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Cancer Research

Vivo पेलोड डिलीवरी में एक डिश में रक्त मस्तिष्क ट्यूमर-बैरियर का उपयोग करने की भविष्यवाणी

Published: April 16, 2019 doi: 10.3791/59384
Automatic Translation
1, 1,2, 1,3
1Research Programs Unit, Translational Cancer Medicine Research Program, University of Helsinki, 2Wihuri Research Institute, Biomedicum Helsinki, University of Helsinki, 3Laboratory Animal Center, Helsinki Institute of Life Science (HiLIFE), University of Helsinki

Summary

केंद्रीय तंत्रिका तंत्र ट्यूमर को लक्षित दवा एक बड़ी चुनौती है । यहां हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए रक्त मस्तिष्क ट्यूमर की नकल विट्रो में एक उत्पादन-murine और/या मानव कोशिकाओं का उपयोग बैरियर और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र vivo में ट्यूमर लक्ष्यीकरण की predictability के लिए उनकी प्रासंगिकता पर चर्चा ।

Abstract

प्रकृति द्वारा अत्यधिक चयनात्मक, रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB) शारीरिक परिस्थितियों में मस्तिष्क homeostasis के लिए आवश्यक है । हालांकि, मस्तिष्क ट्यूमर के संदर्भ में, bbb के आणविक चयनात्मकता भी पेरिएटरली प्रशासित कीमोथेरेपी की डिलीवरी अवरुद्ध द्वारा नवोत्पादित कोशिकाओं ढाल । उपन्यास दवाओं के विकास (नैनोकणों सहित) घातक मस्तिष्क ट्यूमर को लक्षित करने दवा के transcytosis और अर्बुदरोधी प्रभावकारिता का अध्ययन करने के लिए आदर्श रूप से पूर्व नैदानिक पशु मॉडल के उपयोग की आवश्यकता है । आदेश में 3R सिद्धांत के साथ पालन करने के लिए (परिष्कृत, कम, और बदलने के लिए) प्रयोगात्मक सेटअप में प्रयोगशाला जानवरों की संख्या को कम करने और अर्बुदरोधी एजेंटों के एक बड़े पुस्तकालय की उच्च थ्र्पुट स्क्रीनिंग प्रदर्शन, हम विट्रो मानव में एक reproducible विकसित और म्यूरिन की नकल रक्त मस्तिष्क ट्यूमर-बैरियर (BBTB) endothelial कोशिकाओं, astrocytes के तीन स्तरित संस्कृतियों का उपयोग कर, और रोगी-ग्लियोब्लास्टोमा क्षेत्रों से व्युत्पन्न । उच्च scalability और reproducibility के लिए, वाणिज्यिक सेल लाइनों या अमर कोशिकाओं के अनुरूप परिस्थितियों में इस्तेमाल किया गया है एक बाधा के गठन की अनुमति के लिए वास्तविक BBB जैसी । यहाँ हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन आवेषण पर विशिष्ट सेल घनत्व पर astrocytes के साथ संपर्क में endothelial कोशिकाओं को संवर्धन द्वारा एक bbtb नकल प्राप्त करने के लिए । इस bbtb नकल, उदाहरण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, परिमाणन और एक ही परख के भीतर ट्यूमर सेल लक्ष्यीकरण के मूल्यांकन के अलावा endothelial और astrocytic बाधाओं के माध्यम से nanoparticle बीतने के संनाभि इमेजिंग के लिए । इसके अलावा, हम बताते है कि प्राप्त डेटा पूर्व नैदानिक पशु मॉडल में नैनोकणों के व्यवहार की भविष्यवाणी करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । एक व्यापक परिप्रेक्ष्य में, इन विट्रो मॉडल में BBB के माध्यम से नए चिकित्सीय अणुओं के पारित होने के निर्धारण के लिए अन्य न्यूरोडेजेनेरेटिव रोगों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है और/या सीधे की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए मस्तिष्क organoids के साथ पूरक होना दवाओं.

Introduction

Neurovascular इकाई ंयूरॉंस, astrocytes से बना है, और BBB, pericytes, astrocytes, endothelial कोशिकाओं के बीच जटिल कनेक्शन द्वारा गठित है, और जुड़े तहखाने मस्तिष्क microvasculature1बनाने झिल्ली । लगातार, nonfenestrated जहाजों द्वारा गठित इस तंग सेलुलर दीवार पतले आयन और अणुओं (हार्मोन, पोषक तत्वों, या दवाओं सहित) के आंदोलन को नियंत्रित करता है, लेकिन यह भी परिसंचारी कोशिकाओं के1. उच्च आणविक के BBB के माध्यम से विशेष रूप से कम transcytosis-चिकित्सकीय एंटीबॉडी के रूप में वजन अणुओं,, दवा conjugates, या nanocompounds, नाटकीय रूप से घातक सहित मस्तिष्क संबंधी बीमारियों के लिए दवा की खोज में अग्रिम प्रतिबंधित ग्लियोमास2. वास्तव में, मौखिक रूप से या नसों के द्वारा वितरित कीमोथेरेपी अक्सर अपर्याप्त कम सांद्रता में मस्तिष्क पैरेन्काइमा तक पहुंचने के लिए एक अर्बुदरोधी प्रभाव पैदा करने के लिए या केवल करने के लिए bbtb पार करने में असमर्थ है नवोत्पादित3कोशिकाओं तक पहुंचने । कई पूर्व नैदानिक और नैदानिक अध्ययन bbtb प्रवेश के मुद्दे के साथ निपटा नहीं है, लेकिन के लिए bbtb संक्रमण को बाधित करने का प्रयास किया है, उदाहरण के लिए ध्यान केंद्रित ultrasounds4,5का उपयोग करके, या यह सीटू में प्रत्यक्ष द्वारा दरकिनार 6औषधियों का वितरण । हालांकि, इन तकनीकों में से कोई भी अपरिहार्य ट्यूमर विस्तार या पतन प्रभावहीन करने में सक्षम थे । इसलिए, जब उपंयास antiglioma उपचार के विकास, BBTB के माध्यम से प्रसार चिकित्सीय एजेंटों7के सफल प्रसव के लिए महत्वपूर्ण पहलुओं में से एक के रूप में माना जाना चाहिए ।

BBTB के भीतर कोशिका बातचीत के बहुत जटिल प्रकृति के कारण, प्रयोगशाला पशुओं में vivo अध्ययन में स्पष्ट विकल्प है जब रक्त से मस्तिष्क के लिए अणुओं के पारित होने का अध्ययन करने लगते हैं । हालांकि, vivo तरीकों में उच्च पैमाने पर स्थापित करने के लिए अपेक्षाकृत जटिल है और, इसलिए, एक उचित कीमत पर एक उचित समय में अणुओं की उच्च थ्रुपुट स्क्रीनिंग की अनुमति नहीं है । इससे भी अधिक महत्वपूर्ण बात, पशु परीक्षण के लिए 3R नैतिक मैं के रूप में परिभाषित दिशानिर्देश का पालन किया है) परिष्कृत, द्वितीय) को कम करने, और, वर्तमान संदर्भ के लिए प्रासंगिकता के, iii) वैकल्पिक प्रोटोकॉल (जैसे, में विट्रो में/ इसलिए, इन विट्रो में BBTB पुनः बनाने एक दिलचस्प और आकर्षक संभावना के रूप में प्रकट होता है, लेकिन यह भी एक जटिल विभिंन सीमाओं द्वारा चुनौती दी कार्य का गठन किया । कई के लिए सभ्य प्राथमिक कोशिकाओं या canine से सेल लाइनों के साथ इस जटिल डिब्बे बहलाना प्रयास, porcine, मुराने, और यहां तक कि मानव मूल प्रकाशित किया गया है (के रूप में रहमान एट अल.8 और helms एट अल.9द्वारा की समीक्षा) । इन मॉडलों में तीन आयामी microfluidic10सिस्टम, bbb-पर-एक चिप11,12, और वेरिएंट की multitudes शास्त्रीय सह पर आधारित-सम्मिलित करता है सिस्टम में संस्कृतियों शामिल हैं । फिर भी, वर्तमान microfluidic और चिप सिस्टम या तो तेजी के लिए उपयुक्त नहीं हैं, उच्च थ्र्यूपुट दवा-सत्यापन अध्ययन13,14 या वर्तमान में मस्तिष्क ट्यूमर को दवा वितरण के अध्ययन के साथ असंगत हैं । इसके अलावा, १५५ प्रकाशित की समीक्षा के प्राथमिक कोशिकाओं का उपयोग कर मॉडल, प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSC), या वाणिज्यिक सेल लाइनों सभी सह पर सुसंस्कृत आवेषण अपने मापन में अंतर अध्ययन विसंगति के लिए एक प्रवृत्ति और/ यह अंतर प्रयोगशाला reproducibility की कमी मैं के साथ सहसंबद्ध किया जा सकता है) nonnormalized संस्कृति की स्थिति, उदाहरण के लिए कक्ष संस्कृति पोत में तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स प्रोटीन के साथ वैकल्पिक कोटिंग के साथ, द्वितीय) उपसंस्कृति और उपयोग की वृद्धि हुई संख्या सीरम युक्त मीडिया, दोनों कोशिका लाइनों15, या iii के आनुवंशिक और लक्षणप्ररूपी संशोधनों के प्रमुख ड्राइवरों) कठिनाई को reproducibly एक डिश में astroglial और endothelial घटकों के बीच सही संतुलन पुनः बनाना । हालांकि अमर कोशिकाओं या वाणिज्यिक सेल लाइनों के उपयोग के लिए एक विट्रो BBB मॉडल में स्थापित करने के लिए समान मॉडल है कि केवल प्राथमिक कोशिकाओं का उपयोग की तुलना में गुणों में से कुछ का अभाव है, वर्णित विधि में हम बताते है कि कोशिकाओं के सही संयोजन प्रदर्शित करता है एक बहुत 16,17संदर्भ के अन् य मॉडलों में प्रकाशित अध् ययन के लिए तुलनीय निष् पादन । अंततः, एक मजबूत और reproducible मॉडल की कमी के लिए उपचारात्मक यौगिकों के पारित होने का अध्ययन करने के लिए BBTB के माध्यम से मस्तिष्क ट्यूमर लक्ष्यीकरण हमें प्रेरित तरीके विकसित करने के लिए यहां वर्णित है ।

के बाद से लक्ष्य के लिए मॉडल का उपयोग करने के लिए पूर्व नैदानिक पशु मॉडलों में नैनोकणों की vivo डिलीवरी में भविष्यवाणी की थी, हम पहली बार म्यूरिन astrocytes के साथ संपर्क में म्यूरिन endothelial कोशिकाओं युक्त आवेषण का उपयोग करके bbtb मॉडल मांय । इस के अलावा, हम भी मॉडल कुछ मानव कोशिका लाइनों का उपयोग करने के लिए अनुकूलित । एक बार स्थिर, सेल बाधाओं रोगी के साथ संस्कृतियों को स्थानांतरित कर रहे है ग्लियोब्लास्टोमा क्षेत्रों या वाणिज्यिक तंत्रिकाबंधार्बुद सेल लाइनों व्युत्पंन । इसके बाद, नैनोकणों और ट्यूमर सेल लक्ष्यीकरण के transcytosis संनाभि माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना की जा सकती है और समय के साथ नमूनों का संग्रह द्वारा मात्रा निर्धारित. महत्वपूर्ण बात, परिणाम bbtb mimics मज़बूती से vivo में नैनोकणों के व्यवहार की भविष्यवाणी सकता है का उपयोग कर प्राप्त, bbtb mimics के उपयोग पूर्व नैदानिक सत्यापन से पहले का समर्थन ।

Protocol

पशु प्रयोगों को दक्षिणी फिनलैंड के जिले के पशु प्रयोगों के लिए समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था (ESAVI/6285/04.10.07/2014).

1. BBTB Mimics की स्थापना

नोट: कोशिका संस्कृति मध्यम और पूरक सामग्री की मेजमें विस्तृत कर रहे हैं ।

  1. एस्ट्रोसाइटीज की तैयारी
    नोट: निम्नलिखित खंड एक 10 सेमी पेट्री डिश या एक T75 सेल संस्कृति फ्लास्क के लिए उपयुक्त हैं ।
    1. एक बाँझ कोशिका संस्कृति हुड के तहत, ध्यान से बाँझ फॉस्फेट-buffered खारा (PBS) के 5 मिलीलीटर के साथ सुसंस्कृत astrocytes धोने. धीरे से एक वैक्यूम पंप का उपयोग कर PBS छोड़ें और 5 मिनट के लिए सेल वियोजन अभिकर्मक के 2 मिलीलीटर जोड़ें (३७ डिग्रीसेल्सियस पर, सामग्री की मेजदेखें) कोशिकाओं को अलग करने के लिए. माइक्रोस्कोप के नीचे सेल टुकड़ी की जांच करें । कोशिकाओं पर तनाव को सीमित करने के लिए ऊष्मायन के 5 मिनट से अधिक नहीं है ।
    2. सेल वियोजन अभिकर्मक की गतिविधि को बाधित करने के लिए पोत को बाँझ पूरा astrocyte सेल संस्कृति मध्यम (ABM +) के 10 मिलीलीटर जोड़ें । पोत से अलग कोशिकाओं को बाँझ 15 मिलीलीटर ट्यूब पर स्थानांतरित करने के लिए एक बाँझ सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग करें । सेंट्रीफ्यूज २५० आरसीएफ (त्वरण: 9 आरसीएफ/एस, मंदी: 5 आरसीएफ/एस) में कमरे के तापमान (आरटी) पर 3 मिनट के लिए सेल निलंबन ।
    3. इस बीच, आवेषण तैयार ( सामग्री की मेजदेखें): बाँझ संदंश का उपयोग कर, एक बाँझ 6-कूप प्लेट (चित्र 1b) के ढक्कन पर मस्तिष्क पक्ष (चित्रा 1a) के साथ आवेषण प्लेस. पहले से सत्यापित करें कि थाली को छूने या प्रक्रिया के दौरान आवेषण ले जाने के बिना आवेषण पर उल्टा रखा जा सकता है ।
      नोट: आवेषण की उचित स्थान झिल्ली और कूप के नीचे के बीच में astrocyte निलंबन के फंसाने की अनुमति देता है ।
    4. एक बार केन्द्रापसारक, ध्यान से अधिनतांत सेल निलंबन से त्याग; ABM के 1 मिलीलीटर में astrocyte गोली resuspend + धीरे से एक्स 5x करने के लिए ट्यूब की दीवार पर गोली कोपुनः बंद । कोशिकाओं पर तनाव को सीमित करने के लिए कोशिकाओं के अत्यधिक पिख्ता से बचें । कक्षों की गणना करें और कक्ष निलंबन घनत्व को समायोजित करें १.५ x 105 कक्षों में ४०० ΜL abm +/insert।
    5. मस्तिष्क के मध्य में कोशिका निलंबन की जगह डालें's झिल्ली (चित्र 1b) और, बहुत सावधानी से, एक बाँझ पिपेट टिप के साथ केशिका बल का उपयोग करके फैल. झिल्ली विशेष रूप से नाजुक है के रूप में सीधे संपर्क से बचें ।
    6. अब भी सम्मिलित करता है के मस्तिष्क पक्ष के साथ, 6-well थाली वापस आवेषण पर जगह. यह सुनिश्चित करता है कि सेल निलंबन झिल्ली और अच्छी तरह के वास्तविक नीचे के बीच फंस गया है (चित्रा 1 सी) । सेल निलंबन में हवा के बुलबुले से बचें, क्योंकि यह झिल्ली पर astrocytes के सजातीय प्रसार को रोकने जाएगा ।
    7. प्लेट और आवेषण, मस्तिष्क पक्ष के साथ प्लेस, इनयूबेटर में (5% सह 2के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर) 2 एच की एक ंयूनतम के लिए सेल आसंजन की अनुमति के लिए (murine अमर astrocytes) और अप करने के लिए 6 एच (मानव प्राथमिक astrocytes) ।
      नोट: के रूप में आवेषण उल्टा बनाए रखा है, कोशिका आसंजन के दृश्य एक खुर्दबीन के नीचे संभव नहीं है । इसलिए, यह एक अलग नियमित सेल संस्कृति पोत बीज और समय के साथ पोत में कोशिका आसंजन को नियंत्रित करने की सिफारिश की है । झिल्ली के सावधान हेरफेर एक चाहिए के रूप में परिणाम अविश्वसनीय जब झिल्ली क्षतिग्रस्त हो जाएगा ।
    8. ऊष्मायन समय के अंत में, सीडिंग क्षेत्र के बाहर सेल निलंबन लीक के अभाव की पुष्टि करें, और यदि वे नलों में आवेषण छोड़ें । अपनी नियमित स्थिति के लिए 6-well थाली वापस, कि अब रक्त की ओर होगा (आंकड़ा 1ए) आवेषण के साथ । प्रत्येक कूप में एबीएम + की २.६ मिलीलीटर जोड़ें । प्रत्येक डालने में पूरा astrocyte मध्यम के २.५ मिलीलीटर डालो और मशीन में (5% सह2के साथ ३७ डिग्रीसेल्सियस पर) में थाली जगह ।
  2. एंडोथीलीयल कोशिकाओं की तैयारी
    नोट: म्यूरिन मस्तिष्क माइक्रोसंवहनी endothelial कोशिकाओं (bEND3) के लिए, कोशिकाओं १००% संगम तक पहुंचने के लिए अधिकतम सेल सेल संपर्क सुनिश्चित करने के प्रयोग के दिन पर इष्टतम तंग जंक्शन प्रोटीन अभिव्यक्ति ट्रिगर करना चाहिए । इस मानव गर्भनाल नस endothelial कोशिकाओं के लिए लागू नहीं होता (HuAR2T) astrocytes की उपस्थिति के रूप में इन कोशिकाओं के लिए एक तंग जंक्शन प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए आवश्यक है ।
    1. पहले astrocytes के लिए वर्णित के रूप में आगे बढ़ना (1.1.1 कदम और 1.1.2.) । एक बार केन्द्रापसारक, ध्यान supernatant त्यागने; पूर्ण एन्डोथेलीयल सेल कल्चर मीडियम (EBM +) के 1 मिलीलीटर में एंडोथेलीयल कोशिका गोली को पुन: बंद करके 5x तक नली की दीवार पर कोशिका निलंबनको धीमा करके । कोशिकाओं पर तनाव को सीमित करने के लिए कोशिकाओं के अत्यधिक पिख्ता से बचें । कक्षों की गणना करें और सेल निलंबन घनत्व को समायोजित करें 2 x 105 कोशिकाओं में २.५ मिलीलीटर/endothelial सेल संस्कृति मध्यम सीरम (ebm-) और संवहनी endothelial विकास फैक्टर-एक (Vegf-एक) से रहित की डालें ।
    2. बाहर आवेषण युक्त थाली ले लो, ध्यान से रक्त की ओर से मध्यम त्याग, और यह endothelial सेल निलंबन के २.५ मिलीलीटर के साथ बदलें । मशीन (5% CO2के साथ ३७ डिग्रीसेल्सियस पर) और यह endothelial कोशिकाओं के लिए रात भर छोड़ने के लिए झिल्ली का पालन करने के लिए थाली वापस ।
    3. अगले दिन, एक बाँझ 6-well थाली prewarmed सीरम मुक्त astrocyte मध्यम (ABM-) के प्रत्येक अच्छी तरह से 3 मिलीलीटर स्थानांतरित करके तैयार करते हैं । बाँझ संदंश के साथ आवेषण को संभालने के द्वारा, ध्यान से रक्त की ओर से endothelial पूरा माध्यम त्यागने, ABM युक्त नई थाली में डालने जगह, और EBM के २.५ मिलीलीटर जोड़ें.
      नोट: EBM का उपयोग-endothelial बाधा की स्थापना के लिए महत्वपूर्ण है (कृपया चर्चा अनुभाग देखें) ।
    4. इनयूबेटर में आवेषण छोड़ दें (5 % CO2के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर) ंयूनतम शारीरिक अशांति और 5 दिनों के लिए तापमान विविधताओं के साथ, endothelial तहखाने झिल्ली, astrocyte संपर्कों के उत्पादन की अनुमति के साथ endothelial कोशिकाओं, और अंततः, BBTB नकल गठन । ग्लाइमा सेल संस्कृतियों पर स्थानांतरण के दिन के माध्यम से बदलें (कृपया अनुभाग १.४ को देखें) ।
  3. BBTB नक़ल पारगम्यता की माप (वैकल्पिक)
    Equation 1
    1. छोटे आणविक वजन फ्लोरोसेंट डाई सोडियम-fluorescein (एनए-Fl) के निष्क्रिय प्रसार रक्त से समय के साथ सम्मिलित करता है के मस्तिष्क की ओर करने के लिए निम्न सूत्र के अनुसार पारगम्यता मूल्यों की गणना की अनुमति देता है:
      यहां, dFअच्छीतरह से प्रतिदीप्ति मूल्य एक निश्चित समय बिंदु से कम सेल संस्कृति मध्यम autofluorescence मूल्य में मापा जाता है, डीटी सेकंड में समय है, एक वर्ग सेंटीमीटर में बाधा की सतह है, और dFसंमिलित प्रतिदीप्ति मान को एक ही समय बिंदु शूंय से मध्यम autofluorescence मान में संमिलित में मापा जाता है) ।
    2. दोनों रक्त और BBTB नकल के मस्तिष्क पक्षों से माध्यम के १०० μL लीजिए और उनमें से प्रत्येक के हस्तांतरण के बाद प्रतिदीप्ति माप के लिए एक अलग फ्लैट तली, काले ९६-well थाली के लिए । Autofluorescence सही करने के लिए खाली के रूप में सादे मीडिया का प्रयोग करें ।
    3. EBM-में Na-Fl (५० μM) के कूप प्रति २.५ मिलीलीटर तैयार करें । ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए Na-Fl समाधान Prewarm. मीडिया के साथ सम्मिलित करें Na-Fl के साथ मीडिया के रक्त की ओर से बदलें । माध्यम के रूप में जल्द ही एक टाइमर प्रारंभ करें ।
    4. ध्यान से 5, 30, ६०, और १२० मिनट में सम्मिलित करता है के रक्त और मस्तिष्क की ओर से मीडिया के १०० μL इकट्ठा. काले ९६-कुआं थाली के कुओं को अलग करने के लिए प्रत्येक नमूने स्थानांतरण ।
    5. तदनुसार, एकत्रित मीडिया को दोनों पक्षों के बीच वॉल्यूम संतुलन बनाए रखने के लिए संमिलन से प्रतिस्थापित करें । एक नमूना संग्रह के बीच इनयूबेटर में वापस आवेषण प्लेस तापमान विविधताओं को कम करने के लिए.
    6. 480/560 एनएम (उत्तेजन और उत्सर्जन, क्रमशः) पर सेट फिल्टर के साथ एक थाली पाठक का उपयोग कर, एकत्र नमूनों से प्रतिदीप्ति मात्रा ।
      नोट: मस्तिष्क की ओर से प्रतिदीप्ति लगभग 5 मिनट के समय बिंदु पर undetectable है । रिक् त की तुलना में उच् च मूल् यों में सम्मिलित झिल्ली या अवरोध कारिसाव/क्षति का संकेत मिलता है; इसलिए, इन को आगे विश्लेषण से बाहर करें । BBTB के लिए अपेक्षित Na-Fl पारगम्यता मान 10-5 से 10-6 सेमी/s श्रेणी (तालिका 1) में होना चाहिए ।
  4. ग्लाइमा कोशिकाओं की तैयारी
    नोट: हालांकि रोगी व्युत्पन्न ग्लियोब्लास्टोमा क्षेत्रों यहाँ उपयोग किया जाता है, निम्न प्रोटोकॉल आसानी से, जैसे U-87MG के रूप में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं, आसंन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।
    1. वैकल्पिक रूप से, इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग के लिए, चार गोल बाँझ बोरोसिलिकेट coverslips (ø ०.९ सेमी) प्रति अच्छी तरह से एक 6-अच्छी तरह से थाली में 2 मिलीलीटर पाली-डी-lysine (०.०१%) । 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनसेबेट ।
    2. इस बीच, ध्यान से एक 15 मिलीलीटर बाँझ ट्यूब के लिए सेल संस्कृति पोत से ट्यूमर क्षेत्रों हस्तांतरण एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग कर । २५० आरसीएफ में 3 मिनट के लिए ट्यूमर क्षेत्रों सेंट्रीफ्यूज ।
    3. Supernatant छोड़ें, धीरे bfgf/egf मुक्त (gbm-) तंत्रिकाबंधार्बुद सेल मध्यम के 1 मिलीलीटर में क्षेत्रों resuspend और कोशिकाओं गिनती । GBM में सेल घनत्व को लगभग 104 गोलों/एमएल (105 सेल/एमएल) में समायोजित करें ।
    4. पाली-डी-lysine कुओं से छोड़ें और उन्हें बाँझ PBS के साथ 3x कुल्ला । बीज 3 मिलीलीटर के साथ प्लेट/ट्यूमर गोलाभ निलंबन और ट्यूमर सेल निलंबन पर bbb नकल के साथ आवेषण हस्तांतरण ।
    5. सेते रातोंरात (5% CO2के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर) रक्त और परख के मस्तिष्क ट्यूमर पक्षों के बीच संतुलन की अनुमति । अगले दिन, मीडिया की जगह के साथ रक्त की ओर से EBM-पूरक के अणुओं के साथ ब्याज की दवाओं/ पिछले अनुभाग में बताए गए अनुसार प्रत्यक्ष मात्रा के लिए नमूनों को समय के साथ एकत्र किया जाता है । कोशिकाओं प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए एक सटीक समय बिंदु पर तय कर रहे है (कृपया २.१ और २.२ वर्गों को देखें) ।

2. उच्च संकल्प BBTB के Confocal इमेजिंग

नोट: 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए, पीएच ७.४, 6 एमएल प्रति bbtb प्रतिकृति) हमेशा pbs में ताजा तैयार किया जाता है । इसे बर्फ पर रखें ।

चेतावनी: पीएफए यलो है । पीएफए संभाल और एक रासायनिक धूआं डाकू के तहत समाधान तैयार करने के लिए नाइट्रिले दस्ताने का प्रयोग करें ।

  1. BBTB तंग जंक्शन प्रोटीन की endothelial अभिव्यक्ति
    1. बर्फ के साथ झिल्ली के दोनों ओर कुल्ला-ठंडे PBS (5 मिनट के लिए 3x, २.५ मिलीलीटर/ PBS छोड़ें और 3 मिलीलीटर और २.५ मिलीलीटर बर्फ ठंडा 4% पीएफए में अच्छी तरह से और डालने में, क्रमशः जोड़ें । 10 मिनट के लिए बर्फ पर सेते. पीएफए को छोड़ दें (संस्थाके खतरनाक रासायनिक निपटान के अनुसार) और आरटी (२.५ एमएल/डालने, 3 एमएल/कूप) में pbs के साथ 3x कुल्ला ।
      नोट: एक बार स्थिर होने पर, नमूनों को पीबीएस (२.५ मिलीलीटर/insert, 3 मिलीलीटर/कूप) में एक सप्ताह के लिए 4 डिग्रीसेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है ।
    2. डालने के मस्तिष्क की ओर पोंछने के लिए एक सूती झाड़ू का प्रयोग करें और astrocytes को हटा दें । एक तीव्र स्केलपेल का प्रयोग, ध्यान से दो लंबवत कटौती, एक क्रॉस बनाने के द्वारा चार बराबर टुकड़ों में झिल्ली में कटौती । इसके बाद, स्केलपेल को उस बिंदु पर डालें जहाँ झिल्ली डालने की दीवार से जुड़ी हुई है और चार नमूनों को मुक्त करने के लिए दूसरे हाथ से सम्मिलित करें को घुमाएँ. ठीक चिमटी का प्रयोग, ध्यान से एक 24-अच्छी तरह से PBS के २०० μL युक्त थाली के लिए प्रत्येक नमूना हस्तांतरण/
    3. PBS में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ झिल्ली ब्लॉक (आरटी में 30 मिनट के लिए, २०० μL/well) । तंग जंक्शन प्रोटीन (चित्रा 1 डी) (zonula occludens-1, क्लाउडिं-5; कृपया सामग्री की तालिकाको देखें) के २०० μl में अवरुद्ध समाधान के लिए 1° एंटीबॉडी समाधान/ वैकल्पिक रूप से, endothelial सेल पहचान एक प्लेटलेट endothelial कोशिका आसंजन अणु (PECAM1 या CD31 के खिलाफ उठाया एंटीबॉडी जोड़कर सत्यापित है, कृपया सामग्री की मेजको देखें) प्रत्येक तंग जंक्शन एंटीबॉडी समाधान के लिए । ब्लॉकिंग समाधान को छोड़ें और 4 °C पर प्राथमिक एंटीबॉडीज O/N के साथ इनसेबेट करें ।
    4. अगले दिन, प्राथमिक एंटीबॉडी त्यागें और उंहें PBS के २०० μL के साथ कुल्ला (आरटी में 5 मिनट के लिए 3x) । उन्हें उपयुक्त प्रजातियों के साथ सेते-विशिष्ट फ्लोरोफोर-संयुग्मित द्वितीयक एंटीबॉडी (1:500 कमजोर पड़ने, २०० μL/well, अवरुद्ध समाधान में पतला; आरटी पर 2 एच के लिए सामग्री की मेजको देखें) ।
    5. माध्यमिक एंटीबॉडी छोड़ें, PBS के २०० μL के साथ कुल्ला (आरटी में 5 मिनट के लिए 3x) । PBS को निकालें और एक 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) समाधान का उपयोग करके सेल नाभिक प्रतिदाग शुद्ध आसुत एच2ओ में 1 μg/mL की एक अंतिम एकाग्रता पर (dH2o; २०० μl/अच्छी तरह से, कृपया सामग्री की मेज को देखें ). आर टी पर 7 मिनट के लिए सेते. निकालें DAPI और धो झिल्ली 3x डीएच2ओ (२०० μl/well) के साथ ।
    6. एक गिलास माइक्रोस्कोप स्लाइड पर बढ़ते माध्यम की एक बूंद प्लेस ( सामग्री की मेजदेखें) । ठीक चिमटी का प्रयोग, ध्यान से अच्छी तरह से बाहर झिल्ली ले, और उंमुखीकरण रखते हुए, dH2ओ के अतिरिक्त हटाने और बढ़ते माध्यम की बूंद पर जगह है । झिल्ली के शीर्ष पर बढ़ते माध्यम की एक और बूंद जोड़ें और ध्यान से यह एक बोरोसिलिकेट कवर ग्लास के साथ कवर । सुनिश्चित करें कि कोई फँस हवा बुलबुले हैं । 4 डिग्रीसेल्सियस पर नमूनों की दुकान और संनाभि माइक्रोस्कोपी टिप्पणियों तक प्रकाश से दूर.
      नोट: Astrocyte धुंधला 24 में झिल्ली के टुकड़े रखने के द्वारा किया जा सकता है-अच्छी तरह से थाली मस्तिष्क पक्ष के साथ, और चयनित astrocyte के उपयोग के साथ विशिष्ट एंटीबॉडी (जैसे, glial तंतुक एसिड प्रोटीन के खिलाफ निर्देशित [GFAP]) (चित्रा 1E ).
  2. के लिए nanoparticle ट्रांससाइटोसिस का पता लगाने के लिए BBTB प्रतिदीप्ति धुंधला
    1. लाइव सेल लयनकाय लेबलिंग प्रदर्शन (जैसे, फ्लोरोसेंट जांच का उपयोग [ सामग्री की मेजदेख]) । Prewarmed ebm में ५० एनएम की एक कार्यशील एकाग्रता में लयनकाय फ्लोरोसेंट डाई-(२.५ मिलीलीटर/insert) या prewarmed abm में ७५ मिमी-(3 मिलीलीटर/अच्छी तरह से) endothelial कोशिकाओं और astrocytes के लयनकाय लेबलिंग के लिए क्रमशः । कोशिकाओं को ४५ मिनट के लिए सेते (5 % सह2के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर); फिर, कुल्ला 3x बर्फ के साथ ठंडा PBS (२.५ मिलीलीटर/डालें, 3 मिलीलीटर/
    2. PBS छोड़ें और 3 मिलीलीटर और २.५ मिलीलीटर बर्फ ठंडा 4% पीएफए के लिए अच्छी तरह से और डालने के लिए, क्रमशः जोड़ें । उंहें 10 मिनट के लिए बर्फ पर सेते. पीएफए को छोड़ दें और सेल 3x PBS के साथ (RT, २.५ mL/insert, 3 मिलीलीटर/
      नोट: एक बार स्थिर होने पर, नमूनों को एक सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस (२.५ मिलीलीटर/insert, 3 मिलीलीटर/कूप) में भंडारित किया जा सकता है ।
    3. डीएपी2ओ में 1 Μg/mL की एक अंतिम एकाग्रता पर एक dapi समाधान का उपयोग करके सेल नाभिक को हटाने और pbs के counterदाग़ (1 मिलीलीटर/ आर टी में 7 मिनट के लिए उंहें सेते । DAPI निकालें और 3 x की झिल्ली को डीएच2ओ (२.५ मिलीलीटर/
    4. ध्यान से झिल्ली में कटौती, dH2ओ के अतिरिक्त हटाने, और बढ़ते माध्यम की एक बूंद पर जगह ( सामग्री की मेजदेखें) एक गिलास माइक्रोस्कोप स्लाइड पर । झिल्ली के दूसरी ओर बढ़ते माध्यम की एक और बूंद जोड़ें और ध्यान से यह एक बोरोसिलिकेट कवर ग्लास के साथ कवर । फँस हवाई बुलबुले से बचें । 4 डिग्रीसेल्सियस पर नमूनों की दुकान और उन्हें संनाभि माइक्रोस्कोपी इमेजिंग तक प्रकाश से सुरक्षित रखने के लिए ।
  3. ट्यूमर कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति अभिरंजक
    1. ठीक चिमटी का प्रयोग, ध्यान से एक 24-अच्छी तरह से बर्फ के साथ भरा थाली के लिए ट्यूमर क्षेत्रों युक्त दौर coverslips हस्तांतरण-ठंडे PBS । लाइव सेल लयनकाय के साथ आगे बढ़ना लेबल prewarmed gbm में ७५ एनएम फ्लोरोसेंट लयनकाय जांच का उपयोग कर-(२०० μl/ ४५ मिनट के लिए नमूने सेते; फिर, उंहें कुल्ला बर्फ के साथ 3x-ठंड PBS (२०० μL/
    2. PBS छोड़ें और प्रति अच्छी तरह से बर्फ ठंडा पीएफए के २०० μL जोड़ें । 10 मिनट के लिए बर्फ पर सेते. पीएफए छोड़ें और नमूने कुल्ला PBS के साथ 3x (RT पर) ।
      नोट: एक बार तय की, नमूने PBS (२०० μL) में एक सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है ।
    3. डीएपी2ओ (२०० μl/well) में 1 Μg/mL की एक अंतिम एकाग्रता पर एक dapi समाधान का उपयोग करके सेल नाभिक को हटाने और pbs counterदाग़ । उंहें आर टी में 7 मिनट के लिए सेते । DAPI निकालें और coverslips 3x डीएच2ओ (२०० μl/well) के साथ धोने ।
    4. ठीक चिमटी का प्रयोग, बाहर coverslip ले, dH2ओ के अतिरिक्त हटाने, और बढ़ते माध्यम की एक बूंद पर जगह ( सामग्री की मेजदेखें) एक गिलास माइक्रोस्कोप स्लाइड पर । किसी भी हवाई बुलबुले entrapping से बचें । 4 डिग्रीसेल्सियस पर नमूनों की दुकान और संनाभि माइक्रोस्कोपी टिप्पणियों तक उन्हें प्रकाश से सुरक्षित रखने के लिए ।

3. Vivo में तुलनात्मक अध्ययन

  1. BBB के माध्यम से सोडियम-फ्लोरेसइन प्रसार की स्वस्थानी रिकॉर्डिंग में
    1. एक शारीरिक समाधान में ५० एनएम Na-Fl समाधान का १५० μL तैयार करें । ३७ डिग्रीसेल्सियस पर अंतःशिरा वितरण पर समाधान रखें ।
    2. एनस्थेटाइज़ एक चूहे के एक intraperitoneal इंजेक्शन के साथ एक केटामाइन/xylazine कॉकटेल (३०० μL of १०० मिलीग्राम/किलो ketamine और पीबीएस में 10 मिलीग्राम/किलो xylazine) । एक बार गहरी बेहोशी की स्थापना की है, एक हीटिंग पैड पर जानवर जगह के लिए अपने शरीर के तापमान को बनाए रखने ।
      नोट: दस सप्ताह पुरानी महिला नौसेना चिकित्सा अनुसंधान संस्थान (nmri) नग्न प्रतिरक्षा चूहों चित्रा 2में प्रस्तुत डेटा प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. हालांकि, इस प्रोटोकॉल असुरक्षित और असुरक्षित चूहों दोनों के लिए अनुकूलित है । संवेदनाहरण विधि वैज्ञानिक के विवेकाधिकार पर है । हालांकि, साँस लेना बेहोशी ऐसे isoflurane के रूप में यह काफी BBB पारगम्यता18बढ़ जाती है अनुशंसित नहीं है ।
    3. एक stereotaxic फ्रेम पर माउस प्लेस ( सामग्री की मेजदेखें) और ठीक कैंची के साथ खोपड़ी का एक अनुदैर्ध्य चीरा प्रदर्शन, संयोजी ऊतक के कोमल dilacerations के बाद, ठीक चिमटी का उपयोग, खोपड़ी प्रकट करने के लिए । एक महीन माइक्रोड्रिल के साथ परिपत्र आंदोलनों का उपयोग करना, बाईं या सही परितल हड्डी से खोपड़ी के एक ø ०.३ मिमी परिपत्र टुकड़ा हटा दें । ड्रिलिंग के दौरान अत्यधिक सावधानी के साथ आगे बढ़ना है और जबकि खोपड़ी टुकड़ा हटाने के लिए अंतर्निहित दिमागी ऊतक और रक्त वाहिकाओं घायल से बचने के ।
    4. उजागर ऊतक पर शारीरिक समाधान की एक बूंद रखें । ठीक forceps के दो जोड़े का उपयोग करना, ध्यान से मस्तिष्क प्रांतस्था का उपयोग करने के लिए मस्तिष्कीय ऊतक हटा दें । मस्तिष्क ऊतक हवा के साथ सीधे संपर्क में कभी नहीं होना चाहिए ।
      नोट: मस्तिष्कीय चोट से मामूली हेमोरेज hematologic स्पंज का उपयोग कर बंद कर दिया जा सकता है (कृपया सामग्री की मेजको देखें) ।
    5. एक बार मस्तिष् क ऊतक को हटा दिया जाता है और प्रांतस्था पूरी तरह से सामने आ जाती है, तो कॉर्टेक्स और ए ø ०.५ एमएम बोरोसिलिकेट कोवर्लिप के बीच शारीरिक समाधान की एक बूंद को उलझाए । Cyanoacrylate गोंद की एक बूंद के साथ अवलोकन क्षेत्र सुरक्षित (कृपया सामग्री की मेजको देखें) एक सुई के साथ coverslip चारों ओर फैल गया । गोंद को 1 मिनट के लिए सूखने दें ।
    6. पूंछ नस इंजेक्शन के लिए प्रत्यारोपण कैथेटर तैयार (चित्रा 2A) । रोचेस्टर-ऑक्सनर संदंश का उपयोग करके एक 25 ग्राम सुई की नोक को तोड़ें और 10 सेमी लंबी PE20 पॉलियूरिथेन ट्यूब में टिप डालें (कृपया सामग्रियों की तालिकादेखें) (चित्र 2a) ।
    7. माउस के पार्श्व पूंछ नस में कैथेटर डालें, कैथेटर हेरफेर और प्रविष्टि के लिए बुलडॉग clamps का उपयोग (कृपया सामग्री की तालिकाको देखें) (चित्रा 2b) । Cyanoacrylate गोंद की एक बूंद के साथ डाला सुई सुरक्षित । 20 एस के लिए गोंद सूखी बुलडॉग दबाना हटाने से पहले चलो । ध्यान से एक 25 ग्राम सुई Na-Fl समाधान युक्त सिरिंज से जुड़ा करने के लिए कैथेटर के दूसरे छोर से कनेक्ट (चित्रा 2B).
    8. नोट: बुलडॉग दबाना के साथ पूंछ दबाना मत करो; यह केवल सटीक कैथेटर हैंडलिंग के लिए प्रयोग किया जाता है । उचित कैथेटर प्रविष्टि पारदर्शी टयूबिंग में रक्त भाटा द्वारा की पुष्टि की जा सकती है ।
    9. स्टीरिओमिकरोस्कोप के तहत पशु प्लेस ( सामग्री की मेजदेखें) । ग्रीन चैनल (४८० एनएम) में निम्न स्तर autofluorescence का उपयोग कर, अपेक्षाकृत बड़े रक्त वाहिकाओं युक्त एक क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित (वे इस तरंग दैर्ध्य पर प्रकाश का हीमोग्लोबिन अवशोषण के कारण गहरा दिखाई देते हैं) और छोटे केशिकाओं (चित्र 2c). पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति का माप प्राप्त करने के लिए फ्लोरोसेंट डाई इंजेक्शन लगाने से पहले समय-चूक अधिग्रहण संक्षेप में शुरू करें ।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, समय चूक रिकॉर्डिंग टी0 से स्नैपशॉट चित्रों और किसी भी अन्य पूर्व निर्धारित समय बिंदुओं से प्रतिस्थापित किया जा सकता है ।
    10. एक धीमी और सतत गति से समाधान सुई, या वैकल्पिक रूप से, एक स्वचालित अर्क प्रणाली का उपयोग करें । Na-Fl रक्त में पाया प्रतिदीप्ति स्थिर रहना चाहिए (आधा रक्त में जीवन: २८६ मिनट), जो कई मिनट के लिए कपाल खिड़की के माध्यम से BBB प्रसार की एक रिकॉर्डिंग की अनुमति देता है । एक बार अधिग्रहण पूरा हो गया है, ध्यान से कैथेटर को हटाने और गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था से जानवर euthanize ।
  2. Vivo में BBB पारगम्यता का निर्धारण
    नोट: मान किसी भी छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर से प्राप्त कर रहे हैं, जैसे ImageJ, ब्याज की एक कस्टम क्षेत्र के अंदर प्रतिदीप्ति संकेत तीव्रता के माप की अनुमति (ROI).
    1. एनोटेशन उपकरण का उपयोग करना, एक रक्त वाहिका के बाहर एक आयत के आकार का रॉय ड्रा, मस्तिष्क के ऊतकों में, Na-Fl से भरा किसी भी दृश्य रक्त वाहिकाओं से लगभग 5 μm दूरी पर. ध्यान दें कि रॉय के आयामों और टी0 पर मापा प्रतिदीप्ति तीव्रता कि ROI में, जो ऊतक के स्वप्रतिदीप्ति के लिएरिक्त के रूप में प्रयोग किया जाता है. बिना रॉय को विस्थापित, तेजी से आगे एक postinjection समय बिंदु (जैसे, बहुत पिछले दर्ज की फ्रेम करने के लिए जब पूरे समाधान जानवर को इंजेक्शन दिया गया है) और सटीक समय और प्रतिदीप्ति मूल्यों रॉय के भीतर मापा (चित्र 2c) ध्यान दें ।
    2. एक दृश्य रक्त वाहिका पर रॉय ले जाएं (चित्र 2c) और रक्त से टी0 autofluorescence मूल्य ध्यान दें । रॉय को विस्थापित किए बिना, तेजी से आगे-कदम 3.2.1 में परिभाषित के रूप में एक ही समय बिंदु के लिए । और रॉय के भीतर प्रतिदीप्ति मूल्य मापा (चित्र 2c) ध्यान दें ।
      Equation 2
    3. BBB पारगम्यता निर्धारित करने के लिए निम्न सूत्र (अनुभाग १.३ से अनुकूलित) का उपयोग करें:
    4. यहां, dfमस्तिष्क प्रतिदीप्ति तीव्रता मूल्य शूंय से मस्तिष्क में रिक्त मूल्य है, डीटी सेकंड में अधिग्रहण समय बिंदु है, एक अनुमानित पोत सतह क्षेत्र है, वर्ग सेंटीमीटर में रॉय क्षेत्र के रूप में लिया, और dF रक्त प्रतिदीप्ति तीव्रता मान है जो कि रक्त में टी0 रिक् त मान को घटा रहा है ।
      नोट: BBB के लिए अपेक्षित पारगम्यता मान 10-6 सेमी/s श्रेणी (तालिका 1) में होना चाहिए ।
  3. म्यूरिन मस्तिष्क में फ्लोरोसेंट नैनोकणों का पता लगाने के लिए ऊतक प्रसंस्करण
    1. प्रत्यारोपण रोगी-ग्लियोब्लास्टोमा (5 x 10 बाँझ pbs के 5 μl में4 कोशिकाओं) में ऊपर 6 सप्ताह पुरानी महिला nmri नग्न चूहों में कॉर्पस callosum । निंनलिखित stereotaxic निर्देशांक पर इस मस्तिष्क क्षेत्र की स्थिति जानें, Bregma से शुरू: anteroposterior + ०.५ मिमी, सही करने के लिए छोड़ दिया + २.५ मिमी, डोर्सोवेंट्रल + 3 मिमी. मस्तिष्क ट्यूमर 2 सप्ताह के लिए विकसित करने के लिए अनुमति दें ।
    2. नैनोकणों नसों के द्वारा इंजेक्शन (१०० μg बाँझ शारीरिक समाधान के १०० μL में) और उन्हें 8 एच के लिए प्रसारित करने के लिए अनुमति देते हैं । बाँझ शारीरिक समाधान के १०० μL के साथ नसों के नियंत्रण चूहों को सुई ।
    3. गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के द्वारा चूहों को इकट्ठा करना और सूखी बर्फ पर बनाए रखा आइसोफेंटाने में स्नैप-जमने के लिए दिमाग तेजी से एकत्र (1 मिनट में-५० डिग्रीसेल्सियस) । पर दिमाग की दुकान-८० डिग्रीसेल्सियस जब तक ऊतक प्रसंस्करण ।
    4. एक cryomicrotome के साथ कोरोनल मस्तिष्क वर्गों में कटौती. निशान यह प्रांतस्था पर गठन और उचित माइक्रोस्कोप स्लाइड पर उस क्षेत्र से 9 μm मोटी वर्गों में कटौती द्वारा intracranial आरोपण का पता लगाने ( सामग्री की मेजदेखें) ।
    5. बर्फ में ठंड PBS (5 मिनट के लिए 2x) में स्लाइड पर मैटीरियल हैं कि मस्तिष्क वर्गों में विसर्जित कर दिया और, फिर, उन्हें बर्फ में ठीक-ठंडा 4% पीएफए (5 मिनट के लिए) । PBS (आरटी में 5 मिनट के लिए 3x) में स्लाइड धोने । स्लाइड् स को क्षैतिज रूप में रखें और ब्लॉक करने वाले घोल को पीबीएस में 10% भ्रूण गोवाइन सीरम से युक्त करें और पूरी सतह को कवर करने वाले ऊतकों पर (1 ज के लिए RT, ५०० μL/slide) पर लगाएं । CD31 एंटीबॉडी तैयार (कृपया सामग्री की तालिकाको देखें) में २५० μl अवरुद्ध समाधान/ प्रतिपिंड के साथ अवरुद्ध समाधान को प्रतिस्थापित करें और 4 डिग्रीसेल्सियस पर रात भर सेते हुए एक हडिफाइड चैंबर में ।
    6. अगले दिन, (आरटी में 5 मिनट के लिए 3x) PBS में स्लाइड विसर्जित और इसी फ्लोरोफोर के साथ उन्हें सेते-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी (1:500 में २५० μL के लिए PBS की आरटी में 2 एच) । PBS में 3x कुल्ला (आरटी में) और 1 μg/एमएल की एक अंतिम एकाग्रता पर एक DAPI समाधान का उपयोग करके सेल नाभिक counterदाग़ dH2O (२५० μl/ आर टी पर 7 मिनट के लिए नमूने सेते. DAPI समाधान निकालें और स्लाइड 3x डीएच2ओ के साथ धोने ।
    7. प्रत्येक ऊतक अनुभाग पर, बढ़ते माध्यम की एक बूंद जोड़ने (कृपया सामग्री की मेजको देखें) और एक coverslip के साथ नमूनों को सुरक्षित । हवा के बुलबुले entrapping से बचें । 4 डिग्रीसेल्सियस पर नमूनों की दुकान और संनाभि माइक्रोस्कोपी टिप्पणियों तक उन्हें प्रकाश से सुरक्षित रखने के लिए ।

Representative Results

म्यूरिन bbtb नकल की confocal इमेजिंग, bEND3 में टाइट जंक्शन प्रोटीन्स zonula occludens-1 (ZO-1) और claudin-5 की अभिव्यक्ति और सेलुलर स्थानीयकरण दिखाती है । Endothelial कोशिकाओं और astrocytes के बीच संपर्क स्पष्ट रूप से ZO-1 और claudin-5 के स्थान पर endothelial सेल सेल संपर्क करने के लिए bEND3 monocultures की तुलना में प्रेरित (चित्रा 1 डी) । मस्तिष्क-झिल्ली के किनारे पर astrocytes को व्यक्त करने के लिए, यह निरीक्षण और एस्ट्रोसाइटिक प्रक्रियाओं और अंत-पैर झिल्ली के माध्यम से endothelial कोशिकाओं से संपर्क करने के लिए संभव है की कल्पना करने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला का उपयोग करना (चित्रा 1e ). एस्ट्रोसाइट-endothelial सेल संपर्कों को बढ़ावा देने और सेलुलर बाधा के कस को स्थिर करने के लिए जाना जाता है और BBB19के कम पारगम्यता मूल्यों के साथ जुड़े रहे हैं । उस के अनुसार, हम माउस की पारगम्यता में काफी कमी मनाया BBTB की नकल के लिए Na-Fl से २७.६३ (± ३.४५) x 10-6 सेमी/monocultures के मामले में ६.७४ (± ३.०१) x 10-6 सेमी/s जब सह-सुसंस्कृत हाइपोक्सिया के साथ-inducible फैक्टर नॉकआउट (HIFko) astrocytes (तालिका 1) । अमर HuAR2T उच्च पारगम्य सेलुलर बाधाओं के रूप में (१०४.९२ ± २७.१ x 10-6 सेमी/ के लिए इसी तरह की murine मॉडल, हम काफी कम पारगम्यता के लिए BBTB Na-Fl, अर्थात् ४७.४ (± १४.३२) x 10-6 सेमी/s, जब HuAR2T कोशिकाओं को मानव प्राथमिक astrocytes के साथ सह-सुसंस्कृत थे (तालिका 1).

दोनों murine और मानव BBTB mimics में, रोगी की उपस्थिति-ग्लियोब्लास्टोमा क्षेत्रों व्युत्पंन endothelial कोशिका की तुलना में पारगम्यता मूल्यों में मामूली वृद्धि प्रेरित-astrocyte सह संस्कृतियों अकेले (तालिका 1) । यह घटना कई नहीं बल्कि रोगी तंत्रिकाबंधार्बुद क्षेत्र मॉडल के सभी के साथ मनाया जाता है । यह VEGF के कारण हो सकता है-एक है कि इन रोगियों के कुछ व्युत्पंन कोशिकाओं से स्रावित है ।

Vivo BBTB में के साथ इन विट्रो BBTB mimics के पारगम्यता मूल्यों की तुलना करने के लिए, हम नग्न चूहों में प्रत्यारोपित एक कपाल खिड़की के माध्यम से Na-Fl के वास्तविक समय प्रसार imaged । एक प्रतिदीप्ति स्टीरियोमिकरोस्कोप का उपयोग करना, मुख्य पिआल रक्त वाहिकाओं से व्युत्पन्न रक्त वाहिका केशिकाओं से, एनए-Fl विसरण से पहले, दौरान, और जांच के प्रणालीगत इंजेक्शन के बाद दर्ज किया गया था (चित्र 2c). समय के साथ परिसंचारी रक्त और मस्तिष्क वल्कुट पैरेन्काइमा से अंतर प्रतिदीप्ति मूल्यों का मापन हमें नग्न माउस के लिए's bbb के अनुमानित पारगम्यता मूल्यों की गणना करने की अनुमति दी Na-Fl (५.५७ ± २.१९ x 10-6 सेमी/ तालिका 1).

उदाहरण के लिए कैसे इस BBTB नकल यौगिकों के पारित होने के दृश्य के लिए रक्त की ओर से मस्तिष्क की ओर के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, हम की तुलना में transcytosis ø ११० एनएम (NP110) और ø ३५० एनएम (NP350) नैनोकणों को लक्षित रोगी से व्युत्पन्न ग्लियोब्लास्टोमा क्षेत्रों. विट्रो में प्राप्त परिणाम तो vivo transcytosis की तुलना में थे । प्रस्तुत उदाहरण में, नैनोकणों सतह के साथ लेपित थे ट्यूमर लक्ष्यीकरण पेप्टाइड कॉप20 और फ्लोरोसेंट डाई (fitc) के साथ भरी हुई दृश्य की सुविधा के लिए. हम लेसोसोमल डाई का उपयोग कर कोशिकाओं लेबल और bbtb नकल के रक्त-पक्ष पर fitc नैनोकणों के अलावा और विभिन्न स्तरों पर प्राप्त संनाभि माइक्रोग्राफ (जैसे, रक्त पक्ष, झिल्ली, मस्तिष्क पक्ष, के बाद dapi 24 h के साथ counterstained और रोगी ग्लियोब्लास्टोमा क्षेत्रों) (चित्रा 3A) । NP110-जुड़े फ्लोरिसेंट संकेत endothelial कोशिकाओं, astrocytes, और ट्यूमर कोशिकाओं में lysosomes के साथ colocalized । इसके अलावा, NP110s में पाया गया-endothelial कोशिकाओं और astrocytes के बीच, डालने की झिल्ली pores के माध्यम से गुजर (चित्रा 3A) ।

NP110s के पारित होने के रक्त और मस्तिष्क की ओर से एकत्र नमूनों से प्रतिदीप्ति को मापने के द्वारा मात्रा निर्धारित था. इन पारगम्यता मूल्यों ø  ३५० एनएम (NP350) के नैनोकणों के लिए निर्धारित उन लोगों की तुलना में थे । परिणाम बताते हैं कि केवल NP110 BBTB mimics (चित्रा 3B) को पार करने में सक्षम था. NP350 BBTB mimic, जो इन नैनोकणों के लिए कम पारगम्यता मूल्यों के परिणामस्वरूप के रक्त-पक्ष पर बनी रही ।

को vivo मॉडल में की तुलना में BBTB mimics की प्रासंगिकता को उजागर करने के लिए, नग्न चूहों नसों के साथ NP110 या NP350 ट्यूमर के साथ लेपित नैनोकणों के साथ इंजेक्शन थे पेप्टाइड कॉप लक्ष्यीकरण और लाल फ्लोरोसेंट डाई (TRITC) के साथ संयुग्मित का पता लगाने के लिए । कई समय बिंदुओं पर एकत्र ऊतकों से पता चला कि 8 ज के बाद, BBB-पारगम्य नैनोकणों मस्तिष्क पैरेन्काइमा में असाधारण है, जबकि असंपारगम्य है कि संचलन में रहने वाले मुख्य रूप से vivo में प्रणालीगत संचलन से मंजूरी दे दी गई । इसलिए, हम दिमाग एकत्र और वर्ग मिलीमीटर 8 एच postinjection प्रति नैनोकणों की संख्या मात्रा निर्धारित । इन विट्रो निष्कर्षों के अनुसार, NP110, लेकिन NP350 नहीं, सफलतापूर्वक मस्तिष्क पैरेन्काइमा (चित्रा 3C) में extravasated. उच्च मस्तिष्क में nanoparticle स्थान का इज़ाफ़ा इमेजिंग से पता चला कि NP110 homogeneously रक्त केशिकाओं के बाहर मस्तिष्क पैरेन्काइमा में वितरित किया गया था और सफलतापूर्वक प्रत्यारोपित ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं को homed (चित्रा 3 डी) । एक ही ट्यूमर लक्ष्यीकरण मोइटी (कॉप) का प्रदर्शन करने के बावजूद, NP350 मस्तिष्क पैरेन्काइमा में असाधारण करने में असमर्थ था और केवल मस्तिष्क रक्त वाहिकाओं (चित्रा 3E), विट्रो में प्राप्त परिणामों के लिए इसी तरह के luminal पक्ष के भीतर का पता चला।

Figure 1
चित्रा 1: रक्त मस्तिष्क ट्यूमर-बैरियर (BBTB) मॉडल का विवरण । (क) विभिन्न प्रकार के प्रकोष् ठ के स् थानों का योजनाबद्ध निरूपण । (ख) 6-कूप प्लेट आवरण और सम्मिलित की झिल्ली के मस्तिष्क की ओर एस्ट्रोसाइट्स के लिए सीडिंग तकनीक पर सम्मिलित प्लेसमेंट का चित्रण । (ग) astrocyte आसंजन की अनुमति 6-कूप प्लेट प्लेसमेंट का चित्रण । (घ) इम्युनोफ्लोरेसेंस माइक्रोग्राफ ऑफ टाइट जंक्शन प्रोटीन्स जोनुला ऑक्लेसेंस-1 (जो-1, ऊपरी पंक्ति, लाल) और क्लाउडइन-5 (निचली पंक्ति, हरा). प्रोटीन अभिव्यक्ति की तुलना में एक monoculture (बाएँ कॉलम) के रूप में या एक मोनोकल्चर के रूप में अकेले BBTB के रक्त पक्ष पर सभ्य मस्तिष्क सूक्ष्मवाहिकीय endothelial कोशिकाओं (bEND3) के लिए है (दाएँ कॉलम) । सेल नाभिक DAPI (नीला) के साथ counterstained हैं । (ङ) इमयूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोग्राफ, जो बीबीटीबी के मस्तिष्क के किनारे स्थित हिफको astrocytes में ग्लाइल रेशिलरी अम्लीय प्रोटीन (जीएपी, रेड) दर्शाता है । उच्च आवर्धन छवि astrocyte प्रक्रियाओं और अंत फुट (तीर) झिल्ली pores (सही पैनल) के माध्यम से endothelial कोशिकाओं से संपर्क से पता चलता है । हिफको astrocytes की पहचान इम्यूनोफ्लोरेसेंस के दाग से सत्यापित किया गया था सिमियन वायरस ४० बड़ी टी प्रतिजन (SV40 बड़ी टी, हरी) कोशिकाओं के अमर के लिए इस्तेमाल किया । Endothelial कोशिकाओं न तो GFAP और न ही SV40 बड़ी टी एक्सप्रेस और इसलिए, आंशिक रूप से DAPI के रूप में झिल्ली के पारदर्शी, विपरीत पक्ष के माध्यम से मनाया जा सकता है केवल दाग कोशिकाओं (डैश्ड लाइनें) । सेल नाभिक DAPI (नीला) के साथ counterstained हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: माउस BBB पारगम्यता का Intravital लाइव दृढ़ संकल्प । (क) प्रत्यारोपण योग्य पुच्छ शिरा कैथेटर तैयार करना । (1) उपकरण और उपकरण निंन हैं: (a) एक PE20 पॉलीथीन ट्यूब (b) २ २५ ग्राम सुई (c) रोचेस्टर-ओक्सनर संदंश, और (d) एक छोटा बुलडॉग दबाना । (2) एक 25 ग्राम सुई कई torsions द्वारा संदंश और (3) ध्यान से ट्यूब में डाला का उपयोग करके हटा दिया जाता है । (४) ट्यूब के दूसरी ओर एक और २५ ग्राम सुई से जुड़ा होता है. (ख) कैथेटर आरोपण और स्थिति के लिए मार्गदर्शन एक माउस की पूंछ नस के माध्यम से सोडियम-फ्लोरेसइन समाधान में डालना । गोलाकार क्षेत्र जहां cyanoacrylate गोंद की एक बूंद कैथेटर सुरक्षित करने के लिए रखा गया है क्षेत्र इंगित करता है । बुलडॉग दबाना कैथेटर को संभालने के लिए प्रयोग किया जाता है और एक बार कैथेटर सुरक्षित निकाल दिया जाता है । (ग) सोडियम-फ्लोरेसेइन पारगम्यता मूल्यों का निर्धारण करने के लिए प्रतिनिधि प्रतिबिंबन और परिमाणन विधि । सोडियम-फ्लोरेसेइन अर्क (बाएँ स्तंभ) से पहले, autofluorescence/खाली ब्याज (रॉय) मस्तिष्क (शीर्ष पैनल, सफेद आयत) और रक्त वाहिका क्षेत्रों (नीचे पैनल, लाल आयत) पर रखा के एक क्षेत्र के भीतर मापा जाता है । सोडियम फ्लोरेसेइन अर्क (दाएँ स्तंभ) के दौरान, प्रतिदीप्ति तीव्रता दोनों रोइस में मापा जाता है, BBB पारगम्यता की गणना की अनुमति. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: vivo में bbb के माध्यम से नैनोकणों के इंट्रा transcytosis का पूर्वानुमान विट्रो bbb मॉडल में का उपयोग कर । (क) म्यूरिन बीबीटीबी मॉडल के विभिन्न स्तरों पर प्राप्त प्रतिनिधि संनाभि चित्रों के साथ बीबीटीबी परख का ग्राफिक निरूपण । व्यास (NP110) में ११० एनएम के नैनोकणों और फाइक (ग्रीन) को संयुग्मित करने के लिए BBTB कोशिकाओं के रक्त पक्ष को जोड़ा गया लायोसोमल जांच (लेफ्टिनेंट-९९, लाल) के साथ लेबल थे ।  (1) endothelial कोशिकाओं, (2) नैनोकणों के endothelial ट्रांससाइटोसिस झिल्ली के pores के माध्यम से (सफेद डैश्ड लाइन), (3) astrocytes, और (4) रोगी ग्लियोब्लास्टोमा क्षेत्रों ग्राफिक पर पहचान कर रहे है और इसी संनाभि माइक्रोग्राफ (सही) । नैनोकणों (एरो) का लाइसोसोमल संपुल्कन, BBTB के एंडोथेलियल और एस्ट्रोसाइट परतों के माध्यम से सक्रिय ट्रांससाइटोसिस का पता चलता है । (ख) इन विट्रो (द = 6) में बीबीटीबी के माध्यम से निदष्ट नैनोपलेख पारगम्यता का परिमाणन । (ग) निर्वस्त्र चूहों (द = 3) के पुच्छ शिरा जलसेक के बाद मस्तिष्क ऊतक खंडों में दर्शाए गए नैनोलेख घनत्व का परिमाण, 8 ज । (घ) confocal माइक्रोग्राफ ø ११० एनएम नैनोकणों (NP110, red) का वितरण दिखा रहा है जो एक विरोधी माउस CD31 एंटीबॉडी (green) के साथ लेबल किए गए म्यूरिन मस्तिष्क ऊतक वर्गों में है । ऐरो नैनोपलेख ट्रांससाइटोसिस (बाएं पैनल) को हाइलाइट करता है । मस्तिष्क ट्यूमर कोशिकाओं के आसपास जमा नैनोकणों (ट्यूमर, सही पैनल) कॉप लक्ष्यीकरण पेप्टाइड उनकी सतह पर प्रस्तुत करने के लिए कारण. मस्तिष्क ऊतक (मस्तिष्क) में कोई महत्वपूर्ण अभिलक्ष्यन मनाया जाता है । (ङ) संनाभि सूक्ष्मरेखांकन एक एंटी-माउस CD31 एंटीबॉडी (green) के साथ लेबल किए गए म्यूरिन मस्तिष्क ऊतक अनुभागों में ø ३५० एनएम नैनोकणों (NP350, red) का वितरण दर्शाते हैं । ऐरोहेड NP350s कि रक्त वाहिका लुमेन में बनाए रखा और bbb को पार करने में असमर्थ थे करने के लिए बिंदु, शायद उनके बड़े व्यास के कारण NP110s की तुलना में. सेल नाभिक dapi (नीला) के साथ counterstained रहे हैं । * * P < ०.०१. P-मानों की गणना एक दो-पुच्छ, nonparametric मान-Whitney U परीक्षण का उपयोग कर रहे थे । त्रुटि पट्टियां मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

म्यूरिन bbtb नकल bEND3 bEND3 + हिफको म्हटले bEND3 + GB bEND3 + हिफको As + GB Vivo में
पारगम्यता (10-6 सेमी/ २७.६३ ६.७४ २६.८ १०.८३ ५.५७
एसडी (10-6 सेमी/ ३.४५ ३.०१ ७.९९ २.६५ २.१९
मानव bbtb नकल HuAR2T HuAR2T + हिअस HuAR2T + GB HuAR2T + हिअस + जीबी
पारगम्यता (10-6 सेमी/ १०४.९२ ४७.४ ८९.०८ ४८.२४
एसडी (10-6 सेमी/ २७.१ १४.३२ १०.२१ १३.०७

तालिका 1: सोडियम-fluorescein के मान (Na-Fl) पारगम्यता (प्रति सेकंड सेंटीमीटर में) विट्रो में निर्धारित संकेत सह संस्कृति प्रणालियों में और vivo में NMRI नग्न चूहों में । एक प्रतिनिधि प्रयोग (n = 3 चूहों) से डेटा ।

Discussion

इंटरपेशेंट ट्यूमर परिवर्तनशीलता अवधारणा के उदय निजीकृत कैंसर चिकित्सा21पर अनुसंधान कायाकल्प । यह परिवर्तनशीलता भी केंद्रीय तंत्रिका तंत्र ट्यूमर की एक बानगी है । ट्यूमर की अनिश्चितता के कारण, कीमोथेरेपी की प्रतिक्रिया दवा वितरण के लिए BBB के आश्रय प्रभाव के लिए कहते हैं, और पूरी तरह से रोगी की देखभाल22में प्रमुख चुनौतियों का गठन किया । अधिक प्रभावी चिकित्सा विकसित करने के लिए, यह अक्सर नए अणुओं के बड़े पुस्तकालयों स्क्रीन करने के लिए आवश्यक है । अर्बुदरोधी प्रभावकारिता और नए चिकित्सीय की क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए ट्यूमर साइट तक पहुँचने के लिए, सबसे अच्छा विकल्प है रोगी पर पूर्व नैदानिक अध्ययन-प्राप्त कोशिकाओं को मुर्इन रोगी बदलते रूपों में vivo में प्रत्यारोपित. व्यावहारिक (वित्तीय, समय, मानव, और सुविधा संसाधनों) और नैतिक कारणों (प्रयोगशाला जानवरों का उपयोग करते समय 3Rs सिद्धांत) के कारण, vivo स्क्रीनिंग प्लेटफॉर्म में इतने बड़े पैमाने पर विकास अक्सर संभव नहीं है, और इसलिए, सेल आधारित assays 23विकल्प के एक मॉडल रहते हैं । स्थापित सेल लाइनों के चयन और प्राथमिक कोशिकाओं से बचने के लिए प्रमुख कारण के लिए reproducibility की सुविधा और प्रयोगशाला जानवरों के उपयोग को कम करने के लिए है, जो अलगाव और प्राथमिक murine संस्कृतियों की स्थापना के लिए मुख्य स्रोत हैं । यहां पेश तरीकों, दृढ़ता से 3rs के साथ पालन, कुशलतापूर्वक मॉडल bbtb पार करने के लिए अपनी असमर्थता के मापदंडों पर एक और पूर्व नैदानिक जांच से नैनोकणों को छोड़ सकता है । एक सबूत के सिद्धांत के रूप में, हम यहां का वर्णन विकास और BBTB के सत्यापन के दौरान प्राप्त निष्कर्षों । हम vivo में विट्रो निष्कर्षों में पुष्टि करने में सक्षम थे, उदाहरण के लिए जब एक ३७६ दा सोडियम-fluorescein के निष्क्रिय प्रसार को मापने ।

इस पत्र में उल्लिखित प्रोटोकॉल में एक विट्रो सेटअप में एक रक्त मस्तिष्क ट्यूमर-बाधा की तरह इंटरफेस बनाने के लिए एस्ट्रोसाइट्स के साथ cocultured endothelial कोशिकाओं की तैयारी का वर्णन है । एक बार इन दो सेल प्रकार के बीच एक शारीरिक संपर्क स्थापित है, endothelial कोशिका परत BBB (जैसे, तंग जंक्शन प्रोटीन और अपेक्षाकृत कम पारगम्यता के एक सेल की सतह अभिव्यक्ति) के साथ समानताएं दर्शाती है । मजे की बात है, murine BBTB नकल करने के लिए विशेष रूप से समान Na-Fl पारगंयता मूल्यों vivo माउस BBTB पारगम्यता माप24में के साथ प्राप्त करने के लिए प्रदान करने के लिए लग रहा था । इसलिए, BBTB mimics के प्रदर्शन सीधे बाधा फार्म के लिए इस्तेमाल किया कोशिकाओं की पसंद से जुड़ा होगा । BEND3 endothelial कोशिकाओं मस्तिष्क से उत्पन्न और बाधाओं बनाने में सफल होने के लिए जाना जाता है जब25astrocytes के साथ cocultured. हालांकि, हम अमर हिफको astrocytes26 का उपयोग कर रहा है bbtb नकल उत्पंन । उनके हाइपोक्सिया-inducible कारक की कमी के कारण, इन astrocytes VEGF-एक है, जो BBTB है mimic स्थिरीकरण में quintessential है उत्पादन नहीं यहां वर्णित है । Astrocytes bbb पारगम्यता के नियन्त्रक के रूप में पहचान की गई है, vegf की रिहाई के माध्यम से उदाहरण के लिए-एक neuroinflammation के जवाब में27। संवहनी endothelial वृद्धि कारक रिसेप्टर्स के सक्रियकरण (VEGFRs)28 और vivo29में दोनों विट्रो में endothelial/नाड़ी पारगम्यता का एक महत्वपूर्ण नियामक है । इसलिए, vegf-मध्यम में एक की खुराक endothelial कोशिकाओं पर VEGFR2 सक्रिय है, जो ऐसे VE के रूप में आसंजन जंक्शन प्रोटीन के फॉस्फोरिलेशन लाती-कैधेन30। Endothelial सेल के नुकसान-सेल संपर्कों अत्यधिक पारगम्य रक्त वाहिकाओं उत्पंन करता है । इसी तरह, दोनों मजबूत mitogenic संपत्ति और भ्रूण गोजातीय सीरा सेल संस्कृति assays में इस्तेमाल की अज्ञात संरचना बाधा स्थिरीकरण और परख reproducibility में प्रमुख मुद्दों के कारण ।

मानव नाभि शिरा endothelial कोशिकाओं (HUVECs) कभी-कभार31विट्रो में bbb बनाने के लिए उपयोग किया जाता है; हालांकि, वे काफी मस्तिष्क माइक्रोवाहिकीय endothelial कोशिकाओं से अलग है, जैसे hCMEC/D3 सेल लाइन३२, जीन अभिव्यक्ति और बाधा बनाने संपत्तियों के संदर्भ में । हालांकि, अपेक्षाकृत उच्च पारगम्यता HuAR2T bEND3 की तुलना में अकेले बड़े हो कोशिकाओं के साथ प्राप्त मूल्यों बहुत उंहें मानव प्राथमिक astrocytes के साथ coculturing द्वारा कम किया गया । हालांकि endothelial कोशिकाओं सेलुलर दीवार बनाने के लिए आवश्यक हैं, यह स्पष्ट है कि एस्ट्रोसाइट्स BBTB गठन और स्थिरीकरण के लिए खेलने के लिए एक समान रूप से महत्वपूर्ण भूमिका है ।

जब रोगी व्युत्पन्न तंत्रिकाबंधार्बुद इस समीकरण में जोड़े गए थे, माउस bbtb नकल मस्तिष्क vasculature और ट्यूमर सेल लक्ष्यीकरण के माध्यम से इस तरह के दवा प्रसार के रूप में, म्यूरिन xenografts, की सुविधाओं में से कुछ recapitulated. BBTB mimics यहां चर्चा की थी, उदाहरण के लिए, mirroring में सफल vivo व्यवहार में जब हम विभिंन diameters के साथ कई नैनोकणों की जांच की । विट्रो में और vivo मॉडल के बीच समानता को वर्णन करने के लिए, हम पहले से वर्णित mesoporous सिलिकेट नैनोकणों३३ सेल के साथ-penetrating गुण३४ ट्यूमर को संयुग्मित-लक्ष्यीकरण पेप्टाइड कॉप पर उनके surface20 । कॉप-लक्ष्यीकरण पेप्टाइड के माध्यम से इनवेसिव ट्यूमर कोशिकाओं के लिए विशिष्ट बंधन के माध्यम से mammary-व्युत्पन्न विकास अवरोध (MDGI). Gliomas सहित कई कैंसर, mdgi सामांय ऊतक३५है, जो कॉप एक बहुत ही कुशल ट्यूमर-एक पेलोड20की डिलीवरी बढ़ाने में सक्षम मोइटी को लक्षित करता है की तुलना में overexpressing कर रहे हैं । यहां इस्तेमाल किया नैनोकणों पहले मस्तिष्क पैरेन्काइमा (२७५४७९५५) में फैलाना दिखाया गया है, और जब taxol के साथ functionalized, इन नैनो-cargos पूर्व नैदानिक मॉडल३६में तंत्रिकाबंधार्बुद वृद्धि को कम करने में सफल रहा है । नैनोकणों की सतह पर पॉलीथीन ग्लाइकोल (पीईजी) अवशेषों के अलावा भी सकारात्मक मूल्यों (लगभग + 4 एमवी) के लिए अपने स्थैतिक प्रभार बनाए रखा, neurovascular इकाई३७ के साथ बेहतर संपर्क की अनुमति और भी उनकी स्थिरता में वृद्धि संचलन में । प्रस्तुत आंकड़ों में खूंटी के 3 केडीए को NP110s से संयुग्मित किया गया, जबकि खूंटी के 10 केडीए के साथ NP350s लेपित किया गया । हालांकि, बढ़-आणविक वजन खूंटी भी nanoparticle व्यास में एक महत्वपूर्ण वृद्धि हुई है, इसलिए उनकी शारीरिक क्षमताओं BBB पार करने के लिए । इसलिए, हमने जांच की कि क्या कणों के भौतिक आयामों को BBTB के माध्यम से उनके मार्ग को रोका गया है और क्या इन टिप्पणियों को vivo में प्रतिबिंबित किया जा सकता है ।

पहले प्रकाशित टिप्पणियों के अनुसार, हमने देखा कि NP110s दोनों में bbtb के माध्यम से बहिर्वतित और intracranial ट्यूमर असर चूहों के bbtb, जबकि NP350s bbtb नकल की लुमिनल ओर और रक्त वाहिकाओं में बनाए रखा चूहों. ये इसी तरह के परिणाम दृढ़ता से सुझाव है कि bbtb मॉडल नैनोकणों की vivo क्षमता में bbtb पार और मस्तिष्क तक पहुंचने की भविष्यवाणी की ।

BBB के सेलुलर मॉडलों की प्रासंगिकता पर अक्सर चर्चा की जाती है, यहां तक कि नैनोकणों३८के केंद्रीय वितरण के लिए । हम यहां बताते है कि प्राथमिक astrocytes और endothelial कोशिकाओं, दोनों विट्रो उपकरण में सबसे अधिक प्रासंगिक माना जाता है, अमर और/या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कोशिकाओं द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है, अधिक से अधिक scalability और reproducibility सुनिश्चित करने । इन विट्रो bbb mimics में की अगली पीढ़ी microfluidic उपकरणों को शामिल करके विकसित किया जा सकता है, खूबसूरती से गठन neurovascular इकाइयों कि संरचनात्मक वास्तविक bbb12,14सदृश की अनुमति । तथापि, ऐसे मॉडल वर्तमान में ग्लियोमास को दिए गए अणुओं की उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए अनुपयुक्त हैं, क्योंकि डिलीवरी14के अनुवर्ती में तकनीकी सीमाओं के कारण होती है । यह वास्तव में एक डिश में BBB की शारीरिक जटिलता पर कब्जा मुश्किल है, और कुछ रिसेप्टर्स के संभावित कमी/प्रोटीन, BBB द्वारा व्यक्त करने के लिए जाना जाता है, परिणाम की व्याख्या समझौता सकता है । एक और तर्क vivo और विट्रो शर्तों में के बीच जीन अभिव्यक्ति में महान परिवर्तनशीलता से संबंधित है, साथ ही साथ एक सेल लाइन से दूसरे, विशेष रूप से endothelial कोशिकाओं पर विचार । हालांकि, यह भी तर्क दिया जा सकता है कि neurovascular इकाई मस्तिष्क३९के भीतर एक समान इकाई नहीं है । जीव विज्ञान में वैज्ञानिक अनुसंधान एक मानवीय युग में पहुंच गया है जहां पशु कल्याण, नैतिक जिंमेदारी, और पशु जीवन का उपयोग करने की लागत हमेशा एक प्रयोग डिजाइन करने से पहले माना जाता है । इसलिए, जानवरों के प्रतिस्थापन का समर्थन करने के लिए, हाल के अध्ययनों की बढ़ती संख्या दर्शाती है कि मॉडलों की सीमाओं के बारे में जागरूकता और सेलुलर मॉडलों के सावधान चयन के लिए बाधा स्थापित करने के लिए-astrocytes पर जोर देने के साथ-वारंट एक एक डिश में और पशु मॉडल४०में प्राप्त परिणामों के बीच मैच । यहां वर्णित पद्धति के साथ, हम एक कदम पाने के लिए प्रयोगात्मक संभावित चिकित्सा विज्ञान के लिए BBB transcytosis के प्रयोजनों स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल पशुओं की संख्या को कम करने के करीब ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस शोध को फिनिश कैंसर संगठनों, जेन & ट्स एरको फाउंडेशन, और सिग्ड जुसेलियस फाउंडेशन (P.L. और V.L.J.), स्विस नेशनल साइंस फाउंडेशन (एडवांस्ड पोस्टडॉक) से अनुदान का समर्थन प्राप्त था । गतिशीलता अनुदान सं: P300PB_164732, को एस. के. के.), ओरिऑन रिसर्च फाउंडेशन (एस. एस.), मौद Kuistila मेमोरियल फाउंडेशन (एस. एस.), और फिनलैंड की अकादमी (TERVA २०१७, अनुदान नहीं: ३१४ ४९८) । बायोमेडीकम इमेजिंग यूनिट (हेलसिंकी) माइक्रोस्कोपी इमेजिंग कोर सुविधा प्रदान करने के लिए स्वीकार किया जाता है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells
bEND3 ATCC CRL-2299 Cultured in: DMEM (1g/L glucose) supplemented with 10% FBS, 5 mL L-glutamine and 5 mL penicillin/streptomycin
HIFko immortalized mouse astrocytes Isolated in Dr. Gabriele Bergers Lab https://doi.org/10.1016/S1535-6108(03)00194-6 Cultured in: BME-1 supplemented with 5% FBS, 5 mL 1 M HEPES, 5 mL 100 mM sodium pyruvate, 3 g D-glucose and 5 mL penicillin/streptomycin
HuAR2T Isolated in Dr. Dagmar Wirth Lab https://doi.org/10.1089/ten.tea.2009.0184 Cultured in: EBM-2 with SupplementMix
normal human primary astrocytes Lonza CC-2565 Cultured in: ABM with SingleQuots
Material and reagents
100 mm x17 mm Dish, Nunclon Delta ThermoFisher Scientific 150350
10 mL serological pipet ThermoFisher Scientific 170361
15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 339650
ABM Basal Medium, 500 mL Lonza CC-3187 For primary human astrocytes. ABM+: contains all the additives from the supplement mix. ABM-:all the additives except for rhEGF and FBS
Accutase Cell Detachment Solution Corning 25-058-CI
AGM SingleQuots Supplements and Growth Factors Lonza CC-4123
B27 supplement Gibco 17504-044 for both GBM + and - medium
Basal Medium Eagle ThermoFisher Scientific 21010046 BME-1
Corning Costar TC-Treated 6-Well Plates Sigma-Aldrich CLS3506
Corning Transwell polyester membrane cell culture inserts Sigma-Aldrich CLS3452 
D-glucose Sigma-Aldrich G8270 dissolve in 50 mL of BME-1 and sterile filter before adding to the medium
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient F-12 Ham Gibco 21331-020 Specific to the culture of the patient-derived spheres isolated in our lab, may vary for other glioma cell lines
EBM-2 growth Medium SupplementMix PromoCell c-39216 EBM+: contains all the additives from the supplement mix. EBM-:all the additives except for VEGF-A and FBS
Endothelial Basal Medium 2 (EBM-2) PromoCell c-22211 EBM+: contains all the additives from the supplement mix. EBM-:all the additives except for VEGF-A and FBS
Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin ThermoFisher Scientific 10500056
Fluorescein sodium salt Sigma-Aldrich F6377
Greiner CELLSTAR 96 well plates Sigma-Aldrich Greiner 655090 black polystyrene wells flat bottom (with micro-clear bottom)
Menzel-Gläser 0.9 cm round borosilicate Cover Slips Thermo Scientific 10313573
PBS tablets Medicago 09-9400-100 one tablet per liter of dH2O, then sterilize the solution by autoclaving
Poly-D-lysine hydrobromide Sigma-Aldrich P6407 
Recombinant Human EGF Peprotech GMP100-15 for GBM+ medium
Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) Peprotech 100-18B for GBM+ medium
Immunofluorescence
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
24 mm x 60 mm microscope slide cover glass ORSAtec 0224601-D
AlexaFluor 488 and 594 secondary antibodies ThermoFisher Scientific dilution: 1/500
Anti-Claudin-5 antibody Abcam ab15106 dilution: 1/150
Anti-GFAP antibody clone GF5 Abcam ab10062 dilution: 1/150
Anti-Mouse CD31 antibody Clone MEC 13.3 BD Biosciences 550274 dilution 1/800
Anti-SV40 T-antigen antibody Abcam ab16879 dilution: 1/150
Anti-Zonula Occludens-1 Abcam ab96587 dilution: 1/200
DAPI TOCRIS 5748
Fluoromount Aqueous Mounting Medium  Sigma-Aldrich F4680
LysoTracker Red DND-99 ThermoFisher Scientific L7528
Animal procedures
10 cm curved dissecting scissors World Precision Instruments 14394
BD Microlance 25 G needles Becton Dickinson 300600
Fine Forceps (12.5 cm) World Precision Instruments 503283 for tissue dissociation
Intramedic Polyethylene tubing PE20 Becton Dickinson 427406
Ketaminol vet 50 mg/mL Intervet Vnr511485 Ketamine
Mains Powered microdrill World Precision Instruments 503599
Menzel-Gläser 0.5 cm round borosilicate Cover Slips Thermo Scientific 11888372
Micro Bulldog clamp World Precision Instruments 14119
Physiological saline solution Mustela Sterile single dose vials 20 x 5 mL / 40 x 5 mL - Medical device class
Rochester-Oschner forceps World Precision Instruments 501709
Rompun vet 20 mg/mL Intervet Vnr148999 Xylazine
Stereotaxic adapter World Precision Instruments 502063
Sugi Sponge Points Kettenbach 31603
Equipment
Axio Zoom.V16 fluorescence stereo zoom microscope  Carl Zeiss
FLUOstar Omega microplate reader BMG Labtech
ORCA-Flash 4.0 digital sCMOS camera Hamamatsu Photonics
Universal 320 tabletop centrifuge  Hettich Cat. No. 1401
ZEISS LSM 880 with Airyscan confocal microscope Carl Zeiss

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Le Joncour, V., Karaman, S.,… More

Le Joncour, V., Karaman, S., Laakkonen, P. M. Predicting In Vivo Payloads Delivery using a Blood-brain Tumor-barrier in a Dish. J. Vis. Exp. (146), e59384, doi:10.3791/59384 (2019).

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