Summary
마약 중추 신 경계 종양을 대상으로 하는 것은 주요 도전 이다. 여기는 murine 및 인간의 세포를 사용 하 여 혈액 뇌종양 장벽의 생체 모방을 생산 하 고 중추 신 경계 종양 vivo에서 대상의 예측 가능성에 대 한 그들의 관련성을 토론 하는 프로토콜에 설명 합니다.
Abstract
매우 자연에 의해 선택, 혈액-뇌 장벽 (BBB)은 생리 적인 조건에서 두뇌 항상성 필수적입니다. 그러나, 뇌 종양의 맥락에서 BBB의 분자 선택도 또한 보호 종양 약 셀 주변 관리 chemotherapies의 납품을 차단 하 여 한다. 이상적으로 악성 뇌 종양을 대상으로 하는 소설 약물 (포함 나노 입자)의 개발 의약품의 transcytosis antitumor 효능을 공부 하 고 전 임상 동물 모델의 사용을 해야 합니다. 3R 원칙에 따르기 위해 (수정, 그리고 대체) 우리 재현 생체 외에서 인간을 개발 하는 실험 설정에서 실험 동물의 수를 줄이기 위해 antitumor 에이전트의 큰 도서관의 높은 처리량 검열을 수행 하 고 혈액-뇌 종양 방 벽 (BBTB)의 murine 모방 내 피 세포, 이다, 및 세포종 환자-파생 분야의 문화 3 층을 사용 하 여. 높은 확장성 및 재현성, 상업 세포 선 또는 불멸 하 게 셀 사용 되었습니다 맞춤형된 조건에서 실제 BBB를 닮은 방 벽의 대형을 허용 하도록. 여기는 삽입에 특정 세포 조밀도에서 이다 접촉 내 피 세포를 배양 하 여 BBTB 모방을 프로토콜에 설명 합니다. 이 BBTB 모방 사용할 수 있습니다, 예를 들어, 정량화 및 동일한 분석 결과 내에서 타겟팅 하는 종양 세포의 평가 뿐만 아니라, 내 피 및 astrocytic 장벽을 통해 나노 통로의 confocal 영상. 또한, 우리는 전 임상 동물 모델에서 나노 입자의 행동을 예측 하는 얻은 데이터를 사용할 수 있습니다 보여줍니다. 광범위 한 관점에서이 체 외 모델 BBB 통해 새로운 치료 분자의 통과의 결정에 대 한 다른 신경 퇴행 성 질환에 적응 될 수 및 직접의 효능을 평가 하기 위해 뇌 organoids로 보충 마약입니다.
Introduction
혈관 단위는 뉴런, 이다, 그리고 pericytes, 이다, 내 피 세포, 두뇌 microvasculature1형성 관련된 지하실 막 간의 복잡 한 연결에 의해 형성 된 BBB의 구성입니다. 연속, nonfenestrated 배에 의해 가늘게 형성이 꽉 세포 벽 세포1순환의 뿐만 아니라 이온 및 분자 (를 포함 하 여 호르몬, 영양분, 또는 약물)의 움직임을 통제 한다. 치료 항 체, 약물 어원이 같은 말, 또는 nanocompounds와 같은 높은 분자 무게 분자의 BBB 통해 특히 낮은 transcytosis 극적으로 제한 하는 등 악성 신경 질환에 대 한 신약에서 발전 gliomas2. 실제로, 구두로 또는 정 맥으로 전달된 chemotherapies antitumor 효과 유도 하기 위해 부적당 하 게 낮은 농도에서 종종 뇌 실질에 도달 또는 단순히 종양 약 셀3에 도달 BBTB 교차 수 있습니다. 여러 전 임상 및 임상 연구 BBTB 침투의 문제 처리 하지는 하지만 집중된 초음파4,5을 사용 하 여 예는 BBTB 정도, 방해 하거나 현장에서 직접에 의해 그것을 우회 시도 약6의 납품입니다. 그러나, 이러한 기술의 아무도 피할 수 없는 종양 확장을 중화 또는 재발을 수 있었다. 따라서, 소설 antiglioma 치료를 개발할 때 치료제7의 성공적인 전달에 대 한 중요 한 측면 중 하나는 BBTB 통해 유포를 고려 한다.
BBTB 내 세포 상호 작용의 매우 복잡 한 특성상, vivo에서 연구 실험실 동물에 뇌에 혈액에서 분자의 통로 공부를 할 때 분명 한 선택이 될 것 같다. 그러나, 대규모 vivo에서 메서드는 상대적으로 복잡 한 설정 하 고, 따라서 허용 하지 않습니다 적절 한 시간에 분자의 높은 처리량 검열 합리적인 비용. 심지어 더 중요 한 것은, 동물 실험 i) 구체화로 정의 3R 윤리 지침에 따라, ii), 그리고, 현재 컨텍스트에 관련성, iii) 대체 대체 프로토콜 (예: 체 외/철 방법) 있다. 따라서, 생체 외에서 BBTB를 재현 한 흥미롭고 매력적인 가능성으로 나타나지만 그것은 또한 다양 한 한계에 의해 도전 하는 복잡 한 작업을 구성. 많은 교양된 1 차 셀 또는 셀 라인 개, 돼지, murine, 그리고 심지어 인간의 기원 (로 라만 외.8 과 헬 름 외.9의 검토) 게시 된에서이 복잡 한 구획을 다시 하려고 합니다. 이러한 모델을 3 차원 미세 시스템10, BBB-칩11,12, 포함 고 변종에 클래식 공동 문화에 따라 수많은 시스템을 삽입 합니다. 그럼에도 불구 하 고, 현재 미세 칩 시스템 중 하지는 급속 한, 높은 처리량의 약물 유효성 검사 연구13,14 또는 현재 연구와 호환 되지 않는 뇌 종양 약물 전달의 적합. 또한, 일차 전지, 유도할 수 있는 만능 줄기 세포 (iPSC), 또는 상업 셀 라인을 사용 하 여 155 게시 된 모델의 검토 모든 공동 경작된에 삽입 그들의 측정 및 결론8interstudy 불일치에 대 한 추세를 보였다. 연구실 재현성이 부족 수와 상관 될 i) 정규화 되지 않은 문화 조건, 예를 들어 셀 문화 선박, subculture 및 사용의 증가 수 ii)는 지하실 멤브레인 매트릭스 단백질 선택 코팅 포함 하는 혈 청의 미디어, 셀 라인15또는 iii의 유전 그리고 phenotypic 수정의 주요 드라이버 모두) reproducibly astroglial와 접시에 내 피 구성 요소 간의 올바른 균형을 재현 하는 데 어려움. 우리 불멸 하 게 셀 또는 상업적인 셀을 사용 하 여 생체 외에서 BBB 모델 부족만 1 차 셀을 사용 하는 비슷한 모델에 비해 속성의 일부 설정 라인, 비록 설명 방법에서의 적절 한 조합을 전시 세포 표시는 매우 유사한 성능을 참조16,17의 다른 모델에 연구 출판. 결국, 연구 대상으로 BBTB 통해 뇌종양 치료 화합물의 통과를 강력 하 고 재현할 수 모델의 부족 여기에 설명 된 방법을 개발 하는 우리 동기.
목표는 전 임상 동물 모델에서 나노 입자의 생체 조건 납품을 예측 하는 모델을 사용 했다, 이후 우리가 먼저 murine 이다 접촉 murine 내 피 세포를 포함 하는 삽입을 이용 하 여 BBTB 모델 검증. 이것 이외에, 우리는 또한 특정 인간의 세포 라인을 사용 하도록 모델 최적화. 안정, 일단 세포 장벽은 세포종 환자에서 파생 된 분야 또는 상업적인 glioma 셀 라인 문화에 전송 됩니다. 그 후, 나노 입자 및 종양 세포를 대상으로 transcytosis confocal 현미경 검사 법에 의해 시각 하 고 시간 동안 샘플을 수집 하 여 정량 될 수 있습니다. 중요 한 것은, BBTB 모방을 사용 하 여 얻은 결과 안정적으로 예측할 수 vivo에서, BBTB 모방 전에의 사용을 지 원하는 나노 입자의 동작 전 임상 유효성 검사.
Protocol
동물 실험 동물 실험 지구의 남쪽 핀란드 (ESAVI/6285/04.10.07/2014)의 위원회에 의해 승인 되었다.
1입니다. BBTB 모방의 설립
참고: 세포 배양 매체와 보충 자료의 테이블에 자세히 나와 있습니다.
- 이다의 준비
참고: 다음 볼륨은 10 cm 배양 접시 또는 T75 셀 문화 술병에 적합 합니다.- 살 균 세포 문화 후드 신중 하 게 씻는 다 5 mL의 멸 균 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)와 교양된 이다. 부드럽게 진공 펌프를 사용 하 여 PBS를 삭제 하 고 셀 분리 시 약 5 분의 2 개 mL를 추가 (37 °C, 테이블의 자료를 참조 하십시오) 세포를 분리. 현미경 세포 분리를 확인 합니다. 셀에 대 한 스트레스를 제한 하는 외피의 5 분을 초과 하지 마십시오.
- 셀 분리 시 약의 활동을 억제 하기 위해 선박에 메 마른 완전 한 사이토 세포 배양 매체 (ABM +) 10 mL를 추가 합니다. 살 균 혈 청 학적인 피펫으로 사용 하 여 살 균 15 mL 튜브에 선박에서 분리 된 세포를 전송. 3 분 250 rcf에 세포 현 탁 액을 원심 (가속: 9 rcf/s, 감속: rcf/s) 실 온 (RT)에서.
- 한편, 준비 ( 재료의 표참조) 삽입: 소독 집게를 사용 하 여 살 균 6 잘 플레이트 (그림 1B)의 뚜껑 위에 뇌 쪽 (그림 1A)와 삽입. 그는 접시에 배치 될 수 거꾸로 삽입 만지거나 삽입 과정에서 이동 하지 않고 미리 확인 합니다.
참고: 삽입의 적절 한 배치 수 있습니다 사이토 서 스 펜 션의 함정 사이 막 우물의 바닥. - Centrifuged, 일단 신중 하 게 세포 현 탁 액;에서 상쾌한 삭제 사이토 펠 릿 resuspend 1 mL에 ABM + 부드럽게 펠 릿 튜브'에 resuspending에 의해 s 최대 5 배 벽. 셀에 대 한 스트레스를 제한 하는 세포의 과도 한 pipetting 하지 마십시오. 셀을 계산 하 고 1.5 ABM의 400 µ L 105 셀 x 셀 서 스 펜 션 밀도 조정 + 삽입.
- 삽입'의 뇌 쪽의 한가운데에 세포 현 탁 액 배치 s 막 (그림 1B) 하 고, 매우 신중 하 게, 살 균 피펫으로 팁 모 세관 힘을 사용 하 여 그것을 확산. 특히 허약한 막으로 직접 접촉을 하지 마십시오.
- 삽입의 뇌 쪽으로 여전히 최대, 삽입에 다시 6-잘 접시를 놓습니다. 그러면 세포 현 탁 액 막과 우물 (그림 1C)의 실제 바닥 사이 갇혀 있다. 그것은 멤브레인에 이다 균질 확산을 방지할 것 이다 세포 현 탁 액에 공기 방울을 피하십시오.
- 인큐베이터에 접시와 두뇌 측면 삽입, 배치 (37 °C 5 %CO2) (인간의 기본 이다)에 최소 2 h (murine 불멸 하 게 이다) 그리고 h 6까지 세포의 접착을 허용 하도록.
참고: 삽입 거꾸로 유지, 세포 접착의 시각화 현미경 수는 없습니다. 그것은, 따라서, 별도 일반 셀 문화 배 씨는 용기에 세포 접착 시간 제어 하는 것이 좋습니다. 결과 신뢰할 수 없을 때 세포 막 손상으로 막의 신중한 조작 해야 합니다. - 보육 시간의 끝에, 시드 영역 외부 세포 현 탁 액 누출의 부재를 확인 하 고 만약 그들이 새 삽입 삭제. 6 잘 플레이트 삽입 이제 혈액 쪽 (그림 1A)는 것과 일반 위치로 되돌립니다. 각 우물에 ABM + 2.6 mL를 추가 합니다. 각 삽입 완료 사이토 매체의 2.5 mL를 붓고 고 인큐베이터에 접시 (37 °C 5 %CO2).
- 내 피 세포의 준비
참고: Murine 뇌 microvascular 내 피 세포 (bEND3)에 대 한 셀 최대 셀 연락처 실험 당일 최적의 꽉 접합 단백질 표정 트리거링 되도록 100% 합류를 도달 해야 한다. 이 이다의 존재는이 셀에 대 한 꽉 접합 단백질 표정에 필요한 인간의 탯 줄 정 맥 내 피 세포 (HuAR2T)에 대 한 적용 되지 않습니다.- 앞에서 설명한 이다 (단계 1.1.1와 1.1.2.)에 대 한 진행 합니다. Centrifuged, 일단 신중 하 게 버리고 상쾌한; 내 피 세포 펠 릿 resuspend 천천히'튜브에 세포 현 탁 액 pipetting으로 완전 한 내 피 세포 배양 매체 (EBM +) 1 mL에 s 최대 5 배 벽. 셀에 대 한 스트레스를 제한 하는 세포의 과도 한 pipetting 하지 마십시오. 셀의 개수와 2.5 mL에 2 x 105 셀에 셀 서 스 펜 션 밀도 조정/세럼 (EBM-)과 혈관 내 피 성장 인자 없는 내 피 세포 배양 매체의 삽입-(VEGF-A).
- 삽입을 포함 하는 접시 밖으로 가십시오, 신중 하 게 혈액에서 매체를 삭제 하 고 내 피 세포 현 탁 액의 2.5 mL와 함께 그것을 대체. 인큐베이터에 접시를 반환 (37 °C 5 %CO2) 하룻밤 사이에 막 내 피 세포에 대 한 그것을 두고.
- 다음 날, prewarmed 혈 청 무료 사이토 매체 (ABM-)의 3 mL을 각 영역 전송 하 여 살 균 6-잘 접시를 준비 합니다. 소독 집게와 삽입을 처리 하 여 신중 하 게 혈액 쪽에서 내 피 완전 한 매체를 삭제, 삽입 포함 ABM-새로운 접시에 놓고의 EBM-2.5 mL를 추가 합니다.
참고: EBM-의 사용은 내 피 방 벽의 설립에 대 한 중요 한 (토론 섹션을 참고 하십시오). - 인큐베이터에는 삽입을 두고 (37 °C 5 %CO2) 사이토와 함께 연결 하는 최소한의 물리적 장애 및 내 피 지하실 막의 생산을 허용, 5 일에 대 한 온도 변화 내 피 세포, 그리고 결국,는 BBTB 형성을 모방. 매체 glioma 세포 배양에 전송의 하루에 교체 (섹션 1.4 참조 하십시오).
- (선택 사항) BBTB 모방 투과율의 측정
- 삽입의 뇌 쪽으로 혈액에서 시간이 지남에 작은 분자 무게 형광 염료-fluorescein 나트륨 (Na-플로리다)의 수동 확산 다음 공식에 따라 침투성 값의 계산을 허용 한다:
여기, dF잘형광 값에 특정 시간 세포 배양 매체 autofluorescence 값을 뺀 시점에서 잘 측정, dT 는 시간 (초), A 는 평방 센티미터, 그리고 에 방 벽의 표면 dF삽입 형광 값 삽입 중간 autofluorescence 값을 뺀 같은 시간 지점에서 측정). - 피와 BBTB 모방의 두뇌 측면에서 매체의 100 µ L를 수집 하 고 후속 형광 측정에 대 한 별도 바닥, 블랙 96 잘 접시에 그들의 각각을 전송. autofluorescence를 해결 하기 위해 빈으로 일반 미디어를 사용 합니다.
- 준비 나 플로리다의 당 2.5 mL (50 µ M)에서 EBM-. 37 ° c 나 플로리다 솔루션 prewarm 삽입의 혈액에서에서 미디어를 포함 하는 미디어 나 층 시작 타이머 마자 매체 교체로 바꿉니다.
- 조심 스럽게 피 고 5, 30, 60, 삽입의 두뇌 측면에서 미디어의 100 µ L를 수집 하 고 120 분 검은 96 잘 접시의 우물을 각 샘플을 전송.
- 이 따라 양측 간의 볼륨 균형을 유지 하기 위해 삽입에서 수집 된 미디어 교체 합니다. 온도 변화를 최소화 하기 위해 각 샘플 컬렉션 간에 인큐베이터에 다시 삽입을 놓습니다.
- 480/560에 설정 필터 플레이트 리더를 사용 하 여 수집 된 샘플에서 형광을 계량 nm (여기 및 방출, 각각).
참고: 뇌 쪽에서 형광 5 분 시간 지점에서 거의 감지 되지 않습니다. 빈에 비해 높은 값의 누출을 나타냅니다 /'삽입을 손상 s 막 또는 장벽; 따라서, 이러한 추가 분석에서 제외 합니다. BBTB에 대 한 예상된 나 플로리다 침투성 값 10-5 10-6 c m/s 범위 (표 1)에 있어야 합니다.
- 삽입의 뇌 쪽으로 혈액에서 시간이 지남에 작은 분자 무게 형광 염료-fluorescein 나트륨 (Na-플로리다)의 수동 확산 다음 공식에 따라 침투성 값의 계산을 허용 한다:
- Glioma 셀의 준비
참고: 세포종 환자에서 파생 된 분야는 여기 사용 됩니다, 있지만 다음 프로토콜 부착, 상용 세포종 세포 등 U-87 밀리 그램에 대 한 쉽게 적용할 수 있습니다.- 필요한 경우, 면역 형광 이미징, 최대 4 개의 라운드 불 임 붕 coverslips 장소 (ø 0.9 cm) 폴 리-D-리 (0.01%)의 2 개 mL를 포함 하는 6-잘 접시에 잘 당. 30 분 동안 실 온에서 품 어.
- 한편, 신중 하 게 종양 분야에서에서 전송할 셀 문화 배 살 균 혈 청 학적인 피펫으로 사용 하 여 15 mL 무 균 튜브에. 종양 분야 250 rcf에 3 분 동안 원심
- 삭제는 상쾌한, 부드럽게 bFGF/EGF 무료 (GBM) glioma 셀 매체의 1 mL에 구체를 resuspend 하 고는 셀. 약 104 분야/ml (105 셀/mL)에 GBM-셀 밀도 조정 합니다.
- 우물에서 폴 리 D lysine을 무시 하 고 그들을 씻어 살 균 PBS 가진 3 배. 시드 3 mL/종양 회전 타원 체 서 스 펜 션의 플레이트와 종양 세포 현 탁 액에 BBB 모방으로 삽입 전송.
- 밤새 품 어 (37 °C 5 %CO2)는 혈액과 뇌 사이의 평형 분석 결과의 종양 측면 있도록. 다음 날에서 EBM-관심의 분자/마약/나노 보충 혈액 측면에서 미디어를 바꿉니다. 이전 섹션에 설명 된 대로 샘플 직접 정량화에 대 한 시간이 지남에 수집 됩니다. 셀 형광 이미징에 대 한 정확한 시간에 고정 (2.1과 2.2 절을 참조 하십시오).
2.는 BBTB의 고해상도 Confocal 영상
참고: 4 %paraformaldehyde (PFA, pH 7.4, BBTB 복제 당 6 mL) PBS에 신선한 준비가 항상 되어 있습니다. 얼음에 그것을 유지.
주의: PFA는 발암 성. 니트 릴 글러브를 사용 하 여 처리 PFA 화학 증기 두건에서 솔루션을 준비 하.
-
꽉 접합 단백질의 BBTB 내 피 식
- 얼음 처럼 차가운 PBS 가진 막의 양쪽 린스 (3 x 5 분, 2.5 ml/삽입, 3 mL/음). PBS를 삭제 하 고 3 mL 및 얼음 4%의 2.5 mL 추가 PFA 우물 및 삽입, 각각. 10 분 삭제는 PFA ice에 품 어 ('기관에 따르면 s 유해 화학 처리) RT (2.5 mL/삽입, 3 mL/음)에 PBS 가진 3 배를 씻어.
참고: 일단 고정, 샘플 저장할 수 있습니다 (2.5 mL/삽입, 3 mL/잘) PBS에 4 °C에서 1 주일에 대 한. - 면봉을 사용 하 여 삽입의 두뇌 측면을 닦 고 제거는 이다. 두 개의 수직 컷, 십자가 형성 하 여 4 개의 동등한 조각으로 막을 잘라 신중 하 게 날카로운 메스를 사용 하 여. 다음, 막 삽입 벽에 연결 된 지점에서 메스를 삽입 하 고 회전 하는 4 개의 샘플을 해방 하는 다른 한 손으로 삽입. 24-잘 접시 200 µ L의 PBS/잘 각 잘에서 혈액 쪽으로 포함 된 각 샘플 전송 신중 하 게 좋은 족집게를 사용 하 여.
- 10% 태아 둔감 한 혈 청 PBS에서 (대 한 실시간, 200 µ L/우물에서 30 분)와 막 차단 합니다. 단백질 (그림 1D) 꽉 접합의 immunostaining에 대 한 1° 항 체 솔루션을 준비 (zonula occludens-1, claudin-5; 테이블의 자료를 참조 하십시오) 솔루션/잘 차단의 200 µ L에서. 필요한 경우, 내 피 세포 정체성 혈소판 내 피 성장 세포 접착 분자 (PECAM1 또는 CD31; 테이블의 자료를 참조 하십시오)에 대 한 각 꽉 접합 항 체 솔루션을 제기 하는 항 체를 추가 하 여 확인 됩니다. 차단 솔루션을 삭제 하 고 기본 항 체' O/N 4 °c.에서 함께 품 어
- 다음 날, 1 차 항 체를 삭제 하 고 PBS의 200 µ L로 씻 (3 배 RT에서 5 분). 적절 한 종의 fluorophore 활용 된 이차 항 체와 그들을 품 어 (1: 500 희석, 200 µ L/잘 차단 솔루션에 희석; 테이블의 자료를 참조 하십시오) 실시간에서 2 h
- 2 차 항 체, PBS의 200 µ L 린스 (3 배 RT에서 5 분). PBS를 제거 하 고는 4', 1 μg/mL의 순수 증류수 H2O (dH2O; 200 µ L/잘; 테이블의 자료를 참조 하십시오 최종 농도에서 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 솔루션을 사용 하 여 셀 핵 counterstain ). DAPI에서 실시간 제거에서 7 분 동안 품 어 고 막 3 세척 dH2O와 x (200 µ L/잘).
- 설치 매체의 드롭 장소 ( 테이블의 자료를 참조) 유리 현미경 슬라이드에서. 고급 핀셋을 사용 하 여, 신중 하 게 잘 막 꺼내 고 방향을 유지, dH2O의 초과 제거 하 고 설치 매체의 드롭에. 막 위에 장착 매체의 또 다른 방울을 추가 하 고 신중 하 게 커버는 커버 글라스와. 없는 봉된 기포 확인 합니다. Confocal 현미경 관찰까지 4 °C에서 그리고 멀리 빛 샘플을 저장 합니다.
참고: 사이토 얼룩이 24-잘 접시 선택한 사이토 특정 항 체의 사용과, 두뇌 쪽에에서 막의 조각을 배치 하 여 수행할 수 있습니다 (예: 폐해 fibrillary 산 성 단백질 [GFAP]에 대 한 감독) (그림 1E ).
- 얼음 처럼 차가운 PBS 가진 막의 양쪽 린스 (3 x 5 분, 2.5 ml/삽입, 3 mL/음). PBS를 삭제 하 고 3 mL 및 얼음 4%의 2.5 mL 추가 PFA 우물 및 삽입, 각각. 10 분 삭제는 PFA ice에 품 어 ('기관에 따르면 s 유해 화학 처리) RT (2.5 mL/삽입, 3 mL/음)에 PBS 가진 3 배를 씻어.
-
BBTB 형광 나노 transcytosis를 검출 하기 위하여 얼룩
- 라이브 셀 리소좀 라벨을 수행 (예: 형광등을 사용 하 여 조사 [ 테이블의 자료를 참조]). 50의 작업 농도에서 리소좀 형광 염료 희석 prewarmed EBM-nM (2.5 mL/삽입) 또는 prewarmed ABM-75 m m (3 mL/음)는 리소좀에 대 한 이다, 내 피 세포의 각각 라벨. 45 분에 대 한 셀을 품 어 (37 °C 5 %CO2); 다음, 얼음 처럼 차가운 PBS (2.5 mL/삽입, 3 mL/잘)를 가진 3 배 린스.
- PBS를 삭제 하 고 3 mL 및 얼음 4%의 2.5 mL 추가 PFA는 잘 하 고 삽입, 각각. PFA 10 분 삭제에 대 한 얼음에 그들을 품 어 및 3 셀 린스 (RT, 2.5 mL/삽입, 3 mL/음)에 PBS 가진 x.
참고: 일단 고정, 샘플 수 저장 PBS (2.5 mL/삽입, 3 mL/음)에 4 ° C에서 1 주일에 대 한. - PBS를 제거 하 고 세포 핵 (1 mL/삽입, 1 mL/잘) dH2O 1 µ g/mL의 최종 농도에 DAPI 솔루션을 사용 하 여 counterstain. DAPI에서 실시간 제거에서 7 분 동안 그들을 품 어 고 막 3 세척 dH2O (2.5 mL/삽입, 3 mL/잘) x.
- 신중 하 게 막 잘라, dH2O, 초과 제거 하 고 설치 매체의 한 방울에 ( 재료의 표참조) 유리 현미경 슬라이드에서. 막의 반대편에 장착 매체의 또 다른 방울을 추가 하 고 신중 하 게 커버는 커버 글라스와. 봉된 공기 방울을 피하십시오. 4 °C에서 샘플을 저장 하 고 confocal 현미경 이미징까지 빛 으로부터 보호 유지.
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형광 종양 세포의 얼룩
- 고급 핀셋을 사용 하 여 신중 하 게 얼음 처럼 차가운 PBS 가득 24-잘 접시에 종양 분야를 포함 하는 라운드 coverslips 전송. 라이브 셀 리소좀 75에서 형광 리소좀 프로브를 사용 하 여 라벨 진행 prewarmed GBM-nM (200 µ L/잘). 45 분;에 대 한 샘플을 품 어 다음, 그들을 씻어 얼음 처럼 차가운 PBS 가진 3 배 (200 µ L/잘).
- PBS를 무시 하 고 잘 당 차가운 PFA의 200 µ L를 추가 합니다. 10 분 삭제는 PFA ice에 품 어와 린스 샘플 3 (RT)에 PBS 가진 x.
참고: 일단 고정, 샘플 PBS에 저장할 수 있습니다 (200 µ L) 일주일에 4 ° C에서. - PBS를 제거 하 고 세포 핵 dH2O 1 µ g/mL의 최종 농도에 DAPI 솔루션을 사용 하 여 counterstain (200 µ L/잘). DAPI에서 실시간 제거에서 7 분 동안 그들을 품 어와 coverslips 3 세척 dH2O와 x (200 µ L/잘).
- coverslip 꺼내 dH2O, 초과 제거 하 고 설치 매체의 한 방울에 정밀한 핀셋을 사용 하 여 참조 테이블의 재료유리 현미경 슬라이드에서. 어떤 기포 entrapping 하지 마십시오. 4 °C에서 샘플을 저장 하 고 confocal 현미경 관찰까지 빛 으로부터 보호 유지.
3. Vivo에서 비교 연구
- BBB 통해 나트륨 fluorescein 유포의 현장에서 녹음
- 150 µ L 생리 솔루션에 50 nM 나 플로리다 솔루션의 준비. 37 °C 정 맥 배달 시에 솔루션을 유지.
- 케 타 민/xylazine 칵테일 (PBS에 100 mg/kg 케 타 민 고 10 mg/kg xylazine의 300 µ L)의 복 주사와 마우스 anesthetize 깊은 마 취 설정 되 면 동물 그것의 체온을 유지 하기 위해 난방 패드를 놓습니다.
참고: 10 주 오래 된 여성 건 함 의료 연구 연구소 (NMRI) 누드 immunocompromised 쥐 그림 2에 표시 하는 데이터를 가져오는 데 사용 되었습니다. 그러나,이 프로토콜은 immunocompetent와 immunocompromised 마우스에 적응. 마 취/무 통 방법은 과학자'에 s 재량. 그러나, 그것은 크게 증가 함에 따라 BBB 침투성18isoflurane 같은 흡입 마 취 권장 하지 않습니다. - Stereotaxic 프레임에 마우스를 놓고 ( 재료의 표참조) 좋은 위, 결합 조직, 두개골을 정밀한 핀셋을 사용 하 여 부드러운 dilacerations 뒤 피의 세로 절 개를 수행. 왼쪽 또는 오른쪽 정수 리 뼈에서 두개골의 ø 0.3 m m 원형 조각 제거 원형 움직임 좋은 microdrill를 사용 하. 훈련 하는 동안, 그리고 기본 meningeal 조직과 혈관 부상 피하려고 두개골 조각을 제거 하는 동안 극단주의 함께 진행.
- 노출 된 조직에 생리 적 솔루션의 한 방울을 놓습니다. 두 켤레 미세 집게를 사용 하 여 조심 스럽게 뇌 피 질에 액세스 하려면 meningeal 조직 제거. 뇌 조직의 공기 직접 접촉에 않을 것입니다.
참고: 작은 출혈 meningeal 부상에서 혈액 스폰지를 사용 하 여 중지 할 수 있습니다 ( 테이블의 자료를 참조 하십시오). - 일단 meningeal 조직을 제거 하 고 피 질 완전히 노출, 피 질과 ø 0.5 m m 붕 coverslip 사이 생리 적인 솔루션의 한 방울을 모 함. Cyanoacrylate 접착제의 방울으로 관찰 영역을 확보 ( 테이블의 자료를 참조 하십시오) 바늘으로는 coverslip 주위에 확산. 하자 1 분 동안 건조 접착제.
- 꼬리 정 맥 주입 (그림 2A)에 대 한 매 카 테 터를 준비 합니다. 로체스터 Ochsner 집게를 사용 하 여 25 G 바늘의 팁 휴식과 팁 10 cm 긴 PE20 폴리우레탄 튜브에 삽입 ( 테이블의 자료를 참조 하십시오) (그림 2A).
- 불독 클램프를 사용 하 여 카 테 터 조작 및 삽입에 대 한 마우스의 측면 꼬리 정 맥에 카 테 터를 삽입 ( 테이블의 자료를 참조 하십시오) (그림 2B). 보안 cyanoacrylate 접착제 한 방울과 함께 삽입 된 바늘. 하자 20 건조 접착제 불독 클램프를 제거 하기 전에 s. 조심 스럽게 나 플로리다 솔루션 (그림 2B)를 포함 하는 주사기에 연결 25 G 바늘에 테의 다른 쪽 끝을 연결 합니다.
- 참고: 불독 클램프;와 꼬리를 클램프 하지 마십시오 또한 정확한 테 처리에만 사용 됩니다. 적절 한 카 테 터 삽입은 투명 한 튜브에 혈액 역류에 의해 확인할 수 있습니다.
- 장소는 stereomicroscope에서 동물 ( 재료의 표참조). 녹색 채널에 낮은 수준의 autofluorescence를 사용 하 여 (480 nm), (그들은이 파장에 빛의 헤모글로빈 흡수로 인해 어두운 표시) 비교적 큰 혈관과 작은 모세 혈관 (그림 2C)를 포함 하는 지역에 초점. 배경 형광의 측정을 형광 염료를 주입 하기 전에 간단히 시간 경과 수집을 시작 합니다.
참고: 또한, 시간 경과 기록 T0에서 스냅숏 그림으로 대체 될 수 있습니다 및 어떤 다른 시간 포인트를 미리. - 느리고 지속적인 속도로 솔루션을 주입 하거나 또는 자동된 주입 시스템을 사용 하 여. 혈액에서 감지 나 플로리다 형광 안정적으로 유지 한다 (혈액에서 하프 라이프: 286 분), 몇 분 동안 두개골 창을 통해 BBB 확산의 녹음을 수 있는. 인수 완료 되 면 신중 하 게 카 테 터를 제거 하 고 자 궁 경부 전위에 의해 동물 안락사.
- BBB 침투성의 생체 조건 결정
참고: 값 (ROI)의 사용자 지정 영역 내 형광 신호 강도 측정을 수 있도록 ImageJ, 등 어떤 이미지 처리 소프트웨어에서 가져옵니다.- 뇌 조직에서 혈관, 외부 사각형 모양의 ROI를 그리기 주석 도구를 사용 하 여, 약 5 µ m에서 어떤 눈에 보이는 혈관에서 거리 가득한 나 층 참고 수익과 그 수익에 (T0)에서 측정 된 형광 강도의 크기는 사용 됩니다 빈 조직's autofluorescence. 투자 수익을 전치 하지 않고 postinjection 시간 (예를 들어, 마지막 기록 된 프레임 전체 솔루션은 동물에 주입 되어 때) 하 고 투자 수익 (그림 2C) 내에서 측정 된 정확한 시간 및 형광 값을 참고 빨리.
- 보이는 혈관 (그림 2C)에 투자 수익을 이동 하 고 혈액에서 T0 autofluorescence 값. 3.2.1 단계에서 정의 된 투자 수익을 전치 하지 않고 같은 시간 지점으로 빨리. 그리고 형광 값 ROI (그림 2C) 내에서 측정 하는 참고.
- 다음 수식 (단면도 1.3에서 적응)를 사용 하 여 BBB 침투성을 결정.
- 여기, dF두뇌 는 두뇌에 T0 빈 값을 뺀 형광 강도 값 dT 수집 시간 포인트 초에서, A는 평방 센티미터, 그리고 에 투자 수익 영역으로 대략적인 선박 표면적 dF 혈액 혈액에 T0 빈 값을 뺀 형광 강도 값이입니다.
참고: BBB에 대 한 예상된 침투성 값 (표 1) 10-6 c m/s 범위에 있어야 합니다.
- 조직 murine 뇌에 형광 나노 입자의 검출에 대 한 처리
- 마 취 6 주 된 여성 NMRI 누드 생쥐에서 신체 callosum에 세포종 환자에서 파생 된 분야 (살 균 PBS의 5 µ L에서 5 x 104 세포)를 이식. 이 두뇌 지구는 Bregma에서 시작 다음 stereotaxic 좌표를 찾습니다: anteroposterior + 0.5 m m, 왼쪽 오른쪽 + 2.5 m m, dorsoventral + 3 m m. 2 주 동안 성장 뇌종양 허용.
- 나노 입자를 정 맥 주사 (무 균 생리 적 솔루션의 100 µ L에서 100 µ g) 8 헤 주입 제어 마우스 정 맥 무 균 생리 적 솔루션의 100 µ L에 대 한 순환 수 있도록.
- 자 궁 경부 전위에 의해 쥐를 안락사 하 고 빠르게 스냅-동결 isopentane 드라이 아이스 (-50 °C에서 1 분)에서 유지 관리에 대 한 두뇌를 수집 합니다. 조직 처리까지-80 °C에서 두뇌를 저장 합니다.
- cryomicrotome와 코로나 뇌 섹션을 잘라. 그것은 피 질에 형성 하 고 적절 한 현미경 슬라이드 ( 재료의 표참조)에 그 지역에서 9 µ m 두께 섹션을 잘라 흉터에 의해 intracranial 주입을 찾습니다.
- 얼음 처럼 차가운 PBS에 슬라이드에 움직일 두뇌 섹션을 담가 (2 x 5 분), 다음, 얼음 4%에 그들을 수정 하 고 PFA (5 분)에 대 한. PBS에서 슬라이드를 세척 (3 배 RT에서 5 분). 슬라이드를 가로로 놓고 피펫으로 차단 솔루션 포함 10% 태아 둔감 한 혈 청 PBS에 조직에 섹션 (RT, 500 µ L/슬라이드에서 1 시간)에 대 한 전체 표면을 커버 합니다. CD31 항 체를 준비 ( 테이블의 자료를 참조 하십시오) 차단 솔루션/슬라이드의 250 µ L에서. 항 체로 차단 솔루션을 장착 하 고 하룻밤에 4 °C 습도 챔버에 품 어.
- 다음 날, 담가 PBS에 슬라이드 (RT 5 분에 대 한 3 배)는 해당 fluorophore 활용 된 이차 항 체 (1: 500에 RT에서 2 h에 대 한 PBS의 250 µ L)으로 그들을 품 어 고. (RT)에 PBS에 3 x 린스와 dH2O 1 µ g/mL의 최종 농도에 DAPI 솔루션을 사용 하 여 셀 핵 counterstain (250 µ L/슬라이드). 7 분 실시간 제거 DAPI 솔루션에 대 한 샘플을 품 어와 슬라이드 3을 씻어 dH2O. x
- 각 조직 섹션에서 추가 설치 매체의 한 방울 ( 테이블의 자료를 참조 하십시오)는 coverslip로 샘플을 확보 하 고. 공기 방울 entrapping 하지 마십시오. 4 °C에서 샘플을 저장 하 고 confocal 현미경 관찰까지 빛 으로부터 보호 유지.
Representative Results
Murine BBTB 모방의 confocal 영상 bEND3 표현과 꽉 접합 단백질 zonula occludens-1 (조로-1) claudin-5의 셀룰러 지역화를 보여 줍니다. 연락처 내 피 세포 사이의 이다 명확 하 게 ZO-1 claudin-5 bEND3 monocultures (그림 1D)에 비해 내 피 세포-세포 연락처의 이전을 유도 한다. 면역 형광 막의 뇌 쪽에 GFAP 표현 이다 시각화에 얼룩을 사용 하 여, 그것은 관찰 하 고 연구 astrocytic 프로세스 및 끝 발 내 피 세포 막 (그림 1E를 통해 연락 가능 ). 사이토 내 피 세포 연락처 홍보 하 고 세포 벽의 강화 안정 하며 BBB19의 낮은 침투성 가치와 관련 됩니다. 우리 없음-플로리다 monocultures의 경우 10-6 cm/s x 27.63 (± 3.45)에서 10-6 cm/s x 6.74 (± 3.01)에 대 한 마우스 BBTB 모방의 침투성에 상당한 감소를 관찰 하는, 그에 따라 때와 hypoxia-유도할 수 있는 공동 경작 요소 (HIFko) 이다 (표 1) 밖으로 노크. 불멸 하 게 HuAR2T 높게 침투성 세포 장벽 (104.92 ± 27.1 x 10-6 c m/s, 표 1)을 형성 한다. Murine 모델와 마찬가지로, 우리가 측정 BBTB x 10-6 c m/s, 즉 47.4 (± 14.32) 나 플로리다의 상당히 낮은 침투성 HuAR2T 세포 인간의 기본 이다 (표 1)와 함께 공동 경작 했다.
모두 인간과 murine BBTB 모방에 세포종 환자-파생 분야의 존재 침투성 값 혼자 내 피 세포-사이토 공동 문화에 비해 (표 1)에 약간의 증가 유도 한다. 이 현상은 여러 관찰 하지만 환자 glioma의 모든 모델을 범위. 이것은 일부 환자에서 파생 된 세포에 의해 은닉 되는 VEGF A 원인일 수 있습니다.
Vivo에서 BBB와 생체 외에서 BBTB 모방의 침투성 값 비교, 우리 누드 마우스에 이식 두개골 창을 통해 나 플로리다의 실시간 확산 몇 군데. 형광 stereomicroscope를 사용 하 여, 주요 pial 혈관에서 파생 혈관 모세 혈관에서 나 플로리다 확산 하기 전에, 하는 동안, 그리고 프로브 (그림 2C)의 조직의 주입 후를 기록 했다. 시간이 지남에 순환 혈액과 뇌 피 질 실질에서 차동 형광 값의 측정'누드 마우스의 대략적인 침투성 값을 계산할 수 있었습니다 s BBB 나 Fl (5.57 ± 2.19 x 10-6 c m/s, 에 대 한 표 1).
뇌 쪽으로 혈액 쪽에서 화합물의 통로의 시각화를 위한이 BBTB 모방을 사용 하는 방법을 설명 하기 위해 우리는 ø 110 nm (NP110)와 ø 350 nm (NP350) 나노 대상 세포종 환자-파생 분야의 transcytosis 비교. 결과 얻은 생체 외에서 다음 vivo에서 transcytosis에 비교 했다. 제시 등에서 나노 쿠퍼20 종양을 대상으로 펩타이드와 표면 코팅 되었고 (FITC) 시각화를 촉진 하기 위하여 형광 염료와 로드. 우리는 lysosomal 염료를 사용 하 여 셀을 표시 하 고는 BBTB의 혈액 쪽에 FITC 나노 입자의 추가 모방 다른 수준 (예: 혈액 쪽, 막, 두뇌 쪽에 confocal 현미경 인수 후 DAPI 24 h counterstained 그리고 환자 세포종 분야) (그림 3A). NP110 관련 형광 신호 이다, 내 피 세포, 종양 세포의 리소좀과 colocalized. 또한, NP110s은 검색된 사이 내 피 세포 및 삽입 (그림 3A)의 막 숨 구멍을 통해 전달 하는 이다.
NP110s의 통로 혈액과 뇌 쪽에서 수집 된 샘플에서 형광을 측정 하 여 정량 했다. 그의 나노 입자에 대 한 결정이 침투성 값 비교 되었다 ø 350 nm (NP350). 결과 표시만 NP110 (그림 3B) BBTB 모방을 교차 수 있었습니다. NP350는 이러한 나노 입자에 대 한 낮은 침투성 값 결과 BBTB 모방의 혈액 쪽에 남아 있었다.
Vivo에서 모델에 비해 BBTB 모방의 관련성을 강조 하기 위해 누드 마우스 정 맥 NP110 또는 NP350 나노 입자는 종양을 대상으로 펩 티 드 쿠퍼와 코팅 및 검출을 위한 빨간색 형광 염료 (TRITC)와 활용으로 주입 했다. 조직 여러 시간 지점에서 수집 된 후 8 h, BBB 투과 나노가 뇌 실질의 순환에 머물 렀 고 즉 vivo에서 조직의 순환에서 주로 맑게 되었다 nonpermeable 동안에 extravasated는 밝혔다. 따라서, 우리 두뇌를 수집 하 고 정연 한 밀리미터 8 h postinjection 당 나노 입자의 수를 측정할. 생체 외에서 연구 결과, NP110, 하지만 하지 NP350에 따라 뇌 실질 (그림 3C)으로 extravasated 성공적으로. 뇌에 나노 위치의 고배율 이미징 NP110 혈액 모세 혈관 밖 뇌 실질에 균질 분산 되었고 성공적으로 이식된 세포종 세포 (그림 3D)에 홈을 보여주었다. Moiety (쿠퍼)를 대상으로 같은 종양, 전시에 불구 하 고 NP350 뇌 실질에 extravasate 하지 못했습니다 하 고 뇌 혈관의 (그림 3E), 생체 외에서. 을 얻은 결과 유사 luminal 측면 이내 감지만
그림 1: 혈액 뇌종양 장벽 (BBTB) 모델의 설명. (A) 종류의 다른 세포 위치의 도식 적인 표현입니다. (B) 그림 6 잘 플레이트 커버에 삽입'의 뇌에 이다에 대 한 시드 기술 삽입 배치의 s 막. 사이토 접착 수 있도록 6 잘 플레이트 배치의 (C) 그림. (D) 꽉 접합 단백질 zonula occludens-1 (조-1, 위 행, 레드)와 claudin-5 (낮은 행, 녹색)의 면역 형광 현미경. 단백질 표정 murine 뇌 microvascular 내 피 세포 (bEND3) 단 (왼쪽된 열) 또는 murine 불멸 하 게 HIFko 이다 (오른쪽 열)와 함께 혼자 BBTB의 혈액에 경작과 비교 됩니다. 세포 핵 DAPI (파란색)와 counterstained는. (E) HIFko 이다은 BBTB의 뇌 쪽에 교양 폐해 fibrillary 산 성 단백질 (GFAP, 레드)를 보여주는 면역 형광 현미경 사진. 끝-피트 (화살표) 내 피 세포는 세포 막을 통해 연락 숨 구멍 (오른쪽 패널) 및 고배율 이미지는 사이토 프로세스를 보여 줍니다. HIFko 이다의 id 유인원 바이러스 40 큰 T 항 원 (SV40 큰 T, 녹색) 셀의 immortalization 사용의 면역 형광 염색에 의해 확인 되었다. 내 피 세포에 GFAP도 SV40 큰 T 익스프레스 그리고, 따라서 관찰 될 수 있다 부분적으로 반대 측 DAPI 전용 스테인드 셀 (점선)으로 막의 투명 한 통해. 세포 핵 DAPI (파란색)와 counterstained는. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 마우스 BBB 침투성의 intravital 라이브 결정. 삽입형 꼬리 정 맥 카 테 터의 (A) 준비 합니다. (1) 도구와 장비는 다음: (a)는 PE20 폴 리 에틸렌 튜브 (b) 2 개의 25 G 바늘 (c) 로체스터 Ochsner 집게, 및 (d) 작은 불독 클램프. (2) A 25 G 바늘 여러 torsions에 의해 제거 되는 튜브에 삽입 집게 및 (3) 신중 하 게 사용 하 여. (4) 튜브의 다른 쪽은 또 다른 25 G 바늘에 연결 된다. (B) 마우스의 꼬리 정 맥을 통해 나트륨 fluorescein 솔루션에 카 테 테 르 주입 및 위치에 대 한 지도. 동그라미 지역 cyanoacrylate 접착제 한 방울 테를 확보 하기 위해 위치 하는 영역을 나타냅니다. 불독 클램프 카 테 터를 처리 하는 데 사용 하 고 일단 테 장악을 제거. (C) 대표 이미징 및 정량화 메서드를 나트륨 fluorescein 침투성 값을 결정 합니다. 나트륨 fluorescein 주입 (왼쪽된 열), 이전 autofluorescence/텅 빈 뇌 (상단 패널, 흰색 사각형)와 혈관 영역 (하단 패널, 빨간 사각형)에 관심 (ROI)의 영역 내에서 측정 됩니다. 나트륨-fluorescein 주입 (오른쪽 열) 동안 형광 강도 BBB 침투성의 계산을 허용 두 ROIs 측정 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 예측의 vivo 생체 외에서 BBTB 모델을 사용 하 여에서 BBB 통해 나노 입자의 intracerebral transcytosis. (A) 대표 confocal 이미지 murine BBTB 모델의 지정 된 서로 다른 수준에서 얻은 BBTB 분석 결과의 그래픽 표현입니다. 110의 나노 nm 직경 (NP110) FITC (녹색)를 활용 하 고 추가 된 혈액에 BBTB 세포의 lysosomal 프로브 (LT-99, 빨간색)으로 표시 했다. (1) Endothelial 세포 막 (흰색 점선), (3) 이다의 숨 구멍을 통해 나노 입자의 (2) Endothelial transcytosis 및 (4) 환자 세포종 분야는 그래픽에 식별 되 고 해당 confocal 현미경 사진 (오른쪽)입니다. 나노 입자 (화살표)의 lysosomal 캡슐화는 BBTB의 내 피와 사이토 레이어를 통해 활성 transcytosis를 나왔다. (B) 생체 외에서 BBTB 통해 표시 된 나노 침투성의 정량화 (n = 6). 뇌 조직에서 지정 된 나노 입자 밀도의 부 량 (C) 섹션, 누드 쥐의 꼬리 정 맥 주입 후 8 h (n = 3). (D) Confocal 현미경 murine 뇌 조직 단면도에 110 nm 나노 입자 (NP110, 빨간색)는 ø의 분포를 보여 주는 안티 마우스 CD31 항 체 (녹색)으로 표시. 화살표는 나노 transcytosis (왼쪽된 패널)를 강조 표시합니다. 나노 입자 축적 때문에 닭장을 대상으로 펩 티 드 그들의 표면에 뇌 종양 세포 (종양, 오른쪽 패널) 주변. 아니 중요 한 유도 뇌 조직 (뇌)에서 관찰 됩니다. (E) Confocal 현미경 표시는 ø의 분포 350 nm 나노 (NP350, 빨간색) murine 뇌 조직 단면도 반대로 마우스 CD31 항 체 (녹색)으로 표시. 화살촉을 혈관 루멘에 유지 했다 NP110s. 세포 핵에 비해 그들의 큰 직경 때문에 아마 BBB를 교차 하지 못했습니다 NP350s 포인트는 DAPI (파란색)와 counterstained. P < 0.01. P-값 양측 비패라메트릭 맨-휘트니 U 테스트를 사용 하 여 계산 했다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| murine BBTB 모방 | bEND3 | bEND3 + HIFko로 | bEND3 + 기가바이트 | bEND3 + HIFko로 + 기가바이트 | Vivo에서 |
| 침투성 (10-6 cm/s) | 27.63 | 6.74 | 26.8 | 10.83 | 5.57 |
| SD (10-6 cm/s) | 3.45 | 3.01 | 7.99 | 2.65 | 2.19 |
| 인간 BBTB 모방 | HuAR2T | HuAR2T + hIAs | HuAR2T + GB | HuAR2T + hIAs + 기가바이트 | |
| 침투성 (10-6 cm/s) | 104.92 | 47.4 | 89.08 | 48.24 | |
| SD (10-6 cm/s) | 27.1 | 14.32 | 10.21 | 13.07 |
표 1: 체 외에서 결정 (초당 센티미터)에서 나트륨-fluorescein (Na-플로리다) 침투성의 값 표시 된 공동 문화 시스템에서 그리고 vivo에서 NMRI 누드 마우스에. 대표적인 실험에서 데이터 (n = 3 쥐).
Discussion
Interpatient 종양 다양성 개념의 맞춤된 암 의학21에 대 한 연구를 젊 어지게. 이 다양성은 또한 중앙 신경 신생의 특징 이다. 종양의 예측 때문 화학 요법에 대 한 응답 약물 전달에 대 한 BBB의 sheltering 효과를 추가 하 고 환자 치료22주요 과제를 구성 하는 모두. 더 효과적인 치료법을 개발 하기 위하여 그것이 종종 새로운 분자의 화면 큰 라이브러리에 필요 합니다. Antitumor 효능과 종양 사이트에 도달 하는 새로운 치료 단서의 능력을 평가 하기 위해 최고의 옵션 murine 환자 아바타에 생체 내에 이식 환자 파생 셀에 전 임상 연구 이다. 실제 (재정, 시간, 인적, 시설 자원) 및 윤리적인 이유로 (3Rs 원리 실험실 동물을 사용 하는 경우), 같은 대규모 vivo에서 심사 플랫폼의 개발은 종종 가능, 그리고 그러므로, 세포 기반 분석 선택23의 모델을 남아 있다. 선택에 대 한 주요한 이유 세포 라인을 설립 하 고 재현성 하며 절연 및 기본 murine 문화의 설립에 대 한 주요 소스는 실험실 동물의 사용 하는 1 차 셀을 피하. 여기, 제시 하는 방법을 효율적으로 폐기 수 확고 하 게 준수 하는 3Rs nanoparticles는 추가 임상 조사는 쿠리에 모델 BBTB 교차 하는 그들의 무 능력의에서. 원칙으로 서 증거-의-, 여기 개발 및 유효성 검사는 BBTB의 기간 동안 얻은 결과 설명 합니다. 우리는 예를 들어 때 측정 376 다 나트륨 fluorescein의 수동 확산 vivo에서 생체 외에서 연구 결과 확인 수 있었다.
이 문서에서 설명 하는 프로토콜 이다와 cocultured 내 피 세포의 준비를 생체 외에서 설치에서 혈액 종양 장벽 같은 인터페이스를 설명 합니다. 이러한 두 셀 형식 간의 신체 접촉 설립 되 면, 내 피 세포 층 BBB (예를 들어, 한 셀 표면 식 꽉 접합 단백질의 상대적으로 낮은 침투성)와 유사성을 전시 한다. 흥미롭게도, murine BBTB 모방 vivo에서 마우스로 BBB 침투성 측정24얻은 그 특히 비슷한 나 플로리다 침투성 값을 제공 하는 것 같았다. 따라서, BBTB 모방의 성능 장벽을 형성 하는 데 사용 하는 셀의 선택에 직접 연결 될 것입니다. BEND3 내 피 세포 두뇌에서 발생 하 고 이다25cocultured 때 장벽을 형성에 성공한 것으로 알려져 있습니다. 그러나, 우리는 사용 하 고 불멸 하 게 HIFko 이다26 BBTB 모방 생성 하. 저 산소 증 유도할 수 있는 요인의 그들의 부족 때문이 이다 생산 하지 않습니다 VEGF A는 여기에서 설명 하는 BBTB 모방의 안정화에 전형적인. 이다는 VEGF-A neuroinflammation27에 대 한 응답의 출시를 통해 예를 들어 BBB 침투성의 변조기로 확인 되었습니다. 혈관 내 피 성장 인자 수용 체 (VEGFRs)의 활성화는 내 피/혈관 침투성 모두 체 외28 에 vivo에서29의 키 레 귤 레이 터입니다. 따라서, 매체에 VEGF A 보충 VE cadherin30등 외화 접합 단백질의 인 산화를 유도 한다 내 피 세포에 VEGFR2를 활성화 합니다. 내 피 세포-세포 접촉의 손실 높은 침투성 혈관 생성합니다. 마찬가지로, 강한 mitogenic 속성 및 셀 문화 분석에 사용 되는 태아 소 세라의 알 수 없는 구성 장벽 및 분석 결과 재현성에 주요 문제를 일으킬.
인간의 탯 줄 정 맥 내 피 세포 (HUVECs)는 가끔 체 외31; BBB를 형성 하는 데 사용 됩니다. 그러나, 그들은 크게 다 뇌 microvascular 내 피 세포에서 hCMEC/D3 셀 라인32, 유전자 발현 및 방 벽을 형성 하는 같은 속성. 그러나, 혼자 성장 하는 HuAR2T 세포로 가져온 값은 bEND3에 비해 상대적으로 높은 침투성 인간의 기본 이다와 coculturing에 의해 크게 감소 했다. 비록 내 피 세포는 세포 벽을 형성 하는 데 필요한, 그것은 분명는 이다 BBTB 형성 및 안정화를 동등 하 게 중요 한 역할을 했습니다.
때 환자 파생 glioma 분야는이 방정식에 추가 된, 마우스 BBTB 모방 murine xenografts 뇌 맥 관 구조와 종양 세포 타겟팅을 통해 마약 확산 등의 기능 중 일부 지. 여기 BBTB 모방 했다 예를 들어, 우리는 다른 직경을 가진 여러 나노 상영 때 vivo에서 동작을 미러링에 성공. 생체 외에서 그리고 vivo에서 모델 간의 병렬 처리를 설명 하기 위해 우리 세포 관통 속성34 에 종양을 대상으로 펩 티 드 쿠퍼에 활용 된 앞에서 설명한 mesoporous 규 산 염 나노 입자33 사용 그들의 surface20입니다. 닭장을 대상으로 펩 티 드 주택 유 방 파생 된 성장 억제 물 (MDGI)에 특정 바인딩을 통해 침입 종양 세포. Gliomas를 포함 하 여 여러 암 MDGI 정상 조직의35, 쿠퍼는 매우 효율적인 종양을 대상으로 moiety 페이로드20의 납품을 증가 수 게에 비해 overexpressing는. 여기에 사용 되는 나노 입자 (27547955), 뇌 실질에 확산 이전 표시 되었습니다 그리고 때 Taxol과 기능성, 이러한 나노 화물 전 임상 모델36에 glioma 성장 감소에 성공 했습니다. 나노 입자의 표면에 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG) 잔류물의 추가 또한 그들의 정전기 양수 값을 유지 (주위 4 + mV), 혈관 단위37 와 함께 더 나은 상호 작용을 허용 하 고 또한 그들의 안정성을 증가 순환. 표시 데이터에서 말뚝의 3 kDa NP350s 말뚝의 10 kDa 코팅 했다 하는 동안 NP110s에 활용 했다. 그러나, 증가-분자-무게 못 또한 결과 나노 직경, 따라서 상당한 증가에 BBB를 그들의 실제 기능. 따라서, 우리는 입자의 실제 크기는 BBTB 통해 그들의 통행을 방해 하는 여부 및 여부 이러한 관측 수 미러링할 vivo에서 확인 합니다.
이전 게시 된 관측에 따라 생체 외에서 BBTB와 NP350s BBTB 모방의 luminal 사이드의 혈관에서에 유지 하면서 intracranial 종양 방위 쥐의 BBB를 통해 NP110s extravasated는 관찰 된 쥐입니다. 이러한 비슷한 결과 좋습니다 BBTB 모델 BBB를 교차 하 고 두뇌에 도달 하는 나노 입자의 생체 조건 능력을 예측 했다.
BBB의 휴대 전화 모델의 관련성은 나노38의 중앙 배달에도 자주 토론 됩니다. 우리가 보여 여기는 기본 이다 그리고 내 피 세포, 둘 다 가장 관련 된 생체 외에서 도구로 간주 대체 될 수 있다 불멸 하 게 또는 상업적으로 사용할 수 있는 셀, 더 큰 확장성과 재현성을 확보. 생체 외에서 BBB 모방의 다음 세대는 구조적으로 유사한 실제 BBB12,14아름 답게 형성된 neurovascular 단위를 수 있도록 미세 장치를 통합 하 여 개발 될 수 있습니다. 그러나, 이러한 모델은 현재 gliomas 배달14의 속 행에 기술적인 제한 때문에 배달 하는 분자의 높은 처리량 검열에 적합 합니다. 그것은 실제로 접시에 BBB의 생리 적인 복잡성을 포착 하기 어려운 그리고 일부 수용 체/단백질, BBB에 의해 표현 될 알려진의 가능한 부족 결과의 해석을 손상 시킬 수 있습니다. 또 다른 인자 유전자 발현 특히 내 피 세포를 고려 하 고, 다른 한 셀 라인에서 뿐만 아니라 vivo에서 그리고 생체 외에서 조건 사이에서 큰 변화를 염려 한다. 그러나, 그것은 수 또한 될 주장 neurovascular 단위 두뇌39내 균일 한 엔터티 아니다. 생물학에서 과학 연구에 도달 했습니다 인간적 시대 어디 동물 복지, 윤리적 책임, 그리고 동물 생활을 사용 하 여 비용 항상 실험을 설계 하기 전에 간주 됩니다. 따라서, 동물의 교체를 지원 하기 위해 최근 연구의 증가 수 보여줍니다 모델의 한계와 장벽을 설치 하기 세포 모델의 신중한 선택의 인식-는 이다에 대 한 강조와 함께-영장을 경기 결과 접시에 고 동물 모델40있습니다. 여기에 설명 된 방법으로 우리는 한 걸음 더 가까이 상영 BBB transcytosis 잠재적인 치료에 대 한의 목적을 위해 사용 하는 실험 동물의 수를 감소 얻을.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 연구는 핀란드 암 조직, 제인 & Aatos Erkko 재단, 그리고 Sigrid Juselius 재단 (P.L.와 V.L.J.), 스위스 국립 과학 재단에서 교부 금에 의해 지원 되었다 (고급 Postdoc.Mobility 부여 no: P300PB_164732 s. K.), 오리온 연구 재단 (S.K.)에, Maud Kuistila 기념 재단 (S.K.), 그리고 핀란드의 아카데미 (TERVA 2017, 부여 no: 314 498). Biomedicum 이미징 장치 (헬싱키)는 현미경 이미징 핵심 시설을 제공 하는 인정 했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells | |||
| bEND3 | ATCC | CRL-2299 | Cultured in: DMEM (1g/L glucose) supplemented with 10% FBS, 5 mL L-glutamine and 5 mL penicillin/streptomycin |
| HIFko immortalized mouse astrocytes | Isolated in Dr. Gabriele Bergers Lab | https://doi.org/10.1016/S1535-6108(03)00194-6 | Cultured in: BME-1 supplemented with 5% FBS, 5 mL 1 M HEPES, 5 mL 100 mM sodium pyruvate, 3 g D-glucose and 5 mL penicillin/streptomycin |
| HuAR2T | Isolated in Dr. Dagmar Wirth Lab | https://doi.org/10.1089/ten.tea.2009.0184 | Cultured in: EBM-2 with SupplementMix |
| normal human primary astrocytes | Lonza | CC-2565 | Cultured in: ABM with SingleQuots |
| Material and reagents | |||
| 100 mm x17 mm Dish, Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific | 150350 | |
| 10 mL serological pipet | ThermoFisher Scientific | 170361 | |
| 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339650 | |
| ABM Basal Medium, 500 mL | Lonza | CC-3187 | For primary human astrocytes. ABM+: contains all the additives from the supplement mix. ABM-:all the additives except for rhEGF and FBS |
| Accutase Cell Detachment Solution | Corning | 25-058-CI | |
| AGM SingleQuots Supplements and Growth Factors | Lonza | CC-4123 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | for both GBM + and - medium |
| Basal Medium Eagle | ThermoFisher Scientific | 21010046 | BME-1 |
| Corning Costar TC-Treated 6-Well Plates | Sigma-Aldrich | CLS3506 | |
| Corning Transwell polyester membrane cell culture inserts | Sigma-Aldrich | CLS3452 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | dissolve in 50 mL of BME-1 and sterile filter before adding to the medium |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient F-12 Ham | Gibco | 21331-020 | Specific to the culture of the patient-derived spheres isolated in our lab, may vary for other glioma cell lines |
| EBM-2 growth Medium SupplementMix | PromoCell | c-39216 | EBM+: contains all the additives from the supplement mix. EBM-:all the additives except for VEGF-A and FBS |
| Endothelial Basal Medium 2 (EBM-2) | PromoCell | c-22211 | EBM+: contains all the additives from the supplement mix. EBM-:all the additives except for VEGF-A and FBS |
| Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin | ThermoFisher Scientific | 10500056 | |
| Fluorescein sodium salt | Sigma-Aldrich | F6377 | |
| Greiner CELLSTAR 96 well plates | Sigma-Aldrich | Greiner 655090 | black polystyrene wells flat bottom (with micro-clear bottom) |
| Menzel-Gläser 0.9 cm round borosilicate Cover Slips | Thermo Scientific | 10313573 | |
| PBS tablets | Medicago | 09-9400-100 | one tablet per liter of dH2O, then sterilize the solution by autoclaving |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6407 | |
| Recombinant Human EGF | Peprotech | GMP100-15 | for GBM+ medium |
| Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) | Peprotech | 100-18B | for GBM+ medium |
| Immunofluorescence | |||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| 24 mm x 60 mm microscope slide cover glass | ORSAtec | 0224601-D | |
| AlexaFluor 488 and 594 secondary antibodies | ThermoFisher Scientific | dilution: 1/500 | |
| Anti-Claudin-5 antibody | Abcam | ab15106 | dilution: 1/150 |
| Anti-GFAP antibody clone GF5 | Abcam | ab10062 | dilution: 1/150 |
| Anti-Mouse CD31 antibody Clone MEC 13.3 | BD Biosciences | 550274 | dilution 1/800 |
| Anti-SV40 T-antigen antibody | Abcam | ab16879 | dilution: 1/150 |
| Anti-Zonula Occludens-1 | Abcam | ab96587 | dilution: 1/200 |
| DAPI | TOCRIS | 5748 | |
| Fluoromount Aqueous Mounting Medium | Sigma-Aldrich | F4680 | |
| LysoTracker Red DND-99 | ThermoFisher Scientific | L7528 | |
| Animal procedures | |||
| 10 cm curved dissecting scissors | World Precision Instruments | 14394 | |
| BD Microlance 25 G needles | Becton Dickinson | 300600 | |
| Fine Forceps (12.5 cm) | World Precision Instruments | 503283 | for tissue dissociation |
| Intramedic Polyethylene tubing PE20 | Becton Dickinson | 427406 | |
| Ketaminol vet 50 mg/mL | Intervet | Vnr511485 | Ketamine |
| Mains Powered microdrill | World Precision Instruments | 503599 | |
| Menzel-Gläser 0.5 cm round borosilicate Cover Slips | Thermo Scientific | 11888372 | |
| Micro Bulldog clamp | World Precision Instruments | 14119 | |
| Physiological saline solution | Mustela | Sterile single dose vials 20 x 5 mL / 40 x 5 mL - Medical device class | |
| Rochester-Oschner forceps | World Precision Instruments | 501709 | |
| Rompun vet 20 mg/mL | Intervet | Vnr148999 | Xylazine |
| Stereotaxic adapter | World Precision Instruments | 502063 | |
| Sugi Sponge Points | Kettenbach | 31603 | |
| Equipment | |||
| Axio Zoom.V16 fluorescence stereo zoom microscope | Carl Zeiss | ||
| FLUOstar Omega microplate reader | BMG Labtech | ||
| ORCA-Flash 4.0 digital sCMOS camera | Hamamatsu Photonics | ||
| Universal 320 tabletop centrifuge | Hettich | Cat. No. 1401 | |
| ZEISS LSM 880 with Airyscan confocal microscope | Carl Zeiss |
References
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