s, которые были сохранены в просвет сосуда и смогли пересечь BBB, вероятно из-за их большего диаметра, по сравнению с NP110s. клеточных ядер counterstained с DAPI (синий). P < 0.01. P-значения были рассчитаны с использованием двух белохвоста, непараметрический тест U Манна-Уитни. Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| мышиных имитировать BBTB | bEND3 | bEND3 + HIFko как | bEND3 + ГБ | bEND3 + HIFko как + ГБ | В естественных условиях |
| Проницаемость (10-6 см/с) | 27.63 | 6.74 | 26.8 | 10.83 | 5.57 |
| SD (10-6 см/с) | 3.45 | 3.01 | 7.99 | 2,65 | 2.19 |
| имитировать человека BBTB | HuAR2T | HuAR2T + ХИАСа | HuAR2T + ГБ | HuAR2T + ХИАС + ГБ | |
| Проницаемость (10-6 см/с) | 104.92 | 47,4 | 89.08 | 48.24 | |
| SD (10-6 см/с) | 27.1 | 14.32 | 10.21 | 13.07 |
Таблица 1: значения проницаемости флуоресцеин натрия (Na-ФЗ) (в сантиметрах в секунду) определяется в пробирке в системах указанного совместного культуры и in vivo в обнаженной мышей ВММНИИ. Данные от представителя эксперимент (n = 3 мышей).
Discussion
Возникновение концепции изменчивости interpatient опухоли омолаживается исследования по персональной рака медицины21. Эта изменчивость также является признаком опухолей центральной нервной системы. Из-за непредсказуемости опухоли ответа на химиотерапию добавляет укрытия эффект BBB для доставки лекарств и вообще представляет собой основные проблемы в стационар22. В целях разработки более эффективных методов лечения, часто бывает необходимо для больших библиотек экрана новых молекул. Для оценки эффективности противоопухолевой и новых терапевтических приводит способность достигнуть опухоли, лучшим вариантом является доклинические исследования на пациента производные клетки имплантируется в естественных условиях в мышиных пациента аватары. Из-за практических (финансовых, времени, человека и фонда ресурсы) и этическим соображениям (принцип 3Rs при использовании лабораторных животных) развитие такой крупномасштабной в естественных условиях скрининг платформы является часто не возможно и, следовательно, анализы на основе ячеек остаются модель выбора23. Основной причиной для выбора создана клеточных линий и избегая Главные ячейки заключается в облегчении воспроизводимость и сокращения использования лабораторных животных, которые являются основным источником для изоляции и создание первичных мышиных культур. Методы, представляя здесь, твердо соблюдает 3Rs, может эффективно удалить наночастиц из дальнейшего доклинические исследования на критерий их неспособность пересечь модель BBTB. Доказательства в принципе мы здесь описать выводы, полученные в ходе разработки и проверки BBTB. Мы смогли подтвердить в пробирке выводы в естественных условиях, например при измерении пассивной диффузии 376 да натрия флюоресцеином.
Протокол, изложенных в настоящем документе описывается подготовка эндотелиальных клеток, cocultured с астроциты сформировать кровоснабжение мозга опухоль барьер как интерфейс в лабораторных условиях установки. После того, как физический контакт между этими типами двух клеток установлено, эндотелиальных клеток слой экспонатов сходство с BBB (например, клетки поверхности выражение туго Джанкшен белков и относительно низкой проницаемости). Интересно, что мышиных имитировать BBTB, как представляется, особенно аналогичные значения проницаемости Na-Fl с полученными с помощью мыши в естественных условиях измерения проницаемости BBB24. Таким образом производительность BBTB имитирует будет непосредственно увязываться с выбора ячеек, которые используются для формирования барьера. BEND3 эндотелиальные клетки происходят из мозга и как известно, быть успешным в формировании барьеров при cocultured с астроциты25. Однако мы использовали увековечен астроциты HIFko26 для создания мнемосхемы BBTB. Из-за их отсутствия гипоксия индуцибельной фактором, не производят эти астроциты VEGF-A, который является квинтэссенцией в мнемосхеме BBTB стабилизации, описанных здесь. Астроциты были определены как модуляторы проницаемости BBB, например путем выпуска VEGF-A в ответ на neuroinflammation27. Активация Сосудистый эндотелиальный фактор роста рецепторов (VEGFRs) является ключевым регулятором эндотелиальной/сосудистой проницаемости в vitro28 и в естественных условиях29. Таким образом VEGF-A добавки в среде активировать VEGFR2 на эндотелиальных клеток, которая вызывает фосфорилирование белков перекрестка adherens например VE-Кадгерины30. Потеря контактов эндотелиальных клеток создает повышенную проницаемость кровеносных сосудов. Аналогично сильное митогенный имущество и неизвестного состава плода говядину сера используется в assays культуры клетки вызывают основные вопросы в барьер стабилизации и пробирного воспроизводимость.
Эндотелиальные клетки человека пупочную вену (HUVECs) иногда используются для формирования BBB в vitro31; Однако, они значительно отличаются от микрососудистой эндотелиальных клеток головного мозга, такие, как hCMEC/D3 клеток линии32, с точки зрения экспрессии генов и образуя барьер свойства. Однако относительно высокой проницаемости, что значения, полученные с HuAR2T клетками, выращенных только по сравнению с bEND3 были значительно сокращены путем coculturing их с человека первичной астроциты. Хотя эндотелиальные клетки необходимы для формирования клеточной стенки, становится ясно, что астроциты имеют столь же важную роль для BBTB формирования и стабилизации.
Когда пациент производные глиомы сферах были добавлены в это уравнение, имитировать BBTB мыши перечисляет некоторые из особенностей мышиных ксенотрасплантатов, например наркотиками диффузии через сосудистую мозга и ориентации клетки опухоли. Например, имитирует BBTB, обсуждаемые здесь были успешными в зеркальном отображении в естественных условиях поведение, когда мы проверяются несколько наночастиц с различными диаметрами. Чтобы проиллюстрировать параллелизм между моделями в vitro и in vivo, мы использовали ранее описанных мезопористых силикатных наночастиц33 с клеток проникающие свойства34 конъюгированных опухоль таргетинг пептид курятник на их surface20. Курятник ориентация дома пептид инвазивные опухоли клетки через конкретные привязки ингибитор роста молочных производных (MDGI). Несколько рака, в том числе глиомы, экспрессирующих MDGI, по сравнению с нормальной ткани35, который делает курятник весьма эффективным остаток опухоли таргетинг способен увеличения доставки полезной нагрузки20. Наночастицы, используемый здесь было ранее показано, диффундируют в паренхиме мозга (27547955), и когда функционализированных с Таксол, эти нано грузы были успешными в сокращении глиомы роста в доклинических моделей36. Добавление полиэтиленгликоля (PEG) остатков на поверхности наночастиц также поддерживали их статический заряд положительных значениям (около + 4 мВ), позволяя лучше взаимодействия с нервно-сосудистого подразделение37 , а также увеличения их стабильность в обращении. В представленных данных 3 кДа PEG был спрягаются в NP110s, в то время как NP350s были покрыты 10 кДа КОЛЫШЕК. Однако увеличение молекулярный вес PEG также привели к значительное увеличение диаметра наночастиц, следовательно их физические возможности пересечь BBB. Таким образом мы проверили ли физические размеры частиц предотвратить их прохождения через BBTB и ли эти замечания могут быть зеркально отображены в естественных условиях.
В соответствии с ранее опубликованных замечания, мы наблюдали, что NP110s extravasated через BBTB в пробирке и BBB мышей, принимая внутричерепной опухоли, при NP350s, сохранил на стороне Люминал, BBTB имитируют и кровеносные сосуды мышей. Эти аналогичные результаты настоятельно рекомендую, что модель BBTB предсказал в естественных условиях способность наночастиц пересечь BBB и достигает мозга.
Актуальность сотовой модели BBB часто обсуждается, даже для Центральной доставки наночастиц38. Мы показываем здесь что первичной астроциты и эндотелиальных клеток, оба считаются наиболее актуальными в пробирке инструменты, могут быть заменены клетками увековечен или коммерчески доступных, обеспечивая большую масштабируемость и воспроизводимость. Следующее поколение в пробирке имитирует BBB могут разрабатываться путем включения microfluidic приборы, позволяя прекрасно сформированной нейроваскулярных единиц, которые структурно напоминают фактической BBB12,14. Однако такие модели в настоящее время непригодны для высокопроизводительного скрининга молекул, доставлены глиомы, из-за технических ограничений доставки14в рамках последующей деятельности. Это действительно трудно захватить физиологические сложности BBB в блюдо, и возможное отсутствие некоторых рецепторов/белков, известный выражаться путем BBB, может скомпрометировать интерпретацию результатов. Еще один аргумент касается большой изменчивости в экспрессии генов между в vivo и in vitro условий, а также от линии одной клетки в другую, особенно учитывая эндотелиальных клеток. Однако можно утверждать, что нервно-сосудистого единица не имеет единой сущности в мозг39. Научные исследования в биологии достиг гуманной эпохи где Благосостояние животных, этической ответственности и стоимость использования животных жизнь всегда считаются перед проектированием эксперимент. Таким образом, для поддержки замены животных, все большее число последних исследований показывают, что осведомленность об ограничениях модели и тщательный подбор клеточных моделей, чтобы создать барьер — с упором на астроциты — ордер матч между результаты получены в блюдо и в животных моделях40. С методологией, описанной здесь мы получить один шаг ближе к сокращению числа экспериментальных животных, используемых для отбора целей BBB Трансцитоз для потенциальных терапии.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано грантов от финских организаций рака, Джейн и Aatos Эркко фонд и Сигрид Juselius фонда (п.л. и V.L.J.), Швейцарский Национальный научный фонд (Расширенный Postdoc.Mobility Грант без: P300PB_164732, для S. K.), Орион исследовательский фонд (для с.к.), мод Kuistila мемориального фонда (с.к.) и Академия Финляндии (TERVA 2017, Грант без: 314 498). Imaging группа Biomedicum (Хельсинки) признается за предоставление микроскопии изображений объекта ядра.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells | |||
| bEND3 | ATCC | CRL-2299 | Cultured in: DMEM (1g/L glucose) supplemented with 10% FBS, 5 mL L-glutamine and 5 mL penicillin/streptomycin |
| HIFko immortalized mouse astrocytes | Isolated in Dr. Gabriele Bergers Lab | https://doi.org/10.1016/S1535-6108(03)00194-6 | Cultured in: BME-1 supplemented with 5% FBS, 5 mL 1 M HEPES, 5 mL 100 mM sodium pyruvate, 3 g D-glucose and 5 mL penicillin/streptomycin |
| HuAR2T | Isolated in Dr. Dagmar Wirth Lab | https://doi.org/10.1089/ten.tea.2009.0184 | Cultured in: EBM-2 with SupplementMix |
| normal human primary astrocytes | Lonza | CC-2565 | Cultured in: ABM with SingleQuots |
| Material and reagents | |||
| 100 mm x17 mm Dish, Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific | 150350 | |
| 10 mL serological pipet | ThermoFisher Scientific | 170361 | |
| 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339650 | |
| ABM Basal Medium, 500 mL | Lonza | CC-3187 | For primary human astrocytes. ABM+: contains all the additives from the supplement mix. ABM-:all the additives except for rhEGF and FBS |
| Accutase Cell Detachment Solution | Corning | 25-058-CI | |
| AGM SingleQuots Supplements and Growth Factors | Lonza | CC-4123 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | for both GBM + and - medium |
| Basal Medium Eagle | ThermoFisher Scientific | 21010046 | BME-1 |
| Corning Costar TC-Treated 6-Well Plates | Sigma-Aldrich | CLS3506 | |
| Corning Transwell polyester membrane cell culture inserts | Sigma-Aldrich | CLS3452 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | dissolve in 50 mL of BME-1 and sterile filter before adding to the medium |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient F-12 Ham | Gibco | 21331-020 | Specific to the culture of the patient-derived spheres isolated in our lab, may vary for other glioma cell lines |
| EBM-2 growth Medium SupplementMix | PromoCell | c-39216 | EBM+: contains all the additives from the supplement mix. EBM-:all the additives except for VEGF-A and FBS |
| Endothelial Basal Medium 2 (EBM-2) | PromoCell | c-22211 | EBM+: contains all the additives from the supplement mix. EBM-:all the additives except for VEGF-A and FBS |
| Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin | ThermoFisher Scientific | 10500056 | |
| Fluorescein sodium salt | Sigma-Aldrich | F6377 | |
| Greiner CELLSTAR 96 well plates | Sigma-Aldrich | Greiner 655090 | black polystyrene wells flat bottom (with micro-clear bottom) |
| Menzel-Gläser 0.9 cm round borosilicate Cover Slips | Thermo Scientific | 10313573 | |
| PBS tablets | Medicago | 09-9400-100 | one tablet per liter of dH2O, then sterilize the solution by autoclaving |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6407 | |
| Recombinant Human EGF | Peprotech | GMP100-15 | for GBM+ medium |
| Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) | Peprotech | 100-18B | for GBM+ medium |
| Immunofluorescence | |||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| 24 mm x 60 mm microscope slide cover glass | ORSAtec | 0224601-D | |
| AlexaFluor 488 and 594 secondary antibodies | ThermoFisher Scientific | dilution: 1/500 | |
| Anti-Claudin-5 antibody | Abcam | ab15106 | dilution: 1/150 |
| Anti-GFAP antibody clone GF5 | Abcam | ab10062 | dilution: 1/150 |
| Anti-Mouse CD31 antibody Clone MEC 13.3 | BD Biosciences | 550274 | dilution 1/800 |
| Anti-SV40 T-antigen antibody | Abcam | ab16879 | dilution: 1/150 |
| Anti-Zonula Occludens-1 | Abcam | ab96587 | dilution: 1/200 |
| DAPI | TOCRIS | 5748 | |
| Fluoromount Aqueous Mounting Medium | Sigma-Aldrich | F4680 | |
| LysoTracker Red DND-99 | ThermoFisher Scientific | L7528 | |
| Animal procedures | |||
| 10 cm curved dissecting scissors | World Precision Instruments | 14394 | |
| BD Microlance 25 G needles | Becton Dickinson | 300600 | |
| Fine Forceps (12.5 cm) | World Precision Instruments | 503283 | for tissue dissociation |
| Intramedic Polyethylene tubing PE20 | Becton Dickinson | 427406 | |
| Ketaminol vet 50 mg/mL | Intervet | Vnr511485 | Ketamine |
| Mains Powered microdrill | World Precision Instruments | 503599 | |
| Menzel-Gläser 0.5 cm round borosilicate Cover Slips | Thermo Scientific | 11888372 | |
| Micro Bulldog clamp | World Precision Instruments | 14119 | |
| Physiological saline solution | Mustela | Sterile single dose vials 20 x 5 mL / 40 x 5 mL - Medical device class | |
| Rochester-Oschner forceps | World Precision Instruments | 501709 | |
| Rompun vet 20 mg/mL | Intervet | Vnr148999 | Xylazine |
| Stereotaxic adapter | World Precision Instruments | 502063 | |
| Sugi Sponge Points | Kettenbach | 31603 | |
| Equipment | |||
| Axio Zoom.V16 fluorescence stereo zoom microscope | Carl Zeiss | ||
| FLUOstar Omega microplate reader | BMG Labtech | ||
| ORCA-Flash 4.0 digital sCMOS camera | Hamamatsu Photonics | ||
| Universal 320 tabletop centrifuge | Hettich | Cat. No. 1401 | |
| ZEISS LSM 880 with Airyscan confocal microscope | Carl Zeiss |
References
- Daneman, R., Prat, A.
- Quail, D. F., Joyce, J. A.
- Wang, Z., Sun, H., Yakisich, J. S. Overcoming the blood-brain barrier for chemotherapy: limitations, challenges and rising problems. Anticancer Agents in Medicinal Chemistry. 14 (8), 1085-1093 (2014).
- Alkins, R. D., Brodersen, P. M., Sodhi, R. N., Hynynen, K. Enhancing drug delivery for boron neutron capture therapy of brain tumors with focused ultrasound. Neuro Oncology. 15 (9), 1225-1235 (2013).
- Alli, S., et al. Brainstem blood brain barrier disruption using focused ultrasound: A demonstration of feasibility and enhanced doxorubicin delivery. Journal of Controlled Release. 281, 29-41 (2018).
- Ashby, L. S., Smith, K. A., Stea, B. Gliadel wafer implantation combined with standard radiotherapy and concurrent followed by adjuvant temozolomide for treatment of newly diagnosed high-grade glioma: a systematic literature review. World Journal of Surgical Oncology. 14 (1), 225 (2016).
- Guishard, A. F., Yakisich, J. S., Azad, N., Iyer, A. K. V. Translational gap in ongoing clinical trials for glioma. Journal of Clinical Neurosciences. 47, 28-42 (2018).
- Rahman, N. A., et al. Immortalized endothelial cell lines for in vitro blood-brain barrier models: A systematic review. Brain Research. 1642, 532-545 (2016).
- Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).
- Wang, J. D., Khafagy, el-S., Khanafer, K., Takayama, S., ElSayed, M. E. Organization of Endothelial Cells, Pericytes, and Astrocytes into a 3D Microfluidic in Vitro Model of the Blood-Brain Barrier. Molecular Pharmaceutics. 13 (3), 895-906 (2016).
- Phan, D. T., et al. Blood-brain barrier-on-a-chip: Microphysiological systems that capture the complexity of the blood-central nervous system interface. Experimental Biology and Medicine (Maywood). 242 (17), 1669-1678 (2017).
- Bang, S., et al. A Low Permeability Microfluidic Blood-Brain Barrier Platform with Direct Contact between Perfusable Vascular Network and Astrocytes. Scientific Reports. 7 (1), 8083 (2017).
- Wilhelm, I., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier for the study of drug delivery to the brain. Molecular Pharmacology. 11 (7), 1949-1963 (2014).
- Campisi, M., et al. 3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes. Biomaterials. 180, 117-129 (2018).
- Pirsko, V., et al. An Effect of Culture Media on Epithelial Differentiation Markers in Breast Cancer Cell Lines MCF7, MDA-MB-436 and SkBr3. Medicina (Kaunas). 54 (2), (2018).
- Stebbins, M. J., et al. Differentiation and characterization of human pluripotent stem cell-derived brain microvascular endothelial cells. Methods. 101, 93-102 (2016).
- Canfield, S. G., et al. An isogenic blood-brain barrier model comprising brain endothelial cells, astrocytes, and neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Journal of Neurochemistry. 140 (6), 874-888 (2017).
- Cao, Y., et al. Hypoxia-inducible factor-1alpha is involved in isoflurane-induced blood-brain barrier disruption in aged rats model of POCD. Behavioural Brain Research. 339, 39-46 (2018).
- Abbott, N. J. Astrocyte-endothelial interactions and blood-brain barrier permeability. Journal of Anatomy. 200 (6), 629-638 (2002).
- Kinnari, P. J., et al. Tumour homing peptide-functionalized porous silicon nanovectors for cancer therapy. Biomaterials. 34 (36), 9134-9141 (2013).
- Levin, V. A.
- Weathers, S. S., Gilbert, M. R. Toward Personalized Targeted Therapeutics: An Overview. Neurotherapeutics. 14 (2), 256-264 (2017).
- O'Duibhir, E., Carragher, N. O., Pollard, S. M. Accelerating glioblastoma drug discovery: Convergence of patient-derived models, genome editing and phenotypic screening. Molecular and Cellular Neuroscience. 80, 198-207 (2017).
- Kaya, M., Ahishali, B. Assessment of permeability in barrier type of endothelium in brain using tracers: Evans blue, sodium fluorescein, and horseradish peroxidase. Methods in Molecular Biology. 763, 369-382 (2011).
- Yang, S., et al. Identification of two immortalized cell lines, ECV304 and bEnd3, for in vitro permeability studies of blood-brain barrier. PLoS One. 12 (10), e0187017 (2017).
- Blouw, B., et al. The hypoxic response of tumors is dependent on their microenvironment. Cancer Cell. 4 (2), 133-146 (2003).
- Argaw, A. T., et al. Astrocyte-derived VEGF-A drives blood-brain barrier disruption in CNS inflammatory disease. Journal of Clinical Investigation. 122 (7), 2454-2468 (2012).
- Miao, Z., et al. VEGF increases paracellular permeability in brain endothelial cells via upregulation of EphA2. The Anatomical Record (Hoboken). 297 (5), 964-972 (2014).
- Heinolainen, K., et al. VEGFR3 Modulates Vascular Permeability by Controlling VEGF/VEGFR2 Signaling. Circulation Research. 120 (9), 1414-1425 (2017).
- Claesson-Welsh, L.
- Adriani, G., Ma, D., Pavesi, A., Goh, E. L., Kamm, R. D. Modeling the Blood-Brain Barrier in a 3D triple co-culture microfluidic system. Conference Proceedings - IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 2015, 338-341 (2015).
- Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids and Barriers of the CNS. 10 (1), 16 (2013).
- Paatero, I., et al. Analyses in zebrafish embryos reveal that nanotoxicity profiles are dependent on surface-functionalization controlled penetrance of biological membranes. Scientific Reports. 7 (1), 8423 (2017).
- Prabhakar, N., et al. Stimuli-responsive hybrid nanocarriers developed by controllable integration of hyperbranched PEI with mesoporous silica nanoparticles for sustained intracellular siRNA delivery. International Journal of Nanomedicine. 11, 6591-6608 (2016).
- Hyvonen, M., et al. Novel target for peptide-based imaging and treatment of brain tumors. Molecular Cancer Therapeutics. 13 (4), 996-1007 (2014).
- Feng, X., et al. Mammary-Derived Growth Inhibitor Targeting Peptide-Modified PEG-PLA Nanoparticles for Enhanced Targeted Glioblastoma Therapy. Bioconjugate Chemistry. 26 (8), 1850-1861 (2015).
- Nance, E. A., et al. A dense poly(ethylene glycol) coating improves penetration of large polymeric nanoparticles within brain tissue. Science Translational Medicine. 4 (149), 149rA119 (2012).
- Berg, C. Quantitative analysis of nanoparticle transport through in vitro blood-brain barrier models. Tissue Barriers. 4 (1), e1143545 (2016).
- Noumbissi, M. E., Galasso, B., Stins, M. F. Brain vascular heterogeneity: implications for disease pathogenesis and design of in vitro blood-brain barrier models. Fluids and Barriers of the CNS. 15 (1), 12 (2018).
- Heymans, M., Sevin, E., Gosselet, F., Lundquist, S., Culot, M. Mimicking brain tissue binding in an in vitro model of the blood-brain barrier illustrates differences between in vitro and in vivo methods for assessing the rate of brain penetration. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 127, 453-461 (2018).
